Možnosť využitia bakteriologický výskum pri očné choroby obmedzený prístupnosťou patologického zamerania. Pri jej lokalizácii v zadnom segmente oka je získanie materiálu na výskum často veľmi náročné a možnosť bakteriologickej diagnostiky je v takýchto prípadoch prirodzene vylúčená. Hlavnou oblasťou použitia bakteriologickej diagnostiky v oftalmologickej praxi sú choroby vonkajšej časti oka, ako aj penetrujúce rany, v ktorých je možné získať materiál na výskum počas chirurgická liečba rany alebo pri odstraňovaní cudzieho telesa. Vo všeobecnosti treba poznamenať, že kedy chirurgické zákroky Rozsah možností získavania bakteriologického materiálu sa výrazne rozširuje.
Získavanie materiálu na výskum
Na získanie materiálu zo spojovkového vaku sa používa platinová slučka (ak nie je k dispozícii, možno použiť slučku zo špirálového závitu elektrického sporáka, alebo iného nástroja (sklená tyčinka, špachtle a pod.), ktorá je najprv sterilizovaný kalcináciou v plameni liehového kahana Stiahnutie spodného viečka , s vychladenou slučkou, uchopte hrudku spojivkového výtoku z hĺbky dolného fornixu V tomto prípade je potrebné vyhnúť sa dotyku slučky na kožu a okraje viečok, aby sa do materiálu nedostala cudzorodá mikroflóra. Materiál je vhodné odobrať pred začiatkom liečby a na začiatku liečby. ranné hodiny keď je výtok hojnejší. Pri absencii hlienu a hnisu (napríklad pri vyšetrovaní zdravej spojovky pred operáciou) treba použiť slznú tekutinu alebo zľahka zoškrabať povrch spojivovej membrány (podľa Lindnera). V takýchto prípadoch je však lepšie použiť Elynnigovu techniku: kvapnite jednu kvapku sterilného fyziologického roztoku alebo bujónu do spojovkového vaku z Pasteurovej pipety a po niekoľkých sekundách túto kvapku odsajte.
Podľa toho istého všeobecné pravidlá získať materiál zo slzného vaku vytlačením jeho obsahu a z okraja očného viečka v prípade ulceróznej blefaritídy po odstránení kôry z vredu.
Pri odbere materiálu z rohovky je potrebná veľká opatrnosť, najmä v prípade plazivého vredu rohovky. Slučka (alebo iný tupý nástroj) by mala smerovať šikmo k povrchu vredu a materiál by sa mal odoberať z jeho progresívneho okraja. Vyžaduje si to anestéziu (3 kvapky 1% dikaínu) a fixáciu. očná buľva.
Ako materiál na výskum v prípade penetrujúcich rán oka môžete použiť výtok z rany (ak existuje), jeho zachytenie slučkou alebo gázovým tampónom, prepichnutie prednej komory alebo extrakciu cudzie telo, ktorý sa vloží do sterilnej skúmavky s 1-2 ml fyziologického roztoku. Po pretrepaní skúmavky sa roztok použije na testovanie.
Z prednej komory možno materiál na výskum získať rezným nástrojom počas paracentézy alebo punkciou. Po anestézii rohovky (3 kvapky 1% roztoku dikaínu) a fixácii očnej buľvy šikmo na limbe sa vstrekne ihla injekčnej striekačky, zavedie sa do prednej očnej komory (pozor, neporaníme dúhovku a puzdro šošovky!) a 0,3 sa odsaje ml obsahu prednej komory.
Pri endoftalmitíde môže byť potrebné získať materiál z sklovca. Punkcia očnej gule sa vykonáva po anestézii (1 ml 2% roztoku novokaínu pod spojovkou) ostrou ihlou s pomerne širokým lúmenom, vstreknutým bližšie k rovníku. Odsáva sa 0,3-0,5 ml vnútroočného obsahu.
Výsledný materiál sa študuje s cieľom identifikovať mikrób a určiť jeho typ (mikrobiologická diagnóza). Materiál je možné študovať:
- na podložnom skle (bakterioskopická metóda);
- v plodinách (skutočná bakteriologická metóda);
- pri pokuse na zvierati (biologická metóda).
Bakterioskopická metóda
možno použiť v každej očnej nemocnici s jednoduchým laboratórnym vybavením a niektorými činidlami.
Ak to chcete urobiť, musíte mať nasledujúce:
- kovová slučka;
- čisté sklenené sklíčka (na čistom pohári sa kvapka vody rozprestrie a nenadobudne guľovitý tvar);
- kúpeľ s podperami pre sklenené sklíčka (sklenené tyčinky alebo hrubý medený drôt);
- destilovaná voda;
- alkohol;
- pinzety;
- filtračný papier;
- Lugolov roztok (jód 1 g, jodid draselný 2 g, destilovaná voda 300 ml);
- roztoky farieb (najlepšie vo fľašiach uzavretých pipetami s gumenými nádobkami).
Na čistenie sa nové poháre varia v 1% roztoku sódy (môže sa použiť popol) a potom sa umyjú miernou vodou kyselina chlorovodíková a opäť s vodou. Použité sklo sa vloží na 1-2 hodiny do kyseliny sírovej, potom sa vyvarí v roztoku sódy, premyje sa vodou a ponorí sa do 96° alkoholu. Poháre sa skladujú buď v liehu, alebo po zotretí liehu nasucho, v pohároch so zabrúsenou zátkou.
Najčastejšie používané farby sú: Ziehl karbol fuchsin (základný fuchsín 1 g, kryštalická kyselina karbolová 5 g, alkohol 96° 10 ml, glycerín - pár kvapiek, destilovaná voda 100 ml). Na farbenie sa fuchsín Tsilya zvyčajne riedi 10-krát destilovanou vodou (zriedený alebo vodný fuchsín). Metylénová modrá (metylénová modrá 10 g, alkohol 96° 100 ml). Pripravuje sa z nej Lefflerova alkalická modrá ( alkoholový roztok modrá 30 ml, 1 % draslíka alebo sodíka 1 ml, destilovaná voda 100 ml). Karbolická genciánová violeť (pripravená rovnakým spôsobom ako Ziehlov karbolický fuchsín).
Mikróby sa skúmajú buď naživo (metóda „rozdrvená“ a „zavesená kvapka“) alebo usmrtené (vo farebnom prípravku). Živé štúdie odhaľujú najmä schopnosť mikróbov aktívne sa pohybovať, zatiaľ čo farbené prípravky umožňujú dobré štúdium ich morfológie.
Existujú jednoduché metódy farbenia, keď sa zvyčajne používa jedna farba, a zložité metódy farbenia, ktoré odhaľujú niektoré vlastnosti fyzikálno-chemickej štruktúry mikrobiálnej bunky, a preto majú rozdielne diagnostická hodnota.
Technika prípravy farebných prípravkov je nasledovná. Materiál sa nanesie na čisté podložné sklo a rovnomerne sa rozloží po povrchu vo forme kruhu alebo oválu. Náter by mal byť dosť tenký. Ak máte hustý hnis, mali by ste najprv na podložné sklíčko nakvapkať jednu kvapku destilovanej vody a v tejto kvapke hmotu premiešať. Náter sa suší na vzduchu. Pohár so sušeným prípravkom sa odoberá okrajmi s veľkým ukazovákov rozotrite nahor a zafixujte tak, že trikrát prejdete cez plameň liehového horáka (na hranici jeho svetlých a tmavých častí). Pri dostatočnej fixácii sa v prstoch cíti mierne pálenie. Zafixovaná škvrna je zafarbená. Pripraví sa niekoľko prípravkov, aspoň dva, z ktorých jeden sa farbí jednoduchým spôsobom (metylénová modrá Leffler, zriedený fuchsín Ziehl), druhý - podľa Gramovej metódy.
Loefflerovo farbenie:
- Položte kúsok filtračného papiera na náter a nalejte Lefflerov modrý roztok na 3-5 minút;
- prípravok sa premyje destilovanou vodou a vysuší.
Gramovo farbenie:
- na náter sa položí kúsok filtračného papiera, na ktorý sa naleje roztok genciánovej violeti na 1-2 minúty;
- vypustite farbu, odstráňte papier a bez opláchnutia vodou nalejte roztok Lugol na 1 minútu; súčasne sa náter stáva čiernym;
- vypustite Lugolov roztok a škvrnu vybielte alkoholom ( lepšia cesta ponorenie drogy do pohára alkoholu, kým neprestanú vychádzať fialové pramienky);
- dôkladne opláchnite vodou;
- naplňte náter zriedeným fuchsínom na 1-2 minúty;
- farbu sceďte, prípravok umyte vodou a osušte.
Pohodlná Gramova metóda modifikovaná Sinevom, ktorý navrhol použiť vopred pripravené kúsky filtračného papiera, namočené v roztoku genciánovej violeti a vysušené. Najprv sa na rozmazanie nanesú 2-3 kvapky vody a potom sa umiestnia tieto kúsky papiera. Potom postupujte podľa popisu vyššie.
Mikroskopia náterov sa vykonáva pomocou ponornej šošovky. Pri farbení podľa Loefflera sú zafarbené všetky mikróby Modrá farba; pri farbení Gramovým farbivom je buď modrofialová (Gram-pozitívne mikróby) alebo červená (Gram-negatívne mikróby).
Obmedzený počet mikróbov podieľajúcich sa na ochoreniach vonkajšieho oka a ich charakteristické morfologické znaky často umožňujú stanoviť správnu mikrobiologickú diagnózu len pomocou bakterioskopického vyšetrenia.
Bakteriologická metóda
Je to potrebné v prípadoch, keď štúdium náterov nestačí na stanovenie typu mikróbov alebo je potrebné určiť citlivosť izolovaného patogénu na antibakteriálne liečivá.
Odkazujúc na podrobný úvod do bakteriologickej metódy na špeciálne príručky o mikrobiológii, budeme sa tu venovať iba princípom tejto metódy. Prvá fáza práce spočíva v identifikácii jednotlivé druhy mikróbov, t.j. získať čisté kultúry. Na tento účel sa uchyľujú k mechanickému oddeľovaniu materiálu počas sejby a k použitiu médií najvhodnejších na vývoj predpokladaných patogénov (elektívne médiá). Opätovným nasadením jednotlivých kolónií pestovaných na médiu sa získa čistá kultúra, ktorá sa skúma pod mikroskopom (pripravia sa nátery) a subkultivuje sa na diferenciálne diagnostické médiá na štúdium. biochemické vlastnosti patogén.
Vysoké nároky väčšiny očných patogénnych mikróbov v kultivačných podmienkach viedli k preferenčnému použitiu selektívnych médií obsahujúcich natívny proteín na ich izoláciu. Ide napríklad o prostredie Elschnig (jedna časť konské sérum alebo ascitická tekutina a dva diely bujónu), zrazené Loefflerovo sérum (tri diely séra a jeden diel bujónu s 1 % peptónu, 0,5 % NaCl a 1 % hroznový cukor), Leventhalský krvný agar (agar a 5-10 % defibrinovaná krv).
Čo sa týka zisťovania citlivosti mikróbov na antibiotiká, najjednoduchšou metódou na toto stanovenie je použitie špeciálne vyrobených kotúčov filtračného papiera, namočených v antibiotických roztokoch a sušených vo vákuu. Materiál na výskum (hnis, bodkovaný, extrahované cudzie teleso) sa umiestni do sterilnej skúmavky s fyziologickým roztokom (1,5-2 ml). Po pretrepaní sa tekutina naleje do Petriho misiek, najlepšie do dvoch – jedna s cukrovým agarom, druhá s krvným agarom – a pretrepaním sa rovnomerne rozloží po povrchu média. Potom sa na povrch agaru umiestnia disky s rôznymi antibiotikami vo vzdialenosti 2 cm od seba a od okraja misiek. Misky sa umiestnia do termostatu (37 °C) a nasledujúci deň sa posúdi stupeň citlivosti mikróbov na testované antibiotiká podľa veľkosti zóny inhibície rastu okolo diskov. Neprítomnosť zóny inhibície rastu naznačuje necitlivosť mikróbov na toto antibiotikum.
Biologická metóda
v oftalmologickej praxi sa používa len v prípadoch, keď pre náročnú diagnostiku môže byť toxigénna vlastnosť rozhodujúca pri určovaní typu mikróba (napr. odlišná diagnóza difterický bacil a xerózny bacil).
Laboratórna diagnostika vírusových očných ochorení
V súčasnosti prebieha špeciálna štúdia vírusov vrátane trachómového vírusu (obr. 77) pomocou ich kultivácie v tkanivových kultúrach (kuracie embryo, myší ascites karcinóm a pod.) a elektrónovej mikroskopie.
Ryža. 77. Bunkové inklúzie v trachóme.
IN klinickej praxi Na diagnostiku trachómu sa používa metóda cytologického vyšetrenia výterov spojoviek na prítomnosť alebo neprítomnosť Provacek-Halberstadterových teliesok (inklúzií). Na to použite tupý skalpel alebo okraj podložného sklíčka na zoškrabanie epitelového krytu spojovky (bez krvi), ktorý sa aplikuje tenká vrstva na podložnom sklíčku, sušiť na vzduchu 5 minút a fixovať spustením na 15-20 minút v pohári s metylalkohol alebo Nikiforovova zmes (etyléter a absolútny alkohol v rovnakých množstvách). Natieranie sa vykonáva do 3-4 hodín čerstvo pripraveným roztokom farby Romanovsky-Giemsa (v množstve jedna kvapka farby na 1 ml destilovanej vody). Potom sa prípravok premyje tečúcou vodou, suší sa na vzduchu a skúma sa pod mikroskopom. V tomto prípade sú jadrá epiteliálnych buniek zafarbené ružová farba, protoplazma - svetlomodrá, inklúzie - modrá, modrofialová (obr. 77). Tieto sa objavujú vo forme kokoidných útvarov umiestnených medzi jemnozrnnou hmotou a sú uznávané ako nosiče trachomatózneho vírusu. Častejšie sa nachádzajú v čerstvých prípadoch neliečeného trachómu, ale môžu sa vyskytnúť aj pri paratrachomálnej konjunktivitíde.
Výskum v posledných rokoch odhalil nová uniforma nákazlivý vírusové ochorenie očná - epidemická keratokonjunktivitída a cytologická štúdia zoškrabov spojoviek pri tomto ochorení umožnila odhaliť v epitelových bunkách zvláštne inklúzie, úplne odlišné od Prsvačkových teliesok (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
Aplikácia bakteriologická metóda umožňuje izolovať patogén v čistej kultúre z materiálu získaného od pacienta a identifikovať ho na základe štúdia súboru vlastností. Väčšina baktérií je schopná kultivácie na rôznych umelých živných médiách (okrem chlamýdií a rickettsie), preto má bakteriologická metóda dôležité v diagnostike mnohých infekčných chorôb.
Ak sa získa pozitívny výsledok, bakteriologická metóda umožňuje určiť citlivosť izolovaného patogénu na antimikrobiálne lieky. Účinnosť tejto štúdie však závisí od mnohých parametrov, najmä od podmienky pre zber materiálu a on dopravy do laboratória.
TO základné požiadavky požiadavky na výber a prepravu materiálu na bakteriologický výskum zahŕňajú:
- odber materiálu pred začiatkom etiotropnej liečby;
- dodržiavanie sterilných podmienok pri odbere materiálu;
- technická správnosť zberu materiálu;
- dostatočné množstvo materiál;
- zabezpečenie teplotných podmienok pre skladovanie a prepravu materiálu;
- minimalizácia časového intervalu medzi zberom materiálu a výsevom na pevné živné pôdy.
Transport materiálu do laboratória by sa mal uskutočniť čo najskôr, maximálne však do 1-2 hodín po jeho odbere. Vzorky materiálu sa musia uchovávať pri určitej teplote; najmä normálne sterilné materiály (krv, cerebrospinálny mok) sa skladujú a dodávajú do laboratória pri 37 °C. Nesterilné materiály (moč, výtok dýchacieho traktu atď.) sú uložené na izbová teplota nie viac ako 1-2 hodiny alebo nie viac ako jeden deň pri 4 °C (podmienky domácej chladničky). Ak nie je možné doručiť vzorky do laboratória v regulovanom časovom rámci, odporúča sa použiť transportné médiá určené na zachovanie životaschopnosti patogénov v podmienkach konzervácie.
Krv na výskum sa má odobrať pacientovi v období stúpajúcej telesnej teploty, na začiatku nástupu horúčky. Odporúča sa vyšetrenie 3-4 vzoriek krvi odobratých v intervale 4-6 hodín, čo je opodstatnené z hľadiska zníženia rizika „chýbajúcej“ prechodnej bakteriémie a zvýšenia schopnosti potvrdiť etiologickú úlohu izolovanej oportúnnej mikroflóry z krvi, ak je táto mikroflóra zistená vo viacerých vzorkách žilovej krvi. Vzorka krvi v množstve 10 ml pre dospelého a 5 ml pre deti sa naočkuje najmenej do dvoch fľaštičiek s aeróbnym a anaeróbne mikroorganizmy v pomere 1:10. Odporúča sa jednorazové vyšetrenie arteriálnej krvi.
Vezmite cerebrospinálnej tekutiny (CSF) vykonáva lekár pri lumbálna punkcia v množstve 1-2 ml do suchej sterilnej skúmavky. Vzorka je okamžite doručená do laboratória, kde sa okamžite začína aj jej vyšetrenie. Ak to nie je možné, materiál sa niekoľko hodín skladuje pri 37 °C. Výrazne zvyšuje množstvo pozitívne výsledky bakteriologické vyšetrenie naočkovaním 1-2 kvapiek CSF do skúmavky obsahujúcej polotekuté médium s glukózou a do Petriho misky s „krvným“ agarom. Na odoslanie materiálu použite izotermické boxy, nahrievacie podložky, termosky alebo akékoľvek iné obaly, kde sa teplota udržiava na cca 37 °C.
Výlučky na bakteriologický výskum sa 3-5 g odoberie pomocou sterilných drevených špachtlí do sterilnej nádoby s tesne priliehajúcim vekom. Vyšetrenie zozbieraného materiálu by sa malo začať najneskôr o 2 hodiny neskôr. Ak nie je možné začať vyšetrenie v tomto čase, malo by sa odobrať malé množstvo materiálu a umiestniť ho do vhodného transportného média. Pri odbere stolice by sa malo usilovať o odoslanie patologických nečistôt (hlien, hnis, častice epitelu atď.) na vyšetrenie, ak nejaké existujú, pričom sa treba vyhnúť vnášaniu krvných nečistôt, ktoré majú baktericídne vlastnosti, do materiálu.
Na odber materiálu sa môžu použiť rektálne tampóny (s vatovou špičkou). Tampón sa má navlhčiť sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného alebo transportným médiom (nie však olejovým gélom). Injektuje sa do konečníka do hĺbky 5-6 cm a otáčaním tampónu ho opatrne vyberte, pričom sa sleduje výskyt farby výkalov na tampóne. Tampón sa umiestni do suchej skúmavky, ak sa štúdium materiálu začne do 2 hodín, inak - v transportnom médiu.
som nasratý(priemerná časť voľne uvoľneného moču) v množstve 3-5 ml sa odoberá do sterilnej nádobky po dôkladnej toalete vonkajšieho genitálu. Je lepšie zbierať moč ráno.
Žlč odoberané počas duodenálnej intubácie v ošetrovni oddelene v častiach A, B a C do troch sterilných skúmaviek pri dodržaní pravidiel asepsie.
Voda na výplach žalúdka zhromaždené v sterilných nádobách v množstve 20-50 ml. Treba mať na pamäti, že výplach žalúdka v týchto prípadoch vykonávajú len ľahostajní (nemajú bakteriostatické resp. baktericídny účinok na mikroorganizmy) roztoky - lepšie prevarená voda(bez pridania sódy, manganistanu draselného atď.).
Spútum. Ranný spút uvoľnený počas záchvatu kašľa sa zhromažďuje v sterilnej nádobe. Pred kašľom si pacient umyje zuby a vypláchne ústa prevarenou vodou, aby sa mechanicky odstránili zvyšky potravy, odlupovaný epitel a mikroflóra ústna dutina.
Bronchiálna výplachová voda. Pri bronchoskopii sa nepodáva viac ako 5 ml izotonický roztok chloridu sodného a potom ho odsatím do sterilnej skúmavky.
Výtok z hltana, úst a nosa. Materiál z ústnej dutiny sa odoberá nalačno alebo 2 hodiny po jedle sterilným vatovým tampónom alebo lyžičkou zo sliznice a jej postihnutých oblastí pri vstupoch do vývodov. slinné žľazy, povrch jazyka, z vredov. Ak je tam film, odstráňte ho sterilnou pinzetou. Materiál z nosovej dutiny sa odoberie suchým sterilným vatovým tampónom, ktorý sa zavedie hlboko do nosnej dutiny. Materiál z nosohltanu sa odoberie sterilným zadným hltanovým vatovým tampónom, ktorý sa opatrne zavedie cez nosný otvor do nosohltanu. Ak začne kašeľ, tampón sa nevyberie, kým kašeľ neskončí. Na testovanie záškrtu sa súčasne skúmajú filmy a hlien z nosa a hrdla, pričom sa materiál odoberá rôznymi tampónmi.
Testovaný materiál sa naočkuje na tuhé živné médium s použitím špeciálne techniky na získanie rastu jednotlivých kolónií mikroorganizmov, ktoré sa potom skrínujú, aby sa izolovala čistá kultúra patogénu.
Určité typy baktérií sa izolujú pomocou selektívnych médií, ktoré inhibujú rast cudzích mikroorganizmov alebo obsahujú látky, ktoré stimulujú rast určitých patogénnych mikróbov.
Mikroorganizmy izolované na živných pôdach identifikovať, t.j. určiť ich druh alebo typ. IN V poslednej dobe Na identifikáciu v zdravotníckej praxi sa využívajú mikrotestovacie systémy, čo sú panely so sadou diferenciálne diagnostických prostredí, čo urýchľuje výskum. Mikrotestovacie systémy sa používajú aj na stanovenie citlivosti mikroorganizmov na antimikrobiálne liečivá riedením antibiotika v tekutom živnom médiu.
Pri posudzovaní výsledkov bakteriologického vyšetrenia musí lekár prihliadať na to negatívny výsledok neznamená vždy neprítomnosť patogénu a môže súvisieť s užívaním antimikrobiálnych liekov, vysokou mikrocídnou aktivitou krvi a technickými chybami. Detekcia patogénneho mikróbu v materiáli od pacienta bez spojenia s klinický obraz možné v prípade rekonvalescencie, zdravého alebo prechodného bakteriálneho prenosu.
Izolácia z krvi podlieha všetkým pravidlám asepsie oportúnne mikroorganizmy(Staphylococcus epidermidis, coli) a dokonca aj saprofyty by sa mali považovať za prejav bakteriémie, najmä ak sa tieto mikróby nachádzajú vo viac ako jednej vzorke materiálu alebo v rôznych substrátoch (krv, moč), pretože so znížením imunoreaktivity tela tieto a ďalšie „ nepatogénne“ mikroorganizmy môžu byť patogény infekčné procesy vrátane sepsy.
Existuje určitá ťažkosť interpretácia výsledkov bakteriologického vyšetrenia nesterilných médií, konkrétne dôkaz etiologickej úlohy oportúnnych mikroorganizmov. V tomto prípade sa berú do úvahy také ukazovatele, ako je typ izolovaných kultúr, počet mikrobiálnych buniek daného typu v materiáli, ich opakovaná izolácia počas choroby, prítomnosť monokultúry alebo asociácia mikroorganizmu.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Cieľ:
1. Zvládnite tretiu etapu bakteriologickej metódy na diagnostiku infekčných ochorení.
Vedieť:
1. Účel a postupnosť vykonávania štádia III bakteriologickej metódy na izoláciu čistých kultúr aeróbnych mikroorganizmov.
2. Pojem „typ“. Typové kritériá.
3. Metabolizmus mikroorganizmov a jeho vlastnosti.
4. Princíp a metódy štúdia biochemickej aktivity mikroorganizmov.
5. Účel a metódy stanovenia antibiogramov mikroorganizmov v klinickej mikrobiológii.
Byť schopný:
1. Určite čistotu skúmanej kultúry.
2. Vysievajte skúmanú plodinu na „pestrý riadok“, médium na určenie mobility.
3. Stanovte antibiogram testovanej kultúry pomocou diskovej difúznej metódy.
1. Účel a postupnosť vykonávania štádia III bakteriologickej metódy na izoláciu aeróbov.
2. Metódy stanovenia čistoty študovanej kultúry.
3. Klasifikácia mikroorganizmov podľa druhu výživy. Príchodové mechanizmy živiny do bakteriálnej bunky.
4. Enzýmy mikroorganizmov; ich význam v bunkovom metabolizme. Konštitutívne a indukovateľné enzýmy.
5. Účel a metódy štúdia biochemickej aktivity mikroorganizmov v mikrobiologickej praxi.
6. Priame a nepriame metódy stanovenia pohyblivosti mikroorganizmov.
7. Disková difúzna metóda na stanovenie antibiogramov: podstata, metóda tuhnutia.
Úlohy vykonávané počas lekcie (UIRS):
1. Vykonajte tretiu etapu bakteriologickej metódy izolácie čistých kultúr aeróbov:
Stanovte čistotu izolovanej kultúry;
Zasiať čistú testovaciu plodinu v krátkom „pestrofarebnom riadku“;
Testovanú kultúru vysejte do stĺpca polotekutého agaru;
Stanovte antibiogram testovanej kultúry pomocou diskovej difúznej metódy.
2. Oboznámte sa so systémami na biochemickú identifikáciu baktérií.
Smernice dokončiť výskumnú úlohu:
1. Uskutočnenie nádrže etapy III. metóda izolácie čistých kultúr aeróbov:
1.1. Stanovenie čistoty izolovanej kultúry.
O čistote kultúry svedčí rovnomernosť rastu a prítomnosť mikroorganizmov rovnakého druhu v prípravku. Preto pri makroskopickej štúdii rastu, všímajúc si jeho intenzitu (slabú, strednú, hojnú), priehľadnosť, farbu, dávajte pozor na jeho rovnomernosť. Pripravte fixný prípravok dotykom spodnej, strednej a hornej časti kĺbu pomocou slučky, Gramovej farby a mikroskopu. Zaznamenajte získané výsledky do protokolu a urobte záver. Ak je kultúra, ktorú ste izolovali, čistá, pokračujte ďalším výskumom.
1.2. Výsev plodín v „pestrofarebnom rade“.
Naočkujte čistú testovaciu kultúru na „pestrý rad“: polotekuté Hiss médium s indikátorom BP, sacharidy (glukóza, laktóza, manitol) a MPB.
Opätovné vysievanie do polotekutého média sa vykonáva bakteriologickou ihlou alebo nádržou. slučkou s priemerom 1 mm vstreknite do hrúbky agaru tak, aby nedosahovala na dno skúmavky » 1 mm. Pri opätovnom naočkovaní do tekutého média sa slučka s biomasou skúmanej kultúry ponorí do kvapaliny, rozotrie sa na stenu skúmavky a zmyje sa. Potom sa medzi stenu skúmavky a zátku umiestnia indikátorové papieriky na stanovenie indolu a sírovodíka (H 2 S) bez toho, aby sa okraje skúmavky a zátky namočili. živné médium!
Základom pre štúdium biochemických vlastností mikroorganizmov za účelom ich identifikácie je stanovenie medziproduktov a (alebo) konečných produktov metabolizmu. Sacharolytické a proteolytické vlastnosti baktérií, ktoré sa stanovujú na diferenciálnych diagnostických médiách, ktoré sú súčasťou „pestrofarebných sérií“, majú taxonomický význam.
Definícia sacharolytické vlastnosti vyrobené na médiách Hiss. Ich zloženie: peptónová voda, 1% uhľohydrát, indikátor Andrede (BP alebo iné), 0,3-0,5% agar, ak je médium polotekuté; ak je médium kvapalné, potom sa do skúmaviek spustia plaváky (krátke sklenené skúmavky utesnené na jednom konci).
Kritériá na zaznamenávanie výsledkov:
· farba média sa nemení – kultúra nefermentuje sacharidy;
· mení sa farba média (v prípade použitia indikátora Andrede - zo svetložltej na červenú, BP - z ružovej na modrú atď.) - kultúra fermentuje sacharidy za tvorby kyslých produktov ( organické kyseliny);
· farba média sa mení a v médiu sa objavujú bublinky plynu alebo plávajú - kultúra fermentuje sacharidy za tvorby kyslých a plynných produktov.
Definície proteolytické vlastnosti sa vyrába pomocou peptónovej vody (PV) alebo mäsového peptónového bujónu (MPB), pričom sa berie do úvahy tvorba konečných produktov metabolizmu bielkovín (peptón, aminokyseliny) - indol, H 2 S a v niektorých prípadoch aj amoniak.
Tvorba indolu je sprevádzaná ružovým sfarbením indikátorového papierika namočeného v roztoku kyseliny šťaveľovej (Morelova metóda); tvorba sírovodíka - sčernanie indikátorového papierika impregnovaného octanom olovnatým; tvorba čpavku - sfarbenie lakmusového papierika do modra.
MPB a PV sú tiež určené na štúdium rastového vzoru mikroorganizmov v tekutom živnom médiu. Mikrobiálny rast môže byť vo forme difúzneho zákalu, sedimentu na dne alebo filmu na povrchu média.
1.3. Vysiatie testovanej kultúry do stĺpca polotekutého agaru.
Testovanú kultúru naočkujte do stĺpca polotekutého agaru prepichnutím pomocou nádrže. ihly alebo nádrž. slučky s priemerom 1 mm.
Výsev kultúry do stĺpca polotekutého agaru vám umožňuje určiť jej vzťah k molekulárnemu kyslíku, a tak nepriamo získať predstavu o spôsobe získavania energie. Kritérium účtovníctva a hodnotenia je povaha rastu: rast iba zhora prostredia - kultúra je aeróbne, len v spodnej časti prostredia – anaeróbne; zhora a injekciou - fakultatívne anaeróbne; rast v určitej vzdialenosti od povrchu média – mikroaerofyl.
Touto metódou výsevu možno určiť motilitu u fakultatívnych anaeróbnych mikroorganizmov. Rast je striktne podľa injekcie - kultúra je nepohyblivá, difúzny rast je pohyblivý.
1.4. Stanovenie antibiogramu študovanej kultúry metódou diskovej difúzie.
Lekári vykonávajú etiotropnú antimikrobiálnu chemoterapiu s prihliadnutím na výsledky štúdie. metóda, ktorá spolu s izoláciou patogénu z klinického materiálu a jeho identifikáciou zahŕňa stanovenie citlivosti na antimikrobiálnu chemoterapiu. Na stanovenie citlivosti v Rusku sa najčastejšie používa metóda diskovej difúzie (DDM).
Na stanovenie antibiogramu pripravte suspenziu testovacej kultúry v sterilnom prostredí soľný roztok a upravte na 0,5 McFarlandovho zákalu (1,5 x 108 CFU/ml). Na očkovanie použite sterilný vatový tampón, ktorý sa ponorí do skúmavky so suspenziou, otáčajte ňou, aby bola rovnomerne nasýtená a potom dôkladne zatlačte na suchú stenu skúmavky nad hladinu kvapaliny otáčaním. Výsev kultúry na pohár s médiom AGV aplikujte ťahy v troch smeroch pod uhlom 60°, pričom pohár zakaždým otočte okolo svojej osi. Nakoniec vykonajte niekoľko rotačných pohybov tampónom pozdĺž okrajov povrchu agaru. Potom nechajte plodiny niekoľko minút sušiť pri izbovej teplote v pohároch s uzavretými viečkami. Aplikujte antibiotické kotúče najneskôr 15 minút po očkovaní pomocou sterilnej pinzety alebo automatického dávkovača. Vzdialenosť od disku k okraju pohára a medzi diskami by mala byť 15-20 mm. Na jeden pohár s priemerom 100 mm sa teda neumiestňuje viac ako 6 kotúčov. Každý kotúč by mal byť jemne stlačený pinzetou, aby sa zabezpečil jeho kontakt so živnou pôdou. Ihneď po priložení diskov označte poháre a postavte ich dnom nahor do termostatu na 37° na 18-20 hodín.
Technika bakteriologického výskumu. Izolácia patogénu z krvi (krvná kultúra) je skorá metóda diagnostika chorôb. Bakteriémia u pacientov s týfus-paratýfusom sa objavuje na konci inkubačná doba a nevymizne počas celého febrilného obdobia ochorenia a pri relapsoch. Výsledky bakteriologického vyšetrenia do určitej miery závisia od načasovania odberu materiálu a množstva naočkovanej krvi. Čím skôr sa hemokultúra vykoná od začiatku ochorenia, tým väčšia je pravdepodobnosť odhalenia patogénu. V prvom týždni brušného týfusu sa pacientovi odoberie krv z loketnej žily v množstve 10 ml, viac neskoré termíny a počas relapsov - 20 ml.
V prvý deň štúdia krv sa naočkuje v pomere 1:10 do jednej z tekuté médiá. Špecifikovaný pomer sa musí prísne dodržiavať, pretože pri menšom zriedení krvi môžu mikróby zomrieť v dôsledku jeho baktericídneho účinku. Na očkovanie použite: 10% alebo 20% roztok žlčového bujónu, naliateho do 50-100 ml fliaš, mäsovo-peptónový bujón s prídavkom 1% glukózy, sterilnú destilovanú vodu - podľa metódy N. N. Klodnitského, v ktorej sa lýza červených krviniek, produkty ich rozpadu slúžia ako dobrá živná pôda pre množenie baktérií. Môžete použiť aj sterilnú vodu z vodovodu. najlepšie skóre získané naočkovaním materiálu do žlčového bujónu. Ak nie je možné kultivovať krv na mieste, do laboratória sa odošle sérum a zrazenina alebo citrátová krv (10 ml krvi naliatej do skúmavky s 2 ml 5% sterilného citrátu sodného). Krvná zrazenina sa v laboratóriu rozdrví a naočkuje do jedného z uvedených médií. Fľaše sú umiestnené v termostate pri teplote 37°C.
Druhý deň štúdia. Po 14 až 24 hodinách od začiatku štúdie sa materiál naočkuje do Petriho misky na médium Endo alebo médium s eozínom a metylénovou modrou (Levine médium). Ploskirevovo médium sa neodporúča používať na siatie, pretože bacily týfusu a paratýfu nachádzajúce sa v krvi sú povinné paratrofy podľa typu výživy a nemenia tento typ výživy okamžite na metatrofické (t. j. mŕtve organické substráty). Preto na tomto médiu obsahujúcom soli žlčové kyseliny, bacily brušného týfusu rastú veľmi zle alebo vôbec. Ak po prvej inokulácii nedôjde k množeniu baktérií, ďalšie očkovania sa vykonajú po 48, 72 hodinách a na 5. a 10. deň. Ak sa patogén nepodarilo izolovať, dostane sa záporná odpoveď. V pochybných prípadoch sa odporúča vykonávať plodiny pravidelne - raz za 3-4 dni - až do 24. dňa od okamihu odberu materiálu. Na 7. deň sa stále uvádza negatívna odpoveď.
Tretí deň štúdia. Identifikujú sa „podozrivé“ kolónie pestované na médiu Endo a Levin (na médiu Endo sú kolónie patogénnych mikróbov bezfarebné), pre ktoré sa 2-3 kolónie subkultivujú na šikmom agare a médiu Ressel.
Štvrtý deň výskumu. Výsledky inokulácie na Resselovom médiu sa zohľadnia a zaznamenajú a morfologické vlastnosti izolovaných kultúr sa študujú v Gramovo farbenom nátere. Pohyblivosť - prítomnosť alebo neprítomnosť bičíkov - sa stanovuje v zavesenej alebo rozdrvenej kvapke odobratej zo 4-6-hodinovej kultúry v bujóne. Za týmto účelom sa agarová kultúra (jedna slučka) naočkuje do 1 ml mierne zahriateho bujónu. Vybrané kultúry (2-3 skúmavky) sa preočkujú na Hissovo médium s manitolom, sacharózou a šikmým agarom, ako aj do 2 skúmaviek s mäsovo-peptónovým bujónom, v ktorých sú prúžky filtračného papiera navlhčené špeciálnymi roztokmi na stanovenie vodíka. sulfid a indol (nepreložené) sa umiestnia pod zátky.
Piaty deň výskumu. Zmeny sa zaznamenávajú v rozšírenom „pestromennom riadku“. Ak je prítomná tvorba plynu, vykoná sa aglutinačná reakcia so zmesou sér Salmonella. O pozitívna reakcia vykonajte aglutinačnú reakciu s O- a H-sérami a poskytnite konečnú odpoveď založenú na súhrne všetkých znakov.
Izolácia myelokultúry sa uskutočňuje výsevom výsledného punktu kostná dreň v 3-5 ml sterilnej hovädzej žlče alebo v 25-30 ml 10% žlčového bujónu, umiestnite do termostatu a na druhý deň subkultivujte na Endo alebo Wilson-Blair médiu. V budúcnosti sú fázy výskumu rovnaké.
Izolácia baktérií z výkalov. Od 8. do 10. dňa choroby, častejšie od tretieho týždňa, sa u pacientov s brušným týfusom, paratýfusom vylučujú baktérie stolicou. Na výskum vezmite posledné časti výkalov tekutej konzistencie, emulgujte v izotonickom roztoku chloridu sodného (v pomere 1:10) a nechajte 30 minút, kým sa neusadia veľké častice. Na siatie sa odoberie kvapka materiálu z povrchu kvapaliny.
V prvý deň štúdie sa materiál naočkuje na obohacovacie médium - žlčový bujón, horčík, Muller, Kaufmanovo médium - a umiestni sa do termostatu. Na druhý deň štúdie sa obohacovacie médium naočkuje na platne s médiom Ploskirev, Endo alebo Levin a Wilson-Blair (bizmut-sulfit-agar). Následne sú fázy štúdie rovnaké ako pri izolácii krvnej kultúry.
Izolácia baktérií skupiny týfus-paratýfus z moču sa najlepšie vykonáva od druhého do tretieho týždňa choroby. Pred odberom materiálu umyte vonkajší otvor sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného. močovej trubice; U žien je lepšie odoberať moč katétrom. Na výskum sa odoberie 20-30 ml moču. Po odstredení sa sediment naočkuje do 2 misiek Ploskirevovým médiom alebo bizmutovo-sulfitovým agarom. Supernatant sa naočkuje na obohacovacie médium (10 % žlčový bujón) a umiestni sa do termostatu na 24 hodín, potom sa naočkuje do 2 pohárov jedného z voliteľných médií. Izolované kolónie sa identifikujú obvyklým spôsobom.
Štúdium obsahu dvanástnika - žlč. Metóda sa častejšie používa v štádiu rekonvalescencie. Žlč sa zhromažďuje počas sondovania do sterilných skúmaviek. Obsah dvanástnika sa naočkuje do fľaštičiek s 50 ml bujónu a zvyšná časť materiálu sa spolu s inokuláciami umiestni do termostatu pri 37 °C. Nasledujúci deň sa naočkuje do 2 pohárov hustým diferenciálnym médiom . Izolované kolónie sa identifikujú pomocou opísanej metódy.
Vysoko citlivý a perspektívny v skorá diagnóza týfus a paratýfus je imunofluorescenčná metóda, pri ktorej sa vyšetruje krv od prvých dní choroby, výkaly od 10. dňa, obsah dvanástnika od 10. normálna teplota telá. Baktérie týfus-paratýfus sú označené špecifickými fluorescenčnými sérami, ktoré sú následne stanovené fluorescenčnou mikroskopiou. Metóda umožňuje diagnostikovať ochorenie 10-12 hodín od začiatku štúdie.
Sérologická diagnostika týfus-paratýfus. Od druhého týždňa ochorenia sa v krvi pacientov objavujú špecifické protilátky, ktoré sa dajú určiť pomocou Widalovej reakcie. Pri brušnom týfuse a paratýfuse sa hromadia O- a potom H-aglutiníny. V priebehu ochorenia sa niekedy zistia Vi-aglutiníny, ktoré však na rozdiel od nosičov nemajú žiadnu diagnostickú hodnotu. Stanovenie špecifických aglutinínov v krvi pacientov na pôvodcu brušného týfusu a paratýfusu (Vidalova reakcia) môže pomôcť pri stanovení diagnózy, a to ako v akútne obdobie choroby a počas rekonvalescencie.
Pri salmonelóze je Widalova reakcia pomocnou diagnostickou metódou. Malo by sa pamätať na to, že sa často vyskytujú formy ochorenia so slabo vyjadrenou imunologickou odpoveďou. Obzvlášť často sa u pacientov liečených antibiotikami pozorujú nízke titre aglutinínov, dokonca aj ich absencia.
Pri Widalovej reakcii sa odoberú 1-3 ml krvi z prsta alebo z loketnej žily do sterilnej skúmavky. Aby sa urýchlila zrážanlivosť krvi, umiestni sa na 30 minút do termostatu. Zrazená krv sa zakrúžkuje sklenenou pipetou a umiestni sa do chladničky, kým sa neobjaví číre, usadené sérum. Zrazenina sa používa na kultiváciu (krvná kultúra). Aglutinačná reakcia sa uskutočňuje s H- a O-tyfoidnými, A- a B-paratýfovými diagnostikami. Sérum sa zriedi, počínajúc titrom 1:100 až 1:800, podľa nasledujúceho postupu. Do skúmavky sa naleje 9,9 ml sterilného izotonického roztoku chloridu sodného a 0,1 ml testovacieho séra, aby sa získalo riedenie 1:100. 5 ml zriedeného séra, po 1 ml, sa naleje do 4 skúmaviek (podľa počtu antigénov použitých vo Widalovej reakcii) a do jednej, ktorá slúži ako kontrola séra. Zo zostávajúcich 5 ml séra (riedenie 1:100) sa vyleje 1 ml a do 4 ml sa pridajú 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného a získa sa riedenie 1:200. 4 ml z riedenia 1:200 sa tiež nalejú do 4 skúmaviek po 1 ml a do zvyšných 4 ml sa opäť pridajú 4 ml izotonického roztoku chloridu sodného, aby sa získalo riedenie 1:400. Nasledujúce riedenia (1:800, 1:1600) sa pripravia tak, ako je opísané. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného sa naleje do 4 skúmaviek, ktoré slúžia ako kontrola antigénu. Do všetkých skúmaviek, okrem tých, ktoré slúžia ako kontrola séra, sa nalejú 1-2 kvapky príslušného diagnostického činidla. Stojan so skúmavkami sa pretrepe a umiestni sa do termostatu pri 37 ° C na 24 hodín H-aglutinácia (hrubozrnná) nastáva po 2 hodinách, O-aglutinácia (jemnozrnná) - oveľa neskôr. Intenzita reakcie sa zaznamená po 24 hodinách. Diagnostický titer Widalovej reakcie sa v prítomnosti klinických prejavov zriedi najmenej 1:200.
Treba mať na pamäti, že táto reakcia môže byť pozitívna aj pri iných ochoreniach - tuberkulóza, malária, brucelóza, zhubné novotvary a niektoré stavy (tehotenstvo). Widalova reakcia môže byť pozitívna u zdravých jedincov (každodenná reakcia), u tých, ktorí boli očkovaní a ktorí mali v minulosti nejaké ochorenie (anamnestická reakcia). Na zvýšenie špecifickosti Widalovej reakcie Fischer navrhol riedenie séra hypertonický roztok chlorid sodný (2,9 a 5,8 %). To vedie k oslabeniu alebo eliminácii skupinových reakcií. Hodnota aglutinačnej reakcie sa zvyšuje s opakovanými štúdiami, keď sa zistí zvýšenie titra protilátok s dynamikou ochorenia. Pri paratýfuse A môže byť Widalova reakcia negatívna alebo titer špecifických protilátok je nižší ako skupinová protilátka.
IN posledné roky na uznanie črevnej skupiny ochoreniach sa široko používa pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA) s parciálnymi antigénmi týfusových baktérií. RPGA má vysokú senzitivitu a špecificitu a je pozitívny od 5. dňa choroby. Minimálny diagnostický titer pre pacientov s brušným týfusom, paratýfusom a salmonelózou s O-antigénom je 1:200. Reakcia sa monitoruje v priebehu času, aby sa určilo zvýšenie titra protilátky.
Metódy laboratórna diagnostika prenos baktérií pri brušnom týfuse a paratýfuse. Bakteriologické vyšetrenie výkalov, moču a duodenálneho obsahu sa vykonáva podľa všeobecne uznávaných metód. Najlepšie výsledky sa dosiahnu pri použití seleničitanových médií.
Kvôli frekvencii izolácie baktérií často nie je možné izolovať patogén. U drvivej väčšiny nosičov bacilov týfusu sa nachádzajú mikróby s obsahom Vi-antigénu, a preto sa Vi-protilátky objavujú v krvi akútnych a chronických nosičov (v krvi pacientov sú menej časté). Diagnostický titer reakcie je 1:20 alebo vyšší. Paralelne s Vi-aglutinačnou reakciou (so zahriatym sérom) sa uskutočňuje Widalova reakcia (s natívnym sérom) s H- a O-tyfus diagnosticum. V sérach nosičov týfusových baktérií sa H-protilátky v titri 1:200 až 1:800 nachádzajú v 60-80% prípadov. Prítomnosť kombinácie H- a Vi-protilátok má osobitný diagnostický význam pri identifikácii nosičov bacilov týfusu.
Od dodatočné metódyštúdie na zistenie nosičstva bacilov týfusu používajú kožný alergický test s tyfínom, ako aj RPGA s Vi-antigénom.
Dôležitou podmienkou úspechu boja proti týfus-paratýfusom je teda včasná a úplná identifikácia a neutralizácia zdroja infekcií. V súčasnosti brušný týfus vyskytuje sa sporadicky. Zároveň je priebeh ochorenia kratší a nie je sprevádzaný všetkými typickými znakmi klasickej formy, čo komplikuje klinické rozpoznanie.
V súvislosti s vyššie uvedeným nadobúda význam komplexné laboratórne vyšetrenie.
