Извършва се и бактериологично изследване. Тема: Бактериологичен метод на изследване. Етап III на бактериологичния метод за изолиране на аероби

Възможност за ползване бактериологично изследванепри очни заболяванияограничени от достъпността на патологичния фокус. Когато се намира в задния сегмент на окото, получаването на материал за изследване често е много трудно и възможността за бактериологична диагностика в такива случаи е естествено изключена. Основната област на приложение на бактериологичната диагностика в офталмологичната практика са заболявания на външната част на окото, както и проникващи рани, при които може да се получи материал за изследване по време на хирургично лечениерани или при отстраняване на чуждо тяло. Като цяло трябва да се отбележи, че когато хирургични интервенцииОбхватът на възможностите за получаване на бактериологичен материал значително се разширява.

Получаване на материал за изследване

За получаване на материал от конюнктивалния сак се използва платинена примка (ако няма такава, можете да използвате примка, направена от спираловидна нишка на електрическа печка или друг инструмент (стъклена пръчка, шпатула и др.), Което е първо се стерилизира чрез изпичане в пламъка на спиртна горелка Прибирайки долния клепач, с охладена примка, вземете бучка конюнктивален секрет от дълбочината на долния свод кожата и ръбовете на клепачите, за да не се въведе чужда микрофлора в материала. Препоръчително е материалът да се вземе преди началото на лечението. сутрешните часовекогато течението е по-обилно. При липса на слуз и гной (например при изследване на здрава конюнктива преди операция) трябва да се използва слъзна течност или леко да се изстърже повърхността на съединителната мембрана (според Lindner). Но в такива случаи е по-добре да използвате техниката на Elynnig: поставете една капка стерилен физиологичен разтвор или бульон в конюнктивалния сак от пипетата на Пастьор и след няколко секунди изсмучете тази капка.

Според същите Общи правилавземете материал от слъзния сак, като изстискате съдържанието му и от ръба на клепача в случай на улцерозен блефарит, като първо отстраните кората от язвата.

Изисква се голямо внимание при вземане на материал от роговицата, особено при наличие на пълзяща корнеална язва. Примката (или друг тъп инструмент) трябва да бъде насочен косо към повърхността на язвата и материалът трябва да бъде взет от прогресиращия й ръб. Това изисква анестезия (3 капки 1% дикаин) и фиксиране. очна ябълка.

Като материал за изследване в случай на проникващи рани на окото можете да използвате секрет от рана (ако има такъв), като го вземете с бримка или марлев тампон, пункция на предната камера или извлечен чуждо тяло, която се поставя в стерилна епруветка с 1-2 ml физиологичен разтвор. След разклащане на епруветката разтворът се използва за изследване.

От предната камера материалът за изследване може да бъде получен от режещ инструмент по време на парацентеза или чрез пункция. След анестезия на роговицата (3 капки 1% разтвор на дикаин) и фиксиране на очната ябълка наклонено към лимба се инжектира игла от спринцовка, която се вкарва в предната камера (внимавайте да не нараните ириса и капсулата на лещата!) и 0,3 ml от съдържанието на предната камера се изсмуква.

При ендофталмит може да има нужда от получаване на материал от стъкловидно тяло. Пункцията на очната ябълка се извършва след анестезия (1 ml 2% разтвор на новокаин под конюнктивата) с остра игла с доста широк лумен, инжектирана по-близо до екватора. Аспирират се 0,3-0,5 ml вътреочно съдържимо.

Полученият материал се изследва за идентифициране на микроба и определяне на неговия тип (микробиологична диагноза). Материалът може да се изучава:

1. върху предметно стъкло (бактериоскопски метод);
2. в култури (същинският бактериологичен метод);
3. в експеримент с животни (биологичен метод).

Бактериоскопски метод

може да се използва във всяка очна болница с просто лабораторно оборудване и някои реактиви.

За да направите това, трябва да имате следното:

1. метален контур;
2. предметни стъкла от чисто стъкло (върху чисто стъкло капка вода се разпръсква и не придобива сферична форма);
3. вана с опори за стъклени пързалки (стъклени пръчки или дебела медна тел);
4. дестилирана вода;
5. алкохол;
6. пинсети;
7. филтърна хартия;
8. Луголов разтвор (йод 1 g, калиев йодид 2 g, дестилирана вода 300 ml);
9. разтвори за боя (за предпочитане в бутилки, затворени с пипети с гумени кутии).

За почистване новите чаши се изваряват в 1% разтвор на сода (може да се използва пепел) и след това се измиват с мека вода солна киселинаи пак с вода. Използваното стъкло се поставя в сярна киселина за 1-2 часа, след това се вари в разтвор на сода, измива се с вода и се потапя в 96° спирт. Чашите се съхраняват или в спирт, или след избърсване на алкохола, сухи, в буркани със смляна запушалка.

Най-често използваните бои са: Ziehl carbol fuchsin (основен фуксин 1 g, кристална карболова киселина 5 g, спирт 96° 10 ml, глицерин - няколко капки, дестилирана вода 100 ml). За оцветяване Tsilya fuchsin обикновено се разрежда 10 пъти с дестилирана вода (разреден или воден фуксин). Метиленово синьо (метиленово синьо 10 g, алкохол 96° 100 ml). От него се приготвя алкално синьо на Leffler ( алкохолен разтворсин 30 ml, 1% калиева или натриева основа 1 ml, дестилирана вода 100 ml). Карболова тинтява виолет (приготвя се по същия начин като карболовия фуксин на Ziehl).

Микробите се изследват или на живо (методите на „смачкана“ и „висяща капка“) или убити (в оцветен препарат). Живите изследвания разкриват главно способността на микробите да се движат активно, докато оцветените препарати позволяват добро изследване на тяхната морфология.

Има прости методи за оцветяване, когато обикновено се използва една боя, и сложни методи за оцветяване, които разкриват някои характеристики на физикохимичната структура на микробната клетка и следователно имат разлика диагностична стойност.

Техниката за приготвяне на цветни препарати е следната. Материалът се нанася върху чисто предметно стъкло и се разпределя равномерно по повърхността под формата на кръг или овал. Намазката трябва да е доста тънка. Ако има гъста гной, първо трябва да нанесете една капка дестилирана вода върху предметно стъкло и да разбъркате материала в тази капка. Намазката се изсушава на въздух. Чашата с изсъхналия препарат се хваща за краищата с едро показалцитепогладете нагоре и фиксирайте, като го прекарате три пъти през пламъка на спиртна горелка (на границата на светлата и тъмната част). При достатъчно фиксиране се усеща леко парене в пръстите. Фиксираната цитонамазка се оцветява. Приготвят се няколко препарата, най-малко два, единият от които се оцветява по прост начин (метиленово синьо Leffler, разреден фуксин Ziehl), другият - по метода на Грам.

Оцветяване на Loeffler:

1. Поставете парче филтърна хартия върху намазката и изсипете синия разтвор на Leffler за 3-5 минути;
2. препаратът се промива с дестилирана вода и се суши.

Оцветяване по Грам:

1. върху намазката се поставя парче филтърна хартия, върху която се излива разтвор на тинтява виолет за 1-2 минути;
2. изцедете боята, отстранете хартията и, без да изплаквате с вода, изсипете разтвора на Lugol за 1 минута; в същото време намазката става черна;
3. изцедете разтвора на Lugol и избелете намазката с алкохол ( по-добър начинпотапяне на лекарството в чаша с алкохол, докато лилавите струи спрат да излизат);
4. изплакнете обилно с вода;
5. напълнете намазката с разреден фуксин за 1-2 минути;
6. изцедете боята, измийте препарата с вода и изсушете.

Удобен метод на Грам, модифициран от Синев, който предложи да се използват предварително приготвени парчета филтърна хартия, напоени с разтвор на тинтява виолетово и изсушени. Първо се нанасят 2-3 капки вода върху намазката и след това се поставят тези листчета. След това продължете както е описано по-горе.

Микроскопията на петна се извършва с потапяща леща. При оцветяване по Loeffler всички микроби се оцветяват Син цвят; когато се оцвети с оцветяване по Грам, то е или синьо-виолетово (Грам-положителни микроби), или червено (Грам-отрицателни микроби).

Ограниченият брой микроби, участващи в заболяванията на външното око, и техните характерни морфологични особености често правят възможно поставянето на правилна микробиологична диагноза само с помощта на бактериоскопско изследване.

Бактериологичен метод

Това става необходимо в случаите, когато изследването на петна е недостатъчно за установяване на вида на микроба или е необходимо да се определи чувствителността на изолирания патоген към антибактериални лекарства.

Като се позоваваме за подробно въведение в бактериологичния метод на специални ръководства по микробиология, тук ще се спрем само на принципите на този метод. Първият етап от работата се свежда до идентифициране отделни видовемикроби, т.е. за получаване на чисти култури. За да направят това, те прибягват до механично отделяне на материала по време на засяване и до използването на среди, най-подходящи за развитието на предполагаеми патогени (елективни среди). Чрез повторно засяване на отделни колонии, отгледани върху средата, се получава чиста култура, която се изследва под микроскоп (приготвят се натривки) и се субкултивира върху диференциално диагностична среда за изследване. биохимични свойствапатоген.

Високите изисквания на повечето патогенни за очите микроби при условията на култивиране са довели до преобладаващото използване на селективни среди, съдържащи нативен протеин за тяхното изолиране. Това са например околната среда Елшниг (една част конски серумили асцитна течност и две части бульон), съсирен серум на Loeffler (три части серум и една част бульон с 1% пептон, 0,5% NaCl и 1% гроздова захар), Левентал кръвен агар (агар и 5-10% дефибринирана кръв).

Що се отнася до определянето на чувствителността на микробите към антибиотици, най-простият метод за това определяне е използването на специално произведени дискове от филтърна хартия, напоени с антибиотични разтвори и изсушени във вакуум. Материалът за изследване (гной, пунктат, извлечено чуждо тяло) се поставя в стерилна епруветка с физиологичен разтвор (1,5-2 ml). След разклащане течността се изсипва в петриеви панички, за предпочитане две - едната със захарен агар, другата с кръвен агар - и чрез разклащане се разпределя равномерно по повърхността на средата. След това върху повърхността на агара се поставят дискове с различни антибиотици на разстояние 2 см един от друг и от ръба на съдовете. Съдовете се поставят в термостат (37°С) и на следващия ден по размера на зоната на инхибиране на растежа около дисковете се преценява степента на чувствителност на микроба към изследваните антибиотици. Липсата на зона за инхибиране на растежа показва нечувствителността на микроба към този антибиотик.

Биологичен метод

в офталмологичната практика се използва само в случаите, когато поради трудна диагноза токсигенното свойство може да бъде решаващо при определяне на вида на микроба (напр. диференциална диагнозадифтериен бацил и ксерозен бацил).

Лабораторна диагностика на вирусни очни заболявания

Понастоящем се провежда специално изследване на вируси, включително вируса на трахома (фиг. 77), като се използва тяхното култивиране в тъканни култури (пилешки ембрион, миши асцитен карцином и др.) И електронна микроскопия.

Ориз. 77. Клетъчни включвания в трахома.

IN клинична практикаЗа диагностициране на трахома се използва методът на цитологично изследване на конюнктивални изстъргвания за наличие или отсъствие на тела на Provacek-Halberstadter (включвания). За да направите това, използвайте тъп скалпел или ръба на предметно стъкло, за да изстържете епителната обвивка на конюнктивата (без кръв), която се прилага тънък слойвърху предметно стъкло, изсушава се на въздух за 5 минути и се фиксира чрез спускане в стъкло с метилов алкохолили смес на Никифоров (етилов етер и абсолютен алкохол в равни количества). Боядисването се извършва в рамките на 3-4 часа с прясно приготвен разтвор на боя Romanovsky-Giemsa (със скорост една капка боя на 1 ml дестилирана вода). След това препаратът се измива с течаща вода, суши се на въздух и се изследва под микроскоп. В този случай ядрата на епителните клетки се оцветяват розов цвят, протоплазма - в светло синьо, включвания - в синьо, синьо-виолетово (фиг. 77). Последните се появяват под формата на кокоидни образувания, разположени сред дребнозърнеста маса и се разпознават като носители на трахоматозния вирус. Те се срещат по-често при пресни случаи на нелекувана трахома, но могат да възникнат и при паратрахомен конюнктивит.

Изследванията през последните години разкриха нова униформазаразен вирусно заболяванеоко - епидемичен кератоконюнктивит и цитологично изследване на конюнктивални остъргвания при това заболяване направи възможно откриването на особени включвания в епителните клетки, напълно различни от телата на Prsvaček (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).

Приложение бактериологичен методдава възможност за изолиране на патогена в чиста култура от материал, получен от пациент, и идентифицирането му въз основа на изследването на набор от свойства. Повечето бактерии са способни да се култивират върху различни изкуствени хранителни среди (с изключение на хламидия и рикетсия), поради което бактериологичният метод има важнопри диагностицирането на много инфекциозни заболявания.

Ако се получи положителен резултат, бактериологичният метод позволява да се определи чувствителността на изолирания патоген към антимикробни лекарства. Ефективността на това изследване обаче зависи от много параметри, по-специално от условия за събиране на материали него транспортдо лабораторията.

ДА СЕ основни изискванияизискванията за подбор и транспортиране на материал за бактериологично изследване включват:

• вземане на материал преди началото на етиотропното лечение;
• спазване на стерилни условия при събиране на материал;
• техническа изправност на материалния сбор;
• достатъчно количествоматериал;
• осигуряване на температурни условия за съхранение и транспортиране на материала;
• минимизиране на интервала от време между събирането на материал и засяването върху твърди хранителни среди.

Транспортирането на материала до лабораторията трябва да се извърши възможно най-скоро, но не повече от 1-2 часа след вземането му. Пробите от материали трябва да се съхраняват при определена температура; по-специално, обикновено стерилни материали (кръв, цереброспинална течност) се съхраняват и доставят в лабораторията при 37 °C. Нестерилни материали (урина, секрет респираторен тракти т.н.) се съхраняват в стайна температуране повече от 1-2 часа или не повече от едно денонощие при 4 °C (условия на домашен хладилник). Ако е невъзможно да се доставят проби в лабораторията в рамките на регламентирания период от време, се препоръчва да се използват транспортни среди, предназначени да запазят жизнеспособността на патогените при условия на съхранение.

Кръв за изследванетрябва да се вземе от пациента в периода на повишаване на телесната температура, в началото на началото на треската. Препоръчително е да се изследват 3-4 кръвни проби, взети на интервали от 4-6 часа, което е оправдано от гледна точка на намаляване на риска от „липсваща“ преходна бактериемия и повишаване на способността за потвърждаване на етиологичната роля на изолирана опортюнистична микрофлора от кръвта, ако тази микрофлора се открие в няколко проби венозна кръв. Кръвна проба в количество от 10 ml за възрастен и 5 ml за деца се инокулира в най-малко две бутилки с аеробни и анаеробни микроорганизмив съотношение 1:10. Препоръчва се едно изследване на артериална кръв.

Предприеме гръбначно-мозъчна течност (CSF) се извършва от лекар, когато лумбална пункцияв количество 1-2 ml в суха стерилна епруветка. Пробата веднага се доставя в лабораторията, където веднага започва и нейното изследване. Ако това не е възможно, материалът се съхранява при 37 °C за няколко часа. Значително увеличава количеството положителни резултатибактериологично изследване чрез инокулиране на 1-2 капки CSF в епруветка, съдържаща полутечна среда с глюкоза и в петриево блюдо с "кръвен" агар. За изпращане на материала използвайте изотермични кутии, нагревателни подложки, термоси или други опаковки, където температурата се поддържа около 37 °C.

Екскретиза бактериологично изследване 3-5 g се вземат със стерилни дървени шпатули в стерилен съд с плътно затварящ се капак. Изследването на събрания материал трябва да започне не по-късно от 2 часа. Ако не е възможно да започне изследването в рамките на това време, трябва да се вземе малко количество материал и да се постави в подходяща транспортна среда. Когато събирате изпражнения, трябва да се стремите да изпратите патологични примеси (слуз, гной, епителни частици и др.) За изследване, ако има такива, като избягвате въвеждането на кръвни примеси, които имат бактерицидни свойства, в материала.

За вземане на материал могат да се използват ректални тампони (с памучен накрайник). Тампонът трябва да се навлажни със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид или транспортна среда (но не маслен гел). Въвежда се през ректума на дълбочина 5-6 см и, като завъртите тампона, внимателно го отстранете, като наблюдавате появата на фекален цвят върху тампона. Тампонът се поставя в суха епруветка, ако изследването на материала започне в рамките на 2 часа, в противен случай - в транспортна среда.

пикая(средна порция свободно отделена урина) в количество 3-5 мл се събира в стерилен съд след щателна тоалетна на външните полови органи. За предпочитане е да се вземат проби от сутрешна урина.

Жлъчкасъбрани по време на дуоденална интубация в лечебната зала поотделно на порции A, B и C в три стерилни епруветки, като се спазват правилата за асептика.

Вода за стомашна промивкасъбрани в стерилни буркани в количество от 20-50 мл. Трябва да се има предвид, че стомашната промивка в тези случаи се извършва само безразлично (без бактериостатично или бактерициден ефектвърху микроорганизми) разтвори – по-добри сварена вода(без добавяне на сода, калиев перманганат и др.).

храчки. Сутрешната храчка, отделена по време на пристъп на кашлица, се събира в стерилен буркан. Преди кашлица пациентът мие зъбите си и изплаква устата си с преварена вода, за да отстрани механично остатъците от храна, десквамирания епител и микрофлората. устната кухина.

Бронхиална промивна вода. По време на бронхоскопия се прилагат не повече от 5 ml изотоничен разтворнатриев хлорид и след това го засмуква в стерилна епруветка.

Секреция от фаринкса, устата и носа. Материал от устната кухина се взема на гладно или 2 часа след хранене със стерилен памучен тампон или лъжица от лигавицата и засегнатите от нея участъци на входовете на каналите. слюнчените жлези, повърхността на езика, от язви. Ако има филм, отстранете го със стерилна пинсета. Материалът от носната кухина се взема със сух стерилен памучен тампон, който се вкарва дълбоко в носната кухина. Материал от назофаринкса се взема със стерилен заден фарингеален памучен тампон, който внимателно се вкарва през носния отвор в назофаринкса. Ако започне кашлица, тампонът не се отстранява, докато кашлицата не премине. За изследване за дифтерия филмите и слузта от носа и гърлото се изследват едновременно, като материалът се взема с различни тампони.

Изследваният материал се инокулира върху твърди хранителни среди специални техникиза да се получи растеж на отделни колонии от микроорганизми, които след това се отсяват, за да се изолира чиста култура на патогена.

Някои видове бактерии се изолират с помощта на селективни среди, които инхибират растежа на чужди микроорганизми или съдържат вещества, които стимулират растежа на определени патогенни микроби.

Микроорганизми, изолирани върху хранителни среди идентифицирам, т.е. определя техния вид или тип. IN напоследъкЗа идентификация в здравната практика се използват микротест системи, които представляват панели с набор от диференциално диагностични среди, което ускорява изследването. Микротест системите се използват и за определяне на чувствителността на микроорганизмите към антимикробни лекарства чрез разреждане на антибиотика в течна хранителна среда.

При оценка на резултатите от бактериологичното изследване лекарят трябва да вземе предвид това отрицателен резултатне винаги означава липса на патоген и може да бъде свързано с употребата на антимикробни лекарства, висока микроцидна активност на кръвта и технически грешки. Откриване на патогенен микроб в материал от болен без връзка с клинична картинавъзможно в случай на реконвалесцентно, здраво или преходно бактериално носителство.

Изолиране от кръв при спазване на всички правила на асептиката опортюнистични микроорганизми(Staphylococcus epidermidis, коли) и дори сапрофитите трябва да се считат за проява на бактериемия, особено ако тези микроби се намират в повече от една проба от материал или в различни субстрати (кръв, урина), тъй като с намаляване на имунореактивността на тялото, тези и други „ непатогенните” микроорганизми могат да бъдат патогени инфекциозни процеси, включително сепсис.

Има известна трудност интерпретация на резултатите от бактериологично изследване на нестерилни среди, а именно доказателство за етиологичната роля на опортюнистични микроорганизми. В този случай се вземат предвид такива показатели като вида на изолираните култури, броя на микробните клетки от даден тип в материала, повторното им изолиране по време на заболяването, наличието на монокултура или асоциация на микроорганизъм.

Юшчук Н.Д., Венгеров Ю.Я.

Мишена:

1. Овладяване на третия етап от бактериологичния метод за диагностика на инфекциозни заболявания.

Зная:

1. Целта и последователността на извършване на етап III от бактериологичния метод за изолиране на чисти култури от аеробни микроорганизми.

2. Понятието „тип“. Типови критерии.

3. Метаболизъм на микроорганизмите и неговите особености.

4. Принцип и методи за изследване на биохимичната активност на микроорганизмите.

5. Предназначение и методи за определяне на антибиограми на микроорганизми в клиничната микробиология.

Умейте да:

1. Определете чистотата на изследваната култура.

2. Засейте изследваната култура върху „пъстър ред“, среда за определяне на подвижността.

3. Определяне на антибиограмата на тест културата чрез метода на дискова дифузия.

Контролни въпроси:

1. Целта и последователността на изпълнение на етап III от бактериологичния метод за изолиране на аероби.

2. Методи за определяне на чистотата на изследваната култура.

3. Класификация на микроорганизмите по начин на хранене. Механизми за пристигане хранителни веществав бактериална клетка.

4. Ензими на микроорганизми; тяхното значение за клетъчния метаболизъм. Конститутивни и индуцируеми ензими.

5. Целта и методите за изследване на биохимичната активност на микроорганизмите в микробиологичната практика.

6. Директни и индиректни методи за определяне на подвижността на микроорганизмите.

7. Дисков дифузионен метод за определяне на антибиограми: същност, метод на настройка.

Задачи, изпълнени по време на урока (UIRS):

1. Извършете етап III от бактериологичния метод за изолиране на чисти култури от аероби:

Определяне на чистотата на изолираната култура;

Засейте чистата опитна култура в къс „пъстър ред“;

Посейте тестовата култура в колона с полутечен агар;

Определете антибиограмата на тестовата култура, като използвате метода на дисковата дифузия.

2. Запознайте се със системи за биохимична идентификация на бактерии.

Насокиза изпълнение на изследователската задача:

1. Извършване на етап III танк. метод за изолиране на чисти култури от аероби:

1.1. Определяне на чистотата на изолираната култура.

Чистотата на културата се определя от равномерността на растежа и наличието на микроорганизми от същия вид в препарата. Ето защо, по време на макроскопско изследване на растежа, отбелязвайки неговата интензивност (оскъдна, умерена, изобилна), прозрачност, цвят, обърнете внимание на неговата равномерност. Пригответе фиксиран препарат, като докоснете долната, средната и горната част на ставата с бримка, оцветяване по Грам и микроскоп. Запишете получените резултати в протокола и направете заключение. Ако културата, която сте изолирали, е чиста, продължете с допълнителни изследвания.

1.2. Засяване на култури в „пъстър ред“.

Инокулирайте чиста тестова култура върху „пъстър ред“: полутечна среда Hiss с индикатор за BP, въглехидрати (глюкоза, лактоза, манитол) и MPB.

Повторното засяване в полутечна среда се извършва с бактериологична игла или резервоар. с примка с диаметър 1 мм, инжектирайте в дебелината на агара, като не достигате дъното на епруветката » 1 мм. При повторно засяване в течна среда, бримка с биомасата на изследваната култура се потапя в течността, втрива се по стената на епруветката и се измива. След това между стената на епруветката и запушалката се поставят индикаторни хартии за определяне на индол и сероводород (H 2 S), без да се допуска намокряне на краищата на епруветката и запушалката хранителна среда!

Основата за изучаване на биохимичните свойства на микроорганизмите с цел тяхната идентификация е определянето на междинни и (или) крайни продукти на метаболизма. Захаролитичните и протеолитичните свойства на бактериите, които се определят върху диференциално диагностични среди, които са част от „пъстрата серия“, са от таксономично значение.

Определение захаролитични свойствапроизведени на Hiss media. Техният състав: пептонна вода, 1% въглехидрат, индикатор Андреде (BP или др.), 0,3-0,5% агар, ако средата е полутечна; ако средата е течна, тогава в епруветките се спускат поплавъци (къси стъклени тръби, запечатани в единия край).

Критерии за записване на резултатите:

· цветът на средата не се променя - културата не ферментира въглехидрати;

· цветът на средата се променя (в случай на използване на индикатора Andrede - от светло жълто до червено, BP - от розово до синьо и т.н.) - културата ферментира въглехидрати с образуването на киселинни продукти ( органични киселини);

· цветът на средата се променя и в средата се появяват газови мехурчета или плуват - културата ферментира въглехидрати с образуване на кисели и газообразни продукти.

Дефиниции протеолитични свойствасе произвежда с помощта на пептонна вода (PV) или месно-пептонен бульон (MPB), като се вземе предвид образуването на крайни продукти на протеиновия метаболизъм (пептон, аминокиселини) - индол, H 2 S и в някои случаи амоняк.

Образуването на индол е придружено от розово оцветяване на индикаторна хартия, напоена с разтвор на оксалова киселина (метод на Морел); образуване на сероводород - почерняване на индикаторна хартия, импрегнирана с оловен ацетат; образуване на амоняк - оцветяване на лакмусовата хартия в синьо.

MPB и PV също са предназначени за изследване на модела на растеж на микроорганизми в течна хранителна среда. Микробният растеж може да бъде под формата на дифузна мътност, дънна утайка или филм върху повърхността на средата.

1.3. Засяване на тестовата култура в колона с полутечен агар.

Инокулирайте тестовата култура в колона от полутечен агар, като я пробиете с помощта на резервоар. игли или резервоар. бримки с диаметър 1 мм.

Засяването на култура в колона от полутечен агар ви позволява да определите връзката й с молекулярния кислород и следователно косвено да получите представа за метода за получаване на енергия. Критерият за отчитане и оценкае природата на растежа: растеж само отгоре на средата - културата е аеробика, само в долната част на околната среда – анаеробни; отгоре и чрез инжектиране - факултативен анаероб; растеж на известно разстояние от повърхността на средата – микроаерофил.

С този метод на засяване може да се определи подвижността на факултативни анаеробни микроорганизми. Растежът е строго съобразен с инжекцията - културата е неподвижна, дифузният растеж е подвижен.

1.4. Определяне на антибиограмата на изследваната култура по метода на дисковата дифузия.

Клиницистите провеждат етиотропна антимикробна химиотерапия, като вземат предвид резултатите от изследването. метод, който заедно с изолирането на патогена от клиничния материал и неговата идентификация включва определяне на чувствителността към антимикробна химиотерапия. За определяне на чувствителността в Русия най-често се използва методът на дискова дифузия (DDM).

За да определите антибиограмата, пригответе суспензия от тест културата в стерилен съд физиологичен разтвори регулирайте до 0,5 мътност по McFarland (1,5 х 108 CFU/ml). За инокулация използвайте стерилен памучен тампон, който се потапя в епруветка, съдържаща суспензията, завърта се така, че да е равномерно наситен и след това старателно натиснете върху сухата стена на епруветката над нивото на течността чрез усукване. Засявайки културата върху чаша с AGV среда, нанесете удари в три посоки под ъгъл от 60 °, като всеки път завъртате чашата около оста си. Накрая направете няколко въртеливи движения с тампона по краищата на повърхността на агара. След това оставете културите да изсъхнат за няколко минути при стайна температура в чаши със затворени капаци. Поставете антибиотичните дискове не по-късно от 15 минути след инокулацията, като използвате стерилни пинсети или автоматичен дозатор. Разстоянието от диска до ръба на чашата и между дисковете трябва да бъде 15-20 мм. Така на една чаша с диаметър 100 мм се поставят не повече от 6 диска. Всеки диск трябва внимателно да се притисне с пинсети, за да се осигури контакт с хранителната среда. Веднага след нанасяне на дисковете, надпишете чашите и ги поставете обърнати в термостат на 37° за 18-20 часа.

Техника за бактериологично изследване. Изолирането на патогена от кръвта (хемокултура) е ранен методдиагностика на заболявания. Бактериемията при пациенти с коремен тиф-паратиф се появява в края инкубационен периоди не изчезва през целия фебрилен период на заболяването и по време на рецидиви. Резултатите от бактериологичното изследване до известна степен зависят от времето на събиране на материала и количеството инокулирана кръв. Колкото по-рано се направи хемокултура от началото на заболяването, толкова по-голяма е вероятността за откриване на патогена. През първата седмица на коремен тиф кръвта на пациента се взема от кубиталната вена в количество от 10 ml, повече късни датии при рецидиви - 20 мл.

В първия ден от изследванетокръв се инокулира в съотношение 1:10 в една от течна среда. Посоченото съотношение трябва да се спазва стриктно, тъй като при по-малко разреждане на кръвта микробите могат да умрат поради бактерицидния му ефект. За сеитба използвайте: 10% или 20% разтвор на жлъчен бульон, излят в бутилки от 50-100 ml, месо-пептонен бульон с добавяне на 1% глюкоза, стерилна дестилирана вода - по метода на Н. Н. Клодницки, в който лизис на червените кръвни клетки, техните разпадни продукти служат като добра среда за размножаване на бактериите. Можете също така да използвате стерилна чешмяна вода. най-добри резултатиполучен чрез инокулиране на материал в жлъчен бульон. Ако не е възможно да се култивира кръвта на място, серумът и съсирекът или цитратната кръв (10 ml кръв, излята в епруветка, съдържаща 2 ml 5% стерилен натриев цитрат) се изпращат в лабораторията. Кръвният съсирек се раздробява в лабораторията и се инокулира в една от изброените среди. Бутилките се поставят в термостат при температура 37°C.

Втори ден от изследването. След 14-24 часа от началото на изследването материалът се инокулира в петриево блюдо върху среда Endo или среда с еозин и метиленово синьо (среда на Levine). Не се препоръчва използването на среда на Ploskirev за сеитба, тъй като тиф-паратифните бацили, открити в кръвта, са задължителни паратрофи по вид хранене и не променят незабавно този тип хранене на метатрофични (т.е. мъртви органични субстрати). Следователно, на тази среда, съдържаща соли жлъчни киселини, бацилите на коремния тиф се развиват много слабо или изобщо не се развиват. Ако след първата инокулация няма бактериален растеж, следващите инокулации се извършват след 48, 72 часа и на 5-ия и 10-ия ден. Ако патогенът не може да бъде изолиран, се дава отрицателен отговор. В съмнителни случаи се препоръчва посевът да се извършва периодично - веднъж на 3-4 дни - до 24-ия ден от момента на вземане на материала. На 7-ия ден все още се дава отрицателен отговор.

Трети ден от изследването. Идентифицират се „подозрителни“ колонии, отглеждани върху среда Endo и Levin (на среда Endo, колониите от патогенни микроби са безцветни), за които 2-3 колонии се субкултивират върху наклонен агар и среда Ressel.

Четвърти ден на изследване. Резултатите от инокулацията върху средата на Ressel се вземат предвид и се записват, а морфологичните свойства на изолираните култури се изследват в натривка, оцветена по Грам. Определя се подвижността - наличието или отсъствието на флагели - във висяща или натрошена капка, взета от 4-6-часова бульонна култура. За да направите това, агар култура (една бримка) се инокулира в 1 ml леко затоплен бульон. Избраните култури (2-3 епруветки) се засяват повторно върху среда на Hiss с манитол, захароза и наклонен агар, както и в 2 епруветки с месно-пептонен бульон, в който ленти от филтърна хартия, навлажнени със специални разтвори за определяне на водорода сулфид и индол (разгънати) се поставят под запушалките "пъстър ред").

Пети ден изследвания. Промените се записват в разширения „пъстър ред“. Ако има образуване на газ, се извършва реакция на аглутинация със смес от серуми на Salmonella. При положителна реакцияизвършва реакция на аглутинация с О- и Н-серуми и дава окончателен отговор въз основа на съвкупността от всички признаци.

Изолирането на миелокултурата се извършва чрез засяване на получения пунктат костен мозъкв 3-5 ml стерилна телешка жлъчка или в 25-30 ml 10% жлъчен бульон, поставете го в термостат и на следващия ден го субкултивирайте върху среда Endo или Wilson-Blair. В бъдеще етапите на изследване са същите.

Изолиране на бактерии от изпражненията. От 8-ия до 10-ия ден на заболяването, по-често от третата седмица, при пациенти с коремен тиф, паратиф, бактериите се отделят с изпражненията. За изследване вземете последните порции изпражнения с течна консистенция, емулгирайте в изотоничен разтвор на натриев хлорид (в съотношение 1:10) и оставете за 30 минути, докато големите частици се утаят. За сеитба се взема капка материал от повърхността на течността.

На първия ден от изследването материалът се инокулира върху обогатителна среда - жлъчен бульон, магнезий, среда на Мюлер, Кауфман - и се поставя в термостат. На втория ден от изследването обогатяващата среда се инокулира върху плаки със среда на Ploskirev, Endo или Levin и Wilson-Blair (бисмут-сулфит-агар). Впоследствие етапите на изследването са същите като при изолиране на хемокултура.

Изолирането на бактериите от групата на коремен тиф-паратиф от урината се извършва най-добре от втората до третата седмица на заболяването. Преди да вземете материала, измийте външния отвор със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид. пикочен канал; При жените е по-добре урината да се взема с катетър. За изследване се вземат 20-30 ml урина. След центрофугиране утайката се инокулира в 2 панички със среда на Плоскирев или бисмут-сулфитен агар. Супернатантата се инокулира върху обогатителна среда (10% жлъчен бульон) и се поставя в термостат за 24 часа, след което се инокулира в 2 чаши от една от избраните среди. Изолираните колонии се идентифицират по обичайния начин.

Изследване на дуоденално съдържание - жлъчка. Методът се използва по-често в етапа на възстановяване. Жлъчката се събира по време на сондиране в стерилни епруветки. Дуоденалното съдържимо се инокулира във флакони с 50 ml бульон, а останалата част от материала, заедно с инокулациите, се поставя в термостат при 37 ° C. На следващия ден се инокулира в 2 чаши с плътна диференциална среда . Изолираните колонии се идентифицират с помощта на описания метод.

Силно чувствителен и обещаващ в ранна диагностикакоремен тиф и паратиф е имунофлуоресцентен метод, който изследва кръв от първите дни на заболяването, изпражнения от 10-ия ден, дуоденално съдържание на 10-ия ден нормална температуратела. Тиф-паратифните бактерии се маркират със специфични флуоресцентни серуми, които впоследствие се определят чрез флуоресцентна микроскопия. Методът ви позволява да диагностицирате заболяването 10-12 часа от началото на изследването.

Серологична диагностика на коремен тиф-паратиф. От втората седмица на заболяването в кръвта на пациентите се появяват специфични антитела, които могат да бъдат определени с помощта на реакцията на Widal. При коремен тиф и паратиф се натрупват О- и след това Н-аглутинини. В хода на заболяването понякога се откриват Vi-аглутинини, но последните, за разлика от носителите, нямат диагностична стойност. Определянето в кръвта на пациенти на специфични аглутинини към причинителя на коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) може да помогне при установяването на диагноза, както при остър периодзаболяване и по време на възстановяване.

За салмонелоза реакцията на Widal е спомагателен диагностичен метод. Трябва да се помни, че често се срещат форми на заболяването със слабо изразен имунен отговор. Особено често се наблюдават ниски титри на аглутинини, дори липсата им, при пациенти, лекувани с антибиотици.

За реакцията на Widal се вземат 1-3 ml кръв от пръст или кубитална вена в стерилна епруветка. За да се ускори кръвосъсирването, се поставя в термостат за 30 минути. Съсирената кръв се обикаля със стъклена пипета и се поставя в хладилника, докато се появи бистър, утаен серум. Съсирекът се използва за култура (хемокултура). Реакцията на аглутинация се извършва с Н- и О-тифоидни, А- и В-паратифоидни диагностикуми. Серумът се разрежда, започвайки от титър от 1:100 до 1:800, съгласно следната процедура. 9,9 ml стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид и 0,1 ml тестов серум се изсипват в епруветка, за да се получи разреждане 1:100. 5 ml разреден серум, по 1 ml всяка, се изсипват в 4 епруветки (според броя на антигените, използвани в реакцията на Widal) и в една, служеща за серумна контрола. От останалите 5 ml серум (разреждане 1:100) се излива 1 ml и към 4 ml се добавят 4 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид и се получава разреждане 1:200. 4 ml от разреждане 1:200 също се наливат в 4 епруветки по 1 ml всяка, а към останалите 4 ml отново се добавят 4 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид, за да се получи разреждане 1:400. Последващите разреждания (1:800, 1:1600) се правят, както е описано. 1 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид се налива в 4 епруветки, които служат за антигенен контрол. 1-2 капки от съответния диагностикум се наливат във всички епруветки, с изключение на тези, които служат за серумен контрол. Стелажът с епруветки се разклаща и се поставя в термостат при 37 ° C в продължение на 24 часа. Интензитетът на реакцията се отбелязва след 24 часа, при наличие на клинични прояви, титърът на Widal се разрежда най-малко.

Трябва да се има предвид, че тази реакция може да бъде положителна и при други заболявания - туберкулоза, малария, бруцелоза, злокачествени новообразуванияи някои състояния (бременност). Реакцията на Widal може да бъде положителна при здрави индивиди (ежедневна реакция), при ваксинирани и преболедували в миналото (анамнестична реакция). За да се увеличи специфичността на реакцията на Widal, Fischer предложи разреждане на серума хипертоничен разтворнатриев хлорид (2,9 и 5,8%). Това води до отслабване или елиминиране на груповите реакции. Стойността на реакцията на аглутинация се увеличава с многократни изследвания, когато се установи повишаване на титъра на антителата с динамиката на заболяването. При паратиф А реакцията на Widal може да бъде отрицателна или титърът на специфичните антитела е по-малък от груповото антитяло.

IN последните годиниза признание чревна групазаболявания широко се използва реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA) с частични антигени на тифоидни бактерии. RPGA има висока чувствителност и специфичност и е положителен от 5-ия ден на заболяването. Минималният диагностичен титър при пациенти с коремен тиф, паратиф и салмонелоза с О-антиген е 1:200. Реакцията се наблюдава във времето, за да се определи повишаването на титъра на антитялото.

Методи лабораторна диагностикабактериално носителство при коремен тиф и паратиф. Бактериологичното изследване на изпражненията, урината и съдържанието на дванадесетопръстника се извършва съгласно общоприетите методи. Най-добри резултати се получават при използване на селенитна среда.

Поради честотата на бактериална изолация често не е възможно да се изолира патогенът. В по-голямата част от носителите на тифни бацили се откриват микроби, съдържащи Vi-антиген, поради което Vi-антитела се появяват в кръвта на остри и хронични носители (те са по-рядко срещани в кръвта на пациентите). Диагностичният титър на реакцията е 1:20 или по-висок. Успоредно с реакцията на Vi-аглутинация (с нагрят серум), реакцията на Widal (с нативен серум) се извършва с H- и O-тифоидни диагностикуми. В серума на носителите на тифоидни бактерии Н-антитела в титър от 1:200 до 1:800 се откриват в 60-80% от случаите. Наличието на комбинация от H- и Vi-антитела е от особено диагностично значение за идентифициране на носителството на коремен тиф.

от допълнителни методиизследванията за откриване на носителство на тифни бацили използват тест за кожна алергия с тифин, както и RPGA с Vi-антиген.

По този начин важно условие за успеха на борбата с тиф-паратифните заболявания е ранното и пълно идентифициране и неутрализиране на източника на инфекции. Понастоящем Коремен тифвъзниква спорадично. В същото време ходът на заболяването е по-кратък и не е придружен от всички типични признаци на класическата форма, което усложнява клиничното разпознаване.

Във връзка с горното е важен цялостен лабораторен преглед.