Felhasználási lehetőség bakteriológiai kutatás nál nél szem betegségek korlátozza a kóros fókusz hozzáférhetősége. Ha a szem hátsó szegmensében helyezkedik el, a kutatáshoz szükséges anyag beszerzése gyakran nagyon nehéz, és ilyen esetekben természetesen kizárt a bakteriológiai diagnózis lehetősége. A bakteriológiai diagnosztika fő alkalmazási területe a szemészeti gyakorlatban a szem külső részének megbetegedései, valamint a behatoló sebek, amelyek során kutatási anyag nyerhető. sebészi kezelés sebek vagy idegen test eltávolításakor. Általában meg kell jegyezni, hogy mikor sebészeti beavatkozások Jelentősen bővül a bakteriológiai anyag beszerzési lehetőségeinek köre.
Anyag beszerzése a kutatáshoz
A kötőhártyazsákból anyag kinyeréséhez platinahurkot használnak (ha nem áll rendelkezésre, használhat elektromos tűzhely spirálmenetéből készült hurkot, vagy más eszközt (üvegrúd, spatula stb.), amely először kalcinálással alkoholégő lángjában visszahúzva hűtött hurokkal ragadjon meg egy kötőhártya-váladékot az alsó fornix mélyéből Ebben az esetben kerülni kell a hurok érintését bőr és a szemhéjak széle, hogy ne kerüljön idegen mikroflóra az anyagba. Az anyagot a kezelés megkezdése előtt és a kezelés elején célszerű bevenni. reggeli órák amikor a váladékozás bőségesebb. Nyálka és genny hiányában (például egészséges kötőhártya műtét előtti vizsgálatakor) könnyfolyadékot kell használni, vagy a kötőhártya felületét enyhén le kell kaparni (Lindner szerint). De ilyen esetekben érdemesebb Elynnig technikáját alkalmazni: Pasteur pipettával cseppensünk egy csepp steril sóoldatot vagy húslevest a kötőhártyazsákba, és néhány másodperc múlva szívjuk ki ezt a cseppet.
Ugyanez szerint Általános szabályok nyersanyagot a könnyzsákból, kinyomva annak tartalmát, valamint fekélyes blepharitis esetén a szemhéj széléről, először eltávolítva a fekélyről a kérget.
Nagy körültekintést igényel a szaruhártya anyagának levétele, különösen kúszó szaruhártyafekély esetén. A hurkot (vagy más tompa műszert) ferdén a fekély felületére kell irányítani, és a progresszív szélétől kell anyagot venni. Ehhez érzéstelenítés (3 csepp 1%-os dikain) és rögzítés szükséges. szemgolyó.
A szem behatoló sebeinek kutatási anyagaként használhatja a sebváladékot (ha van), hurokkal vagy géztamponnal rögzítve, az elülső kamra szúrásával vagy extrahálásával. idegen test, amelyet steril tubusba helyezünk 1-2 ml fiziológiás oldattal. A kémcső felrázása után az oldatot tesztelésre használjuk.
Az elülső kamrából paracentézis során vagy szúrással vágóműszerrel nyerhető a kutatáshoz szükséges anyag. A szaruhártya érzéstelenítése (3 csepp 1%-os dikainoldat) és a szemgolyó ferdén a limbusnál történő rögzítése után fecskendőtűt fecskendezünk be, szúrjuk az elülső kamrába (vigyázzunk, hogy ne sérüljön meg az írisz és a lencsekapszula!) és 0,3 az elülső kamra tartalmának ml-ét kiszívjuk.
Endoftalmitis esetén szükség lehet az anyag beszerzésére üvegszerű. A szemgolyó szúrását érzéstelenítés után (1 ml 2% -os novokainoldat a kötőhártya alatt) végezzük éles tűvel, meglehetősen széles lumennel, és közelebb fecskendezzük az egyenlítőhöz. 0,3-0,5 ml intraokuláris tartalom leszívása történik.
A kapott anyagot tanulmányozzák a mikroba azonosítására és típusának meghatározására (mikrobiológiai diagnózis). Az anyag tanulmányozható:
- üveglemezen (bakterioszkópos módszer);
- haszonnövényekben (a tényleges bakteriológiai módszer);
- állatkísérletben (biológiai módszer).
Bakterioszkópos módszer
bármely szemkórházban használható egyszerű laboratóriumi felszereléssel és néhány reagenssel.
Ehhez a következőkre van szükség:
- fém hurok;
- tiszta üveglapok (tiszta üvegen egy csepp víz szétterül, és nem ölt gömb alakút);
- fürdő üvegcsúszdák tartóival (üvegrudak vagy vastag rézhuzal);
- desztillált víz;
- alkohol;
- csipesz;
- szűrőpapír;
- Lugol-oldat (1 g jód, 2 g kálium-jodid, 300 ml desztillált víz);
- festékoldatok (lehetőleg gumidobozos pipettával lezárt palackokban).
A tisztításhoz az új poharakat 1%-os szódaoldatban felforraljuk (hamu is használható), majd enyhe vízzel kimossuk. sósavés újra vízzel. A használt poharakat 1-2 órára kénsavba tesszük, majd szódaoldatban felforraljuk, vízzel mossuk és 96°-os alkoholba mártjuk. A poharakat vagy alkoholban, vagy az alkohol letörlése után szárazon, csiszolt dugós üvegekben tároljuk.
A leggyakrabban használt festékek: Ziehl karbol fukszin (bázis fukszin 1 g, kristályos karbolsav 5 g, alkohol 96° 10 ml, glicerin - néhány csepp, desztillált víz 100 ml). A színezéshez a Tsilya fukszint általában 10-szer hígítják desztillált vízzel (hígított vagy vizes fukszinnal). Metilénkék (metilénkék 10 g, alkohol 96° 100 ml). Leffler alkálikéket készítenek belőle ( alkoholos oldat kék 30 ml, 1% kálium vagy nátrium lúg 1 ml, desztillált víz 100 ml). Karbolos enciánibolya (ugyanúgy elkészítve, mint a Ziehl-féle karbolos fukszin).
A mikrobákat élőben (a „zúzott” és „függő csepp” módszerekkel) vagy elpusztítják (színes készítményben) vizsgálják. Az élő vizsgálatok elsősorban a mikrobák aktív mozgási képességét tárják fel, míg a festett készítmények morfológiájuk alapos tanulmányozását teszik lehetővé.
Vannak egyszerű színezési módszerek, amikor általában egy festéket használnak, és összetett színezési módszerek, amelyek felfedik a mikrobasejt fizikai-kémiai szerkezetének néhány jellemzőjét, és ezért eltérőek. diagnosztikai érték.
A színes készítmények elkészítésének technikája a következő. Az anyagot tiszta üveglemezre visszük fel, és kör vagy ovális alakban egyenletesen elosztjuk a felületen. A kenetnek elég vékonynak kell lennie. Ha sűrű genny van, először csepegtessen egy csepp desztillált vizet egy tárgylemezre, és keverje össze az anyagot ebben a cseppben. A kenetet levegőn szárítjuk. A megszáradt készítménnyel ellátott poharat a széleinél fogva egy nagy mutatóujjait húzza felfelé és rögzítse úgy, hogy háromszor átengedi az alkoholégő lángján (világos és sötét részei határán). Megfelelő rögzítés esetén enyhe égő érzés érezhető az ujjakban. A rögzített kenet foltos. Számos készítményt készítenek, legalább kettőt, amelyek közül az egyik festett egyszerű módon (metilénkék Leffler, hígított fukszin Ziehl), a másik - a Gram-módszer szerint.
Loeffler festés:
- Helyezzen egy darab szűrőpapírt a kenetre, és öntse bele Leffler-kék oldatát 3-5 percig;
- a készítményt desztillált vízzel mossuk és szárítjuk.
Gram-festés:
- egy darab szűrőpapírt helyezünk a kenetre, amelyre enciánibolya oldatot öntünk 1-2 percig;
- engedje le a festéket, távolítsa el a papírt, és vízzel történő öblítés nélkül öntse bele a Lugol-oldatot 1 percig; ugyanakkor a kenet feketévé válik;
- ürítse ki a Lugol oldatot, és fehérítse alkohollal a kenetet ( Jobb út merítse a gyógyszert egy pohár alkoholba, amíg a lila patakok megszűnnek kijönni);
- alaposan öblítse le vízzel;
- töltse fel a kenetet hígított fukszinnal 1-2 percig;
- ürítse le a festéket, mossa le a készítményt vízzel és szárítsa meg.
Egy kényelmes Gram-módszer, amelyet Sinev módosított, és azt javasolta, hogy használjanak előre elkészített szűrőpapírdarabokat, amelyeket enciánibolya oldatba áztattak és szárítottak. Először 2-3 csepp vizet csepegtetünk a kenetre, majd ezeket a papírdarabokat helyezzük el. Ezután járjon el a fent leírtak szerint.
A kenetek mikroszkópos vizsgálata merülőlencsével történik. A Loeffler szerinti festéskor minden mikroba megfestődik Kék szín; Gram-festéssel megfestve vagy kék-lila (Gram-pozitív mikrobák) vagy vörös (Gram-negatív mikrobák).
A külső szem betegségeiben szerepet játszó mikrobák korlátozott száma és jellegzetes morfológiai sajátosságai gyakran lehetővé teszik a helyes mikrobiológiai diagnózis felállítását pusztán bakterioszkópos vizsgálat segítségével.
Bakteriológiai módszer
Olyan esetekben válik szükségessé, amikor a kenetek vizsgálata nem elegendő a mikroba típusának megállapításához, vagy meg kell határozni az izolált kórokozó antibakteriális gyógyszerekkel szembeni érzékenységét.
Hivatkozva a bakteriológiai módszer részletes bevezetésére a speciális mikrobiológiai kézikönyvekre, itt csak ennek a módszernek az alapelvein fogunk kitérni. A munka első szakasza az azonosítástól függ egyes fajok mikrobák, azaz tiszta kultúrák előállítása érdekében. Ennek érdekében a vetés során az anyag mechanikai leválasztását és a feltételezett kórokozók (elektív táptalaj) kifejlődésére legalkalmasabb közeg alkalmazását veszik igénybe. A táptalajon növesztett egyedi telepek újraoltásával tiszta tenyészetet kapunk, amelyet mikroszkóp alatt megvizsgálunk (keneteket készítünk), és tanulmányozás céljából differenciáldiagnosztikai táptalajra tenyésztjük. biokémiai tulajdonságok kórokozó.
A legtöbb szempatogén mikrobával szembeni nagy igény a tenyésztési körülmények között ahhoz vezetett, hogy izolálásukra elsősorban a natív fehérjét tartalmazó szelektív táptalajokat használják. Ilyen például az Elschnig környezet (egy rész lószérum vagy ascites folyadék és két rész húsleves), alvadt Loeffler szérum (három rész szérum és egy rész húsleves 1% pepton, 0,5% NaCl és 1% glükóz), Leventhal véragar (agar és 5-10% defibrinált vér).
Ami a mikrobák antibiotikumokkal szembeni érzékenységét illeti, a legegyszerűbb módszer erre a meghatározásra speciálisan gyártott szűrőpapír korongok használata, amelyeket antibiotikus oldatokba áztatnak és vákuumban szárítanak. A kutatáshoz szükséges anyagot (genny, pont, kinyert idegen test) sóoldattal (1,5-2 ml) tartalmazó steril csőbe helyezzük. Felrázás után a folyadékot Petri-csészékbe öntjük, lehetőleg kettőbe - az egyik cukor-agarral, a másik véragarral -, és rázatással egyenletesen elosztjuk a táptalaj felületén. Ezután az agar felületére egymástól és az edények szélétől 2 cm távolságra különböző antibiotikumokat tartalmazó korongokat helyezünk. Az edényeket termosztátba helyezzük (37°C), és másnap a korongok körüli növekedést gátló zóna nagysága alapján ítéljük meg a mikroba érzékenységének mértékét a vizsgált antibiotikumokkal szemben. A növekedésgátló zóna hiánya a mikroba érzéketlenségét jelzi ezzel az antibiotikummal szemben.
Biológiai módszer
a szemészeti gyakorlatban csak olyan esetekben alkalmazzák, amikor a nehéz diagnózis miatt a toxigén tulajdonság döntő lehet a mikroba típusának meghatározásában (pl. megkülönböztető diagnózis diftéria bacillus és xerosis bacillus).
Vírusos szembetegségek laboratóriumi diagnosztikája
Jelenleg a vírusok, köztük a trachoma vírus (77. ábra) speciális vizsgálatát végzik szövettenyészetekben (csirkeembrió, egér ascites carcinoma stb.) és elektronmikroszkóppal történő tenyésztéssel.
Rizs. 77. Sejtzárványok trachomában.
BAN BEN klinikai gyakorlat A trachoma diagnosztizálására a kötőhártya-kaparék citológiai vizsgálatának módszerét alkalmazzák a Provacek-Halberstadter testek (zárványok) jelenlétére vagy hiányára. Ehhez egy tompa szikével vagy egy tárgylemez szélével kaparjuk le a kötőhártya hámborítását (vér nélkül), amelyet felhelyezünk. vékonyréteg tárgylemezen, levegőn szárítva 5 percig, és 15-20 percig süllyesztve rögzítve egy pohárban metil-alkohol vagy Nikiforov keveréke (etil-éter és abszolút alkohol egyenlő mennyiségben). A festést 3-4 órán belül frissen készített Romanovsky-Giemsa festékoldattal végezzük (egy csepp festék per 1 ml desztillált víz). Ezután a készítményt folyó vízzel mossuk, levegőn szárítjuk és mikroszkóp alatt megvizsgáljuk. Ebben az esetben a hámsejtek magjai megfestődnek rózsaszín szín, protoplazma - világoskék színben, zárványok - kék, kék-ibolya színben (77. ábra). Ez utóbbiak finom szemcsés tömeg között elhelyezkedő coccoid formációk formájában jelennek meg, és a trachomatous vírus hordozóiként ismerik fel. Gyakrabban fordulnak elő a kezeletlen trachoma friss eseteiben, de előfordulhatnak paratrachomális kötőhártya-gyulladás esetén is.
Az elmúlt évek kutatásai kimutatták új egyenruha fertőző vírusos betegség szem - járványos keratoconjunctivitis, és a kötőhártya-kaparék citológiai vizsgálata ebben a betegségben lehetővé tette a hámsejtek sajátos zárványainak kimutatását, amelyek teljesen különböznek Prsvaček testétől (B. L. Polyak, N. V. Ploshinskaya).
Alkalmazás bakteriológiai módszer lehetővé teszi a kórokozó tiszta tenyészetben történő izolálását a pácienstől nyert anyagból, és a tulajdonságok összességének vizsgálata alapján azonosítását. A legtöbb baktérium képes különféle mesterséges táptalajokon tenyészteni (kivéve a chlamydia és a rickettsia), ezért a bakteriológiai módszer fontos számos fertőző betegség diagnosztizálásában.
Ha pozitív eredményt kapunk, a bakteriológiai módszer lehetővé teszi az izolált kórokozó antimikrobiális gyógyszerekkel szembeni érzékenységének meghatározását. Ennek a vizsgálatnak a hatékonysága azonban számos paramétertől függ, különösen a anyaggyűjtés feltételeiés őt szállítás a laboratóriumba.
NAK NEK alapkövetelmények A bakteriológiai kutatáshoz szükséges anyagok kiválasztására és szállítására vonatkozó követelmények a következők:
- anyag felvétele az etiotróp kezelés megkezdése előtt;
- a steril feltételek betartása az anyaggyűjtés során;
- az anyaggyűjtés technikai korrektsége;
- elegendő mennyiségben anyag;
- hőmérsékleti feltételek biztosítása az anyagok tárolására és szállítására;
- az anyaggyűjtés és a szilárd táptalajra történő vetés közötti idő minimálisra csökkentése.
Az anyagot a lehető leghamarabb, de legfeljebb 1-2 órán belül a laboratóriumba kell szállítani. Az anyagmintákat meghatározott hőmérsékleten kell tartani; különösen a normál esetben steril anyagokat (vér, agy-gerincvelői folyadék) tárolják és 37 °C-on szállítják a laboratóriumba. Nem steril anyagok (vizelet, váladék légutak stb.) címen tárolják szobahőmérséklet legfeljebb 1-2 óra vagy legfeljebb egy nap 4 °C-on (háztartási hűtőszekrény körülményei). Ha nem lehetséges a mintákat a laboratóriumba szállítani a szabályozott időn belül, akkor javasolt a kórokozók életképességének megőrzésére szolgáló szállítóközeg használata.
Vér a kutatáshoz az emelkedő testhőmérséklet időszakában, a láz kezdetekor kell a betegtől elvenni. 3-4 4-6 órás időközönként vett vérminta vizsgálata javasolt, ami a tranziens bakteriémia „kimaradásának” kockázatának csökkentése és az izolált opportunista mikroflóra etiológiai szerepének megerősítése szempontjából indokolt. a vérből, ha ez a mikroflóra több mintában kimutatható vénás vér. Felnőtteknek 10 ml, gyermekeknek 5 ml vérmintát legalább két palackba kell beoltani aerob ill. anaerob mikroorganizmusok 1:10 arányban. Az artériás vér egyszeri vizsgálata javasolt.
Vesz gerincvelői folyadék (CSF) orvos végzi, amikor lumbálpunkció 1-2 ml mennyiségben egy száraz steril csőbe. A minta azonnal a laboratóriumba kerül, ahol a vizsgálata is azonnal megkezdődik. Ha ez nem lehetséges, az anyagot több órán keresztül 37 °C-on tárolják. Jelentősen növeli az összeget pozitív eredményeket bakteriológiai vizsgálat 1-2 csepp CSF beoltásával félfolyékony tápközeget tartalmazó kémcsőbe glükózzal és Petri-csészébe „véres” agarral. Az anyag küldéséhez használjon izoterm dobozokat, melegítőpárnákat, termoszokat vagy bármilyen más olyan csomagolást, ahol a hőmérsékletet körülbelül 37 °C-on tartják.
Váladék bakteriológiai kutatáshoz steril fa spatulával 3-5 g-ot veszünk egy steril edénybe, szorosan záródó fedéllel. Az összegyűjtött anyag vizsgálatát legkésőbb 2 órával később kell megkezdeni. Ha ezen időn belül nem lehet megkezdeni a vizsgálatot, kis mennyiségű anyagot kell összegyűjteni és megfelelő szállítóközegbe helyezni. A székletgyűjtés során törekedni kell a kóros szennyeződések (nyálka, genny, hámszemcsék, stb.) esetleges vizsgálatra küldésére, kerülni kell a baktériumölő tulajdonságú vérszennyeződések anyagba kerülését.
Anyaggyűjtéshez rektális tampont (vattavéggel) lehet használni. A tampont steril izotóniás nátrium-klorid oldattal vagy szállítóközeggel (de nem olajos géllel) kell megnedvesíteni. Végbélenként 5-6 cm mélységig juttatják be, és a tampont elfordítva óvatosan távolítsák el, figyelve a széklet színének megjelenését a tamponon. A tampont száraz kémcsőbe helyezzük, ha az anyag vizsgálata 2 órán belül megkezdődik, ellenkező esetben - szállítóközegbe.
dühös vagyok(szabadon felszabaduló vizelet átlagos adagja) 3-5 ml mennyiségben a külső nemi szervek alapos tisztálkodása után steril edénybe gyűjtjük. A vizeletet célszerű reggel gyűjteni.
Epe a duodenális intubáció során a kezelőhelyiségben külön A, B és C részletben három steril csőbe gyűjtjük, az aszepszis szabályait betartva.
Gyomormosó víz steril üvegekbe gyűjtve 20-50 ml-es mennyiségben. Szem előtt kell tartani, hogy a gyomormosást ezekben az esetekben csak közömbös (nem bakteriosztatikus ill. baktericid hatás mikroorganizmusokon) oldatok – jobb forralt víz(szóda, kálium-permanganát stb. hozzáadása nélkül).
Köpet. A köhögési roham során felszabaduló reggeli köpet steril edénybe gyűjtjük. Köhögés előtt a páciens fogat mos és száját forralt vízzel öblíti ki, hogy mechanikusan eltávolítsa az ételmaradékot, a hámréteget és a mikroflórát. szájüreg.
Hörgőmosó víz. A bronchoszkópia során legfeljebb 5 ml-t adnak be izotóniás oldat nátrium-kloridot, majd leszívjuk egy steril csőbe.
Váladék a garatból, a szájból és az orrból. A szájüregből származó anyagot éhgyomorra vagy étkezés után 2 órával steril vattacsomóval vagy kanállal kell bevenni a nyálkahártyáról és az érintett területekről a csatornák bejáratánál. nyálmirigyek, a nyelv felszíne, fekélyektől. Ha van benne film, steril csipesszel távolítsa el. Az orrüregből származó anyagot száraz steril pamut törlővel veszik, amelyet mélyen az orrüregbe helyeznek. A nasopharynxből származó anyagot steril hátsó garat vattacsomóval veszik, amelyet óvatosan az orrnyíláson keresztül a nasopharynxbe helyeznek. Ha köhögés kezdődik, a tampont nem távolítják el, amíg a köhögés el nem múlik. A diftéria teszteléséhez az orrból és a torokból származó filmeket és nyálkát egyidejűleg vizsgálják, különböző tamponokkal levéve az anyagot.
A vizsgálati anyagot szilárd táptalajra oltjuk be speciális technikák a mikroorganizmusok egyedi kolóniáinak növekedése érdekében, amelyeket azután kiszűrnek a kórokozó tiszta tenyészetének izolálása érdekében.
Bizonyos típusú baktériumokat olyan szelektív közegek segítségével izolálnak, amelyek gátolják az idegen mikroorganizmusok növekedését, vagy olyan anyagokat tartalmaznak, amelyek stimulálják bizonyos patogén mikrobák növekedését.
Tápközegen izolált mikroorganizmusok azonosítani, azaz meghatározzák fajukat vagy típusukat. BAN BEN Utóbbi időben Az egészségügyi gyakorlatban történő azonosításhoz mikroteszt rendszereket használnak, amelyek egy sor differenciáldiagnosztikai környezetet tartalmazó panelek, amelyek felgyorsítják a kutatást. Mikroteszt rendszereket is alkalmaznak a mikroorganizmusok antimikrobiális gyógyszerekkel szembeni érzékenységének meghatározására az antibiotikum folyékony tápközegben történő hígításával.
A bakteriológiai vizsgálat eredményének értékelésekor az orvosnak figyelembe kell vennie azt negatív eredmény nem mindig jelenti a kórokozó hiányát, és összefügghet antimikrobiális szerek használatával, a vér magas mikrocid aktivitásával és technikai hibákkal. Patogén mikroba kimutatása egy páciensből származó anyagban, kapcsolat nélkül klinikai kép lábadozó, egészséges vagy átmeneti baktériumhordozás esetén lehetséges.
A vértől való izolálás az aszepszis összes szabályának megfelelően opportunista mikroorganizmusok(Staphylococcus epidermidis, coli), sőt a szaprofitákat is a bakteriémia megnyilvánulásának kell tekinteni, különösen, ha ezek a mikrobák egynél több anyagmintában vagy különböző szubsztrátumokban (vér, vizelet) találhatók, mivel a szervezet immunreaktivitásának csökkenésével ezek és más „ nem patogén” mikroorganizmusok lehetnek kórokozók fertőző folyamatok, beleértve a szepszist is.
Van egy bizonyos nehézség nem steril tápközeg bakteriológiai vizsgálati eredményeinek értelmezése, nevezetesen az opportunista mikroorganizmusok etiológiai szerepének bizonyítása. Ebben az esetben olyan mutatókat vesznek figyelembe, mint az izolált tenyészetek típusa, az adott típusú mikrobiális sejtek száma az anyagban, ismételt izolálásuk a betegség során, monokultúra vagy mikroorganizmus társulása.
Juscsuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Cél:
1. Sajátítsa el a fertőző betegségek diagnosztizálására szolgáló bakteriológiai módszer harmadik szakaszát.
Tud:
1. Az aerob mikroorganizmusok tiszta kultúráinak izolálására szolgáló bakteriológiai módszer III. szakaszának célja és sorrendje.
2. A „típus” fogalma. Típuskritériumok.
3. A mikroorganizmusok anyagcseréje és jellemzői.
4. A mikroorganizmusok biokémiai aktivitásának vizsgálatának elve és módszerei.
5. A mikroorganizmusok antibiogramjának meghatározásának célja és módszerei a klinikai mikrobiológiában.
Képesnek lenni:
1. Határozza meg a vizsgált kultúra tisztaságát!
2. Vesse el a vizsgált növényt „tarka sorba”, a mobilitást meghatározó táptalajba.
3. Határozza meg a teszttenyészet antibiogramját korongdiffúziós módszerrel!
1. Az aerobok izolálására szolgáló bakteriológiai módszer III. szakaszának célja és sorrendje.
2. A vizsgált kultúra tisztaságának meghatározására szolgáló módszerek.
3. A mikroorganizmusok osztályozása táplálkozás típusa szerint. Érkezési mechanizmusok tápanyagok baktériumsejtbe.
4. Mikroorganizmusok enzimei; fontosságuk a sejtanyagcserében. Konstitutív és indukálható enzimek.
5. A mikroorganizmusok biokémiai aktivitásának vizsgálatának célja és módszerei a mikrobiológiai gyakorlatban.
6. Közvetlen és közvetett módszerek a mikroorganizmusok mobilitásának meghatározására.
7. Korongdiffúziós módszer az antibiogramok meghatározására: lényeg, beállítás módja.
Az óra során elvégzett feladatok (UIRS):
1. Végezze el az aerobok tiszta kultúráinak izolálására szolgáló bakteriológiai módszer III. szakaszát:
Határozzuk meg az izolált tenyészet tisztaságát;
A tiszta próbanövényt rövid „tarka sorba” vetjük;
Vesse be a teszttenyészetet egy félig folyékony agar oszlopba;
Határozza meg a teszttenyészet antibiogramját korongdiffúziós módszerrel.
2. Ismerkedjen meg a baktériumok biokémiai azonosítására szolgáló rendszerekkel.
Irányelvek a kutatási feladat elvégzéséhez:
1. III. szakasz végrehajtása tartály. módszer az aerobok tiszta kultúráinak izolálására:
1.1. Az izolált tenyészet tisztaságának meghatározása.
A tenyészet tisztaságát jelzi a növekedés egyenletessége és az azonos fajba tartozó mikroorganizmusok jelenléte a készítményben. Ezért a növekedés makroszkopikus vizsgálata során, figyelve annak intenzitását (szegény, mérsékelt, bőséges), átlátszóságát, színét, ügyeljen annak egységességére. Készítsen fix készítményt az ízület alsó, középső és felső részének hurokkal, Gram-festékkel és mikroszkóppal történő érintésével. A kapott eredményeket rögzítse a jegyzőkönyvben, és vonjon le következtetést. Ha az Ön által izolált kultúra tiszta, folytassa a további kutatásokat.
1.2. A növények „tarka sorba” vetése.
Inokuláljon egy tiszta teszttenyészetet egy „tarka soron”: félig folyékony Hiss táptalaj BP indikátorral, szénhidrátokkal (glükóz, laktóz, mannit) és MPB-vel.
A félig folyékony táptalajba történő újraoltást bakteriológiai tűvel vagy tartállyal végezzük. 1 mm átmérőjű hurokkal fecskendezze be az agar vastagságába, ne érje el a cső alját » 1 mm. Folyékony tápközegbe történő újraoltáskor a vizsgált tenyészet biomasszáját tartalmazó hurkot a folyadékba merítjük, rádörzsöljük a kémcső falára és lemossuk. Ezt követően indikátorpapírokat helyeznek a kémcső fala és a dugó közé az indol és a hidrogén-szulfid (H 2 S) meghatározására anélkül, hogy a kémcső és a dugó szélei átnedvesednének. tápközeg!
A mikroorganizmusok biokémiai tulajdonságainak azonosítása céljából történő tanulmányozásának alapja az anyagcsere közbenső és (vagy) végtermékeinek meghatározása. A baktériumok szacharolitikus és proteolitikus tulajdonságai, amelyek a „tarka sorozatba” tartozó differenciáldiagnosztikai táptalajokon határozhatók meg, taxonómiai jelentőséggel bírnak.
Meghatározás szacharolitikus tulajdonságok a Hiss médián készült. Összetételük: pepton víz, 1% szénhidrát, Andrede indikátor (BP vagy egyéb), 0,3-0,5% agar, ha a táptalaj félfolyékony; ha a közeg folyékony, akkor úszókat (egyik végén lezárt rövid üvegcsöveket) engedünk a kémcsövekbe.
Az eredmények rögzítésének kritériumai:
· a táptalaj színe nem változik - a tenyészet nem erjeszt szénhidrátot;
· a táptalaj színe megváltozik (Andrede indikátor használata esetén - világossárgáról pirosra, BP - rózsaszínről kékre stb.) - a tenyészet savas termékek képződésével szénhidrátokat fermentál ( szerves savak);
· a táptalaj színe megváltozik és gázbuborékok jelennek meg a táptalajban vagy lebegnek - a tenyészet szénhidrátokat erjeszt, savas és gáznemű termékek képződésével.
Definíciók proteolitikus tulajdonságok pepton víz (PV) vagy hús-pepton húsleves (MPB) felhasználásával állítják elő, figyelembe véve a fehérje anyagcsere végtermékeinek (pepton, aminosavak) - indol, H 2 S és bizonyos esetekben ammónia - képződését.
Az indol képződését az oxálsavoldatba áztatott indikátorpapír rózsaszínű elszíneződése kíséri (Morel-módszer); hidrogén-szulfid képződése - ólom-acetáttal impregnált indikátorpapír feketedése; ammónia képződése - a lakmuszpapír kékre színeződése.
Az MPB és a PV a mikroorganizmusok növekedési mintázatának tanulmányozására is szolgál folyékony tápközegben. A mikrobiális szaporodás lehet diffúz zavarosság, fenéküledék vagy film a táptalaj felületén.
1.3. A teszttenyészet bevetése egy félfolyékony agar oszlopba.
Oltsuk be a teszttenyészetet egy félig folyékony agar oszlopba úgy, hogy egy tartály segítségével megszúrjuk. tűk vagy tartály. 1 mm átmérőjű hurkok.
A tenyészet félig folyékony agar oszlopába vetése lehetővé teszi a molekuláris oxigénhez való viszonyának meghatározását, és így közvetve képet kaphat az energiaszerzés módjáról. Az elszámolás és az értékelés kritériuma a növekedés természete: a növekedés csak a környezet felett – a kultúra az aerobic, csak a környezet alsó részén – anaerob; felülről és injekcióval - fakultatív anaerob; növekedés bizonyos távolságra a táptalaj felszínétől – mikroaerofil.
Ezzel a vetésmóddal meghatározható a motilitás fakultatív anaerob mikroorganizmusokban. A növekedés szigorúan az injekció szerint történik - a tenyészet mozdulatlan, a diffúz növekedés mozgékony.
1.4. A vizsgált tenyészet antibiogramjának meghatározása korongdiffúziós módszerrel.
A klinikusok etiotrop antimikrobiális kemoterápiát végeznek, figyelembe véve a vizsgálat eredményeit. olyan módszer, amely a kórokozó klinikai anyagból történő izolálásával és azonosításával együtt tartalmazza az antimikrobiális kemoterápiával szembeni érzékenység meghatározását. Az érzékenység meghatározásához Oroszországban a lemez diffúziós módszerét (DDM) használják leggyakrabban.
Az antibiogram meghatározásához készítsen szuszpenziót a teszttenyészetből steril edényben sóoldatés állítsuk be 0,5 McFarland turbiditásra (1,5 x 10 8 CFU/ml). Az oltáshoz használjunk steril vattacsomót, amelyet a szuszpenziót tartalmazó tubusba merítünk, forgassuk el úgy, hogy egyenletesen telítődjön, majd alaposan csavarással nyomjuk rá a kémcső száraz falára a folyadékszint felett. A tenyészetet AGV tápközeggel ellátott csészére vetve végezzen ütéseket három irányban 60°-os szögben, minden alkalommal forgatva a csészét a tengelye körül. Végül végezzen néhány forgó mozdulatot a tamponnal az agar felületének szélei mentén. Ezt követően hagyja a növényeket néhány percig szobahőmérsékleten száradni zárt fedelű csészékben. Az antibiotikum korongokat legkésőbb 15 perccel az oltás után helyezze fel steril csipesz vagy automata adagoló segítségével. A korong és a csésze széle közötti távolság és a korongok közötti távolság 15-20 mm legyen. Így egy 100 mm átmérőjű csészére legfeljebb 6 korongot helyezünk. Minden korongot finoman meg kell nyomni csipesszel, hogy biztosítsa a tápközeggel való érintkezését. A korongok felhelyezése után azonnal címkézze fel a poharakat, és helyezze fejjel lefelé 37°-os termosztátba 18-20 órára.
Bakteriológiai kutatási technika. A kórokozó izolálása a vérből (vérkultúra) az korai módszer betegségek diagnosztizálása. A tífusz-paratífuszban szenvedő betegek bakteriémiája a végén jelenik meg lappangási időszakés nem tűnik el a betegség teljes lázas időszaka alatt és a visszaesések során. A bakteriológiai vizsgálat eredménye bizonyos mértékig függ az anyaggyűjtés időpontjától és a beoltott vér mennyiségétől. Minél korábban történik a vértenyésztés a betegség kezdetétől, annál nagyobb a valószínűsége a kórokozó kimutatásának. A tífusz első hetében 10 ml vért vesznek a cubitalis vénából, több késői időpontokés a visszaesések során - 20 ml.
A tanulmány első napján vért 1:10 arányban oltunk be az egyikbe folyékony közeg. A megadott arányt szigorúan be kell tartani, mivel kisebb vérhígítás mellett baktériumölő hatása miatt a mikrobák elpusztulhatnak. Az oltáshoz használjon: 10% vagy 20% epeleves oldatot, 50-100 ml-es palackokba öntve, hús-pepton levest 1% glükóz hozzáadásával, steril desztillált vizet - N. N. Klodnitsky módszere szerint, amelyben lízis történik. vörösvértestek mennyisége fordul elő, bomlástermékeik jó táptalajként szolgálnak a baktériumok szaporodásához. Használhat steril csapvizet is. legjobb pontszámok anyag epelevesbe oltásával nyerik. Ha a vért a helyszínen nem lehet tenyészteni, a szérumot és a vérrögöt vagy citrátos vért (10 ml vért 2 ml 5%-os steril nátrium-citrátot tartalmazó csőbe öntve) a laboratóriumba küldik. A vérrögöt a laboratóriumban összetörik, és a felsorolt táptalajok egyikébe oltják. A palackokat 37°C-os termosztátba helyezzük.
A tanulmány második napja. A vizsgálat megkezdésétől számított 14-24 óra elteltével az anyagot Petri-csészében oltjuk be Endo táptalajra vagy táptalajra eozinnal és metilénkékkel (Levine-féle táptalaj). Nem javasolt a Ploskirev táptalaj használata vetéshez, mivel a vérben található tífusz-paratífusz bacilusok a táplálkozás típusa szerint kötelező paratrófok, és nem változtatják azonnal ezt a fajta táplálkozást metatrófra (azaz elhalt szerves szubsztrátumokra). Ezért ezen a sókat tartalmazó táptalajon epesavak, a tífuszbacilusok nagyon rosszul vagy egyáltalán nem nőnek. Ha az első beoltás után nincs baktériumszaporodás, akkor a következő oltásokat 48, 72 óra elteltével és az 5. és 10. napon végezzük. Ha a kórokozót nem sikerült elkülöníteni, nemleges választ adnak. Kétes esetekben javasolt időszakosan - 3-4 naponként - a bevetést az anyag felvételétől számított 24. napig végezni. A 7. napon még mindig nemleges választ adnak.
A tanulmány harmadik napja. Az Endo és Levin táptalajon (Endo táptalajon a kórokozó mikrobák színtelenek telepei) növesztett „gyanús” telepeket azonosítjuk, amelyekhez 2-3 telepet ferde agarra és Ressel táptalajra tenyésztünk ki.
A kutatás negyedik napja. A Ressel-féle táptalajon végzett beoltás eredményeit figyelembe vesszük és feljegyezzük, és az izolált tenyészetek morfológiai tulajdonságait Gram-festett kenetben tanulmányozzuk. A mozgékonyságot - flagella jelenlétét vagy hiányát - egy 4-6 órás húsleves tenyészetből vett függő vagy zúzott cseppben határozzuk meg. Ehhez egy agartenyészetet (egy hurkot) 1 ml enyhén felmelegített húslevesbe oltunk. A kiválasztott tenyészeteket (2-3 kémcső) mannitos, szacharózos és ferde agaros Hiss táptalajra, valamint 2 db hús-peptonleves kémcsőbe oltjuk be, amelyekben speciális hidrogénmeghatározási oldatokkal megnedvesített szűrőpapír csíkok. szulfidot és indolt (kihajtva) helyeznek a dugók alá.
A kutatás ötödik napja. A változásokat a kibontott „tarka sorban” rögzítjük. Gázképződés esetén Salmonella szérumok keverékével agglutinációs reakciót hajtanak végre. Nál nél pozitív reakció végezzen agglutinációs reakciót O- és H-szérummal, és adjon végső választ az összes jel összessége alapján.
A mielokultúra izolálását a kapott pont elvetésével végezzük csontvelő 3-5 ml steril szarvasmarha epében vagy 25-30 ml 10%-os epelevesben termosztátba helyezzük és másnap Endo vagy Wilson-Blair táptalajon szubkultúrázzuk. A jövőben a kutatás szakaszai ugyanazok.
Baktériumok izolálása a székletből. A betegség 8.-10. napjától, gyakrabban a harmadik héttől tífuszos, paratífuszos betegeknél a baktériumok a széklettel ürülnek ki. Kutatáshoz vegye ki a folyékony állagú széklet utolsó adagját, emulgeálja izotóniás nátrium-klorid-oldatban (1:10 arányban), és hagyja állni 30 percig, amíg a nagy részecskék leülepednek. A vetéshez egy csepp anyagot veszünk a folyadék felszínéről.
A vizsgálat első napján az anyagot dúsító táptalajra - epeleves, magnézium, Muller, Kaufman táptalaj - oltják be, és termosztátba helyezik. A vizsgálat második napján a dúsító táptalajt Ploskirev, Endo vagy Levin és Wilson-Blair (bizmut-szulfit-agar) tápközeggel oltjuk be a lemezekre. A vizsgálat további szakaszai ugyanazok, mint a vérkultúra izolálásakor.
A tífusz-paratífusz csoportba tartozó baktériumok vizeletből történő izolálása a legjobb a betegség második-harmadik hetétől. Az anyag felvétele előtt mossa le a külső nyílást steril izotóniás nátrium-klorid oldattal. húgycső; Nőknél jobb, ha katéterrel vesznek vizeletet. A kutatáshoz 20-30 ml vizeletet veszünk. Centrifugálás után az üledéket 2 edénybe oltjuk be Ploskirev táptalajjal vagy bizmut-szulfit agarral. A felülúszót dúsító táptalajra (10%-os epeleves) oltjuk be, és 24 órára termosztátba helyezzük, majd 2 csészébe oltjuk be az egyik választható táptalajba. Az izolált telepeket a szokásos módon azonosítjuk.
A nyombél tartalmának vizsgálata - epe. A módszert gyakrabban alkalmazzák a lábadozás szakaszában. A szondázás során az epét steril csövekbe gyűjtik. A nyombél tartalmát fiolákba oltjuk 50 ml húslevessel, és az anyag fennmaradó részét az oltásokkal együtt 37 °C-os termosztátba helyezzük. Másnap az oltást 2 csészében, sűrű differenciálközeggel végezzük. . Az izolált telepeket a leírt módszerrel azonosítjuk.
Nagyon érzékeny és ígéretes korai diagnózis A tífusz és paratífusz az immunfluoreszcens módszer, amely a betegség első napjaitól vért, a 10. naptól a székletet, a 10. naptól a nyombél tartalmát vizsgálja. normál hőmérséklet testek. A tífusz-paratífusz baktériumok specifikus fluoreszcens szérummal vannak megjelölve, amelyeket ezt követően fluoreszcens mikroszkóppal határoznak meg. A módszer lehetővé teszi a betegség diagnosztizálását a vizsgálat kezdetétől számított 10-12 órával.
A tífusz-paratífusz betegségek szerológiai diagnosztikája. A betegség második hetétől a betegek vérében specifikus antitestek jelennek meg, amelyek Widal-reakcióval határozhatók meg. Tífusz és paratífusz láz esetén O-, majd H-agglutinin halmozódik fel. A betegség lefolyása során időnként Vi-agglutinineket észlelnek, de ez utóbbiaknak a hordozókkal ellentétben nincs diagnosztikus értéke. A betegek vérében a tífusz és paratífusz kórokozójának specifikus agglutininjének meghatározása (Vidal reakció) segíthet a diagnózis felállításában, mind akut időszak betegség és lábadozás során.
Szalmonellózis esetén a Widal-reakció egy segéddiagnosztikai módszer. Emlékeztetni kell arra, hogy a betegség gyengén kifejezett immunológiai választ adó formái gyakran találkoznak. Az antibiotikumokkal kezelt betegeknél különösen gyakran alacsony agglutinin titereket figyeltek meg, még azok hiányát is.
A Widal-reakcióhoz 1-3 ml vért veszünk ujjból vagy cubitális vénából egy steril csőbe. A véralvadás felgyorsítása érdekében 30 percre termosztátba helyezzük. Az alvadt vért üvegpipettával körbejárjuk, és hűtőszekrénybe tesszük, amíg tiszta, leülepedett szérum meg nem jelenik. Az alvadékot tenyésztésre (vértenyésztésre) használják. Az agglutinációs reakciót H- és O-tífusz, A- és B-paratífusz diagnosztikával végezzük. A szérumot 1:100-tól 1:800-ig terjedő titertől kezdve a következő eljárás szerint hígítjuk. 9,9 ml steril izotóniás nátrium-klorid oldatot és 0,1 ml tesztszérumot öntünk egy kémcsőbe, hogy 1:100-as hígítást kapjunk. 5 ml, egyenként 1 ml-es hígított szérumot öntünk 4 kémcsőbe (a Widal-reakcióban felhasznált antigének számának megfelelően) és egy szérumkontrollként szolgáló kémcsőbe. A maradék 5 ml szérumból (1:100 hígítás) 1 ml-t öntünk ki, és 4 ml-hez 4 ml izotóniás nátrium-klorid oldatot adunk, és 1:200 hígítást kapunk. Az 1:200 hígításból 4 ml-t szintén 4, egyenként 1 ml-es kémcsőbe öntünk, és a maradék 4 ml-hez ismét 4 ml izotóniás nátrium-klorid-oldatot adunk, hogy 1:400-as hígítást kapjunk. Az ezt követő hígításokat (1:800, 1:1600) a leírtak szerint végezzük. 1 ml izotóniás nátrium-klorid oldatot öntünk 4 kémcsőbe, amelyek antigénkontrollként szolgálnak. Minden kémcsőbe 1-2 cseppet csepegtetünk a megfelelő diagnosztikai anyagokból, kivéve azokat, amelyek szérumkontrollként szolgálnak. A kémcsövekkel ellátott állványt felrázzuk, és 24 órára termosztátba helyezzük 37 ° C-on, a H-agglutináció (durva szemcsés) 2 óra múlva, az O-agglutináció (finomszemcsés) sokkal később következik be. A reakció intenzitását 24 óra elteltével észleljük. A Widal-reakció diagnosztikai titerét legalább 1:200 arányban hígítjuk klinikai megnyilvánulások jelenlétében.
Szem előtt kell tartani, hogy ez a reakció pozitív lehet más betegségekben - tuberkulózis, malária, brucellózis, rosszindulatú daganatokés bizonyos állapotok (terhesség). A Widal-reakció pozitív lehet egészséges egyéneknél (mindennapi reakció), beoltottaknál és korábban valamilyen betegségben szenvedőknél (anamnesztikus reakció). A Widal-reakció specifitásának növelése érdekében Fischer a szérum hígítását javasolta hipertóniás oldat nátrium-klorid (2,9 és 5,8%). Ez a csoportreakciók gyengüléséhez vagy megszűnéséhez vezet. Az agglutinációs reakció értéke növekszik az ismételt vizsgálatok során, amikor a betegség dinamikájával az antitesttiter növekedését állapítják meg. A paratífusz A esetén a Widal-reakció negatív lehet, vagy a specifikus antitestek titere kisebb, mint a csoportos antitesté.
BAN BEN utóbbi évek elismerésért bélcsoport betegségek esetén széles körben alkalmazzák a passzív hemagglutinációs reakciót (RPHA) a tífuszbaktériumok részleges antigénjeivel. Az RPGA nagy érzékenységgel és specificitással rendelkezik, és a betegség 5. napjától pozitív. A tífuszban, paratífuszban és O-antigén szalmonellózisban szenvedő betegek minimális diagnosztikai titere 1:200. A reakciót idővel követjük, hogy meghatározzuk az antitest-titer növekedését.
Mód laboratóriumi diagnosztika bakteriális hordozás tífuszban és paratífuszban. A széklet, a vizelet és a nyombéltartalom bakteriológiai vizsgálatát általánosan elfogadott módszerek szerint végezzük. A legjobb eredményt a szelenit közeg használata éri el.
A bakteriális izolálás gyakorisága miatt gyakran nem lehet izolálni a kórokozót. A tífusz bacilusok hordozóinak túlnyomó többségében Vi-antigént tartalmazó mikrobák találhatók, ezért Vi-antitestek jelennek meg az akut és krónikus hordozók vérében (a betegek vérében ritkábban fordulnak elő). A reakció diagnosztikus titere 1:20 vagy magasabb. A Vi-agglutinációs reakcióval (hevített szérummal) párhuzamosan a Widal-reakciót (natív szérummal) H- és O-tífusz diagnosztikával végezzük. A tífuszbaktériumok hordozóinak szérumában az esetek 60-80%-ában 1:200-1:800 titerű H-antitestek találhatók. A H- és Vi-antitestek kombinációjának jelenléte különösen diagnosztikus jelentőséggel bír a tífuszbacillusok hordozóinak azonosításában.
Tól től további módszerek A tífuszbacilusok hordozásának kimutatására végzett vizsgálatok során bőrallergia tesztet végeznek tífinnel, valamint RPGA-t a Vi-antigénnel.
Így a tífusz-paratífuszos betegségek elleni küzdelem sikerességének fontos feltétele a fertőzések forrásának korai és teljes azonosítása és semlegesítése. Jelenleg tífusz szórványosan fordul elő. Ugyanakkor a betegség lefolyása rövidebb, és nem kíséri a klasszikus forma összes jellemző tünete, ami megnehezíti a klinikai felismerést.
A fentiek kapcsán fontossá válik az átfogó laboratóriumi vizsgálat.
