Aminokyseliny lze detekovat pomocí barevných reakcí: ninhydrin, xantoprotein, Foly, Milone, biuretový test atd. Tyto reakce jsou nespecifické, protože jsou založeny na detekci jednotlivých fragmentů ve struktuře aminokyselin, které lze nalézt i v jiných sloučeninách.
Ninhydrinová reakce, barevná reakce používaná pro kvalitativní a kvantitativní stanovení aminokyselin, iminokyselin a aminů. Při zahřátí v alkalické prostředí ninhydrinem (tricetohydrin dihydrát, C 9 H b O 4) s látkami majícími primární aminoskupiny (-NH 2), vzniká produkt, který má stabilní intenzivní modrofialovou barvu s maximální absorpcí cca 570 nm. Protože absorpce při této vlnové délce závisí lineárně na počtu volných aminoskupin, sloužila ninhydrinová reakce jako základ pro jejich kvantitativní stanovení kolorimetricky nebo spektrofotometricky. Tato reakce se také používá ke stanovení sekundárních aminoskupin (>NH) v iminokyselinách - prolinu a hydroxyprolinu; v tomto případě se vytvoří jasně žlutý produkt. Citlivost - až 0,01%. Moderní automatická analýza aminokyselin se provádí kombinací iontoměničové separace aminokyselin a jejich kvantitativního stanovení pomocí ninhydrinové reakce. Při separaci směsí aminokyselin pomocí papírové chromatografie umožňuje stanovit každou aminokyselinu v množství minimálně 2-5 μg.
Intenzita barvy může být použita k posouzení množství aminokyselin.
Tato reakce je pozitivní nejen u volných aminokyselin, ale také u peptidů, proteinů atd.
Xantoproteinová reakce umožňuje odhalit aromatické aminokyseliny(fenylalanin, tyrosin, histidin, tryptofan), založené na reakci elektrofilní substituce v aromatickém kruhu (nitrace).
Při působení koncentrované kyseliny dusičné např. na tyrosin vzniká žlutě zbarvený produkt.
Follova reakce. Jedná se o reakci na cystein a cystin. Během alkalické hydrolýzy se „slabě vázaná síra“ v cysteinu a cystinu poměrně snadno odštěpí, což má za následek vznik sirovodíku, který reakcí s alkálií vytváří sulfidy sodíku nebo draslíku. Když se přidá octan olovnatý, vytvoří se šedočerná sraženina sulfidu olovnatého.
Popis zážitku. 1 ml roztoku cystinu se nalije do zkumavky, přidá se 0,5 ml 20% roztoku hydroxidu sodného. Směs se zahřeje k varu a poté se přidá 0,5 ml roztoku octanu olovnatého. Je pozorována šedočerná sraženina sulfidu olovnatého:
Zimmermanova reakce. Jedná se o reakci na aminokyselinu glycin.
Popis zážitku. Do 2 ml 0,1% roztoku glycinu, upraveného přidáním 10% alkalického roztoku na pH = 8, přidejte 0,5 ml vodný roztok o-ftalový dialdehyd. Reakční směs se pomalu začne barvit jasně zeleně. Po několika minutách se objeví zelená sraženina.
Reakce na tryptofan. Tryptofan, reagující v kyselém prostředí s aldehydy, tvoří barevné kondenzační produkty. Například s kyselinou glyoxylovou (což je příměs koncentrované kyseliny octové) reakce probíhá podle rovnice:
Reakce tryptofanu s formaldehydem probíhá podle podobného schématu.
Sakaguchiho reakce. Tato reakce na aminokyselinu arginin je založena na interakci argininu s α-naftolem v přítomnosti oxidačního činidla. Jeho mechanismus není dosud zcela objasněn. Zdá se, že reakce probíhá podle následující rovnice:
Protože deriváty chinoneiminu (in v tomto případě naftochinon), ve kterých je vodík iminoskupiny –NH– nahrazen alkylovým nebo arylovým radikálem, jsou vždy zbarveny žlutočerveně, pak je oranžovočervené zbarvení roztoku během Sakaguchiho reakce zjevně vysvětleno vzhled derivátu naftochinoniminu. Nelze však vyloučit možnost vzniku ještě složitější sloučeniny v důsledku další oxidace zbývajících NH skupin argininového zbytku a benzenového kruhu α-naftolu:
Popis zážitku. Do zkumavky se nalijí 2 ml 0,01% roztoku argininu, poté se přidají 2 ml 10% roztoku hydroxidu sodného a několik kapek 0,2% roztoku. alkoholový roztok a-naftol. Obsah zkumavky se dobře promíchá, přidá se 0,5 ml roztoku bromnanu a znovu se promíchá. Okamžitě přidejte 1 ml 40% roztoku močoviny pro stabilizaci rychle se rozvíjejícího oranžovo-červeného zbarvení.
Biuretová reakce– používá se jako barevná reakce na bílkoviny. V alkalickém prostředí v přítomnosti měďnatých solí dávají fialovou barvu. Barva je způsobena tvorbou komplexu mědi(II) díky peptidové skupině -CO-NH-, která je charakteristická pro bílkoviny. Tato reakce dostala svůj název podle derivátu močoviny - biuretu, který vzniká při zahřívání močoviny za odstranění amoniaku:
Stejné zbarvení mají kromě proteinů a biuretu i další sloučeniny obsahující tuto skupinu: amidy, imidy karboxylových kyselin a také sloučeniny obsahující v molekule skupiny -CS-NH- nebo =CH-NH-. Reagují také proteiny, některé aminokyseliny, peptidy, biuret a střední peptony.
Barva komplexu získaného biuretovou reakcí s různými peptidy je poněkud odlišná a závisí na délce peptidového řetězce. Peptidy s délkou řetězce od čtyř aminokyselinových zbytků a výše tvoří červený komplex, tripeptidy - fialové a dipeptidy - modré.
ketonová forma polypeptidu
enolová forma polypeptidu
Když polypeptid interaguje s Cu (OH) 2, vytvoří se komplex, jehož struktura může být znázorněna následovně.
Vybavení a činidlo: chromatografický papír; chromatografická komora; fotoelektrický kolorimetr; nůžky; skleněné talíře (3´32 cm) - 3 ks; držák chromatogramu; sušicí skříň; mikropipety; zkumavky se zabroušenými zátkami; byreta 25 ml; standardní směs aminokyselin; testovací směs aminokyselin; butanol, kyselina octová, voda v poměru 15:3:7; 1% roztok ninhydrinu v 95% acetonu; ethylalkohol (75 %), nasycený síranem měďnatým.
Dokončení práce
Vezměte list chromatografického papíru o rozměrech 18 x 28 cm a jednoduchou tužkou nakreslete vodorovnou čáru ve vzdálenosti 3 cm od jeho krátkého okraje. Poté se rozdělí na nestejné části podle přiloženého schématu a hranice použití standardní a zkušební směsi jsou označeny šipkami a odpovídající nápisy jsou provedeny jednoduchou tužkou.
Papír se zpevní nad povrch stolu a na startovní čáru ohraničenou šipkami se nejprve nanese standardní směs pomocí speciální mikropipety v tenké linii, dokud se celý roztok z mikropipety nepřenese na startovací čáru (mikropipeta je naplněné na 2-3 cm). Hmotnost naneseného roztoku se změří zvážením pipety naplněné standardní směsí (před aplikací roztoku) a prázdné (po aplikaci roztoku). Na papír se obvykle nanáší 0,02-0,03 g standardního roztoku. Poté naplňte čistou pipetu testovací směsí aminokyselin (vydanou učitelem ke studiu), zvažte a naneste směs na startovní čáru s příslušnou značkou.
Připravený chromatogram se umístí do chromatografické komory, do které se předem nalije systém rozpouštědel, aby se oddělila směs aminokyselin, například směs butanolu, octová kyselina a vody v poměru 15:3:7. Separace se provádí vzestupnou chromatografií, dokud přední linie nedosáhne 2-3 cm k hornímu okraji chromatografického papíru (koncová linie). Poté se chromatogram vyjme z komory a horní konec papíru se ihned vloží do držáku ze tří skleněných tyčinek upevněných pryžovým kroužkem a umístí se na 20 minut do digestoře, aby se z papíru odstranila rozpouštědla.
Rýže. 8. Rozložení aminokyselin na chromatogramu:
A - místo aplikace směsi aminokyselin; I - cystin a cystein;
2 - lysin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - kyselina asparagová,
série a glycin; 6 - kyselina glutamová a threonin; 7 - alanin;
8 - prolin; 9 - tyrosin; 10 - valin a methionin; II - tryptofan;
12 - fenylalanin; 13 – leucin a isoleucin
Vysušený chromatogram se ponoří do 1% roztoku ninhydrinu v acetonu, aby se zjistila poloha aminokyselinových skvrn na něm. Chromatogram se poté umístí na 10 minut do digestoře, aby se odstranil aceton, a přenese se do sušárny, kde se nechá 15 minut při 70 °C. Aminokyseliny standardní a testované směsi jsou detekovány ve formě modrofialových skvrn umístěných v řetězci ve směru pohybu systému rozpouštědel od startovací čáry k hornímu okraji chromatogramu.
Identifikace aminokyselin obsažených v testované směsi se provádí shodou pozic v chromatogramu obsazených aminokyselinami standardu a testované směsi (obr. 8).
Pro stanovení kvantitativního obsahu aminokyselin ve zkušebních směsích se chromatogram nakreslí jednoduchou tužkou tak, aby barevné zóny ležící na stejné úrovni, odpovídající téže aminokyselině, byly obsaženy v přibližně stejných obdélníkech (obr. 9). .
I II III IV
Rýže. 9. Rozložení aminokyselin na chromatogramu:
I - směs č. I; II - směs č. 2; 1U - směs č. 3; Ш - standardní
směs aminokyselin
Naznačené oblasti papíru se vystřihnou a vloží do zkumavek, jejichž čísla musí odpovídat počtu skvrn na chromatogramech. Do každé zkumavky se z byrety nalije 10 ml 75% roztoku. ethylalkohol nasycený síranem medovým (do 500 ml ethylalkoholu přidat 0,2 ml nasyceného roztoku síranu měďnatého). Zkumavka se uzavře a za občasného promíchání se cihlově červená barva (Ruhemanova modrofialová měděná sůl) zcela přenese z papíru do roztoku. To trvá 15-20 minut. Absorpce (optická hustota) standardního a testovaného roztoku se měří na fotoelektrickém kalorimetru s filtrem zeleného světla (540 nm). V referenčním toku je instalována kyveta se 75% roztokem ethylalkoholu se síranem měďnatým.
Kvantitativní obsah aminokyselin ve zkušebním roztoku se vypočte z poměru extinkcí zkušebního a standardního vzorku.
Příklad výpočtu. Předpokládejme, že standardní směs obsahuje 1,8 mg glycinu v 1 ml a na startovací proužek se nanese 0,02 g tohoto standardního roztoku. Chromatogram tedy obdržel (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glycinu. Dále se shodneme, že absorpce barevných roztoků byla 0,288 pro standard a 0,336 pro neznámou směs. Potom bude obsah glycinu ve zkoumané směsi vynesený na chromatogramu (36´0,336): 0,288=42 μg. Pokud dále předpokládáme, že se zkušební směs nanese na chromatogram v množství např. 0,0250 g, pak obsah glycinu v 1 ml zkušebního roztoku bude (42:0,0250) = 1680 μg, neboli 1,68 mg/ ml.
Prezentujte výsledky vlastního experimentu a vyvozujte z nich závěry.
Laboratorní práce č. 15
Separace iontůFe 3+ , spol 2+ , Ni 2+
Tento článek se bude zabývat metodami pro stanovení aminokyselin, které se používají nejen při analýze produktů, ale také v biochemii a farmaceutické analýze.
Celkové množství aminokyselin lze stanovit fotometrickou metodou založenou na stanovení amoniaku získaného z aminokyselin Kjeldahlovou metodou.
Reakce s 1-naftolem. Pro stanovení argininu, histidinu a tyrosinu byla navržena reakce s 1-naftolem. V přítomnosti chlornanu sodného (NaOCl) roztok zčervená. Roztok vzorku v 50% ethanolu obsahující aminokyselinu se ochladí ledem a přidá se 10% roztok NaOCl a roztok naftolu. Reakční produkt je zbarven červeně (lmax = 550 nm). Obsah aminokyselin je určen intenzitou barvy výsledného roztoku.
Biuretová reakce. Jeden z nejdůležitější reakce pro stanovení aminokyselin se používá biuretová reakce. Reakce se provádí přidáním zředěného vodného roztoku měďnaté soli k alkalickému roztoku biuretu. V tomto případě se roztok zbarví intenzivně do fialova v důsledku tvorby komplexní sloučeniny.
Biuretová reakce zahrnuje sloučeniny obsahující alespoň 2 amidové skupiny nebo aminohydroxyethylenovou skupinu, stejně jako amidy a imidy aminokyselin. Tuto reakci provádějí proteiny a koncentrované roztoky aminokyselin a amidů. Zředěné roztoky aminokyselin nedávají biuretovou reakci, a proto lze reakci použít ke stanovení konce hydrolýzy bílkovin. Reakce se také používá pro kvalitativní a kvantitativní stanovení bílkovin. Biuretová reakce je základem pro metody používané v klinických diagnostických laboratořích pro stanovení bílkovin v krvi a další biologické tekutiny.
Ninhydrinová reakce. Druhou nejdůležitější reakcí používanou ke stanovení aminokyselin je ninhydrinová reakce - barevná reakce na a-aminokyseliny, která se provádí zahříváním posledně jmenovaných v alkalickém roztoku přebytku ninhydrinu.
Ninhydrin provádí oxidační dekarboxylaci a-aminokyselin za vzniku amoniaku, oxid uhličitý a aldehyd obsahující o jeden atom uhlíku méně než mateřská aminokyselina. Redukovaný ninhydrin dále reaguje s uvolněným amoniakem a druhou molekulou ninhydrinu za vzniku barevného kondenzačního produktu s amoniakem.
Výsledná sloučenina (pigment) má fialovomodrou barvu (l max = 570 nm). Tvorba této barevné sloučeniny se používá v kvantitativním testu a-aminokyselin, který dokáže detekovat aminokyseliny i v množstvích pouhých 1 µg.
Prolin a hydroxyprolin, které nemají a-aminoskupinu, reagují s ninhydrinem za vzniku derivátů žlutá barva(lmax = 440 nm). Reakce není konkrétní, protože amoniak a sloučeniny obsahující aminoskupinu (aminy, proteiny, peptidy) také vytvářejí barevný produkt s ninhydrinem. S těmito sloučeninami se však neuvolňuje žádný CO2. Uvolňování oxidu uhličitého je charakteristické pouze pro a-aminokyseliny. Reakce se používá pro kolorimetrické kvantitativní stanovení a-aminokyselin, včetně automatických analyzátorů aminokyselin (měření objemu CO 2 ).
Ninhydrinová reakce se používá ke stanovení glycinu, isoleucinu, leucinu; serin, fenylalanin, cystein, tyrosin, tryptofan atd. poskytují méně intenzivní zbarvení.
Výsledné produkty se vyznačují poměrně intenzivní barvou (e = 1,8–3,3·10 4), ale barevné produkty jsou nestabilní. Intenzita barvy rychle klesá. Pro stabilizaci se přidá CdCl2. S výslednými sloučeninami tvoří stabilní komplexy. Chlorid kademnatý také urychluje reakci.
Aminokyseliny a některé další sloučeniny obsahující aminoskupinu kondenzují v alkalickém prostředí s 1,2-naftochinon-4-sulfoxylátem za vzniku červených, žlutých, oranžových derivátů 1,2-naftochinonmonoiminu.
Reakce se používá ke stanovení a-aminoxylátů (valin, isoleucin, leucin atd.).
Ke stanovení tryptofanu lze použít reakci s 4-dimethylaminobenzaldehydem. Reakční produkt je zbarven do fialova a obsah tryptofanu v analyzovaném roztoku je určen intenzitou zbarvení.
Je však třeba poznamenat, že tato reakce se při analýze potravin používá jen zřídka.
Pro kvantitativní stanovení aminokyselin obsahujících síru se používá bromatometrická metoda založená na následující reakci:
Roztok cysteinu v 1% roztoku NaOH se nalije do baňky se zabroušenou zátkou, přidá se 0,1 N. roztok bromičnanu draselného, suchý bromid draselný a okyselený 10% HCl.
BrO3 – + 5Br – + 6H + → 3Br2 + 3H20
Brom vzniklý jako výsledek reakce, jehož množství je ekvivalentní množství bromičnanu draselného, reaguje s aminokyselinou. Po 10 minutách se přidá jodid draselný, který reaguje s nezreagovaným bromem a uvolněný jód se titruje 0,1 N. roztok thiosíranu sodného se škrobem jako indikátorem.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Množství thiosíranu použitého pro titraci je ekvivalentní množství bromu, které nereagovalo s aminokyselinou. Na základě rozdílu mezi množstvím přidaného bromičnanu draselného a thiosíranu se zjistí množství bromu, které vstoupilo do reakce s aminokyselinou, a tedy množství aminokyseliny.
Methionin se stanoví podobně. Methionin se oxiduje na sulfon:
Tato reakce za určitých podmínek umožňuje velmi přesně stanovit obsah methioninu.
Metody stanovení aminokyselin
Aminokyseliny jsou biologicky účinné látky, hrají důležitou roli v životě lidského těla, jsou široce používány jako léky. Některé z nich jsou nezbytné a dostávají se do těla s jídlem. V současné době existuje řada metod pro kvantitativní stanovení aminokyselin v léčivých rostlinných materiálech, včetně léky a biologických tekutinách v potravinářských výrobcích.
Z různých metod kvantitativního stanovení aminokyselin v různých objektech lze rozlišit čtyři hlavní skupiny: chromatografické, spektrofotometrické, titrimetrické a elektrochemické metody analýzy.
Chromatografické metody
Za posledních desetiletích Významného pokroku bylo dosaženo v oblasti plyno-kapalinové chromatografie aminokyselin. Byla navržena metoda využívající mikroplněné kolony, která umožňuje relativně krátký čas oddělit téměř úplně 17 biologicky důležitých α-aminokyselin.
Byla vyvinuta metoda pro stanovení aminokyselin pomocí plynové kapalinové chromatografie ve vzorcích séra, plazmy, moči a mozkomíšního moku, na bázi přípravy 2,3,4,5,6-pentafluorbenzoyl-isobutyletherů s následnou separací na polydimethylsiloxanové koloně v režimu programování teploty od 140°C do 250°C s plamenoionizačním detektorem. Doba chromatografické separace je 28 minut. Výsledkem výzkumu bylo separováno 27 aminokyselin.
Navzdory rozmanitosti metod vysokoúčinné kapalinové chromatografie pro analýzu aminokyselin je nejrychlejší a nejdostupnější verze s reverzní fází se spektrofotometrickou detekcí. Pro úspěšnou separaci a detekci se aminokyseliny převádějí na hydrofobní a světlo absorbující deriváty, to znamená, že se provádí předkolonová derivatizace. Jako derivatizační činidla se používají ortoftalový aldehyd, naftalen-2,3-dikarboxyaldehyd a 9-fluorenylmethylchlorformiát.
Byla vyvinuta metoda pro kvantitativní stanovení L-cystinu, kyseliny L-glutamové a glycinu v léku "Eltacin", který má antioxidační aktivitu v kombinaci s antianginózním účinkem. Kyselina glutamová a glycin byly stanoveny vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzní fází po předkolonové derivatizaci s činidlem ortoftalaldehyd/N-acetyl-L-cystein. Derivatizace cysteinu je podle autorů obtížná kvůli nestabilitě samotné aminokyseliny a výsledných derivátů. Proto byla analýza cysteinu provedena bromatometrickou titrací. Bylo zjištěno, že přítomnost významného množství cysteinu ve vzorku neinterferuje se stanovením produktů derivatizace glycinu a kyseliny glutamové s činidlem ortoftalový aldehyd/N-acetyl-L-cystein. Metoda se vyznačuje vysokou reprodukovatelností a přesností stanovení.
Byla navržena možnost použití 4,7-fenanthrolin-5,6-dionu (fanchinonu) jako fluorogenního značícího činidla pro předkolonovou tvorbu jeho derivátů za účelem separace a kvantitativní analýzy aminokyselin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. vyšetřován. Fanchinon, který nemá vlastní fluorescenci, reaguje s aminoskupinami aminokyselin (při 68 °C po dobu 160 minut) za vzniku iminochinolů, jejichž fluorescence se měří při vlnové délce 460 nm. Izolované deriváty byly identifikovány pomocí Tm, IR, hmotnostních a PMR spekter. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie byla prováděna na chromatografu s fluorescenčním detektorem a kolonou s gradientovou elucí se směsmi: roztok triethylaminu - fosfátový pufr(pH 3) - methanol. Chinidin byl použit jako vnitřní standard. Tato metoda je velmi slibný ve velkých laboratořích a může být navržen pro analýzu aminokyselin v hotových lékových formách.
Byla vyvinuta technika vysokoúčinné kapalinové chromatografie s potenciometrickým biosenzorem pro kvantitativní stanovení lysinu. Biosenzor je konstruován připojením membrány obsahující lysinoxidázu k iontově selektivní elektrodě NH4+. Amonné ionty vznikající při enzymatické degradaci lysinu jsou detekovány potenciometricky. Byla vyvinuta chromatodenzitometrická expresní metoda pro analýzu tryptofanu v kultivačních kapalinách. Chromatografie na tenké vrstvě byla prováděna na deskách Sorbfil. Chromatografie byla prováděna v systému propanol-2 - 25% roztok hydroxidu amonného (7:3) po dobu 25 minut. Chromatogramy byly sušeny při pokojová teplota a udržuje se 15 minut při 120 °C. Pro detekci skvrn na chromatogramech bylo použito specifické činidlo - 4-dimethylaminobenzaldehyd, selektivní pro indolový kruh tryptofanu, ve formě 0,5% roztoku ethanolu s přídavkem 5% koncentrované kyseliny sírové. Po vyvolání chromatogramů ponořením do teflonové kyvety s čerstvě připraveným roztokem 4-dimethylaminobenzaldehydu byly ponechány po dobu 5-7 minut při teplotě 110 C. Skenování tryptofanových skvrn bylo prováděno při vlnové délce 625 nm na počítačovém video denzitometru. Vyvinutá metoda je i přes vysokou přesnost stanovení a produktivitu specifická pro tryptofan.
Pro analýzu β-aminokyselin v biologických tekutinách, léčivech a potravinách se široce používají metody kapilární elektroforézy, založené na separaci složek komplexní směsi v křemenné kapiláře působením aplikovaného elektrické pole. Vzhledem k tomu, že aminokyseliny jsou zwitteriontové povahy, lze je separovat pomocí roztoků elektrolytických pufrů s vhodnou hodnotou pH, nejčastěji se používají neutrální a zásadité separační pufry.
Pro zvýšení specifičnosti a citlivosti metody kapilární elektroforézy pro analýzu jednotlivých β-aminokyselin je využívána jejich předběžná derivatizace s následnou separací v křemenné kapiláře a spektrofotometrickým stanovením reakčních produktů. Jako derivatizační činidla se tedy používají 9-fluorenylmethylformiát, 9-(2-karbazol)ethylchlorformiát a cyaninové barvivo. Perspektivy této metody jsou dány takovými výhodami, jako je rychlá analýza, snadná příprava vzorku, nízká spotřeba činidel a jednoduchost instrumentace.
A bílkoviny
Je známo, že všech 20 odrůd kanonických α-aminokyselin má stejnou strukturu se třemi variantami funkčních skupin (obr. 3.3). Bohužel reakce na amino a karboxy skupiny nejsou příliš specifické, protože podle toho jsou charakteristické pro všechny aminy, řadu amidů a karboxylových kyselin. Totéž platí pro většinu jejich radikálů = R, z nichž 10 je nepolárních, tj. reprezentovaných alifatickými = uhlovodíkovými skupinami, z nichž většina je chemicky inertní. Specificita většiny R polárních aminokyselin, které obsahují alkoholové (Ser, Tre, Tyr), amidové (Asn, Gln) a karboxylové skupiny (Asp, Glu), je také relativně nízká. Aktivnější jsou aminoskupina (Lys), imidazol His a guanidinoskupina Arg a maximální aktivita thioskupiny Cys. Proto největší praktický význam v kvalitě a kvantitativní analýzaα-aminokyseliny, včetně analyzátorů aminokyselin, prošly univerzální ninhydrinovou reakcí, specifickou pro současnou přítomnost amino a karboxyskupin na atomu α-C.
Rýže. 3.3. Obecné vzorce struktury α-aminokyselin a produkty jejich polymerace. Vysvětlivky v textu.
Polymerace α-aminokyselin do struktury peptidů a proteinů (obr. 3.3) zachovává všechny jejich R typy, ale:
1. Ninhydrinová reakce se stává negativní, protože s výjimkou N- a C-koncových jsou α-amino a α-karboxyskupiny vynaloženy na tvorbu peptidových vazeb. Pozitivní reakce ninhydrinu s proteinem s největší pravděpodobností ukazuje na přítomnost aminokyselinových nečistot v přípravku nebo nádobě.
2. Pro všechny peptidy a proteiny je biuretová reakce specifická pro peptidovou skupinu, která chybí v monomerních aminokyselinách.
3. Z více specifické reakce pro R aminokyseliny jsou užitečné: xantoproteinová reakce s koncentrovanou kyselinou dusičnou, pro aromatické R Fen, Tyr, Tri; reakce s isatinem na pětičlenném Pro kruhu, stejně jako reakce na imidazolu R His, thioskupině Cys a guanidinové skupině Arg. Je důležité vzít v úvahu, že některé z těchto R jsou skryty uvnitř proteinových globulí, a proto jsou kvalitativní reakce na ně oslabeny. Proto se proteiny před jejich provedením obvykle tím či oním způsobem denaturují.
4. Na rozdíl od skutečných roztoků aminokyselin, koloidní roztoky charakteristické jsou proteiny sedimentární reakce , spojené s destrukcí jejich hydratačních obalů a v důsledku toho se snížením jejich rozpustnosti vlivem látek odstraňujících vodu: neutrální soli = vysolování, methanol = MeOH, ethanol = EtOH, aceton, močovina a další činidla.
Při provádění kvalitativních reakcí byste měli:
1. Pečlivě dodržujte pravidla požární bezpečnosti a pracujte s koncentrovanými kyselinami a louhy = EZh.
2. Označte 2 řady zkumavek skleněným grafem nebo fixem a do jedné z nich dejte ne více než 0,5 ml (2-5 kapek) 1% roztoku aminokyselin a přibližně stejný objem 1 % roztoku proteinu v druhém.
3. Do páru zkumavek s roztoky aminokyselin a proteinů přidejte 3-5 kapek odpovídajících činidel paralelně a proveďte zbývající postupy uvedené pro odpovídající reakci.
4. Pokud je nutné zkumavky zahřát, sejměte víko kelímku a zapalte suché palivo zápalkou. Poté upněte zkumavku do držáku, jehož primitivní konstrukce je velmi nespolehlivá. Proto je lepší zabalit pár zkumavek kusem papíru složeného do pruhů a držet je palec, protáhněte spodní poloviny zkumavek rovnoměrně plamenem, vyhýbejte se namíření krky na sousedy a způsobení prudkého varu roztoku. Po dokončení operace okamžitě uhaste plamen víkem kelímku.
5. Výsledky pokusů se vypracují podle šablony o šíření laboratorního notebooku ve formě tabulky:
6. Po zvážení získaných výsledků a po vyplnění protokolu je spolu se stojanem se zkumavkami předložte učiteli k ochraně.
1. Ninhydrinová reakce. Na základě deaminace a dekarboxylace α-aminokyselin alkoholovým roztokem ninhydrinu:
Výsledný amoniak, reagující se dvěma molekulami ninhydrinu, tvoří barevný derivát s absorpčním maximem při 540 nm (pro Pro - 440 nm).
Pokrok: K testovaným vzorkům přidejte 3-5 kapek 0,5% alkoholového roztoku ninhydrinu. Zkumavky se směsmi jemně zahřejte na plameni a po 2-3 minutách zaznamenejte vzhled barvy.
2. Xantoproteinová reakce. Jak již bylo uvedeno výše, je založena na tvorbě nitroderivátů aminokyselin s aromatickými R: Fen, Tyr, Tri.
Pokrok: Zapnutím odsávání digestoře opatrně přidejte několik kapek koncentrované kyseliny dusičné (HNO 3) do páru zkumavek s testovacími roztoky. Jemně zahřívejte zkumavky na plameni, vyhněte se namíření hrdla na sousedy a zaznamenejte vývoj barvy.
3. Nitroprusidová reakce. Je založen na alkalické hydrolýze aminokyseliny cysteinu obsahující síru za uvolnění sulfidu sodného (Na 2 S), který dává červený komplex s čerstvě připraveným roztokem nitroprusidu sodného.
Pokrok: Přidejte stejný objem 20% hydroxidu sodného do obou zkumavek s 5-10 kapkami zkušebních roztoků a vařte alespoň 3-5 minut. Přidejte 3-5 kapek roztoku nitroprusidu sodného do zkumavek a zaznamenejte vývoj barvy.
4. Biuretová reakce. Je založena na tvorbě barevného komplexu peptidové vazby s iontem Cu 2+ v alkalickém prostředí. Slouží jako univerzální test pro identifikaci peptidů a proteinů v roztocích. Protože s rostoucím počtem peptidových vazeb lineárně roste intenzita barvy roztoku, je široce používán pro fotometrické stanovení koncentrací proteinů.
Pokrok. Přidejte stejné množství 10% roztoku hydroxidu sodného do zkumavek s 5-10 kapkami zkušebních roztoků. Dobře promíchejte a přidejte 2 kapky 1% roztoku síranu měďnatého (CuSO 4). Vzorky promíchejte a po několika minutách zaznamenejte vývoj barvy.
5. Test varu. Na základě tepelné denaturace bílkovin.
Pokrok. Obě zkumavky okyselte testovacími roztoky ne více než jednou kapkou 1% roztoku kyseliny octové (AcOH) a zahřejte k varu. Po varu roztoků po dobu 2-3 minut zaznamenejte výsledky a vysvětlete mechanismus jevu.
6. Srážení solemi těžkých kovů(meh) . Jejich denaturační vlastnosti jsou založeny na schopnosti těžkých kationtů Me reagovat s R funkčními skupinami molekuly proteinu: thio-, amino-, karboxy-, aromatické. Také jejich silné anionty způsobují dobíjení iontových skupin v molekulách proteinů, čímž v nich ničí iontové vazby.
Pokrok. Přidejte několik kapek 5% roztoku síranu měďnatého (CuSO 4) do obou zkumavek s testovacími roztoky. Zaznamenejte a vysvětlete získané výsledky.
7. Srážení organickými kyselinami. Založeno na kyselé denaturaci bílkovin a tvorbě kovalentních derivátů thio-, amino- a aromatických skupin R aminokyselin s organochlory.
Pokrok. Přidejte několik kapek 10% roztoku kyseliny trichloroctové (TCA) do zkumavek s testovacími roztoky a po několika minutách zaznamenejte výsledky
