Bakteriologinio metodo naudojimas leidžia išskirti patogeną grynoje kultūroje iš medžiagos, gautos iš paciento, ir nustatyti jį remiantis savybių rinkinio tyrimu. Dauguma bakterijų gali augti įvairiose dirbtinėse maistinėse terpėse (išskyrus chlamidijas ir riketsijas), todėl bakteriologinis metodas turi svarbu diagnozuojant daugelį infekcinių ligų.
Jei gaunamas teigiamas rezultatas, bakteriologinis metodas leidžia nustatyti izoliuoto patogeno jautrumą antimikrobiniams vaistams. Tačiau šio tyrimo veiksmingumas priklauso nuo daugelio parametrų, ypač nuo medžiagos rinkimo sąlygos ir jį transportavimasį laboratoriją.
KAM pagrindiniai reikalavimai medžiagos parinkimo ir transportavimo reikalavimai bakteriologiniai tyrimai, apima:
- medžiagos paėmimas prieš etiotropinio gydymo pradžią;
- sterilių sąlygų laikymasis renkant medžiagą;
- techninis medžiagų surinkimo teisingumas;
- pakankamas kiekis medžiaga;
- temperatūros sąlygų užtikrinimas medžiagoms laikyti ir transportuoti;
- sumažinant laiko intervalą nuo medžiagos surinkimo iki sėjos ant kietų maistinių medžiagų.
Medžiagos transportavimas į laboratoriją turi būti atliktas kuo greičiau, bet ne vėliau kaip per 1-2 valandas nuo jos paėmimo. Medžiagos pavyzdžiai turi būti laikomi tam tikroje temperatūroje; visų pirma, paprastai sterilios medžiagos (kraujas, smegenų skystis) laikomos ir pristatomos į laboratoriją 37 °C temperatūroje. Nesterilios medžiagos (šlapimas, išskyros kvėpavimo takai ir tt) saugomi adresu kambario temperatūra ne ilgiau kaip 1-2 valandas arba ne ilgiau kaip parą 4 °C temperatūroje (buitinio šaldytuvo sąlygos). Jei neįmanoma pristatyti mėginių į laboratoriją per nustatytą laiką, rekomenduojama naudoti transportavimo terpę, skirtą patogenų gyvybingumui išsaugoti konservavimo sąlygomis.
Kraujas tyrimams reikia paimti iš paciento kūno temperatūros kilimo laikotarpiu, prasidėjus karščiavimui. Rekomenduojama tirti 3-4 kraujo mėginius, paimtus 4-6 valandų intervalu, o tai pateisinama mažinant laikinosios bakteriemijos „trūkimo“ riziką ir didinant galimybę patvirtinti izoliuotos oportunistinės mikrofloros etiologinį vaidmenį. iš kraujo, jei ši mikroflora aptikta keliuose mėginiuose veninio kraujo. 10 ml suaugusiųjų ir 5 ml vaikų kraujo mėginys pasėjamas mažiausiai į du buteliukus su aerobiniais ir. anaerobiniai mikroorganizmai santykiu 1:10. Patartina atlikti vieną arterinio kraujo tyrimą.
Imk cerebrospinalinis skystis (CSF) gamina gydytojas, kai juosmens punkcija 1-2 ml į sausą sterilų mėgintuvėlį. Mėginys nedelsiant pristatomas į laboratoriją, kur nedelsiant pradedamas ir jo tyrimas. Jei tai neįmanoma, medžiaga keletą valandų laikoma 37 °C temperatūroje. Žymiai padidina kiekį teigiamų rezultatų bakteriologinis tyrimas, 1-2 lašus CSF įlašinant į mėgintuvėlį, kuriame yra pusiau skysta terpė su gliukoze ir į Petri lėkštelę su „kraujo“ agaru. Medžiagai siųsti naudokite izotermines dėžutes, kaitinimo pagalvėles, termosus ar bet kokią kitą pakuotę, kurioje palaikoma apie 37 °C temperatūra.
Ekskrementai bakteriologiniams tyrimams steriliomis medinėmis mentelėmis paimama 3-5 g į sterilų indą su sandariu dangteliu. Surinktos medžiagos tyrimas turi prasidėti ne vėliau kaip po 2 valandų. Jei per šį laiką tyrimo pradėti neįmanoma, reikia surinkti nedidelį kiekį medžiagos ir sudėti į tinkamą transportavimo terpę. Renkant išmatas reikia stengtis, kad patologinės priemaišos (gleivės, pūliai, epitelio dalelės ir kt.) būtų išsiųsti tyrimams, jei tokių yra, vengiant kraujo priemaišų, turinčių baktericidinių savybių, patekimo į medžiagą.
Medžiagai rinkti galima naudoti tiesiosios žarnos tamponus (su medvilniniu antgaliu). Tamponą reikia sudrėkinti steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu arba transportavimo terpe (bet ne aliejiniu geliu). Jis įvedamas į tiesiąją žarną iki 5-6 cm gylio ir, pasukant tamponą, atsargiai jį išimame, stebint išmatų spalvą ant tampono. Tamponas dedamas į sausą mėgintuvėlį, jei medžiagos tyrimas pradedamas per 2 valandas, kitu atveju - į transportavimo terpę.
Aš pykstu(vidutinė laisvai išsiskiriančio šlapimo dalis) 3-5 ml surenkama į sterilų indą po kruopštaus išorinių lytinių organų tualeto. Pageidautina šlapimą rinkti ryte.
Tulžis surenkami dvylikapirštės žarnos intubacijos metu gydymo kabinete atskirai A, B ir C porcijomis į tris sterilius mėgintuvėlius, laikantis aseptikos taisyklių.
Skrandžio plovimo vanduo surenkami į sterilius stiklainius po 20-50 ml. Reikia turėti omenyje, kad tokiais atvejais skrandžio plovimą atlieka tik abejingi (neturintys bakteriostatinio ar baktericidinis poveikis ant mikroorganizmų) tirpalai – geriau virintas vanduo(nepridedant sodos, kalio permanganato ir kt.).
Skrepliai. Rytiniai skrepliai, išsiskiriantys kosulio priepuolio metu, surenkami į sterilų indelį. Prieš kosulį pacientas išsivalo dantis ir išskalauja burną virintu vandeniu, kad mechaniškai pašalintų maisto likučius, suragėjusį epitelį ir mikroflorą. burnos ertmė.
Bronchų plovimo vanduo. Atliekant bronchoskopiją, į sterilų mėgintuvėlį įšvirkščiama ne daugiau kaip 5 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo, po to išsiurbiama.
Išskyros iš ryklės, burnos ir nosies. Medžiaga iš burnos ertmės imama nevalgius arba praėjus 2 valandoms po valgio steriliu medvilniniu tamponu ar šaukštu nuo gleivinės ir jos pažeistų vietų prie kanalų įėjimų. seilių liaukos, liežuvio paviršius, nuo opų. Jei yra plėvelė, nuimkite ją steriliu pincetu. Medžiaga iš nosies ertmės paimama sausu steriliu vatos tamponu, kuris įkišamas giliai į nosies ertmę. Medžiaga iš nosiaryklės paimama steriliu užpakalinės ryklės vatos tamponu, kuris per nosies angą atsargiai įkišamas į nosiaryklę. Jei prasideda kosulys, tamponas nenuimamas, kol kosulys nesibaigia. Norint nustatyti, ar nėra difterijos, vienu metu tiriamos plėvelės ir gleivės iš nosies ir gerklės, medžiaga paimama skirtingais tamponais.
Bandomoji medžiaga pasėjama ant kietos maistinės terpės naudojant specialios technikos gauti atskirų mikroorganizmų kolonijų augimą, kurios vėliau atrenkamos, siekiant išskirti gryną patogeno kultūrą.
Tam tikros bakterijų rūšys išskiriamos naudojant selektyvias terpes, kurios slopina svetimų mikroorganizmų augimą arba turi medžiagų, skatinančių tam tikrų patogeninių mikrobų augimą.
Mikroorganizmai, išskirti maistinėse terpėse nustatyti, t.y. nustatyti jų rūšį ar tipą. IN Pastaruoju metu Identifikavimui sveikatos priežiūros praktikoje naudojamos mikrotestų sistemos, kurios yra skydai su diferencinės diagnostikos aplinkų rinkiniu, kuris pagreitina tyrimą. Mikrotestų sistemos taip pat naudojamos mikroorganizmų jautrumui antimikrobiniams vaistams nustatyti, skiedžiant antibiotiką skystoje maistinėje terpėje.
Vertindamas bakteriologinio tyrimo rezultatus gydytojas turi į tai atsižvelgti neigiamas rezultatas ne visada reiškia patogeno nebuvimą ir gali būti susiję su antimikrobinių vaistų vartojimu, dideliu kraujo mikrocidiniu aktyvumu ir techninėmis klaidomis. Patogeninio mikrobo aptikimas medžiagoje iš paciento be ryšio su klinikinis vaizdas galimas sveikstančių, sveikų ar trumpalaikių bakterijų pernešimo atveju.
Oportunistinių mikroorganizmų (staphylococcus epidermidis) išskyrimas iš kraujo, laikantis visų aseptikos taisyklių. coli) ir net saprofitai turėtų būti laikomi bakteriemijos pasireiškimu, ypač jei šie mikrobai randami daugiau nei viename medžiagos mėginyje arba skirtinguose substratuose (kraujyje, šlapime), nes sumažėjus organizmo imunoreaktyvumui, šie ir kiti “ nepatogeniški“ mikroorganizmai gali būti patogenai infekciniai procesai, įskaitant sepsį.
Yra tam tikras sunkumas nesterilių terpių bakteriologinio tyrimo rezultatų interpretavimas o oportunistinių mikroorganizmų etiologinio vaidmens įrodymas. Šiuo atveju atsižvelgiama į tokius rodiklius kaip izoliuotų kultūrų tipas, tam tikro tipo mikrobų ląstelių skaičius medžiagoje, pakartotinis jų išskyrimas ligos eigoje, monokultūros ar mikroorganizmų asociacijos buvimas. .
Juščiukas N.D., Vengerovas Yu.Ya.
Bakteriologinio tyrimo technika. Sukėlėjo išskyrimas iš kraujo (kraujo pasėlis) yra ankstyvas metodas ligų diagnostika. Bakteremija pacientams, sergantiems vidurių šiltine-paratifoine liga, atsiranda pabaigoje inkubacinis periodas ir neišnyksta per visą febrilinį ligos laikotarpį bei recidyvų metu. Bakteriologinio tyrimo rezultatai tam tikru mastu priklauso nuo medžiagos paėmimo laiko ir pasėto kraujo kiekio. Kuo anksčiau nuo ligos pradžios atliekama kraujo pasėlis, tuo didesnė tikimybė aptikti sukėlėją. Pirmąją vidurių šiltinės savaitę paciento kraujas iš kubitinės venos paimamas 10 ml, daugiau vėlyvos datos o recidyvų metu – 20 ml.
Pirmąją studijų dieną kraujas pasėjamas santykiu 1:10 į vieną iš skystos terpės. Būtina griežtai laikytis nurodyto santykio, nes esant mažesniam kraujo praskiedimui, mikrobai gali mirti dėl baktericidinio poveikio. Inokuliacijai naudokite: 10% arba 20% tulžies sultinio tirpalą, supiltą į 50-100 ml butelius, mėsos-peptono sultinį su 1% gliukozės, sterilų distiliuotą vandenį - pagal N. N. Klodnickio metodą, kuriame lizė. atsiranda raudonųjų kraujo kūnelių, jų skilimo produktai yra naudingi maistinė terpė bakterijų augimui. Taip pat galite naudoti sterilų vandenį iš čiaupo. geriausi balai gaunamas sėjant medžiagą į tulžies sultinį. Jei nėra galimybės vietoje pasėlioti kraujo, serumas ir krešulys arba citratinis kraujas (10 ml kraujo supilama į mėgintuvėlį, kuriame yra 2 ml 5 % sterilaus natrio citrato) siunčiamas į laboratoriją. Kraujo krešulys susmulkinamas laboratorijoje ir pasėjamas į vieną iš išvardytų terpių. Buteliai dedami į 37°C temperatūros termostatą.
Antroji studijų diena. Praėjus 14–24 valandoms nuo tyrimo pradžios, medžiaga pasėjama Petri lėkštelėje ant Endo terpės arba terpės su eozinu ir metileno mėlynuoju (Levino terpe). Nerekomenduojama sėjai naudoti Ploskirev terpės, nes kraujyje esančios vidurių šiltinės-paratifo bacilos yra privalomi paratrofai pagal mitybos tipą ir ne iš karto pakeičia šios rūšies mitybą į metatrofinį (ty negyvus organinius substratus). Todėl šioje terpėje, kurioje yra druskų tulžies rūgštys, vidurių šiltinės bacilos auga labai prastai arba visai neauga. Jei po pirmosios inokuliacijos bakterijų neauga, vėlesnės vakcinacijos atliekamos po 48, 72 valandų ir 5 bei 10 dienų. Jei sukėlėjo nepavyko išskirti, pateikiamas neigiamas atsakymas. Abejotinais atvejais pasėlius rekomenduojama atlikti periodiškai - kartą per 3-4 dienas - iki 24 dienos nuo medžiagos paėmimo. Neigiamas atsakymas vis tiek pateikiamas 7 dieną.
Trečia studijų diena. Nustatomos „įtartinos“ kolonijos, auginamos Endo ir Levin terpėje (Endo terpėje patogeninių mikrobų kolonijos yra bespalvės), kurių 2-3 kolonijos subkultūrinamos ant pasvirusio agaro ir Ressel terpės.
Ketvirtoji tyrimo diena. Atsižvelgiama į inokuliacijos Ressel terpėje rezultatus ir jie registruojami, o išskirtų kultūrų morfologinės savybės tiriamos tepinėliais, dažytais pagal gramą. Judrumas – žvynelių buvimas ar nebuvimas – nustatomas pakabintame arba susmulkintame laše, paimtame iš 4–6 valandų sultinio kultūros. Norėdami tai padaryti, agaro kultūra (viena kilpa) pasėjama 1 ml šiek tiek pašildyto sultinio. Atrinktos kultūros (2-3 mėgintuvėliai) persėjamos į Hiss terpę su manitoliu, sacharoze ir slankiuoju agaru, taip pat į 2 mėgintuvėlius su mėsos-peptono sultiniu, kuriuose filtravimo popieriaus juostelės suvilgytos specialiais vandenilio nustatymo tirpalais. sulfidas ir indolas (išlankstyti) dedami po kamščiais „marga eilė“).
Penkta tyrimų diena. Pakeitimai įrašomi išplėstoje „margoje eilutėje“. Jei susidaro dujos, su Salmonella serumų mišiniu atliekama agliutinacijos reakcija. At teigiama reakcija atlikti agliutinacijos reakciją su O ir H serumais ir pateikti galutinį atsakymą, pagrįstą visų požymių visuma.
Mielokultūros išskyrimas atliekamas sėjant gautą tašką kaulų čiulpai 3-5 ml sterilios galvijų tulžies arba 25-30 ml 10 % tulžies sultinio, įdėti į termostatą ir kitą dieną subkultūrinti ant Endo arba Wilson-Blair terpės. Ateityje tyrimų etapai bus tokie patys.
Bakterijų išskyrimas iš išmatų. Nuo 8 iki 10 ligos dienos, dažniau nuo trečios savaitės, sergant vidurių šiltine, paratifu, bakterijos išsiskiria su išmatomis. Tyrimui paimkite paskutines skystos konsistencijos išmatų porcijas, emulsuokite į izotoninis tirpalas natrio chlorido (santykiu 1:10) ir palikite 30 min., kol nusės stambios dalelės. Sėjai nuo skysčio paviršiaus paimamas lašelis medžiagos.
Pirmąją tyrimo dieną medžiaga pasėjama į sodrinimo terpę – tulžies sultinį, magnį, Müller, Kaufman terpę – ir dedama į termostatą. Antrąją tyrimo dieną sodrinimo terpė pasėjama ant plokštelių su Ploskirev, Endo arba Levin ir Wilson-Blair (bismuto-sulfito-agaro) terpėmis. Vėliau tyrimo etapai yra tokie patys kaip ir išskiriant kraujo pasėlį.
Vidurių šiltinės-paratifoinės grupės bakterijas iš šlapimo geriausia išskirti nuo antros iki trečios ligos savaitės. Prieš imdami medžiagą, išorinę angą nuplaukite steriliu izotoniniu natrio chlorido tirpalu. šlaplė; Moterims geriau paimti šlapimą su kateteriu. Tyrimams paimama 20-30 ml šlapimo. Po centrifugavimo nuosėdos pasėjamos į 2 indus su Ploskirev terpe arba bismuto-sulfito agaru. Supernatantas pasėjamas ant sodrinimo terpės (10 % tulžies sultinio) ir dedamas į termostatą 24 valandoms, po to pasėjamas į 2 puodelius vienos iš pasirenkamų terpių. Izoliuotos kolonijos identifikuojamos įprastu būdu.
Dvylikapirštės žarnos turinio tyrimas – tulžis. Metodas dažniau naudojamas sveikimo stadijoje. Tulžis surenkama zondavimo metu į sterilius mėgintuvėlius. Dvylikapirštės žarnos turinys pasėjamas į buteliukus su 50 ml sultinio, o likusi medžiagos dalis kartu su inokuliacijomis dedama į 37 ° C temperatūros termostatą. Kitą dieną inokuliuojama 2 puodeliais su tankia diferencine terpe. . Išskirtos kolonijos identifikuojamos naudojant aprašytą metodą.
Labai jautrus ir daug žadantis ankstyva diagnostika vidurių šiltinė ir paratifas – tai imunofluorescencinis metodas, kurio metu tiriamas kraujas nuo pirmųjų ligos dienų, išmatos – nuo 10 dienos, dvylikapirštės žarnos turinys – 10 dieną. normali temperatūra kūnai. Vidurių šiltinės-paratifoinės bakterijos yra pažymėtos specifiniais fluorescenciniais serumais, kurie vėliau nustatomi fluorescencine mikroskopija. Metodas leidžia diagnozuoti ligą praėjus 10-12 valandų nuo tyrimo pradžios.
Vidurių šiltinės-paratifoidinės ligos serologinė diagnostika. Nuo antros ligos savaitės pacientų kraujyje atsiranda specifinių antikūnų, kuriuos galima nustatyti naudojant Widal reakciją. Sergant vidurių šiltine ir paratifu, kaupiasi O-, o vėliau ir H-agliutininai. Ligos eigoje kartais aptinkami Vi-agliutininai, tačiau pastarieji, skirtingai nei nešiotojai, diagnostinės vertės neturi. Konkrečių agliutininų, susijusių su vidurių šiltinės ir paratifoidinės karštinės sukėlėjo (Vidal reakcija) nustatymas pacientų kraujyje gali padėti nustatyti diagnozę, tiek ūminis laikotarpis sergant ir sveikstant.
Salmoneliozės atveju Widal reakcija yra pagalbinis diagnostikos metodas. Reikėtų prisiminti, kad dažnai susiduriama su ligos formomis, kurių imunologinis atsakas yra silpnas. Ypač dažnai pacientams, gydomiems antibiotikais, stebimi žemi agliutininų titrai, netgi jų nebuvimas.
Widal reakcijai į sterilų mėgintuvėlį paimama 1-3 ml kraujo iš piršto ar kubitinės venos. Siekiant pagreitinti kraujo krešėjimą, jis 30 minučių dedamas į termostatą. Sukrešėjęs kraujas apvalomas stikline pipete ir dedamas į šaldytuvą, kol pasirodys skaidrus, nusistovėjęs serumas. Krešulys naudojamas kultivavimui (kraujo pasėliui). Agliutinacijos reakcija atliekama H- ir O-tifo, A- ir B-paratifos diagnostikomis. Serumas skiedžiamas, pradedant nuo 1:100 iki 1:800 titro pagal šią procedūrą. Į mėgintuvėlį supilama 9,9 ml sterilaus izotoninio natrio chlorido tirpalo ir 0,1 ml tiriamojo serumo, kad praskiedimas būtų 1:100. 5 ml atskiesto serumo, po 1 ml, supilama į 4 mėgintuvėlius (pagal Widal reakcijoje naudojamų antigenų skaičių) ir į vieną, kuris tarnauja kaip serumo kontrolė. Iš likusių 5 ml serumo (1:100 praskiedimas) išpilama 1 ml, o į 4 ml įpilama 4 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo ir gaunamas praskiedimas santykiu 1:200. 4 ml praskiedimo santykiu 1:200 taip pat supilama į 4 mėgintuvėlius po 1 ml, o į likusius 4 ml vėl įpilama 4 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo, kad praskiedimas būtų 1:400. Vėlesni skiedimai (1:800, 1:1600) atliekami taip, kaip aprašyta. 1 ml izotoninio natrio chlorido tirpalo supilama į 4 mėgintuvėlius, kurie tarnauja kaip antigeno kontrolė. Į visus mėgintuvėlius, išskyrus tuos, kurie naudojami kaip serumo kontrolė, įpilama 1-2 lašai atitinkamų diagnostinių medžiagų. Stovas su mėgintuvėliais suplakamas ir dedamas į termostatą 37 °C temperatūroje 24 valandoms H-agliutinacija (stambiagrūdė) įvyksta po 2 valandų, O-agliutinacija (smulkiagrūdė) – daug vėliau. Reakcijos intensyvumas pastebimas po 24 valandų. Esant klinikinėms apraiškoms, Widal reakcijos diagnostinis titras praskiedžiamas mažiausiai 1:200.
Reikėtų nepamiršti, kad ši reakcija gali būti teigiama sergant kitomis ligomis – tuberkulioze, maliarija, brucelioze, piktybiniai navikai ir kai kurios sąlygos (nėštumas). Widal reakcija gali būti teigiama sveikiems asmenims (reakcija kasdien), tiems, kurie buvo paskiepyti ir anksčiau sirgo liga (anamnestinė reakcija). Siekdamas padidinti Widal reakcijos specifiškumą, Fischeris pasiūlė praskiesti serumą hipertoninis tirpalas natrio chloridas (2,9 ir 5,8%). Tai veda prie grupinių reakcijų susilpnėjimo arba pašalinimo. Agliutinacijos reakcijos reikšmė didėja atliekant kartotinius tyrimus, kai, atsižvelgiant į ligos dinamiką, nustatomas antikūnų titro padidėjimas. Sergant paratifu A, Widal reakcija gali būti neigiama arba specifinių antikūnų titras mažesnis nei grupės antikūnų.
Pastaraisiais metais už pripažinimą žarnyno grupė ligų, plačiai taikoma pasyvioji hemagliutinacijos reakcija (RPHA) su daliniais vidurių šiltinės bakterijų antigenais. RPGA pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu ir yra teigiamas nuo 5 ligos dienos. Minimalus diagnostinis titras pacientams, sergantiems vidurių šiltine, paratifu ir salmonelioze su O-antigenu, yra 1:200. Reakcija stebima laikui bėgant, siekiant nustatyti antikūnų titro padidėjimą.
Laboratorinės bakterijų pernešimo vidurių šiltinės ir paratifos diagnostikos metodai. Išmatų, šlapimo ir dvylikapirštės žarnos turinio bakteriologinis tyrimas atliekamas pagal visuotinai priimtus metodus. Geriausi rezultatai gaunami naudojant selenitinę terpę.
Dėl bakterijų išskyrimo dažnumo dažnai neįmanoma išskirti patogeno. Didžiojoje daugumoje vidurių šiltinės bacilų nešiotojų randama mikrobų, kuriuose yra Vi-antigeno, todėl ūminių ir lėtinių nešiotojų kraujyje atsiranda Vi-antikūnų (pacientų kraujyje jie yra rečiau). Diagnostinis reakcijos titras yra 1:20 ar didesnis. Lygiagrečiai su Vi-agliutinacijos reakcija (su pašildytu serumu), Widal reakcija (su natūraliu serumu) atliekama su H ir O vidurių šiltinės diagnostika. Vidurių šiltinės bakterijų nešiotojų serume H-antikūnai, kurių titras yra nuo 1:200 iki 1:800, randami 60-80% atvejų. H- ir Vi-antikūnų derinio buvimas turi ypatingą diagnostinė vertė nustatant vidurių šiltinės bacilų nešiotojus.
Nuo papildomi metodai vidurių šiltinės bacilų pernešimo nustatymo tyrimuose naudojamas odos alergijos testas su tifinu, taip pat RPGA su Vi-antigenu.
Taigi, svarbi sėkmingos kovos su vidurių šiltinės-paratifos ligomis sąlyga yra ankstyvas ir visiškas infekcijų šaltinio nustatymas ir neutralizavimas. Šiuo metu vidurių šiltinės pasitaiko sporadiškai. Tuo pačiu metu ligos eiga yra trumpesnė ir nėra lydima visų tipiškų klasikinės formos požymių, o tai apsunkina klinikinį atpažinimą.
Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta pirmiau, svarbu atlikti išsamų laboratorinį tyrimą.
Bakteriologinių tyrimų panaudojimo galimybės akių ligos ribojamas patologinio židinio prieinamumas. Kai jis yra užpakaliniame akies segmente, gauti medžiagą tyrimams dažnai būna labai sunku, o bakteriologinės diagnozės galimybė tokiais atvejais natūraliai atmetama. Pagrindinė bakteriologinės diagnostikos taikymo sritis oftalmologinėje praktikoje yra išorinės akies dalies ligos, taip pat prasiskverbiančios žaizdos, kurių metu galima gauti medžiagos tyrimams. chirurginis gydymasžaizdos arba pašalinus svetimkūnį. Apskritai reikia pažymėti, kad kada chirurginės intervencijos Gerokai plečiasi bakteriologinės medžiagos gavimo galimybių spektras.
Medžiagos gavimas tyrimams
Norint gauti medžiagą iš junginės maišelio, naudojama platininė kilpa (jei jos nėra, galite naudoti kilpą, pagamintą iš elektrinės viryklės spiralinio sriegio, arba kitą instrumentą (stiklinį strypą, mentelę ir kt.), Pirmiausia sterilizuokite kalcinuojant alkoholio degiklio liepsnoje. Atitraukiant apatinį voką, patraukite junginės išskyros gumulą iš apatinio fornikso gelmių odą ir vokų kraštus, kad į medžiagą nepatektų pašalinės mikrofloros. Patartina paimti medžiagą prieš pradedant gydymą ir gydymo pradžioje. ryto valandos kai išskyros gausesnės. Nesant gleivių ir pūlių (pavyzdžiui, prieš operaciją apžiūrint sveiką junginę), reikia naudoti ašarų skystį arba lengvai nubraukti jungiamosios membranos paviršių (pasak Lindnerio). Tačiau tokiais atvejais geriau naudoti Elynnig techniką: į junginės maišelį iš Pasteur pipetės įlašinkite vieną lašą sterilaus druskos tirpalo arba sultinio ir po kelių sekundžių išsiurbkite šį lašą.
Pagal tą patį Bendrosios taisyklės paimti medžiagą iš ašarų maišelio, išspaudžiant jo turinį, o esant opiniam blefaritui – nuo voko krašto, prieš tai pašalinus nuo opos plutą.
Labai atsargiai reikia paimti medžiagą iš ragenos, ypač jei yra šliaužianti ragenos opa. Kilpa (ar kitas bukas instrumentas) turi būti nukreiptas įstrižai į opos paviršių, o medžiaga paimama nuo jos progresuojančio krašto. Tam reikia anestezijos (3 lašai 1% dikaino) ir fiksacijos. akies obuolys.
Kaip medžiagą tyrimams esant prasiskverbiamoms akies žaizdoms, galite naudoti žaizdos išskyras (jei tokių yra), užfiksuojant kilpa ar marlės tamponu, priekinės kameros punkcija arba ištraukta. svetimas kūnas, kuris dedamas į sterilų mėgintuvėlį su 1-2 ml fiziologinio tirpalo. Sukračius mėgintuvėlį, tirpalas naudojamas tyrimui.
Iš priekinės kameros medžiagą tyrimams galima gauti iš pjovimo instrumento paracentezės metu arba per punkciją. Atlikus ragenos anesteziją (3 lašai 1 % dikaino tirpalo) ir įstrižai ties limbu fiksavus akies obuolį, suleidžiama švirkšto adata, įvedama į priekinę kamerą (atsargiai, kad nepažeistumėte rainelės ir lęšiuko kapsulės!) ir 0,3 Išsiurbiamas ml priekinės kameros turinio.
Sergant endoftalmitu, gali tekti gauti medžiagos iš stiklakūnis. Akies obuolio punkcija atliekama po anestezijos (1 ml 2% novokaino tirpalo po jungine) aštria adata su gana plačiu spindžiu, suleidžiama arčiau pusiaujo. Išsiurbiama 0,3-0,5 ml intraokulinio turinio.
Gauta medžiaga tiriama siekiant nustatyti mikrobą ir nustatyti jo tipą (mikrobiologinė diagnozė). Medžiaga gali būti tiriama:
- ant stiklelio (bakterioskopinis metodas);
- pasėliuose (faktinis bakteriologinis metodas);
- atliekant eksperimentą su gyvūnais (biologinis metodas).
Bakterioskopinis metodas
gali būti naudojamas bet kurioje akių ligoninėje su paprasta laboratorine įranga ir kai kuriais reagentais.
Norėdami tai padaryti, turite turėti šiuos dalykus:
- metalinė kilpa;
- švarios stiklinės (ant švaraus stiklo vandens lašelis išsiskleidžia ir neįgauna sferinės formos);
- vonia su atramomis stiklinėms stiklinėms (stiklo strypai arba stora varinė viela);
- Distiliuotas vanduo;
- alkoholis;
- pincetai;
- filtravimo popierius;
- Lugolio tirpalas (jodas 1 g, kalio jodidas 2 g, distiliuotas vanduo 300 ml);
- dažų tirpalai (geriausia buteliukuose, uždarytuose pipetėmis su guminėmis skardinėmis).
Norėdami išvalyti, naujos stiklinės virinamos 1% sodos tirpale (galima naudoti pelenus), o po to nuplaunamos švelniu vandeniu. vandenilio chlorido rūgštis ir vėl su vandeniu. Panaudotas stiklas 1-2 valandoms dedamas į sieros rūgštį, po to verdamas sodos tirpale, nuplaunamas vandeniu ir panardinamas į 96° spiritą. Stiklinės laikomos arba spirite, arba, nuvalius spiritą, sausos, stiklainiuose su šlifuotu kamščiu.
Dažniausiai naudojami dažai: Ziehl karbolinis fuksinas (bazinis fuksinas 1 g, kristalinė karbolio rūgštis 5 g, alkoholis 96° 10 ml, glicerinas - keli lašai, distiliuotas vanduo 100 ml). Dažymui Tsilya fuksinas paprastai skiedžiamas 10 kartų distiliuotu vandeniu (atskiestu arba vandeniniu fuksinu). Metileno mėlynasis (metileno mėlynasis 10 g, alkoholis 96° 100 ml). Iš jo paruošiamas Lefflerio šarminis mėlynasis ( alkoholio tirpalas mėlynas 30 ml, 1% kalio arba natrio šarmas 1 ml, distiliuotas vanduo 100 ml). Karbolinė gencijoninė žibuoklė (paruošta taip pat kaip Ziehl karbolinis fuksinas).
Mikrobai tiriami arba gyvai ("sutraiškyto" ir "pakabinamo lašo" metodai) arba žudomi (spalvotame preparate). Gyvi tyrimai daugiausia atskleidžia mikrobų gebėjimą aktyviai judėti, o dažyti preparatai leidžia gerai ištirti jų morfologiją.
Egzistuoja paprasti dažymo būdai, kai dažniausiai naudojami vieni dažai, ir sudėtingi dažymo metodai, atskleidžiantys tam tikrus mikrobinės ląstelės fizikinės ir cheminės struktūros ypatumus, todėl turi diferencinę diagnostinę vertę.
Spalvotų preparatų paruošimo technika yra tokia. Medžiaga uždedama ant švaraus stiklelio ir tolygiai paskirstoma ant paviršiaus apskritimo arba ovalo formos. Tepinėlis turi būti gana plonas. Jei pūliai yra tiršti, pirmiausia reikia užlašinti vieną lašą distiliuoto vandens ant stiklelio ir išmaišyti medžiagą šiame laše. Tepinėlis džiovinamas oru. Stiklas su džiovintu preparatu paimamas už kraštų su dideliu rodomieji pirštai pabraukite aukštyn ir pritvirtinkite tris kartus perbraukdami per alkoholio degiklio liepsną (prie šviesios ir tamsios dalių ribos). Esant pakankamam fiksavimui, pirštuose jaučiamas nedidelis deginimo pojūtis. Fiksuotas tepinėlis nusidažo. Paruošiami keli preparatai, mažiausiai du, iš kurių vienas yra beicuotas paprastu būdu (metileno mėlyna Leffleris, praskiestas Ziehl fuchsin), kitas - pagal Gramo metodą.
Loeffler dažymas:
- Ant tepinėlio uždėkite filtravimo popieriaus gabalėlį ir 3–5 minutes užpilkite Lefflerio mėlynojo tirpalo;
- preparatas nuplaunamas distiliuotu vandeniu ir išdžiovinamas.
Gramo dėmės:
- ant tepinėlio uždedamas filtravimo popieriaus gabalas, ant kurio 1-2 minutes pilamas gencijonų violetinės spalvos tirpalas;
- nusausinkite dažus, nuimkite popierių ir, neplaudami vandeniu, 1 minutę užpilkite Lugolio tirpalu; tuo pačiu metu tepinėlis pajuoduoja;
- nusausinkite Lugolio tirpalą ir išbalinkite tepinėlį alkoholiu ( geresnis būdas panardinant vaistą į stiklinę alkoholio, kol nustos išeiti purpurinės srovelės);
- kruopščiai nuplaukite vandeniu;
- užpildykite tepinėlį atskiestu fuksinu 1-2 minutes;
- nusausinkite dažus, preparatą nuplaukite vandeniu ir nusausinkite.
Patogus Gramo metodas, modifikuotas Sinevo, kuris pasiūlė naudoti iš anksto paruoštus filtravimo popieriaus gabalus, pamirkytus gencijonų violetinės spalvos tirpale ir išdžiovinti. Pirmiausia ant tepinėlio užlašinami 2-3 lašai vandens, o po to dedami šie popieriaus gabalėliai. Tada tęskite, kaip aprašyta aukščiau.
Tepinėlių mikroskopija atliekama imersiniu lęšiu. Dažant pagal Loeffler, nudažomi visi mikrobai Mėlyna spalva; nudažytas Gramo dėme, jis būna arba mėlynai violetinis (Gramteigiami mikrobai) arba raudonas (Gramneigiami mikrobai).
Ribotas mikrobų, susijusių su išorinės akies ligomis, skaičius ir jiems būdingi morfologiniai požymiai dažnai leidžia nustatyti teisingą mikrobiologinę diagnozę vien tik bakterioskopinio tyrimo pagalba.
Bakteriologinis metodas
Tai būtina tais atvejais, kai tepinėlių tyrimo nepakanka mikrobo tipui nustatyti arba reikia nustatyti izoliuoto patogeno jautrumą antibakteriniams vaistams.
Remdamiesi išsamiu bakteriologinio metodo įvadu į specialius mikrobiologijos vadovus, čia apsistosime tik prie šio metodo principų. Pirmasis darbo etapas yra identifikavimas atskiros rūšys mikrobų, t.y. gauti grynąsias kultūras. Norėdami tai padaryti, jie naudojasi mechaniniu medžiagos atskyrimu sėjos metu ir naudoja terpę, tinkamiausią spėjamiems patogenams (elektyvinėms terpėms) vystytis. Persėjant pavienes terpėje išaugintas kolonijas, gaunama grynoji kultūra, kuri tiriama mikroskopu (paruošiami tepinėliai) ir subkultūrinama ant diferencinės diagnostikos terpės, siekiant ištirti patogeno biochemines savybes.
Daugumos akių patogeninių mikrobų poreikiai auginimo sąlygomis lėmė tai, kad jų išskyrimui vyrauja selektyvios terpės, kuriose yra natūralių baltymų. Tai, pavyzdžiui, Elschnig aplinka (viena dalis arklio serumas arba ascitinis skystis ir dvi dalys sultinio), sukrešėjęs Loeffler serumas (trys dalys serumo ir viena dalis sultinio su 1% peptono, 0,5% NaCl ir 1% vynuogių cukraus), Leventhal kraujo agaras (agaras ir 5-10 % defibrinuoto kraujo).
Kalbant apie mikrobų jautrumo antibiotikams nustatymą, paprasčiausias šio nustatymo metodas yra naudoti specialiai pagamintus filtravimo popieriaus diskus, mirkytus antibiotikų tirpaluose ir išdžiovintus vakuume. Tyrimui skirta medžiaga (pūliai, taškas, ištrauktas svetimkūnis) dedamas į sterilų mėgintuvėlį su druskos tirpalas(1,5-2 ml). Suplakus skystis pilamas į Petri lėkšteles, geriausia dvi – viena su cukraus agaru, kita su kraujo agaru – ir kratant tolygiai paskirstoma terpės paviršiuje. Tada ant agaro paviršiaus 2 cm atstumu vienas nuo kito ir nuo lėkštelių kraštų dedami diskeliai su įvairiais antibiotikais. Indai dedami į termostatą (37°C), o kitą dieną mikrobo jautrumo tirtiems antibiotikams laipsnis sprendžiamas pagal augimo slopinimo zonos aplink diskus dydį. Augimo slopinimo zonos nebuvimas rodo mikrobo nejautrumą šiam antibiotikui.
Biologinis metodas
oftalmologinėje praktikoje jis naudojamas tik tais atvejais, kai dėl sudėtingos diagnozės toksikogeninė savybė gali būti lemiama nustatant mikrobo tipą (pavyzdžiui, kai diferencinė diagnostika difterijos bacila ir kserozės bacila).
Laboratorinė virusinių akių ligų diagnostika
Šiuo metu atliekamas specialus virusų, tarp jų ir trachomos viruso (77 pav.), tyrimas, naudojant jų auginimą audinių kultūrose (vištienos embrionų, pelės ascito karcinomos ir kt.) ir elektroninę mikroskopiją.
Ryžiai. 77. Ląstelių intarpai trachomoje.
IN klinikinė praktika Trachomai diagnozuoti naudojamas citologinio junginės įbrėžimų tyrimo metodas, siekiant nustatyti Provacek-Halberstadter kūnų (inkliuzų) buvimą ar nebuvimą. Norėdami tai padaryti, buku skalpeliu arba stiklelio krašteliu nubraukite junginės epitelio dangtelį (be kraujo), kuris uždedamas. plonas sluoksnis ant stiklinės stiklelio, džiovinama ore 5 minutes ir fiksuojama nuleidžiant į stiklinę su metilo alkoholis arba Nikiforovo mišinys (etilo eteris ir absoliutus alkoholis vienodais kiekiais). Dažymas atliekamas per 3-4 valandas šviežiai paruoštu Romanovsky-Giemsa dažų tirpalu (vienas dažų lašas 1 ml distiliuoto vandens). Tada preparatas nuplaunamas tekančiu vandeniu, džiovinamas ore ir tiriamas mikroskopu. Tokiu atveju epitelio ląstelių branduoliai yra nudažyti rausva spalva, protoplazma - šviesiai mėlynos spalvos, inkliuzai - mėlynos spalvos, mėlynai violetinė (77 pav.). Pastarieji atsiranda kaip kokoidiniai dariniai, išsidėstę tarp smulkiagrūdės masės ir yra pripažinti trachomatozinio viruso nešiotojais. Jie dažniau nustatomi naujais negydytos trachomos atvejais, tačiau gali atsirasti ir sergant paratrachominiu konjunktyvitu.
Tyrimas Pastaraisiais metais nustatyta nauja uniforma užkrečiama virusinė liga akis – epideminis keratokonjunktyvitas, o citologinis junginės įbrėžimų tyrimas sergant šia liga leido epitelio ląstelėse aptikti savotiškus intarpus, visiškai skirtingus nuo Prsvačeko kūnų (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
Kultūros tyrimo metodas yra tam tikro tipo bakterijų išskyrimas iš maistinės terpės kultivuojant, vėliau identifikuojant jų rūšis. Bakterijų tipas nustatomas atsižvelgiant į jų struktūrą, kultūrinius ir aplinkos duomenis bei genetinius, biocheminius ir biologinius rodiklius. Bakteriologinei diagnostikai atlikti naudojamos Sveikatos apsaugos ministerijos patvirtintos schemos.
Vadinamos naujos bakterijų rūšys, išskirtos iš maistinės terpės, kurių savybės dar nenustatytos grynoji kultūra. Galutinai nustačius jų savybes, iš tam tikros vietos ir tam tikru laiku išskirtos bakterijos įvardijamos įtempti.Šiuo atveju leidžiami nedideli vienos rūšies padermės savybių, išskyrimo vietos ar laiko skirtumai.
Metodo tikslas:
1. Etiologinė diagnozė, tai yra grynos bakterijų kultūros išskyrimas ir identifikavimas.
2. Mikroorganizmų skaičiaus ir jų ypatingų savybių nustatymas. Pavyzdžiui, specifinė reakcija dėl antibiotikų.
3. Mikroorganizmų intragenerinių skirtumų nustatymas remiantis jų epidemiologiniais ir genetiniais komponentais. Tai būtina norint nustatyti išskirtų mikroorganizmų bendruomenę skirtingos vietos Ir skirtingos sąlygos, o tai svarbu epidemiologiniais tikslais.
Šis tyrimo metodas turi tam tikrą etapų skaičių, skirtingą aerobinėms, fakultatyvinėms ir privalomoms aerobinėms bakterijoms.
Grynosios aerobinių ir fakultatyvinių aerobinių bakterijų kultūros kūrimas.
1 etapas
A) Parengiamoji veikla. Šis etapas apima medžiagos surinkimą, saugojimą ir transportavimą. Taip pat, jei reikia, jį galima apdoroti, atsižvelgiant į tiriamų bakterijų savybes. Pavyzdžiui, tiriant medžiagą dėl tuberkuliozės, rūgštims atsparioms mikrobakterijoms nustatyti naudojami šarmų arba rūgščių tirpalai.
B) Praturtinimas. Šis etapas nėra privalomas ir atliekamas, jei bakterijų skaičiaus tiriamojoje medžiagoje nepakanka visaverčiam tyrimui atlikti. Pavyzdžiui, išskiriant kraujo pasėlį, tiriamas kraujas dedamas į terpę santykiu nuo 1 iki 10 ir 24 valandas laikomas 37 o temperatūroje.
IN) Mikroskopija. Tiriamos medžiagos tepinėlis nudažomas ir tiriamas mikroskopu – tiriama mikroflora, jos savybės ir kiekis. Ateityje visus jame esančius mikroorganizmus būtina atskirti nuo pirminio tepinėlio.
G) Atskirų kolonijų kūrimas. Medžiaga užtepama ant puodelio, kuriame yra speciali, selektyvi terpė, tam naudojama kilpa arba mentele. Tada padėkite puodelį aukštyn kojomis, kad apsaugotumėte kolonijas nuo kondensacijos, ir laikykite termostate apie 20 valandų, palaikydami 37 o temperatūrą.
Svarbu! Reikėtų prisiminti, kad tyrimo metu būtina laikytis izoliacijos taisyklių. Viena vertus, apsaugoti tiriamąją medžiagą ir pašalinamas bakterijas, kita vertus, apsaugoti aplinkinius žmones ir išorinė aplinka.
Kalbant apie oportunistinius mikroorganizmus, juos šalinant svarbios jų kiekybinės savybės. Šiuo atveju atliekamas kiekybinis sėjimas, kurio metu medžiaga kelis šimtus kartų praskiedžiama izotoniniame natrio chlorido tirpale. Po to pasėjama 50 μl Petri lėkštelėse.
2 etapas
A ) Terpėje esančių kolonijų morfologinių savybių tyrimas ir jų mikroskopija. Ištiriamos taurelės ir pažymimos mikroorganizmų savybės, jų skaičius, augimo tempai, pažymima tinkamiausia maistinė terpė. Tyrimui geriausia atrinkti kolonijas, esančias arčiau centro, o jei susidaro keli grynųjų kultūrų tipai, tada tirti kiekvieną atskirai. Norėdami ištirti kultūros morfotipinį grynumą, naudokite kolonijos tepinėlį, nudažykite (dažniausiai). naudojant Gramo metodą ar bet kurį kitą) ir atidžiai mikroskopuoti.
B) Grynosios kultūros kaupimas. Tam visų morfotipų kolonijos dedamos į atskirus mėgintuvėlius su maistine terpe ir laikomos termostate tam tikroje temperatūroje (daugumai mikroorganizmų tinka 37 o temperatūra, tačiau kai kuriais atvejais ji gali skirtis).
Maistinė kaupimosi terpė dažnai yra Kliglerio terpė. Mėgintuvėliuose ji yra „nuožulni“, kur 2/3 jos dalies yra stulpelio pavidalo, o 1/3 – nuožulnus, šviesiai raudonos spalvos paviršius. Junginys:
· IPA
· 0,1% gliukozės
· 1% laktozės
· Specialus reagentas vandenilio sulfidui
· Fenolio raudonumo indikatorius.
3 etapas
A) Kultūros augimo ir grynumo lygis. Paprastai gauta grynoji kultūra auga tolygiai, o mikroskopinio tyrimo metu ląstelės turi tą pačią morfologinę ir tinktūrinę struktūrą. Tačiau yra keletas bakterijų tipų, turinčių ryškų pleoforizmą, ir yra skirtingos morfologinės struktūros ląstelių.
Jei Kliglerio terpė buvo naudojama kaip maistinė terpė, tai biochemines charakteristikas lemia kolonėlės ir nuožulniosios dalies spalvos pasikeitimas. Pavyzdžiui, jei laktozė suyra, nuožulnioji dalis pagelsta, jei gliukozė, stulpelis pagelsta; Kai susidaro vandenilio sulfidas, dėl sulfato perėjimo į geležies sulfidą atsiranda juodėjimas.
Kaip matote paveikslėlyje, Kliglerio terpė linkusi keisti spalvą. Taip yra dėl to, kad azoto medžiagų skaidymas bakterijų ir šarminių produktų susidarymas vyksta nevienalyčiai tiek kolonoje (anaerobinėmis sąlygomis), tiek nuožulniu paviršiumi (aerobinėmis sąlygomis).
Aerobinėje aplinkoje (nuožulniame paviršiuje) daugiau aktyvus ugdymasšarminiai nei anaerobinėje aplinkoje (kolonėlė). Todėl gliukozei skilus, rūgštis ant pasvirusio paviršiaus lengvai neutralizuojama. Tačiau skaidant laktozę, kurios koncentracija yra daug didesnė, rūgštis negali būti neutralizuojama.
Kalbant apie anaerobinę aplinką, šarminių produktų susidaro labai mažai, todėl čia galite stebėti, kaip fermentuojama gliukozė.
Ryžiai. Kliglerio auginimo terpė:
1 – šaltinio aplinka,
2 – aukštis E. coli,
3 - aukštis S. paratyphi B,
4 – aukštis S. Typhi.
E.coli skatina gliukozės ir laktozės skilimą susidarant dujoms, negamina vandenilio . Sukelia visos terpės pageltimą su pertraukomis.
S. paratyphi – skatina gliukozės skilimą susidarant dujoms, laktozė neigiama. Nuožulni dalis nekeičia spalvos, stulpelis pagelsta.
S. paratyphi A- negamina vandenilio sulfido.
S. paratyphi B – Gaminamas vandenilio sulfidas (injekcijai progresuojant atsiranda juoda spalva).
S. typhi – gliukozė suyra be dujų susidarymo, susidaro vandenilio sulfidas, laktozė neigiamas. Nuožulnioji dalis nekeičia spalvos, stulpelis pagelsta, o terpė pajuoduoja injekcijos eigoje.
Shigella spp. laktozė neigiama, gliukozė teigiama, vandenilio sulfidas nesigamina. Stulpelis įgyja geltonas atspalvis, o nusklembta dalis lieka ta pati.
B) Galutinis grynosios kultūros identifikavimas ir jos atsakas į antibiotikus. Įjungta šioje stadijoje Tiriamos biocheminės, biologinės, serologinės ir genetinės kultūros savybės.
Tyrimų praktikoje nereikia tirti viso mikroorganizmų savybių. Norint nustatyti, ar mikroorganizmai priklauso tam tikrai rūšiai, pakanka naudoti paprasčiausius tyrimus.
Bakteriologinio tyrimo metodas (BLMI)– metodas, pagrįstas grynųjų bakterijų kultūrų išskyrimu naudojant auginimą maistinėse terpėse ir jų identifikavimu pagal rūšis, remiantis mikroorganizmų morfologinių, kultūrinių, biocheminių, genetinių, serologinių, biologinių, aplinkos savybių tyrimais.
Bakteriologinė infekcijų diagnostika atliekama pagal Sveikatos apsaugos ministerijos patvirtintas standartines diagnostikos schemas.
Gryna kultūra - vienos rūšies bakterijos, auginamos maistinėje terpėje, kurių savybės tiriamos.
Padermė– identifikuota grynoji vienos rūšies mikroorganizmų kultūra, išskirta iš konkretaus šaltinio tam tikras laikas. Tos pačios rūšies padermės gali nežymiai skirtis savo biocheminėmis, genetinėmis, serologinėmis, biologinėmis ir kitomis savybėmis, taip pat išskyrimo vieta ir laiku.
BLMI tikslai:
1. Etiologinės diagnozės nustatymas: grynosios mikroorganizmų kultūros išskyrimas ir identifikavimas.
2. Apibrėžimas papildomos savybės, pavyzdžiui, mikroorganizmo jautrumas antibiotikams ir bakteriofagams.
3. Mikroorganizmų skaičiaus nustatymas (svarbu diagnozuojant UPM sukeltas infekcijas).
4. Mikroorganizmų tipavimas, ty intraspecifinių skirtumų nustatymas remiantis tyrimu genetinė Ir epidemiologinis(fagevarai ir serovarai) žymekliai. Tai naudojama epidemiologiniais tikslais, nes leidžia nustatyti mikroorganizmų, išskirtų iš skirtingų pacientų ir skirtingų aplinkos objektų, bendrumą skirtingose ligoninėse ir geografiniuose regionuose.
BLMI apima kelis etapus, skiriasi aerobams, fakultatyviniams anaerobams ir privalomiems anaerobams.
I. BLMI etapai išskiriant grynąją aerobų ir fakultatyvinių anaerobų kultūrą.
Scena.
A. Medžiagos surinkimas, transportavimas, sandėliavimas, pirminis apdorojimas. Kartais prieš sėją atliekamas selektyvus medžiagos apdorojimas, atsižvelgiant į izoliuoto mikroorganizmo savybes. Pavyzdžiui, prieš tiriant skreplius ar kitą medžiagą, ar nėra rūgštims atsparios Mycobacterium tuberculosis, medžiaga apdorojama rūgščių arba šarmų tirpalais.
B. Sėjama į sodrinimo terpę(jei reikia, tai atliekama, jei tiriamojoje medžiagoje yra nedaug bakterijų, pavyzdžiui, išskiriant kraujo kultūrą). Norėdami tai padaryti, į terpę santykiu 1:10 pasėjamas didelio tūrio kraujas, paimtas karščiuojant (8–10 ml suaugusiems, 4–5 ml vaikams). faktoriai); pasėlis inkubuojamas 37 0 C temperatūroje 18-24 valandas.
B. Tiriamos medžiagos mikroskopija. Iš tiriamos medžiagos paruošiamas tepinėlis, dažomas Gramu ar kitu metodu ir tiriamas mikroskopu. Įvertinama esama mikroflora ir jos kiekis. Tolesni tyrimai turėtų išskirti pradiniame tepinėlyje esančius mikroorganizmus.
D. Sėjama ant maistinių medžiagų, norint gauti izoliuotas kolonijas. Medžiaga užsėjama kilpa arba mentele mechaninio atskyrimo būdu ant lėkštelės su diferencine diagnostine arba selektyvia terpe, kad būtų gautos izoliuotos kolonijos. Po sėjos puodelis apverčiamas aukštyn kojomis (kad kolonijos nepasiteptų kondensacinio skysčio lašeliais), paženklinama etikete ir 18-24 valandoms dedama į 37 0 C temperatūros termostatą.
Reikia atsiminti, kad sėjant ir persėjant mikrobų kultūras, darbuotojo dėmesys turėtų būti skiriamas aseptikos taisyklių laikymuisi, kad būtų išvengta maistinių medžiagų užteršimo ir kitų bei savęs užkrėtimo!
Oportunistinių mikroorganizmų sukeltų infekcijų atveju, kai svarbus mikroorganizmų, esančių patologinėje medžiagoje, skaičius, atliekamas kiekybinis medžiagos sėjimas, kurio metu atliekama serija 100 kartų praskiedus medžiagą (dažniausiai 3 skiedimai). pirmiausia paruošiamas sterilus izotoninis natrio chlorido tirpalas mėgintuvėliuose. Po to 50 μl kiekvieno praskiedimo pasėjama ant maistinių medžiagų terpėse Petri lėkštelėse.
Scena.
A. Kolonijų morfotipų terpėse tyrimas, jų mikroskopija. Jie žiūri pro indus ir pažymi optimalią maistinę terpę, augimo greitį ir mikroorganizmų augimo modelį. Pasirinkite studijuoti izoliuotos kolonijos, esančios išilgai smūgio, arčiau centro. Jei auga kelių tipų kolonijos, kiekviena tiriama atskirai. Įvertinami kolonijų požymiai (7 lentelė). Jei reikia, indai su pasėliais apžiūrimi pro didinamąjį stiklą arba naudojant mikroskopą su mažo didinimo lęšiu ir susiaurinta diafragma. Tam tiriamos skirtingų kolonijų morfotipų tinktūrinės savybės, paruošiama tiriamos kolonijos dalis tepinėlis, nudažyti Gramo ar kitais metodais, mikroskopiškai ir nustatyti kultūros morfologiją bei grynumą Jei reikia, įdėti apytikslis RA ant stiklo su polivalentiniais serumais.
B. Grynosios kultūros kaupimas. Grynajai kultūrai sukaupti izoliuotos visų morfotipų kolonijos persėjamos į atskirus mėgintuvėlius su pasvirusiu agaru ar kita maistine terpe ir inkubuojamos termostate +37 0 C temperatūroje (ši temperatūra yra optimali daugumai mikroorganizmų, tačiau ji gali skirtis, pavyzdys, Campylobacterium spp.– +42 0 C, Candida spp. Ir Yersinia pestis – +25 0 C).
Kliglerio terpė dažniausiai naudojama kaip enterobakterijų kaupimo terpė.
Kliglerio terpės sudėtis: MPA, 0,1% gliukozės, 1% laktozės, vandenilio sulfido reagentas (geležies sulfatas + natrio tiosulfatas + natrio sulfitas), fenolio raudonasis indikatorius. Pradinė terpės spalva yra tamsiai raudona, terpė yra „nuožulni“ mėgintuvėliuose: turi kolonėlę (2/3) ir pasvirusį paviršių (1/3).
Sėjama į Kligler terpę juostelėmis per visą paviršių ir įsmeigiant į kolonėlę.
Scena.
A. Augimo akumuliacinėje terpėje apskaita, kultūros grynumo įvertinimas gramo tepinėlyje Pastaba augimo modelis izoliuota grynoji kultūra. Vizualiai grynai kultūrai būdingas vienodas augimas. At mikroskopinis tyrimas Iš tokios kultūros paruoštas dažytas tepinėlis atskleidžia morfologiškai ir tinktūriškai vienalytes ląsteles skirtinguose matymo laukuose. Tačiau esant ryškiam pleomorfizmui, būdingam kai kurioms bakterijų rūšims, tepinėliuose iš grynos kultūros vienu metu gali būti skirtingos morfologijos ląstelių.
Jei Kliglerio indikacinė terpė buvo naudojama kaip akumuliacinė terpė, tai vertinami jos spalvos pokyčiai stulpelyje ir pasvirusioje dalyje, iš kurių biochemines savybes: gliukozės, laktozės fermentacija ir vandenilio sulfido gamyba. Skilus laktozei, pasvirusi terpės dalis pagelsta, o skaidant gliukozei – gelsva kolonėlė. Kai skaidant cukrų susidaro CO 2, susidaro dujų burbuliukai arba plyšta kolonėlė. Gaminant vandenilio sulfidą, įpurškimo keliu pastebimas juodėjimas dėl geležies sulfato pavertimo geležies sulfidu.
Spalvos pasikeitimo Kliglerio terpėje pobūdis (23 pav.) paaiškinamas nevienodu azotinių medžiagų skaidymo intensyvumu mikroorganizmais ir šarminių produktų susidarymu aerobinėmis (ant nuožulnaus paviršiaus) ir anaerobinėmis (kolonėlėje) sąlygomis. .
Aerobinėmis sąlygomis nuožulniame paviršiuje susidaro intensyvesnis šarmų susidarymas nei terpės stulpelyje. Todėl skaidant gliukozę, kurios terpėje yra nedidelis kiekis, nuožulniame paviršiuje susidariusi rūgštis greitai neutralizuojama. Tuo pačiu metu, skaidant laktozę, kurios terpėje yra didelė koncentracija, šarminiai maisto produktai negali neutralizuoti rūgšties.
Anaerobinėmis sąlygomis kolonoje šarminių produktų susidaro nežymūs kiekiai, todėl čia aptinkama gliukozės fermentacija.
Ryžiai. 23. Kliglerio indikatoriaus terpė:
1 – inicialas,
2 – su augimu E. coli,
3– su augimu S. paratyphi B,
4 – su augimu S. typhi
E. coli skaido gliukozę ir laktozę susidarant dujoms, negamina vandenilio sulfido. Jie sukelia stulpelio ir nuožulniosios dalies pageltimą su terpės pertraukomis.
S. paratyphi skaido gliukozę susidarant dujoms, laktozė neigiama. Jie sukelia stulpelio pageltimą su lūžiais, nuožulni dalis nekeičia spalvos ir išlieka tamsiai raudona. Kuriame S. paratyphi B gaminti vandenilio sulfidą (injekcijai progresuojant atsiranda juoda spalva), S. paratyphi A vandenilio sulfidas negaminamas.
S. typhi skaido gliukozę nesusidarant dujoms, yra laktozės neigiamos, gamina sieros vandenilį. Dėl jų kolonėlė be pertraukų pagelsta, nusklembta dalis nekeičia spalvos ir išlieka tamsiai raudona, o injekcijos eigoje atsiranda juoda spalva.
Shigella spp. gliukozės teigiami, laktozės neigiami, negamina vandenilio sulfido. Dėl jų stulpelis pagelsta (su pertraukomis arba be jų, priklausomai nuo serovaro), nuožulnioji dalis nekeičia spalvos ir išlieka tamsiai raudona.
B. Galutinis grynosios kultūros identifikavimas(sistemingos izoliuoto mikroorganizmo padėties nustatymas pagal rūšies ar varianto lygį) ir išskirtos kultūros jautrumo antibiotikams spektro nustatymas.
Norint nustatyti grynąją kultūrą šiame etape, biocheminiai, genetiniai, serologiniai ir biologines savybes(8 lentelė).
Įprastoje laboratorinėje praktikoje identifikavimo metu nereikia tirti visų savybių. Naudokite informatyvų, prieinamą, paprasti testai, kurio pakanka izoliuoto mikroorganizmo rūšies (varianto) tapatybei nustatyti.
