Използването на бактериологичния метод позволява да се изолира патогенът в чиста култура от материал, получен от пациента, и да се идентифицира въз основа на изследването на набор от свойства. Повечето бактерии са способни да се култивират върху различни изкуствени хранителни среди (с изключение на хламидия и рикетсия), поради което бактериологичният метод има важнопри диагностицирането на много инфекциозни заболявания.
Ако се получи положителен резултат, бактериологичният метод позволява да се определи чувствителността на изолирания патоген към антимикробни лекарства. Ефективността на това изследване обаче зависи от много параметри, по-специално от условия за събиране на материали него транспортдо лабораторията.
ДА СЕ основни изискванияизисквания за подбор и транспортиране на материал за бактериологично изследване, включват:
- вземане на материал преди началото на етиотропното лечение;
- спазване на стерилни условия при събиране на материал;
- техническа изправност на материалния сбор;
- достатъчно количествоматериал;
- осигуряване на температурни условия за съхранение и транспортиране на материала;
- минимизиране на интервала от време между събирането на материал и засяването върху твърди хранителни среди.
Транспортирането на материала в лабораторията трябва да се извърши незабавно, ако е възможно, но не повече от 1-2 часа след вземането му. Пробите от материали трябва да се съхраняват при определена температура; по-специално, обикновено стерилни материали (кръв, цереброспинална течност) се съхраняват и доставят в лабораторията при 37 °C. Нестерилни материали (урина, секрет респираторен тракти т.н.) се съхраняват в стайна температуране повече от 1-2 часа или не повече от един ден при 4 °C (условия на домашен хладилник). Ако е невъзможно да се доставят проби в лабораторията в рамките на регламентирания период от време, се препоръчва да се използват транспортни среди, предназначени да запазят жизнеспособността на патогените при условия на съхранение.
Кръв за изследванетрябва да се вземе от пациента в периода на повишаване на телесната температура, в началото на началото на треската. Препоръчително е да се изследват 3-4 кръвни проби, взети на интервали от 4-6 часа, което е оправдано от гледна точка на намаляване на риска от „липсваща“ преходна бактериемия и повишаване на способността за потвърждаване на етиологичната роля на изолирана опортюнистична микрофлора от кръвта, ако тази микрофлора се открие в няколко проби венозна кръв. Кръвна проба в количество от 10 ml за възрастен и 5 ml за деца се инокулира в най-малко две бутилки с аеробни и анаеробни микроорганизмив съотношение 1:10. Препоръчва се едно изследване на артериална кръв.
Предприеме гръбначно-мозъчна течност (CSF) се извършва от лекар, когато лумбална пункцияв количество 1-2 ml в суха стерилна епруветка. Пробата веднага се доставя в лабораторията, където веднага започва и нейното изследване. Ако това не е възможно, материалът се съхранява при 37 °C за няколко часа. Значително увеличава количеството положителни резултатибактериологично изследване чрез инокулиране на 1-2 капки CSF в епруветка, съдържаща полутечна среда с глюкоза и в петриево блюдо с "кръвен" агар. За изпращане на материала използвайте изотермични кутии, нагревателни подложки, термоси или други опаковки, където температурата се поддържа около 37 °C.
Екскретиза бактериологично изследване 3-5 g се вземат със стерилни дървени шпатули в стерилен съд с плътно затварящ се капак. Изследването на събрания материал трябва да започне не по-късно от 2 часа. Ако не е възможно да започне изследването в рамките на това време, трябва да се вземе малко количество материал и да се постави в подходяща транспортна среда. Когато събирате изпражнения, трябва да се стремите да изпратите патологични примеси (слуз, гной, епителни частици и др.) За изследване, ако има такива, като избягвате въвеждането на кръвни примеси, които имат бактерицидни свойства, в материала.
За вземане на материал могат да се използват ректални тампони (с памучен накрайник). Тампонът трябва да се навлажни със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид или транспортна среда (но не маслен гел). Въвежда се през ректума на дълбочина 5-6 см и, като завъртите тампона, внимателно го отстранете, като наблюдавате появата на фекален цвят върху тампона. Тампонът се поставя в суха епруветка, ако изследването на материала започне в рамките на 2 часа, в противен случай - в транспортна среда.
пикая(средна порция свободно отделена урина) в количество 3-5 мл се събира в стерилен съд след щателна тоалетна на външните полови органи. За предпочитане е урината да се събира сутрин.
Жлъчкасъбрани по време на дуоденална интубация в лечебната зала поотделно на порции A, B и C в три стерилни епруветки, като се спазват правилата за асептика.
Вода за стомашна промивкасъбрани в стерилни буркани в количество от 20-50 мл. Трябва да се има предвид, че стомашната промивка в тези случаи се извършва само безразлично (без бактериостатично или бактерициден ефектвърху микроорганизми) разтвори – по-добри сварена вода(без добавяне на сода, калиев перманганат и др.).
храчки. Сутрешната храчка, отделена по време на пристъп на кашлица, се събира в стерилен буркан. Преди кашлица пациентът мие зъбите си и изплаква устата си с преварена вода, за да отстрани механично остатъците от храна, десквамирания епител и микрофлората. устната кухина.
Бронхиална промивна вода. По време на бронхоскопия се инжектират не повече от 5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид, последвано от засмукване в стерилна тръба.
Секреция от фаринкса, устата и носа. Материал от устната кухина се взема на гладно или 2 часа след хранене със стерилен памучен тампон или лъжица от лигавицата и засегнатите от нея участъци на входовете на каналите. слюнчените жлези, повърхността на езика, от язви. Ако има филм, отстранете го със стерилна пинсета. Материалът от носната кухина се взема със сух стерилен памучен тампон, който се вкарва дълбоко в носната кухина. Материал от назофаринкса се взема със стерилен заден фарингеален памучен тампон, който внимателно се вкарва през носния отвор в назофаринкса. Ако започне кашлица, тампонът не се отстранява, докато кашлицата не премине. За изследване за дифтерия филмите и слузта от носа и гърлото се изследват едновременно, като материалът се взема с различни тампони.
Тестовият материал се инокулира върху твърда хранителна среда с помощта на специални техникиза да се получи растеж на отделни колонии от микроорганизми, които след това се отсяват, за да се изолира чиста култура на патогена.
Някои видове бактерии се изолират с помощта на селективни среди, които инхибират растежа на чужди микроорганизми или съдържат вещества, които стимулират растежа на определени патогенни микроби.
Микроорганизми, изолирани върху хранителни среди идентифицирам, т.е. определя техния вид или тип. IN напоследъкЗа идентификация в здравната практика се използват микротест системи, които представляват панели с набор от диференциално диагностични среди, което ускорява изследването. Микротест системите се използват и за определяне на чувствителността на микроорганизмите към антимикробни лекарства чрез разреждане на антибиотика в течна хранителна среда.
При оценка на резултатите от бактериологичното изследване лекарят трябва да вземе предвид това отрицателен резултатне винаги означава липса на патоген и може да бъде свързано с употребата на антимикробни лекарства, висока микроцидна активност на кръвта и технически грешки. Откриване на патогенен микроб в материал от болен без връзка с клинична картинавъзможно в случай на реконвалесцентно, здраво или преходно бактериално носителство.
Изолиране от кръвта, при спазване на всички правила на асептиката, на опортюнистични микроорганизми (staphylococcus epidermidis, коли) и дори сапрофитите трябва да се считат за проява на бактериемия, особено ако тези микроби се намират в повече от една проба от материал или в различни субстрати (кръв, урина), тъй като с намаляване на имунореактивността на тялото, тези и други „ непатогенните” микроорганизми могат да бъдат патогени инфекциозни процеси, включително сепсис.
Има известна трудност интерпретация на резултатите от бактериологично изследване на нестерилни среди, а именно доказателство за етиологичната роля на опортюнистични микроорганизми. В този случай се вземат предвид такива показатели като вида на изолираните култури, броя на микробните клетки от даден тип в материала, повторното им изолиране по време на заболяването, наличието на монокултура или асоциация на микроорганизъм.
Юшчук Н.Д., Венгеров Ю.Я.
Техника за бактериологично изследване. Изолирането на патогена от кръвта (хемокултура) е ранен методдиагностика на заболявания. Бактериемията при пациенти с коремен тиф-паратиф се появява в края инкубационен периоди не изчезва през целия фебрилен период на заболяването и по време на рецидиви. Резултатите от бактериологичното изследване до известна степен зависят от времето на събиране на материала и количеството инокулирана кръв. Колкото по-рано се направи хемокултура от началото на заболяването, толкова по-голяма е вероятността за откриване на патогена. През първата седмица на коремен тиф кръвта на пациента се взема от кубиталната вена в количество от 10 ml, повече късни датии при рецидиви - 20 мл.
В първия ден от изследванетокръв се инокулира в съотношение 1:10 в една от течна среда. Посоченото съотношение трябва да се спазва стриктно, тъй като при по-малко разреждане на кръвта микробите могат да умрат поради бактерицидния му ефект. За инокулация използвайте: 10% или 20% разтвор на жлъчен бульон, излят в бутилки от 50-100 ml, месо-пептонен бульон с добавяне на 1% глюкоза, стерилна дестилирана вода - по метода на Н. Н. Клодницки, в който лизис на червени кръвни клетки, продуктите от тяхното разпадане служат като добри хранителна средаза растежа на бактериите. Можете също така да използвате стерилна чешмяна вода. най-добри резултатиполучен чрез инокулиране на материал в жлъчен бульон. Ако не е възможно да се култивира кръвта на място, серумът и съсирекът или цитратната кръв (10 ml кръв, излята в епруветка, съдържаща 2 ml 5% стерилен натриев цитрат) се изпращат в лабораторията. Кръвният съсирек се раздробява в лабораторията и се инокулира в една от изброените среди. Бутилките се поставят в термостат при температура 37°C.
Втори ден от изследването. След 14-24 часа от началото на изследването материалът се инокулира в петриево блюдо върху среда Endo или среда с еозин и метиленово синьо (среда на Levine). Не се препоръчва използването на среда на Ploskirev за сеитба, тъй като тиф-паратифните бацили, открити в кръвта, са задължителни паратрофи по вид хранене и не променят незабавно този тип хранене на метатрофични (т.е. мъртви органични субстрати). Следователно, на тази среда, съдържаща соли жлъчни киселини, бацилите на коремния тиф се развиват много слабо или изобщо не се развиват. Ако след първата инокулация няма бактериален растеж, следващите инокулации се извършват след 48, 72 часа и на 5-ия и 10-ия ден. Ако патогенът не може да бъде изолиран, се дава отрицателен отговор. В съмнителни случаи се препоръчва посевът да се извършва периодично - веднъж на всеки 3-4 дни - до 24-ия ден от момента на вземане на материала. На 7-ия ден все още се дава отрицателен отговор.
Трети ден от изследването. Идентифицират се „подозрителни“ колонии, отглеждани върху среда Endo и Levin (на среда Endo, колониите от патогенни микроби са безцветни), за които 2-3 колонии се субкултивират върху наклонен агар и среда Ressel.
Четвърти ден на изследване. Резултатите от инокулацията върху средата на Ressel се вземат предвид и се записват, а морфологичните свойства на изолираните култури се изследват в натривка, оцветена по Грам. Определя се подвижността - наличието или отсъствието на флагели - във висяща или натрошена капка, взета от 4-6-часова бульонна култура. За да направите това, агар култура (една бримка) се инокулира в 1 ml леко затоплен бульон. Избраните култури (2-3 епруветки) се засяват отново върху среда на Hiss с манитол, захароза и наклонен агар, както и в 2 епруветки с месно-пептонен бульон, в който ленти от филтърна хартия, навлажнени със специални разтвори за определяне на водорода сулфид и индол (разгънати) се поставят под запушалките "пъстър ред").
Пети ден изследвания. Промените се записват в разширения „пъстър ред“. Ако има образуване на газ, се извършва реакция на аглутинация със смес от серуми на Salmonella. При положителна реакцияизвършва реакция на аглутинация с О- и Н-серуми и дава окончателен отговор въз основа на съвкупността от всички признаци.
Изолирането на миелокултурата се извършва чрез засяване на получения пунктат костен мозъкв 3-5 ml стерилна телешка жлъчка или в 25-30 ml 10% жлъчен бульон, поставете го в термостат и на следващия ден го субкултивирайте върху среда Endo или Wilson-Blair. В бъдеще етапите на изследване са същите.
Изолиране на бактерии от изпражненията. От 8-ия до 10-ия ден на заболяването, по-често от третата седмица, при пациенти с коремен тиф, паратиф, бактериите се отделят с изпражненията. За изследване вземете последните порции изпражнения с течна консистенция, емулгирайте в изотоничен разтворнатриев хлорид (в съотношение 1:10) и оставете за 30 минути, докато големите частици се утаят. За сеитба се взема капка материал от повърхността на течността.
На първия ден от изследването материалът се инокулира върху хранителна среда за обогатяване - жлъчен бульон, магнезий, среда на Мюлер, Кауфман - и се поставя в термостат. На втория ден от изследването обогатяващата среда се инокулира върху плаки със среда на Ploskirev, Endo или Levin и Wilson-Blair (бисмут-сулфит-агар). Впоследствие етапите на изследването са същите като при изолиране на хемокултура.
Изолирането на бактериите от групата на коремен тиф-паратиф от урината се извършва най-добре от втората до третата седмица на заболяването. Преди да вземете материала, измийте външния отвор със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид. пикочен канал; При жените е по-добре урината да се взема с катетър. За изследване се вземат 20-30 ml урина. След центрофугиране утайката се инокулира в 2 панички със среда на Плоскирев или бисмут-сулфитен агар. Супернатантата се инокулира върху обогатителна среда (10% жлъчен бульон) и се поставя в термостат за 24 часа, след което се инокулира в 2 чаши от една от избраните среди. Изолираните колонии се идентифицират по обичайния начин.
Изследване на дуоденално съдържание - жлъчка. Методът се използва по-често в етапа на възстановяване. Жлъчката се събира по време на сондиране в стерилни епруветки. Дуоденалното съдържимо се инокулира във флакони с 50 ml бульон, а останалата част от материала, заедно с инокулациите, се поставя в термостат при 37 ° C. На следващия ден се инокулира в 2 чаши с плътна диференциална среда . Изолираните колонии се идентифицират с помощта на описания метод.
Силно чувствителен и обещаващ в ранна диагностикакоремен тиф и паратиф е имунофлуоресцентен метод, който изследва кръв от първите дни на заболяването, изпражнения от 10-ия ден, дуоденално съдържание на 10-ия ден нормална температуратела. Тиф-паратифните бактерии се маркират със специфични флуоресцентни серуми, които впоследствие се определят чрез флуоресцентна микроскопия. Методът ви позволява да диагностицирате заболяването 10-12 часа от началото на изследването.
Серологична диагностика на коремен тиф-паратиф. От втората седмица на заболяването в кръвта на пациентите се появяват специфични антитела, които могат да бъдат определени с помощта на реакцията на Widal. При коремен тиф и паратиф се натрупват О- и след това Н-аглутинини. В хода на заболяването понякога се откриват Vi-аглутинини, но последните, за разлика от носителите, нямат диагностична стойност. Определянето в кръвта на пациенти на специфични аглутинини към причинителя на коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) може да помогне при установяването на диагноза, както при остър периодзаболяване и по време на възстановяване.
За салмонелоза реакцията на Widal е спомагателен диагностичен метод. Трябва да се помни, че често се срещат форми на заболяването със слабо изразен имунен отговор. Особено често се наблюдават ниски титри на аглутинини, дори липсата им, при пациенти, лекувани с антибиотици.
За реакцията на Widal се вземат 1-3 ml кръв от пръст или кубитална вена в стерилна епруветка. За да се ускори кръвосъсирването, се поставя в термостат за 30 минути. Съсирената кръв се обикаля със стъклена пипета и се поставя в хладилник, докато се появи бистър, утаен серум. Съсирекът се използва за култура (хемокултура). Реакцията на аглутинация се извършва с Н- и О-тифоидни, А- и В-паратифоидни диагностикуми. Серумът се разрежда, започвайки от титър от 1:100 до 1:800, съгласно следната процедура. 9,9 ml стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид и 0,1 ml тестов серум се изсипват в епруветка, за да се получи разреждане 1:100. 5 ml разреден серум, по 1 ml всяка, се изсипват в 4 епруветки (според броя на антигените, използвани в реакцията на Widal) и в една, служеща за серумна контрола. От останалите 5 ml серум (разреждане 1:100) се излива 1 ml и към 4 ml се добавят 4 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид и се получава разреждане 1:200. 4 ml от разреждане 1:200 също се наливат в 4 епруветки по 1 ml всяка, а към останалите 4 ml отново се добавят 4 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид, за да се получи разреждане 1:400. Последващите разреждания (1:800, 1:1600) се правят, както е описано. 1 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид се налива в 4 епруветки, които служат за антигенен контрол. 1-2 капки от съответния диагностикум се наливат във всички епруветки, с изключение на тези, които служат за серумен контрол. Стелажът с епруветки се разклаща и се поставя в термостат при 37 ° C в продължение на 24 часа. Интензитетът на реакцията се отбелязва след 24 часа, при наличие на клинични прояви, титърът на Widal се разрежда най-малко.
Трябва да се има предвид, че тази реакция може да бъде положителна и при други заболявания - туберкулоза, малария, бруцелоза, злокачествени новообразуванияи някои състояния (бременност). Реакцията на Widal може да бъде положителна при здрави индивиди (ежедневна реакция), при ваксинирани и преболедували в миналото (анамнестична реакция). За да се увеличи специфичността на реакцията на Widal, Fischer предложи разреждане на серума хипертоничен разтворнатриев хлорид (2,9 и 5,8%). Това води до отслабване или елиминиране на груповите реакции. Стойността на реакцията на аглутинация се увеличава с многократни изследвания, когато се установи повишаване на титъра на антителата с динамиката на заболяването. При паратиф А реакцията на Widal може да бъде отрицателна или титърът на специфичните антитела е по-малък от груповото антитяло.
През последните години за признание чревна групазаболявания широко се използва реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA) с частични антигени на тифоидни бактерии. RPGA има висока чувствителност и специфичност и е положителен от 5-ия ден на заболяването. Минималният диагностичен титър при пациенти с коремен тиф, паратиф и салмонелоза с О-антиген е 1:200. Реакцията се наблюдава във времето, за да се определи повишаването на титъра на антитялото.
Методи за лабораторна диагностика на бактериално носителство при коремен тиф и паратиф. Бактериологичното изследване на изпражненията, урината и съдържанието на дванадесетопръстника се извършва съгласно общоприетите методи. Най-добри резултати се получават при използване на селенитна среда.
Поради честотата на бактериална изолация, често не е възможно да се изолира патогенът. В по-голямата част от носителите на тифни бацили се откриват микроби, съдържащи Vi-антиген, поради което Vi-антитела се появяват в кръвта на остри и хронични носители (те са по-рядко срещани в кръвта на пациентите). Диагностичният титър на реакцията е 1:20 или по-висок. Успоредно с реакцията на Vi-аглутинация (с нагрят серум), реакцията на Widal (с нативен серум) се извършва с H- и O-тифоидни диагностикуми. В серума на носителите на тифоидни бактерии Н-антитела в титър от 1:200 до 1:800 се откриват в 60-80% от случаите. Наличието на комбинация от H- и Vi-антитела има особен диагностична стойностпри идентифициране на носители на тифни бацили.
от допълнителни методипроучвания за откриване на носителство на тифни бацили използват тест за кожна алергия с тифин, както и RPGA с Vi-антиген.
По този начин важно условие за успеха на борбата с коремен тиф и паратиф е ранното и пълно идентифициране и неутрализиране на източника на инфекция. Понастоящем Коремен тифвъзниква спорадично. В същото време ходът на заболяването е по-кратък и не е придружен от всички типични признаци на класическата форма, което усложнява клиничното разпознаване.
Във връзка с горното е важен цялостен лабораторен преглед.
Възможности за използване на бактериологични изследвания в очни заболяванияограничени от достъпността на патологичния фокус. Когато се намира в задния сегмент на окото, получаването на материал за изследване често е много трудно и възможността за бактериологична диагностика в такива случаи е естествено изключена. Основната област на приложение на бактериологичната диагностика в офталмологичната практика са заболявания на външната част на окото, както и проникващи рани, при които може да се получи материал за изследване по време на хирургично лечениерани или при отстраняване на чуждо тяло. Като цяло трябва да се отбележи, че когато хирургични интервенцииОбхватът на възможностите за получаване на бактериологичен материал значително се разширява.
Получаване на материал за изследване
За получаване на материал от конюнктивалния сак се използва платинена примка (ако няма такава, можете да използвате примка, направена от спираловидна нишка на електрическа печка или друг инструмент (стъклена пръчка, шпатула и др.), Което е първо се стерилизира чрез изпичане в пламъка на спиртна горелка Прибирайки долния клепач, с охладена примка, вземете бучка конюнктивален секрет от дълбочината на долния свод кожата и ръбовете на клепачите, за да не се въведе чужда микрофлора в материала. Препоръчително е материалът да се вземе преди началото на лечението. сутрешните часовекогато течението е по-обилно. При липса на слуз и гной (например при изследване на здрава конюнктива преди операция) трябва да се използва слъзна течност или леко да се изстърже повърхността на съединителната мембрана (според Lindner). Но в такива случаи е по-добре да използвате техниката на Elynnig: поставете една капка стерилен физиологичен разтвор или бульон в конюнктивалния сак от пипетата на Пастьор и след няколко секунди изсмучете тази капка.
Според същите Общи правилавземете материал от слъзния сак, като изстискате съдържанието му и от ръба на клепача в случай на улцерозен блефарит, като първо отстраните кората от язвата.
Изисква се голямо внимание при вземане на материал от роговицата, особено при наличие на пълзяща корнеална язва. Примката (или друг тъп инструмент) трябва да бъде насочен косо към повърхността на язвата и материалът трябва да бъде взет от прогресиращия й ръб. Това изисква анестезия (3 капки 1% дикаин) и фиксиране. очна ябълка.
Като материал за изследване в случай на проникващи рани на окото можете да използвате секрет от рана (ако има такъв), като го вземете с бримка или марлев тампон, пункция на предната камера или извлечен чуждо тяло, която се поставя в стерилна епруветка с 1-2 ml физиологичен разтвор. След разклащане на епруветката разтворът се използва за изследване.
От предната камера материалът за изследване може да бъде получен от режещ инструмент по време на парацентеза или чрез пункция. След анестезия на роговицата (3 капки 1% разтвор на дикаин) и фиксиране на очната ябълка наклонено към лимба се инжектира игла от спринцовка, която се вкарва в предната камера (внимавайте да не нараните ириса и капсулата на лещата!) и 0,3 ml от съдържанието на предната камера се изсмуква.
При ендофталмит може да има нужда от получаване на материал от стъкловидно тяло. Пункцията на очната ябълка се извършва след анестезия (1 ml 2% разтвор на новокаин под конюнктивата) с остра игла с доста широк лумен, инжектирана по-близо до екватора. Аспирират се 0,3-0,5 ml вътреочно съдържимо.
Полученият материал се изследва за идентифициране на микроба и определяне на неговия тип (микробиологична диагноза). Материалът може да се изучава:
- върху предметно стъкло (бактериоскопски метод);
- в култури (същинският бактериологичен метод);
- в експеримент с животни (биологичен метод).
Бактериоскопски метод
може да се използва във всяка очна болница с просто лабораторно оборудване и някои реактиви.
За да направите това, трябва да имате следното:
- метален контур;
- предметни стъкла от чисто стъкло (върху чисто стъкло капка вода се разпръсква и не придобива сферична форма);
- вана с опори за стъклени пързалки (стъклени пръчки или дебела медна тел);
- дестилирана вода;
- алкохол;
- пинсети;
- филтърна хартия;
- Луголов разтвор (йод 1 g, калиев йодид 2 g, дестилирана вода 300 ml);
- разтвори за бои (за предпочитане в бутилки, затворени с пипети с гумени кутии).
За почистване новите стъкла се изваряват в 1% разтвор на сода (може да се използва пепел) и след това се измиват с мека вода солна киселинаи пак с вода. Използваните чаши се поставят в сярна киселина за 1-2 часа, след което се изваряват в разтвор на сода, измиват се с вода и се потапят в 96° спирт. Чашите се съхраняват или в спирт, или след избърсване на алкохола, на сухо, в буркани с шлифовани запушалки.
Най-често използваните бои са: Ziehl carbol fuchsin (основен фуксин 1 g, кристална карболова киселина 5 g, спирт 96° 10 ml, глицерин - няколко капки, дестилирана вода 100 ml). За оцветяване Tsilya fuchsin обикновено се разрежда 10 пъти с дестилирана вода (разреден или воден фуксин). Метиленово синьо (метиленово синьо 10 g, алкохол 96° 100 ml). От него се приготвя алкално синьо на Leffler ( алкохолен разтворсин 30 ml, 1% калиева или натриева основа 1 ml, дестилирана вода 100 ml). Карболова тинтява виолет (приготвя се по същия начин като карболовия фуксин на Ziehl).
Микробите се изследват или на живо (методите „смачкана“ и „висяща капка“) или убити (в оцветен препарат). Живите изследвания разкриват главно способността на микробите да се движат активно, докато оцветените препарати позволяват добро изследване на тяхната морфология.
Има прости методи за оцветяване, когато обикновено се използва една боя, и сложни методи за оцветяване, които разкриват определени характеристики на физикохимичната структура на микробната клетка и следователно имат диференциална диагностична стойност.
Техниката за приготвяне на цветни препарати е следната. Материалът се нанася върху чисто предметно стъкло и се разпределя равномерно по повърхността под формата на кръг или овал. Намазката трябва да е доста тънка. Ако има гъста гной, първо трябва да нанесете една капка дестилирана вода върху предметно стъкло и да разбъркате материала в тази капка. Намазката се изсушава на въздух. Чашата с изсъхналия препарат се хваща за краищата с едро показалцитепогладете нагоре и фиксирайте, като го прекарате три пъти през пламъка на спиртна горелка (на границата на светлата и тъмната част). При достатъчно фиксиране се усеща леко парене в пръстите. Фиксираната цитонамазка се оцветява. Приготвят се няколко препарата, най-малко два, единият от които се оцветява по прост начин (метиленово синьо Leffler, разреден Ziehl fuchsin), другият - по метода на Грам.
Оцветяване на Loeffler:
- Поставете парче филтърна хартия върху намазката и изсипете синия разтвор на Leffler за 3-5 минути;
- препаратът се промива с дестилирана вода и се суши.
Оцветяване по Грам:
- върху намазката се поставя парче филтърна хартия, върху която се излива разтвор на тинтява виолет за 1-2 минути;
- изцедете боята, отстранете хартията и, без да изплаквате с вода, изсипете разтвора на Lugol за 1 минута; в същото време намазката става черна;
- изцедете разтвора на Лугол и избелете намазката с алкохол ( по-добър начинпотапяне на лекарството в чаша с алкохол, докато лилавите струи спрат да излизат);
- изплакнете обилно с вода;
- напълнете намазката с разреден фуксин за 1-2 минути;
- изцедете боята, измийте препарата с вода и изсушете.
Удобен метод на Грам, модифициран от Синев, който предложи да се използват предварително приготвени парчета филтърна хартия, напоени с разтвор на тинтява виолет и изсушени. Първо се нанасят 2-3 капки вода върху намазката и след това се поставят тези хартийки. След това продължете както е описано по-горе.
Микроскопията на петна се извършва с потапяща леща. При оцветяване по Loeffler всички микроби се оцветяват Син цвят; когато се оцвети с оцветяване по Грам, то е или синьо-виолетово (Грам-положителни микроби), или червено (Грам-отрицателни микроби).
Ограниченият брой микроби, участващи в заболяванията на външното око, и техните характерни морфологични особености често правят възможно поставянето на правилна микробиологична диагноза само с помощта на бактериоскопско изследване.
Бактериологичен метод
Това става необходимо в случаите, когато изследването на петна е недостатъчно за установяване на вида на микроба или е необходимо да се определи чувствителността на изолирания патоген към антибактериални лекарства.
Като се позоваваме за подробно въведение в бактериологичния метод на специални ръководства по микробиология, тук ще се спрем само на принципите на този метод. Първият етап от работата се свежда до идентифициране отделни видовемикроби, т.е. за получаване на чисти култури. За да направят това, те прибягват до механично отделяне на материала по време на засяване и до използването на среди, най-подходящи за развитието на предполагаеми патогени (елективни среди). Чрез повторно засяване на отделни колонии, отглеждани върху средата, се получава чиста култура, която се изследва под микроскоп (приготвят се натривки) и се субкултивира върху диференциално диагностични среди за изследване на биохимичните свойства на патогена.
Високите изисквания на повечето патогенни за очите микроби при условията на култивиране са довели до преобладаващото използване на селективни среди, съдържащи нативен протеин за тяхното изолиране. Това са например околната среда Елшниг (една част конски серумили асцитна течност и две части бульон), съсирен серум на Loeffler (три части серум и една част бульон с 1% пептон, 0,5% NaCl и 1% гроздова захар), Левентал кръвен агар (агар и 5-10% дефибринирана кръв).
Що се отнася до определянето на чувствителността на микробите към антибиотици, най-простият метод за това определяне е използването на специално произведени дискове от филтърна хартия, напоени с антибиотични разтвори и изсушени във вакуум. Материалът за изследване (гной, пунктат, извлечено чуждо тяло) се поставя в стерилна епруветка с физиологичен разтвор(1,5-2 ml). След разклащане течността се изсипва в петриеви панички, за предпочитане две - едната със захарен агар, другата с кръвен агар - и чрез разклащане се разпределя равномерно по повърхността на средата. След това върху повърхността на агара се поставят дискове с различни антибиотици на разстояние 2 см един от друг и от ръба на съдовете. Съдовете се поставят в термостат (37°С) и на следващия ден по размера на зоната на инхибиране на растежа около дисковете се преценява степента на чувствителност на микроба към изследваните антибиотици. Липсата на зона за инхибиране на растежа показва нечувствителността на микроба към този антибиотик.
Биологичен метод
в офталмологичната практика се използва само в случаите, когато поради трудна диагноза токсигенното свойство може да бъде решаващо при определяне на вида на микроба (напр. диференциална диагнозадифтериен бацил и ксерозен бацил).
Лабораторна диагностика на вирусни очни заболявания
Понастоящем се провежда специално изследване на вируси, включително вируса на трахома (фиг. 77), като се използва тяхното култивиране в тъканни култури (пилешки ембрион, миши асцитен карцином и др.) И електронна микроскопия.
Ориз. 77. Клетъчни включвания в трахома.
IN клинична практикаЗа диагностициране на трахома се използва методът на цитологично изследване на конюнктивални изстъргвания за наличие или отсъствие на тела на Provacek-Halberstaedter (включвания). За да направите това, използвайте тъп скалпел или ръба на предметно стъкло, за да изстържете епителната обвивка на конюнктивата (без кръв), която се прилага тънък слойвърху предметно стъкло, изсушава се на въздух за 5 минути и се фиксира чрез спускане в стъкло с метилов алкохолили смес на Никифоров (етилов етер и абсолютен алкохол в равни количества). Боядисването се извършва в рамките на 3-4 часа с прясно приготвен разтвор на боя Romanovsky-Giemsa (със скорост една капка боя на 1 ml дестилирана вода). След това препаратът се измива с течаща вода, суши се на въздух и се изследва под микроскоп. В този случай ядрата на епителните клетки се оцветяват розов цвят, протоплазма - в светло синьо, включвания - в синьо, синьо-виолетово (фиг. 77). Последните се появяват под формата на кокоидни образувания, разположени сред дребнозърнеста маса и се разпознават като носители на трахоматозния вирус. Те се срещат по-често при пресни случаи на нелекувана трахома, но могат да възникнат и при паратрахомен конюнктивит.
Проучване последните годиниидентифицирани нова униформазаразен вирусно заболяванеоко - епидемичен кератоконюнктивит и цитологично изследване на конюнктивални остъргвания при това заболяване направи възможно откриването на особени включвания в епителните клетки, напълно различни от телата на Prsvaček (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
Метод на културно изследванее изолирането на бактерии от определен тип от хранителна среда чрез култивиране, с последващото им видово идентифициране. Видът на бактериите се определя, като се вземат предвид тяхната структура, културни и екологични данни, както и генетични, биохимични и биологични показатели. За извършване на бактериологична диагностика се използват схеми, одобрени от Министерството на здравеопазването.
Наричат се нови видове бактерии, изолирани от хранителна среда, чиито свойства все още не са определени чиста култура. След окончателното идентифициране на характеристиките им се наименуват бактериите, изолирани от определено място и в определено време щам.В този случай се допускат незначителни разлики в свойствата, мястото или времето на изолиране на щам от един вид.
Цел на метода:
1. Етиологична диагноза, т.е. изолиране и идентифициране на чиста бактериална култура.
2. Определяне на броя на микроорганизмите и техните специални характеристики. Например, специфична реакцияза антибиотици.
3. Идентифициране на вътрешнородови различия в микроорганизмите въз основа на техните епидемиологични и генетични компоненти. Това е необходимо, за да се определи общността на микроорганизмите, изолирани в различни местаИ различни условия, което е важно за епидемиологични цели.
Този метод на изследване има определен брой етапи, различни за аеробни, факултативни и облигатни аеробни бактерии.
Разработване на чиста култура за аеробни и факултативни аеробни бактерии.
Етап 1
а) Подготвителни дейности. Този етап включва събиране, съхранение и транспортиране на материала. Също така, ако е необходимо, може да се преработи, в зависимост от свойствата на изследваната бактерия. Например, когато се изследва материал за туберкулоза, се използват алкални или киселинни разтвори за идентифициране на киселинно устойчиви микробактерии.
Б) Обогатяване. Този етапне е задължително и се извършва, ако броят на бактериите в тестовия материал не е достатъчен за провеждане на пълноценно изследване. Например при изолиране на хемокултура изследваната кръв се поставя в среда в съотношение 1 към 10 и се съхранява 24 часа при температура 37 o.
IN) Микроскопия. Натривка от изследвания материал се оцветява и изследва под микроскоп - изследва се микрофлората, нейните свойства и количество. В бъдеще е необходимо да се изолират отделно всички микроорганизми, съдържащи се в него, от първичната намазка.
G) Създаване на отделни колонии. Материалът се нанася върху чаша, съдържаща специална селективна среда; за това се използва примка или шпатула. След това поставете чашата с главата надолу, за да предпазите колониите от кондензация, и я съхранявайте в термостат за около 20 часа, като поддържате температура от 37 o.
важно!Трябва да се помни, че по време на процеса на изследване е необходимо да се спазват правилата за изолация. От една страна, за защита на тестовия материал и отстранените бактерии, а от друга страна, за предотвратяване на инфекция на околните хора и външна среда.
Що се отнася до опортюнистични микроорганизми, при отстраняването им са важни техните количествени характеристики. В този случай се извършва количествено засяване, при което се извършват няколко стотинкратни разреждания на материала в изотоничен разтвор на натриев хлорид. След това се извършва инокулация в петриеви панички от 50 μl.
Етап 2
А ) Изследване на морфологичните свойства на колониите в среди и тяхното микроскопиране. Чашите се преглеждат и се отбелязват свойствата на микроорганизмите, техният брой, скоростта на растеж и се отбелязва най-подходящата хранителна среда. За изследване е най-добре да изберете колонии, разположени по-близо до центъра, и ако се образуват няколко вида чисти култури, след това проучете всяка поотделно, за да изследвате морфотипната чистота на дадена култура, използвайте петно от колонията, оцветете го (обикновено. използвайки метода на Грам или друг) и внимателно микроскопирайте.
Б) Натрупване на чиста култура. За да направите това, колониите от всички морфотипове се поставят в отделни епруветки с хранителна среда и се държат в термостат при определена температура (за повечето микроорганизми е подходяща температура от 37 o, но в някои случаи може да е различна).
Хранителната среда за натрупване често е среда на Клиглер. В епруветките тя има „наклонен“ вид, като 2/3 от нейната част е под формата на колона, а 1/3 е наклонена повърхност, оцветена в светло червено. Съединение:
· IPA
· 0,1% глюкоза
· 1% лактоза
· Специален реактив за сероводород
· Фенолов червен индикатор.
Етап 3
а) Ниво на растеж и чистота на културата. Като цяло, получената чиста култура има еднакъв растеж и при микроскопско изследване клетките имат еднаква морфологична и тинкториална структура. Но има някои видове бактерии с изразен плеофоризъм и има клетки с различна морфологична структура.
Ако като хранителна среда се използва средата на Kligler, тогава биохимичните характеристики се определят от промяната в цвета на колоната и наклонената част. Например, ако се разложи лактозата, скосената част става жълта, ако глюкозата, колоната става жълта; При производството на сероводород се получава почерняване поради прехода на сулфат към железен сулфид.
Както можете да видите на фигурата, средата на Kligler има тенденция да променя цвета си. Това се дължи на факта, че разграждането на азотните вещества от бактериите и образуването на алкални продукти се извършва хетерогенно както в колоната (анаеробни условия), така и на скосената повърхност (аеробни условия).
В аеробна среда (наклонена повърхност) има повече активно образованиеалкална, отколкото в анаеробна среда (колона). Следователно, когато настъпи разграждането на глюкозата, киселината върху наклонената повърхност лесно се неутрализира. Но по време на разграждането на лактозата, чиято концентрация е много по-висока, киселината не може да бъде неутрализирана.
Що се отнася до анаеробната среда, генерират се много малко алкални продукти, така че тук можете да наблюдавате как ферментира глюкозата.
Ориз.Културна среда на Kligler:
1 – изходна среда,
2 – височина Е. коли,
3 - височина S. paratyphi B,
4 – височина S. Typhi.
д.колинасърчава разграждането на глюкозата и лактозата с образуването на газове, не произвежда водород . Причинява пожълтяване на цялата среда с прекъсвания.
S. paratyphi –насърчава разграждането на глюкозата с образуването на газове, отрицателни за лактоза. Скосената част не променя цвета си, колоната става жълта.
S. paratyphi A-не произвежда сероводород.
S. paratyphi B –Получава се сероводород (появява се черен цвят с напредване на инжектирането).
S. typhi –глюкозата се разлага без образуване на газ, образува се сероводород, отрицателен за лактоза. Скосената част не променя цвета си, колоната става жълта, а средата става черна с напредването на инжектирането.
Shigella spp.-лактоза отрицателна, глюкоза положителна, сероводород не се произвежда. Колоната придобива жълт оттенък, а скосената част остава същата.
Б) Окончателна идентификация на чистата култура и нейния отговор към антибиотици. На на този етапИзследват се биохимичните, биологичните, серологичните и генетичните свойства на културата.
В изследователската практика не е необходимо да се изучава пълният набор от свойства на микроорганизмите. Достатъчно е да използвате най-простите тестове, за да определите дали микроорганизмите принадлежат към определен вид.
Бактериологичен метод на изследване (BLMI)– метод, основан на изолирането на чисти култури от бактерии чрез култивиране върху хранителни среди и тяхното идентифициране на видове въз основа на изследване на морфологични, културни, биохимични, генетични, серологични, биологични, екологични характеристики на микроорганизмите.
Бактериологичната диагностика на инфекциите се извършва по стандартни диагностични схеми, одобрени от Министерството на здравеопазването.
Чиста култура –бактерии от един вид, отглеждани върху хранителна среда, чиито свойства са в процес на изследване.
Прецедете– идентифицирана чиста култура от микроорганизми от един вид, изолирана от определен източник в определено време. Щамовете от един и същи вид могат да се различават незначително по биохимични, генетични, серологични, биологични и други свойства, както и по мястото и времето на изолиране.
Цели на BLMI:
1. Поставяне на етиологична диагноза: изолиране на чиста култура от микроорганизми и нейното идентифициране.
2. Определение допълнителни свойства, например, чувствителността на микроорганизма към антибиотици и бактериофаги.
3. Определяне на броя на микроорганизмите (важно при диагностиката на инфекции, причинени от UPM).
4. Типизиране на микроорганизми, т.е. определяне на вътревидови различия въз основа на изследване генетичниИ епидемиологични(фагевари и серовари) маркери.Това се използва за епидемиологични цели, тъй като дава възможност да се установи сходството на микроорганизмите, изолирани от различни пациенти и от различни обекти на околната среда в различни болници и географски региони.
BLMI включва няколко етапа,различни за аероби, факултативни анаероби и облигатни анаероби.
I. Етапи на BLMI при изолиране на чиста култура от аероби и факултативни анаероби.
Сцена.
А. Събиране, транспортиране, съхранение, предварителна обработка на материала.Понякога преди сеитбата се извършва селективна обработка на материала, като се вземат предвид свойствата на изолирания микроорганизъм. Например, преди изследване на храчка или друг материал за наличие на киселинноустойчиви Mycobacterium tuberculosis, материалът се третира с разтвори на киселини или основи.
B. Засяване в среда за обогатяване(ако е необходимо) Извършва се, ако тестовият материал съдържа малък брой бактерии, например при изолиране на кръвна култура. За да направите това, кръвта, взета на върха на треската в голям обем (8-10 ml при възрастни, 4-5 ml при деца), се инокулира в средата в съотношение 1:10 (за преодоляване на ефекта на бактерицидната кръв фактори); реколтата се инкубира при температура 37 0 С в продължение на 18-24 часа.
Б. Микроскопия на изследвания материал.От изследвания материал се приготвя цитонамазка, оцветява се по Грам или друг метод и се изследва под микроскоп. Оценява се наличната микрофлора и нейното количество. Допълнителни изследвания трябва да изолират микроорганизмите, присъстващи в първоначалната цитонамазка.
D. Засяване върху хранителни среди за получаване на изолирани колонии.Материалът се инокулира с бримка или шпатула по метода на механичното разделяне върху съд с диференциално диагностична или селективна среда за получаване на изолирани колонии. След засяване чашата се обръща с капачката надолу (за да се избегне намазването на колониите с капчици кондензационна течност), етикетира се и се поставя в термостат при температура 37 0 С за 18-24 часа.
Трябва да се помни, че при засяване и повторно засяване на микробни култури вниманието на работника трябва да се обърне на спазването на правилата на асептиката, за да се предотврати замърсяването на хранителните среди и да се предотврати инфекция на други и самоинфекция!
В случай на инфекции, причинени от опортюнистични микроорганизми, където броят на микроорганизмите, присъстващи в патологичния материал, е важен, се извършва количествено посяване на материала, за което се извършва серия от 100-кратни разреждания на материала (обикновено 3 разреждания) в Първо се приготвя стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки. След това 50 μl от всяко разреждане се засяват върху хранителни среди в петриеви панички.
Сцена.
А. Изследване на морфотипове на колонии върху среди, тяхната микроскопия.Те преглеждат съдовете и отбелязват оптималната хранителна среда, скоростта на растеж и модела на растеж на микроорганизмите. Изберете да учите изолирани колонии, разположени по хода, по-близо до центъра.Ако растат няколко вида колонии, всеки се изследва отделно. Оценяват се признаците на колонии (Таблица 7). Ако е необходимо, съдовете с култури се гледат през лупа или с помощта на микроскоп с леща с ниско увеличение и стеснена диафрагма. Изследват се тинкториалните свойства на различни морфотипове колонии, за това се подготвя част от изследваната колония намазвам,оцветени по Грам или други методи, микроскопски и определени морфология и чистота на културата, ако е необходимо, поставят приблизителна RA върху стъклос поливалентни серуми.
Б. Натрупване на чиста култура.За да се натрупа чиста култура, изолирани колонии от всички морфотипове се засяват отново в отделни епруветки с наклонен агар или друга хранителна среда и се инкубират в термостат при +37 0 C (тази температура е оптимална за повечето микроорганизми, но може да е различна, за пример, Campylobacterium spp.– +42 0 C, Candida spp. И Yersinia pestis – +25 0 C).
Средата на Kligler обикновено се използва като среда за натрупване на ентеробактерии.
Състав на средата на Kligler: MPA, 0,1% глюкоза, 1% лактоза, сероводороден реагент (железен сулфат + натриев тиосулфат + натриев сулфит), индикатор фенолово червено. Първоначалният цвят на средата е червено-червен, средата е „наклонена“ в епруветките: има колона (2/3) и наклонена повърхност (1/3).
Засяването в средата на Клиглер се извършва чрез щрихиране по повърхността и набождане в колона.
Сцена.
А. Отчитане на растежа върху среда за натрупване, оценка на чистотата на културатав цитонамазка по Грам модел на растежизолирана чиста култура. Визуално чистата култура се характеризира с равномерен растеж. При микроскопско изследванеОцветената цитонамазка, приготвена от такава култура, разкрива морфологично и тинкториално хомогенни клетки в различни зрителни полета. Въпреки това, в случай на изразен плеоморфизъм, присъщ на някои видове бактерии, намазките от чиста култура могат едновременно да съдържат клетки с различна морфология.
Ако като среда за натрупване е използвана индикаторната среда на Kligler, тогава се оценяват промените в цвета й в колоната и наклонената част, от които биохимични свойства: ферментация на глюкоза, лактоза и производство на сероводород. При разлагането на лактозата наклонената част на средата става жълта, а при разграждането на глюкозата колоната става жълта. Когато CO 2 се образува по време на разлагането на захарите, се образуват газови мехурчета или разкъсване на колона. В случай на производство на сероводород се забелязва почерняване по пътя на инжектиране поради превръщането на железен сулфат в железен сулфид.
Естеството на промяната на цвета в средата на Kligler (фиг. 23) се обяснява с неравномерната интензивност на разграждането на азотните вещества от микроорганизмите и образуването на алкални продукти в аеробни (на наклонена повърхност) и анаеробни (в колона) условия .
При аеробни условия по-интензивно образуване на алкали се получава върху скосената повърхност, отколкото в колоната на средата. Следователно, по време на разграждането на глюкозата, която присъства в малко количество в средата, киселината, образувана върху скосената повърхност, бързо се неутрализира. В същото време, по време на разграждането на лактозата, която присъства във висока концентрация в средата, алкални хранине може да неутрализира киселината.
При анаеробни условия в колоната се образуват алкални продукти в незначителни количества, така че тук се открива ферментация на глюкоза.
Ориз. 23.Среден индикатор Kligler:
1 – начален,
2 – с растеж Е. коли,
3– с ръст S. paratyphi B,
4 – с ръст S. typhi
E. coliразграждат глюкозата и лактозата с образуване на газ, не произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната и скосената част с прекъсвания в средата.
S. paratyphiразлагат глюкозата с образуване на газ, лактоза отрицателна. Те причиняват пожълтяване на колоната с прекъсвания; скосената част не променя цвета си и остава пурпурна. При което S. paratyphi Bпроизвеждат сероводород (появява се черен цвят с напредване на инжектирането), S. paratyphi Aне се произвежда сероводород.
S. typhiразлагат глюкозата без образуване на газ, са лактозоотрицателни, произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната без прекъсвания, скосената част не променя цвета си и остава пурпурна, а с напредването на инжектирането се появява черен цвят.
Shigella spp.глюкозо-положителни, лактозо-отрицателни, не произвеждат сероводород. Те причиняват пожълтяване на колоната (с или без прекъсвания, в зависимост от серовара), скосената част не променя цвета си и остава пурпурна.
B. Окончателна идентификация на чиста култура(определяне на системното положение на изолирания микроорганизъм до ниво вид или вариант) и определяне на спектъра на чувствителност на изолираната култура към антибиотици.
За идентифициране на чиста култура на този етап, биохимични, генетични, серологични и биологични характеристики(Таблица 8).
В рутинната лабораторна практика по време на идентификацията не е необходимо да се изследват всички свойства. Използвайте информативен, достъпен, прости тестове, достатъчни за определяне на видовата (вариантна) идентичност на изолирания микроорганизъм.
