Použití bakteriologické metody umožňuje izolovat patogen v čisté kultuře z materiálu získaného od pacienta a identifikovat jej na základě studia souboru vlastností. Většina bakterií je schopna kultivace na různých umělých živných médiích (kromě chlamydií a rickettsie), proto má bakteriologická metoda Důležité v diagnostice mnoha infekčních chorob.
Pokud je získán pozitivní výsledek, bakteriologická metoda umožňuje určit citlivost izolovaného patogenu na antimikrobiální léky. Účinnost této studie však závisí na mnoha parametrech, zejména na podmínky pro sběr materiálu a on přeprava do laboratoře.
NA základní požadavky požadavky na výběr a dopravu materiálu pro bakteriologický výzkum, zahrnout:
- odběr materiálu před zahájením etiotropní léčby;
- dodržování sterilních podmínek při odběru materiálu;
- technická správnost odběru materiálu;
- dostatečné množství materiál;
- zajištění teplotních podmínek pro skladování a přepravu materiálu;
- minimalizace časového intervalu mezi sběrem materiálu a výsevem na pevné živné půdy.
Transport materiálu do laboratoře by měl být proveden co nejdříve, maximálně však do 1-2 hodin po jeho odběru. Vzorky materiálu musí být uchovávány při určité teplotě; zejména normálně sterilní materiály (krev, mozkomíšní mok) jsou skladovány a dodávány do laboratoře při 37 °C. Nesterilní materiály (moč, výtok dýchací trakt atd.) jsou uloženy na pokojová teplota ne více než 1-2 hodiny nebo ne více než jeden den při 4 °C (podmínky domácí chladničky). Pokud není možné dodat vzorky do laboratoře v regulovaném časovém rámci, doporučuje se použít transportní média určená k zachování životaschopnosti patogenů za podmínek konzervace.
Krev pro výzkum by měla být pacientovi odebrána v období stoupající tělesné teploty, na začátku nástupu horečky. Doporučuje se vyšetřit 3-4 krevní vzorky odebrané v intervalu 4-6 hodin, což je opodstatněné z hlediska snížení rizika „chybějící“ přechodné bakteriémie a zvýšení schopnosti potvrdit etiologickou roli izolované oportunní mikroflóry z krve, pokud je tato mikroflóra detekována v několika vzorcích žilní krev. Vzorek krve v množství 10 ml pro dospělého a 5 ml pro děti se naočkuje minimálně do dvou lahviček s aerobní a anaerobní mikroorganismy v poměru 1:10. Doporučuje se jedno vyšetření arteriální krve.
Vzít mozkomíšního moku (CSF) provádí lékař při lumbální punkce v množství 1-2 ml do suché sterilní zkumavky. Vzorek je ihned doručen do laboratoře, kde také ihned začíná jeho vyšetření. Pokud to není možné, skladuje se materiál několik hodin při 37 °C. Výrazně zvyšuje množství pozitivní výsledky bakteriologické vyšetření naočkováním 1-2 kapek CSF do zkumavky obsahující polotekuté médium s glukózou a do Petriho misky s „krevním“ agarem. Pro zaslání materiálu použijte izotermické krabice, nahřívací podložky, termosky nebo jakýkoli jiný obal, kde je udržována teplota cca 37 °C.
Excreta pro bakteriologický výzkum se 3-5 g odebere pomocí sterilních dřevěných špachtlí do sterilní nádoby s těsně přiléhajícím víčkem. Vyšetření odebraného materiálu by mělo začít nejpozději o 2 hodiny později. Pokud není možné zahájit vyšetření během této doby, je třeba odebrat malé množství materiálu a umístit jej do vhodného transportního média. Při odběru stolice by se mělo usilovat o zaslání patologických nečistot (hlenu, hnisu, epiteliálních částic atd.) k případnému vyšetření, aby se zabránilo vnesení krevních nečistot, které mají baktericidní vlastnosti, do materiálu.
Ke sběru materiálu lze použít rektální tampony (s vatovou špičkou). Tampón by měl být navlhčen sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného nebo transportním médiem (nikoli však olejovým gelem). Zavádí se do rekta do hloubky 5-6 cm a otočením tamponu jej opatrně vyjmeme, přičemž se sleduje výskyt barvy stolice na tamponu. Tampón se umístí do suché zkumavky, pokud studie materiálu začne do 2 hodin, jinak - v transportním médiu.
Jsem nasranej(průměrný podíl volně uvolněné moči) v množství 3-5 ml se sbírá do sterilní nádobky po důkladné toaletě zevního genitálu. Sběr moči je lepší ráno.
Žluč odebrané při duodenální intubaci na ošetřovně odděleně po částech A, B a C do tří sterilních zkumavek při dodržení pravidel asepse.
Voda na výplach žaludku shromážděné ve sterilních nádobách v množství 20-50 ml. Je třeba mít na paměti, že výplach žaludku v těchto případech provádějí pouze indiferentní (nemají bakteriostatické resp. baktericidní účinek na mikroorganismy) roztoky - lepší vařící voda(bez přidání sody, manganistanu draselného atd.).
Sputum. Ranní sputum uvolněné během záchvatu kašle se shromažďuje ve sterilní nádobě. Před kašlem si pacient vyčistí zuby a vypláchne ústa převařenou vodou, aby mechanicky odstranil zbytky potravy, deskvamovaný epitel a mikroflóru ústní dutina.
Bronchiální výplachová voda. Při bronchoskopii se neaplikuje více než 5 ml izotonického roztoku chloridu sodného s následným odsátím do sterilní zkumavky.
Výtok z hltanu, úst a nosu. Materiál z dutiny ústní se odebírá nalačno nebo 2 hodiny po jídle sterilním vatovým tamponem nebo lžičkou ze sliznice a jejích postižených míst u vstupů do vývodů. slinné žlázy, povrch jazyka, z vředů. Pokud je tam film, odstraňte jej sterilní pinzetou. Materiál z nosní dutiny se odebírá suchým sterilním vatovým tamponem, který se zavede hluboko do nosní dutiny. Materiál z nosohltanu se odebírá sterilním zadním faryngeálním vatovým tamponem, který se opatrně zavede nosním otvorem do nosohltanu. Pokud kašel začne, tampon se nevyjme, dokud kašel neskončí. Pro testování záškrtu se současně zkoumají filmy a hlen z nosu a krku, přičemž se materiál odebírá různými tampony.
Testovaný materiál se naočkuje na pevné živné médium za použití speciální techniky k získání růstu jednotlivých kolonií mikroorganismů, které jsou následně screenovány, aby se izolovala čistá kultura patogenu.
Určité typy bakterií se izolují pomocí selektivních médií, která inhibují růst cizích mikroorganismů nebo obsahují látky, které stimulují růst určitých patogenních mikrobů.
Mikroorganismy izolované na živných půdách identifikovat, tj. určit jejich druh nebo typ. V Nedávno Pro identifikaci ve zdravotnické praxi se používají mikrotestové systémy, což jsou panely se sadou diferenciálně diagnostických prostředí, což urychluje výzkum. Mikrotestovací systémy se také používají ke stanovení citlivosti mikroorganismů na antimikrobiální léčiva ředěním antibiotika v tekutém živném médiu.
Při posuzování výsledků bakteriologického vyšetření k tomu musí lékař přihlédnout negativní výsledek neznamená vždy nepřítomnost patogenu a může být spojeno s užíváním antimikrobiálních léků, vysokou mikrocidní aktivitou krve a technickými chybami. Detekce patogenního mikroba v materiálu od pacienta bez souvislosti s klinický obraz možné v případě rekonvalescenčního, zdravého nebo přechodného přenosu bakterií.
Izolace oportunních mikroorganismů z krve, při dodržení všech pravidel asepse (staphylococcus epidermidis, coli) a dokonce i saprofyty by měly být považovány za projev bakteriémie, zvláště pokud se tyto mikroby nacházejí ve více než jednom vzorku materiálu nebo v různých substrátech (krev, moč), protože se snížením imunoreaktivity těla tyto a další „ nepatogenní“ mikroorganismy mohou být patogeny infekční procesy včetně sepse.
Existuje určitá obtíž interpretace výsledků bakteriologického vyšetření nesterilních médií, totiž důkaz etiologické role oportunních mikroorganismů. V tomto případě se berou v úvahu takové ukazatele, jako je typ izolovaných kultur, počet mikrobiálních buněk daného typu v materiálu, jejich opakovaná izolace během onemocnění, přítomnost monokultury nebo asociace mikroorganismu.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Technika bakteriologického výzkumu. Izolace patogenu z krve (krevní kultura) je raná metoda diagnostika nemocí. Bakterémie u pacientů s tyfus-paratyfus se objevuje na konci inkubační doba a nemizí během celého horečnatého období onemocnění a při relapsech. Výsledky bakteriologického vyšetření do určité míry závisí na načasování odběru materiálu a množství naočkované krve. Čím dříve je hemokultura provedena od začátku onemocnění, tím větší je pravděpodobnost detekce patogenu. V prvním týdnu břišního tyfu je pacientovi odebrána krev z loketní žíly v množství 10 ml, více pozdní termíny a během relapsů - 20 ml.
První den studia krev se naočkuje v poměru 1:10 do jedné z tekutá média. Uvedený poměr musí být přísně dodržován, protože při menším ředění krve mohou mikroby zemřít kvůli jeho baktericidnímu účinku. K naočkování použijte: 10% nebo 20% roztok žlučového bujónu, nalitý do 50-100ml lahviček, masovo-peptonový bujón s přídavkem 1% glukózy, sterilní destilovanou vodu - podle metody N. N. Klodnitského, ve které se lýza červených krvinek dochází, produkty jejich rozpadu slouží jako dobr živné médium pro růst bakterií. Můžete použít i sterilní vodu z kohoutku. nejlepší skóre získané naočkováním materiálu do žlučového vývaru. Pokud není možné kultivovat krev na místě, je sérum a sraženina nebo citrátová krev (10 ml krve nalité do zkumavky obsahující 2 ml 5% sterilního citrátu sodného) odeslány do laboratoře. Krevní sraženina se v laboratoři rozdrtí a naočkuje do jednoho z uvedených médií. Láhve jsou umístěny v termostatu při teplotě 37°C.
Druhý den studia. Po 14-24 hodinách od začátku studie se materiál naočkuje do Petriho misky na médium Endo nebo médium s eosinem a methylenovou modří (Levinovo médium). Ploskirevovo médium se nedoporučuje používat k setí, protože bacily tyfu a paratyfu nalezené v krvi jsou obligátní paratrofy podle typu výživy a nemění tento typ výživy okamžitě na metatrofní (tj. mrtvé organické substráty). Proto na tomto médiu obsahujícím soli žlučových kyselin, bacily tyfu rostou velmi špatně nebo vůbec. Pokud po první inokulaci nedojde k růstu bakterií, provedou se další inokulace po 48, 72 hodinách a 5. a 10. den. Pokud se patogen nepodařilo izolovat, je dána záporná odpověď. V pochybných případech se doporučuje provádět plodiny pravidelně - jednou za 3-4 dny - až do 24. dne od okamžiku odběru materiálu. 7. den je stále uvedena záporná odpověď.
Třetí den studia. Jsou identifikovány „podezřelé“ kolonie pěstované na médiu Endo a Levin (na médiu Endo jsou kolonie patogenních mikrobů bezbarvé), pro které jsou 2-3 kolonie subkultivovány na šikmém agaru a Resselově médiu.
Čtvrtý den výzkumu. Výsledky inokulace na Resselovo médium jsou zohledněny a zaznamenány a morfologické vlastnosti izolovaných kultur jsou studovány v Gramově obarveném nátěru. Motilita se zjišťuje - přítomnost nebo nepřítomnost bičíků - v zavěšené nebo rozdrcené kapce odebrané ze 4-6hodinové kultivační půdy. K tomu se agarová kultura (jedna smyčka) naočkuje do 1 ml mírně zahřátého bujónu. Vybrané kultury (2-3 zkumavky) se přeočkují na Hissovo médium s mannitolem, sacharózou a šikmým agarem a dále do 2 zkumavek s masovo-peptonovým bujónem, ve kterých jsou proužky filtračního papíru navlhčené speciálními roztoky pro stanovení vodíku sulfid a indol (nepřeložené) jsou umístěny pod zátkami.
Pátý den výzkumu. Změny se zaznamenávají do rozšířeného „pestrého řádku“. Pokud je přítomna tvorba plynu, provede se aglutinační reakce se směsí sér Salmonella. Na pozitivní reakce proveďte aglutinační reakci s O- a H-sérem a poskytněte konečnou odpověď na základě souhrnu všech příznaků.
Izolace myelokultury se provádí výsevem výsledného tečkovaného kostní dřeně do 3-5 ml sterilní hovězí žluči nebo do 25-30 ml 10% žlučového bujónu, umístěte do termostatu a druhý den subkultivujte na Endo nebo Wilson-Blair media. V budoucnu jsou fáze výzkumu stejné.
Izolace bakterií z výkalů. Od 8. do 10. dne nemoci, častěji od třetího týdne, se u pacientů s břišním tyfem, paratyfem vylučují bakterie stolicí. Pro výzkum vezměte poslední porce stolice tekuté konzistence, emulgujte do izotonický roztok chlorid sodný (v poměru 1:10) a nechte 30 minut, dokud se velké částice neusadí. Pro setí se kapka materiálu odebere z povrchu kapaliny.
První den studie se materiál naočkuje na obohacovací médium - žlučový bujón, hořčík, Mullerovo, Kaufmanovo médium - a umístí se do termostatu. Druhý den studie se obohacovací médium naočkuje na misky s médiem Ploskirev, Endo nebo Levin a Wilson-Blair (bismut-sulfit-agar). Následně jsou fáze studie stejné jako při izolaci hemokultury.
Izolace bakterií skupiny tyfus-paratyfus z moči se nejlépe provádí od druhého do třetího týdne nemoci. Před odběrem materiálu omyjte vnější otvor sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného. močová trubice; U žen je lepší odebírat moč katétrem. Pro výzkum se odebírá 20-30 ml moči. Po odstředění se sediment naočkuje do 2 misek Ploskirevovým médiem nebo vizmut-siřičitanovým agarem. Supernatant se naočkuje na obohacovací médium (10% žlučový bujón) a umístí se do termostatu na 24 hodin, poté se naočkuje do 2 šálků jednoho z volitelných médií. Izolované kolonie se identifikují obvyklým způsobem.
Studium duodenálního obsahu - žluč. Metoda se častěji používá ve fázi rekonvalescence. Žluč se shromažďuje během sondování do sterilních zkumavek. Obsah duodena se naočkuje do lahviček s 50 ml bujónu a zbývající část materiálu se spolu s naočkováním umístí do termostatu při 37 °C. Další den se naočkuje do 2 kelímků hustým diferenciálním médiem . Izolované kolonie se identifikují pomocí popsané metody.
Vysoce citlivý a slibný v včasná diagnóza tyfus a paratyfus je imunofluorescenční metoda, která vyšetřuje krev od prvních dnů onemocnění, stolici od 10. dne, obsah dvanáctníku od 10. normální teplota těla. Bakterie tyfus-paratyfus jsou označeny specifickými fluorescenčními séry, která jsou následně stanovena fluorescenční mikroskopií. Metoda umožňuje diagnostikovat onemocnění 10-12 hodin od začátku studie.
Sérologická diagnostika tyfus-paratyfus. Od druhého týdne onemocnění se v krvi pacientů objevují specifické protilátky, které lze stanovit pomocí Widalovy reakce. Při břišním tyfu a paratyfu se hromadí O- a následně H-aglutininy. V průběhu onemocnění jsou někdy detekovány Vi-aglutininy, které však na rozdíl od nosičů nemají žádnou diagnostickou hodnotu. Stanovení specifických aglutininů na původce břišního tyfu a paratyfu (Vidalova reakce) v krvi pacientů může pomoci při stanovení diagnózy, a to jak u akutní období nemoci a během rekonvalescence.
U salmonelózy je pomocnou diagnostickou metodou Widalova reakce. Je třeba připomenout, že se často setkáváme s formami onemocnění se slabě vyjádřenou imunologickou odpovědí. Zvláště často jsou u pacientů léčených antibiotiky pozorovány nízké titry aglutininů, dokonce i jejich absence.
U Widalovy reakce se odeberou 1-3 ml krve z prstu nebo loketní žíly do sterilní zkumavky. Aby se urychlilo srážení krve, umístí se na 30 minut do termostatu. Sražená krev se krouží skleněnou pipetou a umístí se do chladničky, dokud se neobjeví čiré, usazené sérum. Sraženina se používá ke kultivaci (krevní kultivaci). Aglutinační reakce se provádí s H- a O-tyfus, A- a B-paratyfus diagnosticum. Sérum se ředí, počínaje titrem 1:100 až 1:800, podle následujícího postupu. Do zkumavky se nalije 9,9 ml sterilního izotonického roztoku chloridu sodného a 0,1 ml testovacího séra, aby se dosáhlo ředění 1:100. 5 ml naředěného séra, každý po 1 ml, se nalije do 4 zkumavek (podle počtu antigenů použitých ve Widalově reakci) a do jedné sloužící jako kontrola séra. Ze zbývajících 5 ml séra (ředění 1:100) se vylije 1 ml a do 4 ml se přidají 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného a získá se ředění 1:200. 4 ml z ředění 1:200 se také nalijí do 4 zkumavek po 1 ml a do zbývajících 4 ml se znovu přidají 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného, aby se dosáhlo ředění 1:400. Následná ředění (1:800, 1:1600) se připraví tak, jak je popsáno. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 4 zkumavek, které slouží jako kontrola antigenu. Do všech zkumavek, kromě těch, které slouží jako kontrola séra, nakapejte 1-2 kapky odpovídajících diagnostických látek. Stojan se zkumavkami se protřepe a umístí do termostatu při 37 ° C na 24 hodin H-aglutinace (hrubozrnná) nastává po 2 hodinách, O-aglutinace (jemnozrnná) - mnohem později. Intenzita reakce je zaznamenána po 24 hodinách. Diagnostický titr Widalovy reakce je zředěn nejméně 1:200 v přítomnosti klinických projevů.
Je třeba mít na paměti, že tato reakce může být pozitivní u jiných onemocnění - tuberkulóza, malárie, brucelóza, zhoubné novotvary a některé stavy (těhotenství). Widalova reakce může být pozitivní u zdravých jedinců (každodenní reakce), u očkovaných a v minulosti prodělaných onemocnění (anamnestická reakce). Pro zvýšení specificity Widalovy reakce Fischer navrhl ředění séra hypertonický roztok chlorid sodný (2,9 a 5,8 %). To vede k oslabení nebo eliminaci skupinových reakcí. Hodnota aglutinační reakce se zvyšuje s opakovanými studiemi, kdy je stanoven vzestup titru protilátek s dynamikou onemocnění. U paratyfu A může být Widalova reakce negativní nebo titr specifických protilátek je nižší než skupinová protilátka.
V posledních letech za uznání střevní skupina onemocnění se široce používá pasivní hemaglutinační reakce (RPHA) s parciálními antigeny tyfových bakterií. RPGA má vysokou senzitivitu a specificitu a je pozitivní od 5. dne nemoci. Minimální diagnostický titr pro pacienty s břišním tyfem, paratyfem a salmonelózou s O-antigenem je 1:200. Reakce je monitorována v průběhu času, aby se určil nárůst titru protilátky.
Metody laboratorní diagnostiky bakteriálního nosičství u břišního tyfu a paratyfu. Bakteriologické vyšetření stolice, moči a duodenálního obsahu se provádí podle obecně uznávaných metod. Nejlepších výsledků se dosáhne při použití seleničitanových médií.
Vzhledem k četnosti bakteriální izolace často není možné izolovat patogen. U převážné většiny přenašečů bacilu tyfu se nacházejí mikrobi obsahující Vi-antigen, a proto se v krvi akutních i chronických přenašečů objevují Vi-protilátky (v krvi pacientů jsou méně časté). Diagnostický titr reakce je 1:20 nebo vyšší. Paralelně s Vi-aglutinační reakcí (se zahřátým sérem) se provádí Widalova reakce (s nativním sérem) s H- a O-tyfoidními diagnostiky. V sérech nosičů tyfových bakterií se H-protilátky v titru 1:200 až 1:800 nacházejí v 60-80 % případů. Zvláštností je přítomnost kombinace H- a Vi-protilátek diagnostickou hodnotu při identifikaci přenašečů bacilu tyfu.
Z doplňkové metody studie k detekci nosičství bacilu tyfu používají kožní alergický test s typhinem a také RPGA s Vi-antigenem.
Důležitou podmínkou úspěchu boje proti tyfově-paratyfovým onemocněním je tedy včasná a úplná identifikace a neutralizace zdroje infekcí. V současné době břišní tyfus se vyskytuje sporadicky. Průběh onemocnění je přitom kratší a není provázen všemi typickými znaky klasické formy, což komplikuje klinické rozpoznání.
V souvislosti s výše uvedeným nabývá na významu komplexní laboratorní vyšetření.
Možnosti využití bakteriologického výzkumu v oční choroby omezena přístupností patologického zaměření. Při jeho lokalizaci v zadním segmentu oka je získání materiálu pro výzkum často velmi obtížné a možnost bakteriologické diagnostiky je v takových případech přirozeně vyloučena. Hlavní oblastí použití bakteriologické diagnostiky v oftalmologické praxi jsou onemocnění zevní části oka a také penetrující rány, ve kterých lze získat materiál pro výzkum během chirurgická léčba rány nebo při odstraňování cizího tělesa. Obecně je třeba poznamenat, že kdy chirurgické zákroky Spektrum možností získávání bakteriologického materiálu se výrazně rozšiřuje.
Získání materiálu pro výzkum
K získání materiálu ze spojivkového vaku se používá platinová smyčka (pokud není k dispozici, lze použít smyčku vyrobenou ze spirálového závitu elektrického sporáku, nebo jiného nástroje (skleněná tyčinka, špachtle apod.), která je nejprve sterilizovat kalcinací v plameni lihového kahanu Stažením spodního víčka , s chlazenou smyčkou, uchopit hroudu spojivkového výboje z hloubky dolního fornixu V tomto případě je nutné se vyhnout dotyku smyčky na kůže a okraje očních víček, aby se do materiálu nevnesla cizorodá mikroflóra. Materiál je vhodné odebrat před začátkem ošetření a na začátku ošetření. ranní hodiny kdy je výtok vydatnější. Při absenci hlenu a hnisu (např. při vyšetření zdravé spojivky před operací) je třeba použít slznou tekutinu nebo lehce seškrábat povrch vaziva (podle Lindnera). Ale v takových případech je lepší použít Elynnigovu techniku: kápnout jednu kapku sterilního fyziologického roztoku nebo bujónu do spojivkového vaku z Pasteurovy pipety a po několika sekundách tuto kapku odsát.
Podle téhož hlavní pravidla získat materiál ze slzného vaku, vymáčknutím jeho obsahu, a z okraje víčka v případě ulcerózní blefaritidy, nejprve odstranit kůru z vředu.
Při odběru materiálu z rohovky je nutná velká opatrnost, zvláště v případě plazivého vředu rohovky. Klička (nebo jiný tupý nástroj) by měla směřovat šikmo k povrchu vředu a materiál by měl být odebrán z jeho progresivního okraje. To vyžaduje anestezii (3 kapky 1% dikainu) a fixaci. oční bulva.
Jako materiál pro výzkum v případě penetrujících ran oka můžete použít výtok z rány (pokud existuje), jeho zachycení smyčkou nebo gázovým tamponem, punkci přední komory nebo extrahování cizí těleso, který se umístí do sterilní zkumavky s 1-2 ml fyziologického roztoku. Po protřepání zkumavky se roztok použije k testování.
Z přední komory lze materiál pro výzkum získat řezným nástrojem během paracentézy nebo punkcí. Po anestezii rohovky (3 kapky 1% roztoku dikainu) a fixaci oční bulvy šikmo na limbu se vstříkne injekční jehla, zavede se do přední komory (pozor, neporaníme duhovku a pouzdro čočky!) a 0,3 odsaje se ml obsahu přední komory.
U endoftalmitidy může být potřeba získat materiál z sklovitý. Punkce oční bulvy se provádí po anestezii (1 ml 2% roztoku novokainu pod spojivkou) ostrou jehlou s poměrně širokým lumenem, injektovaným blíže k rovníku. Nasává se 0,3-0,5 ml nitroočního obsahu.
Výsledný materiál je studován k identifikaci mikroba a určení jeho typu (mikrobiologická diagnóza). Materiál lze studovat:
- na podložní sklíčko (bakterioskopická metoda);
- v plodinách (vlastní bakteriologická metoda);
- v pokusu na zvířatech (biologická metoda).
Bakterioskopická metoda
lze použít v každé oční nemocnici s jednoduchým laboratorním vybavením a některými reagenciemi.
Chcete-li to provést, musíte mít následující:
- kovová smyčka;
- čistá skleněná sklíčka (na čisté sklenici se kapka vody rozteče a nenabude kulovitého tvaru);
- vana s podpěrami pro sklíčka (skleněné tyče nebo silný měděný drát);
- destilovaná voda;
- alkohol;
- pinzeta;
- filtrační papír;
- Lugolův roztok (jód 1 g, jodid draselný 2 g, destilovaná voda 300 ml);
- roztoky barev (nejlépe v lahvičkách uzavřených pipetami s gumovými plechovkami).
K čištění se nové sklenice vyvaří v 1% roztoku sody (lze použít popel) a poté se umyjí mírnou vodou kyselina chlorovodíková a znovu s vodou. Použité sklo se vloží na 1-2 hodiny do kyseliny sírové, poté se vyvaří v roztoku sody, promyje se vodou a ponoří do 96° lihu. Sklenice se skladují buď v lihu, nebo po setření lihu na sucho, ve sklenicích se zabroušenou zátkou.
Nejčastěji používané barvy jsou: Ziehl karbol fuchsin (zásaditý fuchsin 1 g, krystalická kyselina karbolová 5 g, alkohol 96° 10 ml, glycerin - pár kapek, destilovaná voda 100 ml). Pro barvení se Tsilya fuchsin obvykle ředí 10krát destilovanou vodou (zředěný nebo vodný fuchsin). Methylenová modř (methylenová modř 10 g, alkohol 96° 100 ml). Připravuje se z ní Lefflerova alkalická modř ( alkoholový roztok modrá 30 ml, 1 % draselné nebo sodné alkálie 1 ml, destilovaná voda 100 ml). Karbolická genciánová violeť (připravovaná stejně jako Ziehlův karbolický fuchsin).
Mikroby jsou studovány buď naživo (metody „rozdrcené“ a „zavěšené kapky“) nebo zabité (v barevném přípravku). Živé studie odhalují především schopnost mikrobů se aktivně pohybovat, zatímco obarvené preparáty umožňují dobré studium jejich morfologie.
Existují jednoduché barvicí metody, kdy se obvykle používá jedna barva, a komplexní barvicí metody, které odhalují určité rysy fyzikálně-chemické struktury mikrobiální buňky, a proto mají diferenciálně diagnostickou hodnotu.
Technika přípravy barevných přípravků je následující. Materiál se nanese na čisté podložní sklíčko a rovnoměrně se rozloží po povrchu ve formě kruhu nebo oválu. Nátěr by měl být poměrně tenký. Pokud se objeví hustý hnis, měli byste nejprve na podložní sklíčko nakapat jednu kapku destilované vody a hmotu v této kapce promíchat. Nátěr se suší na vzduchu. Sklenice se zaschlým přípravkem se odebírá za okraje s velkým ukazováčky zdvihněte nahoru a zafixujte tak, že jej třikrát protáhnete plamenem lihového kahanu (na hranici jeho světlé a tmavé části). Při dostatečné fixaci je cítit mírné pálení v prstech. Zafixovaná šmouha je obarvená. Připraví se několik přípravků, alespoň dva, z nichž jeden je obarven jednoduchým způsobem (methylenová modř Leffler, zředěný fuchsin Ziehl), druhý - podle Gramovy metody.
Loefflerovo barvení:
- Umístěte kousek filtračního papíru na nátěr a nalijte Lefflerův modrý roztok po dobu 3-5 minut;
- přípravek se promyje destilovanou vodou a suší.
Gramovo barvení:
- na nátěr se položí kousek filtračního papíru, na který se na 1-2 minuty nalije roztok genciánové violeti;
- vypusťte barvu, odstraňte papír a bez oplachování vodou nalijte roztok Lugol po dobu 1 minuty; současně stěr zčerná;
- vypusťte roztok Lugolu a vybělte nátěr alkoholem ( lepší cesta ponoření drogy do sklenice s alkoholem, dokud nepřestanou vytékat fialové pramínky);
- důkladně opláchněte vodou;
- naplňte nátěr zředěným fuchsinem po dobu 1-2 minut;
- slijte barvu, omyjte přípravek vodou a osušte.
Pohodlná Gramova metoda upravená Sinevem, který navrhl použít předem připravené kousky filtračního papíru, namočené v roztoku genciánové violeti a vysušené. Nejprve se na stěr nanesou 2-3 kapky vody a poté se přiloží tyto kousky papíru. Poté postupujte podle výše uvedeného popisu.
Mikroskopie nátěrů se provádí imerzní čočkou. Při barvení podle Loefflera se obarví všechny mikroby Modrá barva; při barvení Gramovým barvivem je buď modrofialová (Gram-pozitivní mikrobi) nebo červená (Gram-negativní mikrobi).
Omezený počet mikrobů podílejících se na onemocněních zevního oka a jejich charakteristické morfologické znaky často umožňují stanovit správnou mikrobiologickou diagnózu pouze pomocí bakterioskopického vyšetření.
Bakteriologická metoda
Stává se nezbytným v případech, kdy studium nátěrů nestačí ke stanovení typu mikroba nebo je potřeba určit citlivost izolovaného patogenu na antibakteriální léčiva.
S odkazem na podrobný úvod do bakteriologické metody do speciálních příruček o mikrobiologii se zde zastavíme pouze u principů této metody. První fáze práce spočívá v identifikaci jednotlivé druhy mikroby, tj. získat čisté kultury. K tomu se uchylují k mechanické separaci materiálu během setí a k použití médií nejvhodnějších pro vývoj domnělých patogenů (elektivní média). Přeočkováním jednotlivých kolonií pěstovaných na médiu se získá čistá kultura, která se zkoumá pod mikroskopem (připraví se nátěry) a subkultivuje se na diferenciálně diagnostickém médiu pro studium biochemických vlastností patogenu.
Vysoké nároky většiny očních patogenních mikrobů v kultivačních podmínkách vedly k převládajícímu použití selektivních médií obsahujících nativní protein pro jejich izolaci. Jedná se například o prostředí Elschnig (jedna část koňské sérum nebo ascitická tekutina a dva díly bujónu), sražené Loefflerovo sérum (tři díly séra a jeden díl bujónu s 1 % peptonu, 0,5 % NaCl a 1 % hroznový cukr), krevní agar Leventhal (agar a 5-10% defibrinovaná krev).
Pro stanovení citlivosti mikrobů na antibiotika je nejjednodušší metodou pro toto stanovení použít speciálně vyrobené kotouče filtračního papíru, namočené v antibiotických roztocích a vysušené ve vakuu. Materiál pro výzkum (hnis, tečkovaný, extrahované cizí těleso) je umístěn do sterilní zkumavky s fyziologický roztok(1,5-2 ml). Po protřepání se tekutina nalije do Petriho misek, nejlépe do dvou - jedna s cukrovým agarem, druhá s krevním agarem - a protřepáním se rovnoměrně rozdělí po povrchu média. Poté se na povrch agaru umístí disky s různými antibiotiky ve vzdálenosti 2 cm od sebe a od okraje misek. Misky se umístí do termostatu (37 °C) a druhý den se posuzuje stupeň citlivosti mikroba na testovaná antibiotika podle velikosti zóny inhibice růstu kolem disků. Absence zóny inhibice růstu ukazuje na necitlivost mikroba na toto antibiotikum.
Biologická metoda
v oční praxi se používá pouze v případech, kdy z důvodu obtížné diagnózy může být toxigenní vlastnost rozhodující pro určení typu mikroba (např. diferenciální diagnostika difterický bacil a xerózní bacil).
Laboratorní diagnostika virových očních onemocnění
V současné době probíhá speciální studium virů včetně trachomaviru (obr. 77) s využitím jejich kultivace v tkáňových kulturách (kuřecí embryo, myší ascitický karcinom aj.) a elektronové mikroskopie.
Rýže. 77. Buněčné inkluze v trachomu.
V klinická praxe K diagnostice trachomu se používá metoda cytologického vyšetření spojivkových seškrabů na přítomnost či nepřítomnost Provacek-Halberstaedterových tělísek (inkluzí). K tomu použijte tupý skalpel nebo hranu sklíčka seškrábněte epiteliální kryt spojivky (bez krve), který se aplikuje tenká vrstva na podložní sklíčko, 5 minut sušit na vzduchu a fixovat ponořením do sklenice s methylalkohol nebo Nikiforovova směs (ethylether a absolutní alkohol ve stejném množství). Lakování se provádí do 3-4 hodin čerstvě připraveným roztokem barvy Romanovsky-Giemsa (v poměru jedna kapka barvy na 1 ml destilované vody). Poté se přípravek promyje tekoucí vodou, suší se na vzduchu a zkoumá se pod mikroskopem. V tomto případě se obarví jádra epiteliálních buněk růžová barva, protoplazma - ve světle modré, inkluze - v modré, modrofialové (obr. 77). Ty se objevují ve formě kokoidních útvarů umístěných mezi jemnozrnnou hmotou a jsou rozpoznávány jako přenašeči trachomatózního viru. Častěji se vyskytují u čerstvých případů neléčeného trachomu, ale mohou se objevit i u paratrachomální konjunktivitidy.
Výzkum v posledních letech identifikované nová uniforma nakažlivý virové onemocnění oční - epidemická keratokonjunktivitida a cytologické studium spojivkových seškrabů u tohoto onemocnění umožnilo odhalit v epiteliálních buňkách zvláštní inkluze, zcela odlišné od Prsvačkových tělísek (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
Metoda kulturního výzkumu je izolace bakterií určitého typu ze živného média kultivací s jejich následnou druhovou identifikací. Typ bakterií se určuje s přihlédnutím k jejich struktuře, kulturním a environmentálním údajům, jakož i genetickým, biochemickým a biologickým ukazatelům. K provádění bakteriologické diagnostiky se používají schémata schválená Ministerstvem zdravotnictví.
Nazývají se nové druhy bakterií izolované ze živného média, jejichž vlastnosti dosud nebyly stanoveny čistá kultura. Po konečné identifikaci jejich vlastností jsou bakterie odstraněné z určitého místa a v určitou dobu pojmenovány kmen. V tomto případě jsou povoleny drobné rozdíly ve vlastnostech, místě nebo době izolace kmene jednoho druhu.
Účel metody:
1. Etiologická diagnostika, tedy izolace a identifikace čisté kultury bakterií.
2. Stanovení počtu mikroorganismů a jejich speciálních vlastností. Například, specifická reakce pro antibiotika.
3. Identifikace intragenerických rozdílů u mikroorganismů na základě jejich epidemiologických a genetických složek. To je nezbytné pro určení společenství mikroorganismů izolovaných v různá místa A různé podmínky, což je důležité pro epidemiologické účely.
Tato výzkumná metoda má určitý počet fází, odlišných pro aerobní, fakultativní a obligátní aerobní bakterie.
Vývoj čisté kultury pro aerobní a fakultativně aerobní bakterie.
Fáze 1
A) Přípravné činnosti. Tato fáze zahrnuje sběr, skladování a přepravu materiálu. V případě potřeby může být také zpracován v závislosti na vlastnostech studovaných bakterií. Například při zkoumání materiálu na tuberkulózu se k identifikaci acidorezistentních mikrobakterií používají alkalické nebo kyselé roztoky.
b) Obohacení. Tato fáze není povinné a provádí se, pokud počet bakterií ve zkušebním materiálu nestačí k provedení plnohodnotné studie. Například při izolaci hemokultury se testovaná krev umístí do média v poměru 1 ku 10 a skladuje se 24 hodin při teplotě 37 o.
V) Mikroskopie. Nátěr vyšetřovaného materiálu se obarví a zkoumá pod mikroskopem - zkoumá se mikroflóra, její vlastnosti a množství. V budoucnu je nutné z primárního nátěru odděleně izolovat všechny mikroorganismy v něm obsažené.
G) Vytváření samostatných kolonií. Materiál se nanáší na kalíšek obsahující speciální selektivní médium, k tomu se používá smyčka nebo špachtle. Poté kelímek postavte dnem vzhůru, abyste chránili kolonie před kondenzací, a uložte jej do termostatu asi na 20 hodin při udržování teploty 37 o.
Důležité! Je třeba připomenout, že během výzkumného procesu je nutné dodržovat pravidla izolace. Jednak k ochraně testovaného materiálu a odstraňovaných bakterií a jednak k zamezení infekce okolních osob a vnější prostředí.
Pokud jde o oportunní mikroorganismy, při jejich odstraňování jsou důležité jejich kvantitativní charakteristiky. V tomto případě se provádí kvantitativní naočkování, při kterém se provádí několikasetnásobné ředění materiálu v izotonickém roztoku chloridu sodného. Poté se provede inokulace do Petriho misek o objemu 50 μl.
Fáze 2
A ) Studium morfologických vlastností kolonií v médiích a jejich mikroskopie. Prozkoumají se kalíšky a zaznamenají se vlastnosti mikroorganismů, jejich počet, rychlost růstu a zaznamená se nejvhodnější živná půda. Pro studium je nejlepší vybrat kolonie umístěné blíže ke středu, a pokud se vytvoří několik typů čistých kultur, prostudujte každou zvlášť. Chcete-li studovat morfotypickou čistotu kultury, použijte nátěr kolonie, obarvte ji (obvykle. pomocí Gramovy metody nebo jakékoli jiné) a pečlivě mikroskopujte.
b) Akumulace čisté kultury. K tomu se kolonie všech morfotypů umístí do samostatných zkumavek se živnou půdou a udržují v termostatu při určité teplotě (pro většinu mikroorganismů je vhodná teplota 37 o, ale v některých případech může být jiná).
Živnou půdou pro akumulaci je často Kliglerovo médium Ve zkumavkách má „šikmý“ vzhled, kde 2/3 jeho části má tvar sloupce a 1/3 je šikmý povrch, zbarvený světle červeně. Sloučenina:
· IPA
· 0,1 % glukózy
· 1% laktózy
· Speciální činidlo pro sirovodík
· Fenolově červený indikátor.
Fáze 3
A) Úroveň růstu a čistota kultury. Obecně má výsledná čistá kultura rovnoměrný růst a při mikroskopickém zkoumání mají buňky stejnou morfologickou a barvicí strukturu. Existují však některé typy bakterií s výrazným pleoforismem a existují buňky s různými morfologickými strukturami.
Pokud bylo jako živné médium použito Kliglerovo médium, pak jsou biochemické charakteristiky určeny změnou barvy sloupce a šikmé části. Například pokud se rozkládá laktóza, zkosená část zežloutne, pokud glukóza, sloupec zežloutne; Při výrobě sirovodíku dochází k zčernání v důsledku přechodu síranu na sulfid železa.
Jak můžete vidět na obrázku, Kliglerovo médium má tendenci měnit svou barvu. Je to dáno tím, že k odbourávání dusíkatých látek bakteriemi a tvorbě alkalických produktů dochází heterogenně jak v koloně (anaerobní podmínky), tak na zkoseném povrchu (aerobní podmínky).
V aerobním prostředí (šikmá plocha) více aktivní vzdělávání zásadité než v anaerobním prostředí (kolona). Proto, když dojde k rozkladu glukózy, kyselina na šikmém povrchu se snadno neutralizuje. Ale při rozkladu laktózy, jejíž koncentrace je mnohem vyšší, nelze kyselinu neutralizovat.
Pokud jde o anaerobní prostředí, vzniká velmi málo alkalických produktů, takže zde můžete pozorovat, jak probíhá fermentace glukózy.
Rýže. Kliglerovo kultivační médium:
1 – zdrojové prostředí,
2 – výška E-coli,
3 - výška S. paratyphi B,
4 – výška S. Typhi.
E.coli podporuje rozklad glukózy a laktózy za vzniku plynů, neprodukuje vodík . Způsobuje žloutnutí celého média s přestávkami.
S. paratyphi – podporuje rozklad glukózy za vzniku plynů, laktóza negativní. Zkosená část nemění barvu, sloupec zežloutne.
S. paratyphi A- neprodukuje sirovodík.
S. paratyphi B – vzniká sirovodík (při postupu vstřikování se objevuje černá barva).
S. typhi – glukóza se rozkládá bez tvorby plynu, vzniká sirovodík, laktóza-neg. Zkosená část nemění barvu, sloupec zežloutne a médium zčerná v průběhu vstřikování.
Shigella spp.- laktóza negativní, glukóza pozitivní, sirovodík se nevytváří. Sloupec získává žlutý odstín a zkosená část zůstává stejná.
b) Konečná identifikace čisté kultury a její reakce na antibiotika. Na v tomto stádiu Studují se biochemické, biologické, sérologické a genetické vlastnosti kultury.
Ve výzkumné praxi není potřeba studovat celou škálu vlastností mikroorganismů. K určení, zda mikroorganismy patří ke konkrétnímu druhu, stačí použít nejjednodušší testy.
Bakteriologická výzkumná metoda (BLMI)– metoda založená na izolaci čistých kultur bakterií pomocí kultivace na živných půdách a jejich identifikaci na druhy na základě studia morfologických, kulturních, biochemických, genetických, sérologických, biologických, environmentálních charakteristik mikroorganismů.
Bakteriologická diagnostika infekcí se provádí pomocí standardních diagnostických schémat schválených Ministerstvem zdravotnictví.
Čistá kultura - bakterie jednoho druhu pěstované na živném médiu, jejichž vlastnosti jsou předmětem studia.
Kmen– identifikovaná čistá kultura mikroorganismů jednoho druhu izolovaná z konkrétního zdroje v určitý čas. Kmeny stejného druhu se mohou nevýznamně lišit v biochemických, genetických, sérologických, biologických a dalších vlastnostech, stejně jako v místě a době izolace.
Cíle BLMI:
1. Stanovení etiologické diagnózy: izolace čisté kultury mikroorganismů a její identifikace.
2. Definice další vlastnosti například citlivost mikroorganismu na antibiotika a bakteriofágy.
3. Stanovení počtu mikroorganismů (důležité v diagnostice infekcí způsobených UPM).
4. Typizace mikroorganismů, tj. stanovení vnitrodruhových rozdílů na základě studia genetický A epidemiologické(fágvary a sérovary) markery. To se používá pro epidemiologické účely, protože nám to umožňuje stanovit shodnost mikroorganismů izolovaných od různých pacientů a z různých objektů životního prostředí v různých nemocnicích a geografických oblastech.
BLMI zahrnuje několik fází, liší se pro aeroby, fakultativní anaeroby a obligátní anaeroby.
I. Fáze BLMI při izolaci čisté kultury aerobů a fakultativních anaerobů.
Etapa.
A. Sběr, doprava, skladování, předzpracování materiálu. Někdy se před setím provádí selektivní zpracování materiálu s přihlédnutím k vlastnostem izolovaného mikroorganismu. Například před zkoumáním sputa nebo jiného materiálu na přítomnost acidorezistentních Mycobacterium tuberculosis se materiál ošetří roztoky kyselin nebo zásad.
B. Výsev do obohacovacího média(v případě potřeby se provádí, pokud testovaný materiál obsahuje malý počet bakterií, např. při izolaci hemokultury). K tomu se do média naočkuje krev odebraná ve výši horečky ve velkém objemu (8–10 ml u dospělých, 4–5 ml u dětí) v poměru 1:10 (k překonání účinku baktericidní krve faktory); plodina se inkubuje při teplotě 37 0 C po dobu 18-24 hodin.
B. Mikroskopie studovaného materiálu. Ze zkoumaného materiálu se připraví nátěr, obarví se Gramovou nebo jinou metodou a zkoumá se pod mikroskopem. Hodnotí se přítomná mikroflóra a její množství. Další studie by měly izolovat mikroorganismy přítomné v počátečním nátěru.
D. Výsev na živná média pro získání izolovaných kolonií. Materiál se naočkuje smyčkou nebo špachtlí metodou mechanické separace na misku s diferenciálně diagnostickým nebo selektivním médiem za účelem získání izolovaných kolonií. Po výsevu se kelímek obrátí dnem vzhůru (aby se zabránilo potřísnění kolonií kapkami kondenzační kapaliny), označí se a umístí se do termostatu při teplotě 37 0 C na 18-24 hodin.
Je třeba pamatovat na to, že při výsevu a dosévání mikrobiálních kultur je třeba věnovat pozornost pracovníkům dodržování pravidel asepse, aby se zabránilo kontaminaci živných médií a zabránilo se infekci ostatních a samoinfekci!
V případě infekcí způsobených oportunními mikroorganismy, kde je důležitý počet mikroorganismů přítomných v patologickém materiálu, se provádí kvantitativní výsev materiálu, u kterého se provádí série 100násobných ředění materiálu (obvykle 3 ředění) v nejprve se připraví sterilní izotonický roztok chloridu sodného ve zkumavkách. Poté se 50 μl každého ředění vysévá na živná média v Petriho miskách.
Etapa.
A. Studium morfotypů kolonií na médiích, jejich mikroskopie. Prohlížejí misky a všímají si optimálního živného média, rychlosti růstu a vzorce růstu mikroorganismů. Vyberte si studium izolované kolonie umístěné podél tahu, blíže ke středu. Pokud roste několik typů kolonií, zkoumá se každý zvlášť. Hodnotí se známky kolonií (tabulka 7). V případě potřeby se misky s plodinami prohlížejí lupou nebo pomocí mikroskopu s čočkou s malým zvětšením a zúženou clonou. K tomu jsou studovány tinktoriální vlastnosti různých morfotypů kolonií; mazat, obarveny Gramem nebo jinými metodami, mikroskopicky a určit morfologii a čistotu kultury, pokud je to nutné, dát přibližná RA na skle s polyvalentními séry.
B. Akumulace čisté kultury. Pro akumulaci čisté kultury se izolované kolonie všech morfotypů znovu naočkují do samostatných zkumavek se šikmým agarem nebo jiným živným médiem a inkubují se v termostatu při +37 0 C (tato teplota je optimální pro většinu mikroorganismů, ale může se lišit např. příklad, Campylobacterium spp.– +42 0 C, Candida spp. A Yersinia pestis – +25 0 C).
Kliglerovo médium se obvykle používá jako akumulační médium pro enterobakterie.
Složení Kliglerova média: MPA, 0,1% glukóza, 1% laktóza, sirovodíkové činidlo (síran železnatý + thiosíran sodný + siřičitan sodný), indikátor fenolová červeň. Počáteční barva média je karmínově červená, médium je ve zkumavkách „nakloněné“: má sloupec (2/3) a šikmý povrch (1/3).
Výsev do Kliglerova média se provádí pruhováním po povrchu a vpichováním do sloupce.
Etapa.
A. Účtování růstu na akumulačním médiu, hodnocení čistoty kultury v Gramově nátěru růstový vzor izolovaná čistá kultura. Vizuálně čistá kultura se vyznačuje rovnoměrným růstem. Na Mikroskopické vyšetření Obarvený nátěr připravený z takové kultury odhaluje morfologicky a tinctoriálně homogenní buňky v různých zorných polích. Avšak v případě výrazného pleomorfismu, který je vlastní některým typům bakterií, mohou nátěry z čisté kultury současně obsahovat buňky s různou morfologií.
Pokud bylo jako akumulační médium použito Kliglerovo indikátorové médium, pak se posuzují změny jeho barvy ve sloupci a šikmé části, ze kterých se biochemické vlastnosti: fermentace glukózy, laktózy a produkce sirovodíku. Při rozkladu laktózy šikmá část média zežloutne a při rozkladu glukózy sloupec zežloutne. Při vzniku CO 2 při rozkladu cukrů vznikají bublinky plynu nebo prasknutí kolony. V případě výroby sirovodíku je podél vstřikovací cesty zaznamenáno zčernání v důsledku přeměny síranu železnatého na sulfid železnatý.
Charakter změny barvy v Kliglerově médiu (obr. 23) se vysvětluje nestejnou intenzitou odbourávání dusíkatých látek mikroorganismy a tvorbou alkalických produktů v aerobních (na šikmé ploše) a anaerobních (v sloupci) podmínkách. .
Za aerobních podmínek dochází k intenzivnější tvorbě alkálií na zkoseném povrchu než ve sloupci média. Proto se při rozkladu glukózy, která je v prostředí v malém množství přítomna, rychle neutralizuje kyselina vznikající na zkoseném povrchu. Zároveň při rozkladu laktózy, která je v médiu přítomna ve vysoké koncentraci, zásadité potraviny nedokáže neutralizovat kyselinu.
Za anaerobních podmínek v koloně se alkalické produkty tvoří v zanedbatelném množství, proto je zde detekována fermentace glukózy.
Rýže. 23. Kligler indikační médium:
1 – počáteční,
2 – s růstem E-coli,
3 – s růstem S. paratyphi B,
4 – s růstem S. typhi
E-coli rozkládají glukózu a laktózu za vzniku plynů, nevznikají sirovodík. Způsobují žloutnutí sloupu a zkosené části s trhlinami v médiu.
S. paratyphi rozkládají glukózu za tvorby plynů, laktóza negativní. Způsobují žloutnutí sloupu s přestávkami, zkosená část nemění barvu a zůstává karmínová. V čem S. paratyphi B produkují sirovodík (při postupu vstřikování se objeví černá barva), S. paratyphi A sirovodík nevzniká.
S. typhi rozkládají glukózu bez tvorby plynu, jsou laktózově negativní, produkují sirovodík. Způsobují, že sloupec žloutne bez přerušení, zkosená část nemění barvu a zůstává karmínová a při postupu vstřikování se objevuje černá barva.
Shigella spp. glukóza-pozitivní, laktóza-negativní, neprodukují sirovodík. Způsobují žloutnutí sloupku (s přestávkami nebo bez, v závislosti na sérovaru), zkosená část nemění barvu a zůstává karmínová.
B. Konečná identifikace čisté kultury(stanovení systematické polohy izolovaného mikroorganismu na úroveň druhu nebo varianty) a stanovení spektra citlivosti izolované kultury na antibiotika.
K identifikaci čisté kultury v této fázi, biochemické, genetické, sérologické a biologické vlastnosti(Tabulka 8).
V běžné laboratorní praxi není potřeba při identifikaci studovat všechny vlastnosti. Používejte informativní, přístupné, jednoduché testy, dostatečné pro určení druhové (variantní) identity izolovaného mikroorganismu.
