Možnost použití bakteriologický výzkum na oční choroby omezena přístupností patologického zaměření. Při jeho lokalizaci v zadním segmentu oka je získání materiálu pro výzkum často velmi obtížné a možnost bakteriologické diagnostiky je v takových případech přirozeně vyloučena. Hlavní oblastí použití bakteriologické diagnostiky v oftalmologické praxi jsou onemocnění zevní části oka a také penetrující rány, ve kterých lze získat materiál pro výzkum během chirurgická léčba rány nebo při odstraňování cizího tělesa. Obecně je třeba poznamenat, že kdy chirurgické zákroky Spektrum možností získávání bakteriologického materiálu se výrazně rozšiřuje.
Získání materiálu pro výzkum
K získání materiálu ze spojivkového vaku se používá platinová smyčka (pokud není k dispozici, lze použít smyčku vyrobenou ze spirálového závitu elektrického sporáku, nebo jiného nástroje (skleněná tyčinka, špachtle apod.), která je nejprve sterilizovat kalcinací v plameni lihového kahanu Stažením spodního víčka , s chlazenou smyčkou, uchopit hroudu spojivkového výboje z hloubky dolního fornixu V tomto případě je nutné se vyhnout dotyku smyčky na kůže a okraje očních víček, aby se do materiálu nevnesla cizorodá mikroflóra. Materiál je vhodné odebrat před začátkem ošetření a na začátku ošetření. ranní hodiny kdy je výtok vydatnější. Při absenci hlenu a hnisu (např. při vyšetření zdravé spojivky před operací) je třeba použít slznou tekutinu nebo lehce seškrábat povrch vaziva (podle Lindnera). Ale v takových případech je lepší použít Elynnigovu techniku: kápnout jednu kapku sterilního fyziologického roztoku nebo bujónu do spojivkového vaku z Pasteurovy pipety a po několika sekundách tuto kapku odsát.
Podle téhož hlavní pravidla získat materiál ze slzného vaku, vymáčknutím jeho obsahu, a z okraje víčka v případě ulcerózní blefaritidy, nejprve odstranit kůru z vředu.
Při odebírání materiálu z rohovky je nutná velká opatrnost, zejména v případě plíživého rohovkového vředu. Klička (nebo jiný tupý nástroj) by měla směřovat šikmo k povrchu vředu a materiál by měl být odebrán z jeho progresivního okraje. To vyžaduje anestezii (3 kapky 1% dikainu) a fixaci. oční bulva.
Jako materiál pro výzkum v případě penetrujících ran oka můžete použít výtok z rány (pokud existuje), jeho zachycení smyčkou nebo gázovým tamponem, punkci přední komory nebo extrahování cizí těleso, který se umístí do sterilní zkumavky s 1-2 ml fyziologického roztoku. Po protřepání zkumavky se roztok použije k testování.
Z přední komory lze materiál pro výzkum získat řezným nástrojem během paracentézy nebo punkcí. Po anestezii rohovky (3 kapky 1% roztoku dikainu) a fixaci oční bulvy šikmo na limbu se vstříkne injekční jehla, zavede se do přední komory (pozor, neporaníme duhovku a pouzdro čočky!) a 0,3 odsaje se ml obsahu přední komory.
U endoftalmitidy může být potřeba získat materiál z sklovitý. Punkce oční bulvy se provádí po anestezii (1 ml 2% roztoku novokainu pod spojivkou) ostrou jehlou s poměrně širokým lumenem, injektovaným blíže k rovníku. Nasává se 0,3-0,5 ml nitroočního obsahu.
Výsledný materiál je studován k identifikaci mikroba a určení jeho typu (mikrobiologická diagnóza). Materiál lze studovat:
- na podložní sklíčko (bakterioskopická metoda);
- v plodinách (vlastní bakteriologická metoda);
- v pokusu na zvířeti (biologická metoda).
Bakterioskopická metoda
lze použít v každé oční nemocnici s jednoduchým laboratorním vybavením a některými reagenciemi.
Chcete-li to provést, musíte mít následující:
- kovová smyčka;
- čistá skleněná sklíčka (na čisté sklenici se kapka vody rozteče a nenabude kulovitého tvaru);
- vana s podpěrami pro sklíčka (skleněné tyče nebo silný měděný drát);
- destilovaná voda;
- alkohol;
- pinzeta;
- filtrační papír;
- Lugolův roztok (jód 1 g, jodid draselný 2 g, destilovaná voda 300 ml);
- roztoky barev (nejlépe v lahvičkách uzavřených pipetami s gumovými plechovkami).
K čištění se nové sklenice vyvaří v 1% roztoku sody (lze použít popel) a poté se umyjí mírnou vodou kyselina chlorovodíková a znovu s vodou. Použité sklo se vloží na 1-2 hodiny do kyseliny sírové, poté se vyvaří v roztoku sody, promyje se vodou a ponoří do 96° lihu. Sklenice se skladují buď v lihu, nebo po setření lihu na sucho, ve sklenicích se zabroušenou zátkou.
Nejčastěji používané barvy jsou: Ziehl karbol fuchsin (zásaditý fuchsin 1 g, krystalická kyselina karbolová 5 g, alkohol 96° 10 ml, glycerin - pár kapek, destilovaná voda 100 ml). Pro barvení se Tsilya fuchsin obvykle ředí 10krát destilovanou vodou (zředěný nebo vodný fuchsin). Methylenová modř (methylenová modř 10 g, alkohol 96° 100 ml). Připravuje se z ní Lefflerova alkalická modř ( alkoholový roztok modrá 30 ml, 1 % draselné nebo sodné alkálie 1 ml, destilovaná voda 100 ml). Karbolová genciánová violeť (připravovaná stejně jako Ziehlův karbolický fuchsin).
Mikroby jsou studovány buď naživo (metody „rozdrcené“ a „zavěšené kapky“) nebo zabité (v barevném přípravku). Živé studie odhalují především schopnost mikrobů se aktivně pohybovat, zatímco obarvené preparáty umožňují dobré studium jejich morfologie.
Existují jednoduché metody barvení, kdy se obvykle používá jedna barva, a složité metody barvení, které odhalují některé rysy fyzikálně-chemické struktury mikrobiální buňky, a proto mají rozdílné diagnostickou hodnotu.
Technika přípravy barevných přípravků je následující. Materiál se nanese na čisté podložní sklíčko a rovnoměrně se rozloží po povrchu ve formě kruhu nebo oválu. Nátěr by měl být poměrně tenký. Pokud se objeví hustý hnis, měli byste nejprve na podložní sklíčko nakapat jednu kapku destilované vody a hmotu v této kapce promíchat. Nátěr se suší na vzduchu. Sklenice se zaschlým přípravkem se odebírá za okraje s velkým ukazováčky zdvihněte nahoru a zafixujte tak, že jej třikrát protáhnete plamenem lihového kahanu (na hranici jeho světlé a tmavé části). Při dostatečné fixaci je cítit mírné pálení v prstech. Zafixovaná šmouha je obarvená. Připraví se několik přípravků, alespoň dva, z nichž jeden je obarven jednoduchým způsobem (methylenová modř Leffler, zředěný Ziehl fuchsin), druhý - podle Gramovy metody.
Loefflerovo barvení:
- Umístěte kousek filtračního papíru na nátěr a nalijte Lefflerův modrý roztok po dobu 3-5 minut;
- přípravek se promyje destilovanou vodou a suší.
Gramovo barvení:
- na nátěr se položí kousek filtračního papíru, na který se na 1-2 minuty nalévá roztok genciánové violeti;
- vypusťte barvu, odstraňte papír a bez oplachování vodou nalijte roztok Lugol po dobu 1 minuty; současně stěr zčerná;
- Lugolův roztok vypusťte a skvrnu vybělte alkoholem ( lepší cesta ponoření drogy do sklenice s alkoholem, dokud nepřestanou vytékat fialové pramínky);
- důkladně opláchněte vodou;
- naplňte nátěr zředěným fuchsinem po dobu 1-2 minut;
- slijte barvu, omyjte přípravek vodou a osušte.
Pohodlná Gramova metoda upravená Sinevem, který navrhl použít předem připravené kousky filtračního papíru, namočené v roztoku genciánové violeti a vysušené. Nejprve se na stěr nanesou 2-3 kapky vody a poté se přiloží tyto kousky papíru. Poté postupujte podle výše uvedeného popisu.
Mikroskopie nátěrů se provádí imerzní čočkou. Při barvení podle Loefflera se obarví všechny mikroby Modrá barva; při barvení Gramovým barvivem je buď modrofialová (Gram-pozitivní mikrobi) nebo červená (Gram-negativní mikrobi).
Omezený počet mikrobů podílejících se na onemocněních zevního oka a jejich charakteristické morfologické znaky často umožňují stanovit správnou mikrobiologickou diagnózu pouze pomocí bakterioskopického vyšetření.
Bakteriologická metoda
Stává se nezbytným v případech, kdy studium nátěrů nestačí ke stanovení typu mikroba nebo je potřeba určit citlivost izolovaného patogenu na antibakteriální léčiva.
S odkazem na podrobný úvod do bakteriologické metody do speciálních příruček o mikrobiologii se zde zastavíme pouze u principů této metody. První fáze práce spočívá v identifikaci jednotlivé druhy mikroby, tj. získat čisté kultury. K tomu se uchylují k mechanické separaci materiálu během setí a k použití médií nejvhodnějších pro vývoj domnělých patogenů (elektivní média). Přeočkováním jednotlivých kolonií pěstovaných na médiu se získá čistá kultura, která se zkoumá pod mikroskopem (připraví se nátěry) a subkultivuje se na diferenciálně diagnostická média pro studium. biochemické vlastnosti patogen.
Vysoké nároky většiny očních patogenních mikrobů v kultivačních podmínkách vedly k převládajícímu použití selektivních médií obsahujících nativní protein pro jejich izolaci. Jedná se například o prostředí Elschnig (jedna část koňské sérum nebo ascitická tekutina a dva díly bujónu), sražené Loefflerovo sérum (tři díly séra a jeden díl bujónu s 1 % peptonu, 0,5 % NaCl a 1 % hroznový cukr), krevní agar Leventhal (agar a 5-10% defibrinovaná krev).
Pro stanovení citlivosti mikrobů na antibiotika je nejjednodušší metodou pro toto stanovení použít speciálně vyrobené kotouče filtračního papíru, namočené v antibiotických roztocích a vysušené ve vakuu. Materiál pro výzkum (hnis, bodka, extrahované cizí těleso) se umístí do sterilní zkumavky s fyziologickým roztokem (1,5-2 ml). Po protřepání se tekutina nalije do Petriho misek, nejlépe do dvou - jedna s cukrovým agarem, druhá s krevním agarem - a protřepáním se rovnoměrně rozdělí po povrchu média. Poté se na povrch agaru umístí disky s různými antibiotiky ve vzdálenosti 2 cm od sebe a od okraje misek. Misky se umístí do termostatu (37 °C) a druhý den se posuzuje stupeň citlivosti mikroba na testovaná antibiotika podle velikosti zóny inhibice růstu kolem disků. Absence zóny inhibice růstu ukazuje na necitlivost mikroba na toto antibiotikum.
Biologická metoda
v oční praxi se používá pouze v případech, kdy z důvodu obtížné diagnózy může být toxigenní vlastnost rozhodující pro určení typu mikroba (např. diferenciální diagnostika difterický bacil a xerózní bacil).
Laboratorní diagnostika virových očních onemocnění
V současné době se provádí speciální studium virů včetně trachomaviru (obr. 77) pomocí jejich kultivace v tkáňových kulturách (kuřecí embryo, myší ascites karcinom atd.) a elektronové mikroskopie.
Rýže. 77. Buněčné inkluze v trachomu.
V klinická praxe K diagnostice trachomu se používá metoda cytologického vyšetření spojivkových seškrabů na přítomnost či nepřítomnost Provacek-Halberstadterových tělísek (inkluzí). K tomu použijte tupý skalpel nebo hranu sklíčka seškrábněte epiteliální kryt spojivky (bez krve), který se aplikuje tenká vrstva na podložním sklíčku, 5 minut sušit na vzduchu a fixovat ponořením na 15-20 minut do sklenice s methylalkohol nebo Nikiforovova směs (ethylether a absolutní alkohol ve stejném množství). Lakování se provádí do 3-4 hodin čerstvě připraveným roztokem barvy Romanovsky-Giemsa (v poměru jedna kapka barvy na 1 ml destilované vody). Poté se přípravek promyje tekoucí vodou, suší se na vzduchu a zkoumá se pod mikroskopem. V tomto případě se obarví jádra epiteliálních buněk růžová barva, protoplazma - ve světle modré, inkluze - v modré, modrofialové (obr. 77). Ty se objevují ve formě kokoidních útvarů umístěných mezi jemnozrnnou hmotou a jsou rozpoznávány jako přenašeči trachomatózního viru. Častěji se vyskytují u čerstvých případů neléčeného trachomu, ale mohou se objevit i u paratrachomální konjunktivitidy.
Výzkum v posledních letech odhalil nová uniforma nakažlivý virové onemocnění oční - epidemická keratokonjunktivitida a cytologické studium spojivkových seškrabů u tohoto onemocnění umožnilo odhalit v epiteliálních buňkách zvláštní inkluze, zcela odlišné od Prsvačkových tělísek (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
aplikace bakteriologická metoda umožňuje izolovat patogen v čisté kultuře z materiálu získaného od pacienta a identifikovat jej na základě studia souboru vlastností. Většina bakterií je schopna kultivace na různých umělých živných médiích (kromě chlamydií a rickettsie), proto má bakteriologická metoda Důležité v diagnostice mnoha infekčních chorob.
Pokud je získán pozitivní výsledek, bakteriologická metoda umožňuje určit citlivost izolovaného patogenu na antimikrobiální léky. Účinnost této studie však závisí na mnoha parametrech, zejména na podmínky pro sběr materiálu a on přeprava do laboratoře.
NA základní požadavky požadavky na výběr a přepravu materiálu pro bakteriologický výzkum zahrnují:
- odběr materiálu před zahájením etiotropní léčby;
- dodržování sterilních podmínek při odběru materiálu;
- technická správnost odběru materiálu;
- dostatečné množství materiál;
- zajištění teplotních podmínek pro skladování a přepravu materiálu;
- minimalizace časového intervalu mezi sběrem materiálu a výsevem na pevné živné půdy.
Transport materiálu do laboratoře by měl být proveden co nejdříve, maximálně však do 1-2 hodin po jeho odběru. Vzorky materiálu musí být uchovávány při určité teplotě; zejména normálně sterilní materiály (krev, mozkomíšní mok) jsou skladovány a dodávány do laboratoře při 37 °C. Nesterilní materiály (moč, výtok dýchací trakt atd.) jsou uloženy na pokojová teplota ne více než 1-2 hodiny nebo ne více než jeden den při 4 °C (podmínky domácí chladničky). Pokud není možné vzorky dopravit do laboratoře v regulovaném časovém rámci, doporučuje se použít transportní média určená k zachování životaschopnosti patogenů za podmínek konzervace.
Krev pro výzkum by měla být pacientovi odebrána v období stoupající tělesné teploty, na začátku nástupu horečky. Doporučuje se vyšetřit 3-4 krevní vzorky odebrané v intervalu 4-6 hodin, což je opodstatněné z hlediska snížení rizika „chybějící“ přechodné bakteriémie a zvýšení schopnosti potvrdit etiologickou roli izolované oportunní mikroflóry z krve, pokud je tato mikroflóra detekována v několika vzorcích žilní krev. Vzorek krve v množství 10 ml pro dospělého a 5 ml pro děti se naočkuje minimálně do dvou lahviček s aerobní a anaerobní mikroorganismy v poměru 1:10. Doporučuje se jedno vyšetření arteriální krve.
Vzít mozkomíšního moku (CSF) je produkován lékařem, když lumbální punkce v množství 1-2 ml do suché sterilní zkumavky. Vzorek je ihned doručen do laboratoře, kde také ihned začíná jeho vyšetření. Pokud to není možné, skladuje se materiál několik hodin při 37 °C. Výrazně zvyšuje množství pozitivní výsledky bakteriologické vyšetření naočkováním 1-2 kapek CSF do zkumavky obsahující polotekuté médium s glukózou a do Petriho misky s „krevním“ agarem. Pro zaslání materiálu použijte izotermické krabice, nahřívací podložky, termosky nebo jakýkoli jiný obal, kde je udržována teplota cca 37 °C.
Excreta pro bakteriologický výzkum se 3-5 g odebere pomocí sterilních dřevěných špachtlí do sterilní nádoby s těsně přiléhajícím víčkem. Vyšetření odebraného materiálu by mělo začít nejpozději o 2 hodiny později. Pokud není možné zahájit vyšetření během této doby, je třeba odebrat malé množství materiálu a umístit jej do vhodného transportního média. Při odběru stolice by se mělo usilovat o zaslání patologických nečistot (hlenu, hnisu, epiteliálních částic atd.) k případnému vyšetření, aby se zabránilo vnesení krevních nečistot, které mají baktericidní vlastnosti, do materiálu.
Ke sběru materiálu lze použít rektální tampony (s vatovou špičkou). Tampón by měl být navlhčen sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného nebo transportním médiem (nikoli však olejovým gelem). Zavádí se do rekta do hloubky 5-6 cm a otočením tamponu jej opatrně vyjmeme a sledujeme výskyt barvy stolice na tamponu. Tampón se umístí do suché zkumavky, pokud studie materiálu začne do 2 hodin, jinak - v transportním médiu.
jsem nasranej(průměrný podíl volně uvolněné moči) v množství 3-5 ml se sbírá do sterilní nádobky po důkladné toaletě zevního genitálu. Sběr moči je lepší ráno.
Žluč odebrané při duodenální intubaci na ošetřovně odděleně po částech A, B a C do tří sterilních zkumavek při dodržení pravidel asepse.
Voda na výplach žaludku shromážděné ve sterilních nádobách v množství 20-50 ml. Je třeba mít na paměti, že výplach žaludku v těchto případech provádějí pouze indiferentní (nemají bakteriostatické resp. baktericidní účinek na mikroorganismy) roztoky - lepší vařící voda(bez přidání sody, manganistanu draselného atd.).
Sputum. Ranní sputum uvolněné během záchvatu kašle se shromažďuje ve sterilní nádobě. Před kašlem si pacient vyčistí zuby a vypláchne ústa převařenou vodou, aby mechanicky odstranil zbytky potravy, deskvamovaný epitel a mikroflóru ústní dutina.
Bronchiální výplachová voda. Při bronchoskopii se nepodává více než 5 ml izotonický roztok chlorid sodný a poté jej odsát do sterilní zkumavky.
Výtok z hltanu, úst a nosu. Materiál z dutiny ústní se odebírá nalačno nebo 2 hodiny po jídle sterilním vatovým tamponem nebo lžičkou ze sliznice a jejích postižených míst u vstupů do vývodů. slinné žlázy, povrch jazyka, z vředů. Pokud je tam film, odstraňte jej sterilní pinzetou. Materiál z nosní dutiny se odebírá suchým sterilním vatovým tamponem, který se zavede hluboko do nosní dutiny. Materiál z nosohltanu se odebírá sterilním zadním faryngeálním vatovým tamponem, který se opatrně zavede nosním otvorem do nosohltanu. Pokud kašel začne, tampon se nevyjme, dokud kašel neskončí. Pro testování záškrtu se současně vyšetřují filmy a hlen z nosu a krku, přičemž se materiál odebírá různými tampony.
Testovaný materiál se naočkuje na pevné živné médium za použití speciální techniky k získání růstu jednotlivých kolonií mikroorganismů, které jsou následně vytříděny, aby se izolovala čistá kultura patogenu.
Určité typy bakterií se izolují pomocí selektivních médií, která inhibují růst cizích mikroorganismů nebo obsahují látky, které stimulují růst určitých patogenních mikrobů.
Mikroorganismy izolované na živných půdách identifikovat, tj. určit jejich druh nebo typ. V Nedávno Pro identifikaci ve zdravotnické praxi se používají mikrotestové systémy, což jsou panely se sadou diferenciálně diagnostických prostředí, což urychluje výzkum. Mikrotestovací systémy se také používají ke stanovení citlivosti mikroorganismů na antimikrobiální léčiva ředěním antibiotika v tekutém živném médiu.
Při posuzování výsledků bakteriologického vyšetření k tomu musí lékař přihlédnout negativní výsledek neznamená vždy nepřítomnost patogenu a může být spojeno s užíváním antimikrobiálních léků, vysokou mikrocidní aktivitou krve a technickými chybami. Detekce patogenního mikroba v materiálu od pacienta bez souvislosti s klinický obraz možné v případě rekonvalescenčního, zdravého nebo přechodného přenosu bakterií.
Izolace od krve podléhá všem pravidlům asepse oportunní mikroorganismy(Staphylococcus epidermidis, coli) a dokonce i saprofyty by měly být považovány za projev bakteriémie, zvláště pokud se tyto mikroby nacházejí ve více než jednom vzorku materiálu nebo v různých substrátech (krev, moč), protože se snížením imunoreaktivity těla tyto a další „ nepatogenní“ mikroorganismy mohou být patogeny infekční procesy včetně sepse.
Existuje určitá obtíž interpretace výsledků bakteriologického vyšetření nesterilních médií, totiž důkaz etiologické role oportunních mikroorganismů. V tomto případě se berou v úvahu takové ukazatele, jako je typ izolovaných kultur, počet mikrobiálních buněk daného typu v materiálu, jejich opakovaná izolace během onemocnění, přítomnost monokultury nebo asociace mikroorganismu.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Cílová:
1. Zvládnout třetí etapu bakteriologické metody diagnostiky infekčních onemocnění.
Vědět:
1. Účel a posloupnost provádění stupně III bakteriologické metody izolace čistých kultur aerobních mikroorganismů.
2. Pojem „typ“. Typová kritéria.
3. Metabolismus mikroorganismů a jeho vlastnosti.
4. Princip a metody studia biochemické aktivity mikroorganismů.
5. Účel a metody stanovení antibiogramů mikroorganismů v klinické mikrobiologii.
Být schopný:
1. Určete čistotu studované kultury.
2. Zasejte zkoumanou plodinu na „pestrou řadu“, médium pro určení mobility.
3. Stanovte antibiogram testované kultury pomocí diskové difúzní metody.
1. Účel a posloupnost provádění stupně III bakteriologické metody izolace aerobů.
2. Metody stanovení čistoty studované kultury.
3. Klasifikace mikroorganismů podle druhu výživy. Příjezdové mechanismy živin do bakteriální buňky.
4. Enzymy mikroorganismů; jejich význam v buněčném metabolismu. Konstitutivní a indukovatelné enzymy.
5. Účel a metody studia biochemické aktivity mikroorganismů v mikrobiologické praxi.
6. Přímé a nepřímé metody stanovení pohyblivosti mikroorganismů.
7. Disková difúzní metoda stanovení antibiogramů: podstata, způsob tuhnutí.
Úkoly prováděné během lekce (UIRS):
1. Proveďte třetí etapu bakteriologické metody pro izolaci čistých kultur aerobů:
Stanovte čistotu izolované kultury;
Zasejte čistou zkušební plodinu do krátké „pestré řady“;
Testovanou kulturu vysejte do sloupce polotekutého agaru;
Stanovte antibiogram testované kultury pomocí diskové difúzní metody.
2. Seznamte se se systémy pro biochemickou identifikaci bakterií.
Směrnice k dokončení výzkumného úkolu:
1. Provedení nádrže III. etapy. metoda izolace čistých kultur aerobů:
1.1. Stanovení čistoty izolované kultury.
O čistotě kultury svědčí rovnoměrnost růstu a přítomnost mikroorganismů stejného druhu v přípravku. Proto při makroskopickém studiu růstu, všímejte si jeho intenzity (nedostatečný, střední, hojný), průhlednosti, barvy, věnujte pozornost jeho uniformitě. Připravte fixní preparát dotykem spodní, střední a horní části kloubu smyčkou, Gramovým barvivem a mikroskopem. Získané výsledky zaznamenejte do protokolu a udělejte závěr. Pokud je kultura, kterou jste izolovali, čistá, pokračujte dalším výzkumem.
1.2. Výsev plodin do „pestrého řádku“.
Naočkujte čistou testovací kulturu na „pestrou řadu“: polotekuté médium Hiss s indikátorem BP, sacharidy (glukóza, laktóza, mannitol) a MPB.
Přeočkování do polotekutého média se provádí bakteriologickou jehlou nebo nádrží. smyčkou o průměru 1 mm vstříkněte do tloušťky agaru, nedosahující na dno zkumavky » 1 mm. Při přeočkování do kapalného média se smyčka s biomasou zkoumané kultury ponoří do kapaliny, rozetře se o stěnu zkumavky a smyje se. Poté se mezi stěnu zkumavky a zátku umístí indikátorové papírky pro stanovení indolu a sirovodíku (H 2 S), aniž by se okraje zkumavky a zátky namočily. živné médium!
Základem studia biochemických vlastností mikroorganismů za účelem jejich identifikace je stanovení meziproduktů a (nebo) konečných produktů metabolismu. Taxonomický význam mají sacharolytické a proteolytické vlastnosti bakterií, které se zjišťují na diferenciálně diagnostických médiích, která jsou součástí „pestré řady“.
Definice sacharolytické vlastnosti vyrobeno na médiích Hiss. Jejich složení: peptonová voda, 1% sacharid, Andrede indikátor (BP nebo jiné), 0,3-0,5% agar, pokud je médium polotekuté; pokud je médium kapalné, pak se do zkumavek spustí plováky (krátké skleněné zkumavky zatavené na jednom konci).
Kritéria pro záznam výsledků:
· barva média se nemění - kultura nefermentuje sacharidy;
· mění se barva média (v případě použití indikátoru Andrede - ze světle žluté na červenou, BP - z růžové na modrou atd.) - kultura fermentuje sacharidy za vzniku kyselých produktů ( organické kyseliny);
· barva média se mění a v médiu se objevují bublinky plynu nebo plavou - kultura fermentuje sacharidy za vzniku kyselých a plynných produktů.
Definice proteolytické vlastnosti se vyrábí pomocí peptonové vody (PV) nebo masového peptonového bujónu (MPB), přičemž se bere v úvahu tvorba konečných produktů metabolismu bílkovin (pepton, aminokyseliny) - indol, H 2 S, v některých případech i amoniak.
Vznik indolu je doprovázen růžovým zbarvením indikátorového papírku namočeného v roztoku kyseliny šťavelové (Morelova metoda); tvorba sirovodíku - zčernání indikátorového papírku impregnovaného octanem olovnatým; tvorba čpavku - zmodrání lakmusového papírku.
MPB a PV jsou také určeny ke studiu vzorců růstu mikroorganismů v kapalném živném médiu. Mikrobiální růst může být ve formě difúzního zákalu, sedimentu na dně nebo filmu na povrchu média.
1.3. Vysetí testované kultury do sloupce polotekutého agaru.
Testovanou kulturu naočkujte do sloupce polotekutého agaru propíchnutím pomocí tanku. jehly nebo nádrž. smyčky o průměru 1 mm.
Výsev kultury do sloupce polotekutého agaru umožňuje určit její vztah k molekulárnímu kyslíku, a tím nepřímo získat představu o způsobu získávání energie. Kritérium pro účetnictví a hodnocení je povaha růstu: růst pouze shora prostředí - kultura je aerobní, pouze ve spodní části prostředí – anaerobní; shora a injekcí - fakultativní anaerobní; růst v určité vzdálenosti od povrchu média – mikroaerofyl.
Tímto způsobem výsevu lze u fakultativně anaerobních mikroorganismů stanovit motilitu. Růst je striktně podle injekce - kultura je nepohyblivá, difuzní růst je pohyblivý.
1.4. Stanovení antibiogramu studované kultury metodou diskové difúze.
Kliničtí lékaři provádějí etiotropní antimikrobiální chemoterapii s ohledem na výsledky studie. metoda, která spolu s izolací patogenu z klinického materiálu a jeho identifikací zahrnuje stanovení citlivosti na antimikrobiální chemoterapii. Pro stanovení citlivosti v Rusku se nejčastěji používá metoda diskové difúze (DDM).
Pro stanovení antibiogramu připravte suspenzi testovací kultury ve sterilním prostředí fyziologický roztok a upraví se na 0,5 McFarlandova zákalu (1,5 x 108 CFU/ml). K naočkování použijte sterilní vatový tampón, který se ponoří do zkumavky se suspenzí, otáčejte jí, aby byla rovnoměrně nasycená a poté důkladně přitlačte na suchou stěnu zkumavky nad hladinou kapaliny otáčením. Vysévejte kulturu na kelímek s AGV médiem, aplikujte tahy ve třech směrech pod úhlem 60°, pokaždé otočte kelímkem kolem jeho osy. Nakonec proveďte několik rotačních pohybů tampónem podél okrajů povrchu agaru. Poté nechte plodiny několik minut schnout při pokojové teplotě v kelímcích s uzavřenými víčky. Aplikujte antibiotické terčíky nejpozději 15 minut po inokulaci pomocí sterilní pinzety nebo automatického dávkovače. Vzdálenost od disku k okraji šálku a mezi disky by měla být 15-20 mm. Na jeden kelímek o průměru 100 mm se tedy neumístí více než 6 kotoučů. Každý disk by měl být jemně přitlačen pinzetou, aby byl zajištěn jeho kontakt s živnou půdou. Ihned po přiložení kotoučů označte kelímky a postavte je dnem vzhůru do termostatu na 37° na 18-20 hodin.
Technika bakteriologického výzkumu. Izolace patogenu z krve (krevní kultura) je raná metoda diagnostika nemocí. Bakterémie u pacientů s tyfus-paratyfus se objevuje na konci inkubační doba a nemizí během celého horečnatého období onemocnění a při relapsech. Výsledky bakteriologického vyšetření do určité míry závisí na načasování odběru materiálu a množství naočkované krve. Čím dříve je hemokultura provedena od začátku onemocnění, tím větší je pravděpodobnost detekce patogenu. V prvním týdnu břišního tyfu je pacientovi odebrána krev z loketní žíly v množství 10 ml, více pozdní termíny a během relapsů - 20 ml.
První den studia krev se naočkuje v poměru 1:10 do jedné z tekutá média. Uvedený poměr musí být přísně dodržován, protože při menším zředění krve mohou mikroby zemřít kvůli jeho baktericidnímu účinku. K naočkování použijte: 10% nebo 20% roztok žlučového bujónu, nalitý do 50-100ml lahviček, masovo-peptonový bujón s přídavkem 1% glukózy, sterilní destilovanou vodu - podle metody N. N. Klodnitského, ve které se lýza červených krvinek, produkty jejich rozpadu slouží jako dobrá živná půda pro množení bakterií. Můžete použít i sterilní vodu z kohoutku. nejlepší skóre získaný naočkováním materiálu do žlučového vývaru. Pokud není možné kultivovat krev na místě, je sérum a sraženina nebo citrátová krev (10 ml krve nalité do zkumavky obsahující 2 ml 5% sterilního citrátu sodného) odeslány do laboratoře. Krevní sraženina se v laboratoři rozdrtí a naočkuje do jednoho z uvedených médií. Láhve jsou umístěny v termostatu při teplotě 37°C.
Druhý den studia. Po 14-24 hodinách od začátku studie se materiál naočkuje do Petriho misky na médium Endo nebo médium s eosinem a methylenovou modří (Levinovo médium). Ploskirevovo médium se nedoporučuje používat k setí, protože bacily tyfu a paratyfu nalezené v krvi jsou obligátní paratrofy podle typu výživy a nemění tento typ výživy okamžitě na metatrofní (tj. mrtvé organické substráty). Proto na tomto médiu obsahujícím soli žlučových kyselin, bacily břišního tyfu rostou velmi špatně nebo vůbec. Pokud po první inokulaci nedojde k růstu bakterií, provedou se další inokulace po 48, 72 hodinách a 5. a 10. den. Pokud se patogen nepodařilo izolovat, je dána záporná odpověď. V pochybných případech se doporučuje provádět plodiny pravidelně - jednou za 3-4 dny - až do 24. dne od okamžiku odběru materiálu. 7. den je stále uvedena záporná odpověď.
Třetí den studia. Jsou identifikovány „podezřelé“ kolonie pěstované na médiu Endo a Levin (na médiu Endo jsou kolonie patogenních mikrobů bezbarvé), pro které jsou 2-3 kolonie subkultivovány na šikmém agaru a Resselově médiu.
Čtvrtý den výzkumu. Výsledky inokulace na Resselovo médium jsou zohledněny a zaznamenány a morfologické vlastnosti izolovaných kultur jsou studovány v Gramově obarveném nátěru. Motilita se zjišťuje - přítomnost nebo nepřítomnost bičíků - v zavěšené nebo rozdrcené kapce odebrané ze 4-6hodinové kultivační půdy. K tomu se agarová kultura (jedna smyčka) naočkuje do 1 ml mírně zahřátého bujónu. Vybrané kultury (2-3 zkumavky) se přeočkují na Hissovo médium s mannitolem, sacharózou a šikmým agarem a dále do 2 zkumavek s masovo-peptonovým bujónem, ve kterých jsou proužky filtračního papíru navlhčené speciálními roztoky pro stanovení vodíku sulfid a indol (nepřeložené) jsou umístěny pod zátkami.
Pátý den výzkumu. Změny se zaznamenávají do rozšířeného „pestrého řádku“. Pokud je přítomna tvorba plynu, provede se aglutinační reakce se směsí sér Salmonella. Na pozitivní reakce proveďte aglutinační reakci s O- a H-sérem a poskytněte konečnou odpověď na základě souhrnu všech příznaků.
Izolace myelokultury se provádí výsevem výsledného tečkovaného kostní dřeně do 3-5 ml sterilní hovězí žluči nebo do 25-30 ml 10% žlučového bujónu, umístěte do termostatu a druhý den subkultivujte na Endo nebo Wilson-Blair media. V budoucnu jsou fáze výzkumu stejné.
Izolace bakterií z výkalů. Od 8. do 10. dne nemoci, častěji od třetího týdne, se u pacientů s břišním tyfem, paratyfem vylučují bakterie stolicí. Pro výzkum odeberte poslední porce výkalů tekuté konzistence, emulgujte v izotonickém roztoku chloridu sodného (v poměru 1:10) a nechte 30 minut, dokud se neusadí velké částice. Pro setí se kapka materiálu odebere z povrchu kapaliny.
První den studie se materiál naočkuje na obohacovací médium - žlučový bujón, hořčík, Mullerovo, Kaufmanovo médium - a umístí se do termostatu. Druhý den studie se obohacovací médium naočkuje na misky s médiem Ploskirev, Endo nebo Levin a Wilson-Blair (bismut-sulfit-agar). Následně jsou fáze studie stejné jako při izolaci hemokultury.
Izolace bakterií skupiny tyfus-paratyfus z moči se nejlépe provádí od druhého do třetího týdne nemoci. Před odběrem materiálu omyjte vnější otvor sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného. močová trubice; U žen je lepší odebírat moč katétrem. Pro výzkum se odebírá 20-30 ml moči. Po odstředění se sediment naočkuje do 2 misek Ploskirevovým médiem nebo vizmut-siřičitanovým agarem. Supernatant se naočkuje na obohacovací médium (10% žlučový bujón) a umístí se do termostatu na 24 hodin, poté se naočkuje do 2 šálků jednoho z volitelných médií. Izolované kolonie se identifikují obvyklým způsobem.
Studium duodenálního obsahu - žluč. Metoda se častěji používá ve fázi rekonvalescence. Žluč se shromažďuje během sondování do sterilních zkumavek. Obsah duodena se naočkuje do lahviček s 50 ml bujónu a zbývající část materiálu se spolu s naočkováním umístí do termostatu při 37 °C. Další den se naočkuje do 2 kelímků hustým diferenčním médiem . Izolované kolonie se identifikují pomocí popsané metody.
Vysoce citlivý a slibný v včasná diagnóza tyfus a paratyfus je imunofluorescenční metoda, která vyšetřuje krev od prvních dnů onemocnění, stolici od 10. dne, obsah dvanáctníku od 10. normální teplota těla. Bakterie tyfus-paratyfus jsou označeny specifickými fluorescenčními séry, která jsou následně stanovena fluorescenční mikroskopií. Metoda umožňuje diagnostikovat onemocnění 10-12 hodin od začátku studie.
Sérologická diagnostika tyfus-paratyfus. Od druhého týdne onemocnění se v krvi pacientů objevují specifické protilátky, které lze stanovit pomocí Widalovy reakce. Při břišním tyfu a paratyfu se hromadí O- a následně H-aglutininy. V průběhu onemocnění jsou někdy detekovány Vi-aglutininy, které však na rozdíl od nosičů nemají žádnou diagnostickou hodnotu. Stanovení specifických aglutininů na původce břišního tyfu a paratyfu (Vidalova reakce) v krvi pacientů může pomoci při stanovení diagnózy, a to jak u akutní období nemoci a během rekonvalescence.
U salmonelózy je pomocnou diagnostickou metodou Widalova reakce. Je třeba připomenout, že se často setkáváme s formami onemocnění se slabě vyjádřenou imunologickou odpovědí. Zvláště často jsou u pacientů léčených antibiotiky pozorovány nízké titry aglutininů, dokonce i jejich absence.
U Widalovy reakce se odeberou 1-3 ml krve z prstu nebo loketní žíly do sterilní zkumavky. Aby se urychlilo srážení krve, umístí se na 30 minut do termostatu. Sražená krev se krouží skleněnou pipetou a umístí se do chladničky, dokud se neobjeví čiré, usazené sérum. Sraženina se používá ke kultivaci (krevní kultivaci). Aglutinační reakce se provádí s H- a O-tyfus, A- a B-paratyfus diagnosticum. Sérum se ředí, počínaje titrem 1:100 až 1:800, podle následujícího postupu. Do zkumavky se nalije 9,9 ml sterilního izotonického roztoku chloridu sodného a 0,1 ml testovacího séra, aby se dosáhlo ředění 1:100. 5 ml naředěného séra, každý po 1 ml, se nalije do 4 zkumavek (podle počtu antigenů použitých ve Widalově reakci) a do jedné sloužící jako kontrola séra. Ze zbývajících 5 ml séra (ředění 1:100) se vylije 1 ml a do 4 ml se přidají 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného a získá se ředění 1:200. 4 ml z ředění 1:200 se také nalijí do 4 zkumavek po 1 ml a do zbývajících 4 ml se znovu přidají 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného, aby se dosáhlo ředění 1:400. Následná ředění (1:800, 1:1600) se připraví tak, jak je popsáno. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 4 zkumavek, které slouží jako kontrola antigenu. 1-2 kapky odpovídajících diagnostických látek se nakapávají do všech zkumavek, kromě těch, které slouží jako kontrola séra. Stojan se zkumavkami se protřepe a umístí do termostatu při 37 ° C na 24 hodin H-aglutinace (hrubozrnná) nastává po 2 hodinách, O-aglutinace (jemnozrnná) - mnohem později. Intenzita reakce je zaznamenána po 24 hodinách. Diagnostický titr Widalovy reakce je zředěn nejméně 1:200 v přítomnosti klinických projevů.
Je třeba mít na paměti, že tato reakce může být pozitivní u jiných onemocnění - tuberkulóza, malárie, brucelóza, zhoubné novotvary a některé stavy (těhotenství). Widalova reakce může být pozitivní u zdravých jedinců (každodenní reakce), u očkovaných a v minulosti prodělaných onemocnění (anamnestická reakce). Pro zvýšení specificity Widalovy reakce Fischer navrhl ředění séra hypertonický roztok chlorid sodný (2,9 a 5,8 %). To vede k oslabení nebo eliminaci skupinových reakcí. Hodnota aglutinační reakce se zvyšuje s opakovanými studiemi, kdy je stanoven vzestup titru protilátek s dynamikou onemocnění. U paratyfu A může být Widalova reakce negativní nebo titr specifických protilátek je nižší než skupinová protilátka.
V minulé roky pro uznání střevní skupina onemocnění se široce používá pasivní hemaglutinační reakce (RPHA) s parciálními antigeny tyfových bakterií. RPGA má vysokou senzitivitu a specificitu a je pozitivní od 5. dne nemoci. Minimální diagnostický titr pro pacienty s břišním tyfem, paratyfem a salmonelózou s O-antigenem je 1:200. Reakce se monitoruje v průběhu času, aby se určil nárůst titru protilátky.
Metody laboratorní diagnostika přenos bakterií u břišního tyfu a paratyfu. Bakteriologické vyšetření stolice, moči a duodenálního obsahu se provádí podle obecně uznávaných metod. Nejlepších výsledků se dosáhne při použití seleničitanových médií.
Vzhledem k četnosti bakteriální izolace často není možné izolovat patogen. U převážné většiny přenašečů bacilu břišního tyfu se nacházejí mikrobi obsahující Vi-antigen, a proto se Vi-protilátky objevují v krvi akutních i chronických přenašečů (v krvi pacientů jsou méně časté). Diagnostický titr reakce je 1:20 nebo vyšší. Paralelně s Vi-aglutinační reakcí (se zahřátým sérem) se provádí Widalova reakce (s nativním sérem) s H- a O-tyfoidními diagnostiky. V sérech nosičů tyfových bakterií se H-protilátky v titru 1:200 až 1:800 nacházejí v 60-80 % případů. Přítomnost kombinace H- a Vi-protilátek má zvláštní diagnostický význam při identifikaci přenašečů bacilu tyfu.
Z doplňkové metody Výzkum pro detekci přenosu bacilu tyfu používá kožní alergický test s typhinem a také RPHA s Vi-antigenem.
Důležitou podmínkou úspěchu boje proti tyfově-paratyfovým onemocněním je tedy včasná a úplná identifikace a neutralizace zdroje infekcí. V současné době břišním tyfem se vyskytuje sporadicky. Průběh onemocnění je přitom kratší a není provázen všemi typickými znaky klasické formy, což komplikuje klinické rozpoznání.
V souvislosti s výše uvedeným nabývá na významu komplexní laboratorní vyšetření.
