Antonova O.P., Malyugin B.E.
Využití rekombinantního tkáňového aktivátoru plasminogenu v léčbě fibrinózní uveitidy po simultánní keratoplastice a operaci šedého zákalu (klinický případ)
1 Národní centrum lékařského výzkumu "MNTK "Mikrochirurgie oka" pojmenované po. akad. S.N. Fedorov“ Ministerstva zdravotnictví Ruské federaceFibrinózní uveitida je jednou z těžkých komplikací pooperačního období po operaci šedého zákalu a keratoplastice. Dlouhodobá přítomnost fibrinu v přední komoře mění a prohlubuje průběh pooperačního období. Hrozí nebezpečí toxických a mechanických účinků na okolní tkáně, zejména na endoteliální buňky štěpu, a přední synechie vznikající mezi iridolentikulární diafragmou a štěpem mohou způsobit jeho odchlípení (štěpu). Přítomnost fibrinózního výpotku v přední komoře vyžaduje intenzivní lokální a systémovou terapii kortikosteroidy, která naopak oddaluje proces zrakové rehabilitace a dlouhodobá léčba nemusí vést k požadovanému konečnému výsledku. Vznik fibrinózní pupilární membrány zhoršuje funkční výsledek i operace provedené na vysoké technické úrovni a vyvolává nutnost opakovaných zásahů.
Hlavními léky v léčbě fibrinózní uveitidy jsou fibrinolytika a aktivátory plazminogenu: fibrinolysin, streptodekáza, urokináza atd. Všechny tyto léky, kromě urokinázy, jsou však proteiny cizí pro lidský organismus a často způsobují alergické reakce. Kromě toho jsou v dávkách potřebných pro aktivní fibrinolýzu toxické pro vnitřní a v některých případech pro vnější membrány oka.
Jedním z nejnovějších léků ze skupiny trombolytik v oční chirurgii je rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu (rTPA). rTPA je alogenní enzym. Jeho přirozený analog se nachází téměř ve všech tkáních a orgánech lidského těla, včetně všech struktur oka. Proto tento enzym nemá žádné antigenní vlastnosti. Charakteristickým rysem rtPA je jeho vysoká specificita pro fibrin. K aktivaci plazminogenu dochází pouze na povrchu patologického substrátu (krevní sraženina nebo fibrin), zatímco při použití rtPA nedochází k aktivaci systémové fibrinolýzy.
Enzym altepláza, obsahující rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu, má výrazný trombolytický účinek při onemocněních, jako je akutní infarkt myokardu, tromboembolie plicní tepny a mozkových cév. Zahraniční vědci poprvé informovali o výsledcích použití rtPA v oftalmologii v 80. letech. minulé století. Studiu vlivu rtPA na nitrooční fibrinolýzu v experimentech a údajům o jeho jednorázovém použití na klinice existuje řada zahraničních prací. V domácí literatuře se první publikace o tomto problému datují do roku 1995.
Dosud bylo publikováno mnoho prací především zahraničních vědců o použití rtPA v léčbě fibrinózní uveitidy. Řada studií zkoumala účinnost rtPA na různé oční patologické stavy, způsoby jeho podávání, jednorázové a průběžné dávky léku a jeho kompatibilitu s tradičními metodami léčby.
V moderní domácí oftalmologii se rtPA používá extrémně zřídka při léčbě pooperačních komplikací, což se vysvětluje vysokou cenou léku, a proto není každodenní volbou v boji proti fibrinózní uveitidě.
cílová- studovat na našem vlastním klinickém příkladu účinnost a bezpečnost použití rekombinantního tkáňového aktivátoru plazminogenu v léčbě pooperační fibrinózní uveitidy.
materiály a metody
Vyšetřili jsme 1 pacienta, 77 let, s diagnózou Fuchsova endoteliální dystrofie rohovky kombinovaná s kataraktou. Zraková ostrost při přijetí byla 0,05, keratopachymetrie 650 µm v centrálním bodě, hustotu endoteliálních buněk nebylo možné určit. Na základě výše uvedených údajů bylo rozhodnuto o provedení jednostupňové operace: fakoemulzifikace katarakty s implantací zadní komory IOL a zadní automatizované lamelární keratoplastiky. První den pooperačního období je rohovka průhledná, jednotlivé záhyby Descemetovy membrány, přední komora je středně hluboká, tekutina přední komory je průhledná, duhovka je strukturální, IOL je v kapsulárním vaku, v správná poloha, PEC - 1340 buněk/mm 2 . Během prvních čtyř dnů pooperačního období zůstával stav oka stabilní. Terapie v pooperačním období byla standardní a zahrnovala instilace antibiotik, kortikosteroidů, antihypertenziv, keratoprotektorů a subkonjunktivální injekce kortikosteroidů. Pátý den po operaci byl biomikroskopií zviditelněn fibrinózní exsudát v přední komoře, což byla pupilární membrána s předními synechiemi fixovanými k okrajům štěpu (obr. 1), a proto byla upravena výše uvedená terapie: frekvence instilací antibiotika a kortikosteroidy za den, byly přidány instilace mydriatik, NSAID a systémové podávání kortikosteroidů.
Tato terapie byla prováděna po dobu 15 dnů, ale nedošlo k žádné pozitivní dynamice. Otázka opakovaného chirurgického zákroku za účelem aspirace fibrinózního výpotku z přední komory byla zamítnuta pro vysoké riziko odchlípení štěpu. Bylo rozhodnuto použít rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu (Actilyse, Boehringer Ingelheim Pharma, Německo). 16. den pooperačního období byl do přední komory injikován rtPA v množství 25 μg/ml, 0,2 ml. Výpočet prezentované dávky drogy vycházel z výsledků řady prací zahraničních výzkumníků.
Výsledek
Pozitivní dynamika byla zaznamenána během několika následujících hodin: do 3 hodin po podání léku se pupilární membrána zmenšila na polovinu, přední synechie fixované k okrajům štěpu zcela chyběly. Za 8 hodin po podání rtPA byla pozorována téměř úplná resorpce a na předním povrchu IOL zůstalo malé množství fibrinu. Následující den byla dle dat OCT Visante zachována pupilární membrána na přední ploše IOL, jejíž rozměry v sagitální rovině byly 0,21-0,28 mm. Pro posouzení stavu monovrstvy endoteliálních buněk štěpu po zavedení rtPA do přední komory byl proveden počet PEC, který byl 1290 buněk/mm2, zraková ostrost - 0,3. 7. den po podání rtPA byla při biomikroskopii pozorována fibrinózní membrána na přední ploše nitrooční čočky u pupilárního okraje duhovky dle OCT Visante, rozměry reziduálního fibrinu byly následující: v sagitální rovina - 0,09 mm, ve frontální rovině - 0,54 mm. PEC - 1310 buněk/mm2, zraková ostrost zůstala stabilní - 0,3. Po 1 měsíci po podání rtPA došlo k úplnému vymizení fibrinózního procesu v přední komoře, PEC - 1280 buněk/mm 2, zraková ostrost - 0,4. Stojí za zmínku, že po celé pooperační období, které bylo doprovázeno výše uvedenou terapií a zavedením rtPA do přední komory, zůstal štěp průhledný, pevný a zcela přiléhal k zadním vrstvám stromatu příjemce (obr. 2).
závěry
Na základě výše uvedeného klinického případu můžeme usoudit, že proces resorpce fibrinu v přední komoře při jednorázové intrakamerální aplikaci rtPA je mnohonásobně urychlen. Na základě vlastních klinických zkušeností tedy můžeme konstatovat, že použití rekombinantního tkáňového aktivátoru plazminogenu je bezpečnou a účinnou alternativou při eliminaci pooperačních fibrinózních membrán. Absence nežádoucích reakcí a negativních účinků na endotel rohovky, úplné vyřešení fibrinózního procesu pod vlivem rtPA eliminuje potřebu opakovaných chirurgických zákroků, což zase snižuje riziko dislokace štěpu a zajišťuje urychlenou zrakovou rehabilitaci trpěliví. Bohužel vysoké náklady na tento lék ve většině případů znemožňují jeho použití na klinice.
Zdrojová stránka: 9
Plazminogenový aktivátor, urokináza Označení Symboly PLAU Entrez Gene ... Wikipedia
I Fibrinolytické léky (fibrin + řecky lytikos schopné rozpouštění; synonymum trombolytika) léky, které podporují rozpouštění intravaskulárních krevních sraženin a používají se při arteriální a žilní trombóze, stejně jako ... Lékařská encyklopedie
- (z fibrinu a řečtiny lýsis - rozklad, rozpouštění) proces rozpouštění krevních sraženin a krevních sraženin, nedílná součást systému hemostázy, vždy doprovázející proces srážení krve a kultivovaný faktory podílejícími se na tomto ... ... Wikipedie
Účinná látka ›› Alteplase* (Alteplase*) Latinský název Actilyse ATX: ›› B01AD02 Altepláza Farmakologická skupina: Fibrinolytika Nozologická klasifikace (MKN 10) ›› I21 Akutní infarkt myokardu ›› I74 Embolie a arteriální trombóza… … Slovník léků
Idiogram 8. lidského chromozomu 8. lidský chromozom je jedním z 23 lidských chromozomů, který obsahuje asi 145 milionů párů bází, což je od 4,5 % do 5 % celkového genetického materiálu buňky. Na krátkou dobu... Wikipedie
INFARKCE PLIC- Miláček Plicní infarkt (IL) je hemoragická konsolidace plicního parenchymu v důsledku PE. Etiologie a rizikové faktory Hyperkoagulační stavy Polycytémie Srpkovitá anémie Flebitida Hluboká žilní trombóza dolních končetin ... Adresář nemocí
INFARKT MYOKARDU- Miláček Infarkt myokardu (IM) je akutní fokální nekróza srdečního svalu způsobená absolutní nebo relativní nedostatečností koronárního průtoku krve. Ve více než 95 % případů je základem IM ateroskleróza koronárních tepen, komplikovaná... ... Adresář nemocí
AKUTNÍ UZAVŘENÍ TEPENY- Miláček Akutní arteriální okluze je akutní oběhová porucha distálně od místa arteriální okluze embolem nebo trombem. Stav je považován za naléhavý. Proximálně a distálně od místa okluze je narušen normální průtok krve, což vede k... ... Adresář nemocí
Aktivátor plasminogenu tkáňového typu (t-PA) je serinová proteáza. Je vysoce specifický; jeho jediným prokázaným substrátem je plazminogen. Zřejmě je t-PA hlavním fyziologickým aktivátorem fibrinolýzy v lumen cévy. Hlavním místem syntézy t-PA je endotel. Kromě endotelu je t-PA syntetizován v mnoha dalších buňkách: monocytech, megakaryocytech, mezoteliálních buňkách, buňkách vaskulárního svalstva, srdečních fibroblastech atd. Většina plazmatického t-PA je spojena s jeho hlavním inhibitorem PAI-1. Vázaný i volný aktivátor je rychle odstraněn z krevního řečiště jaterními buňkami.
Kromě aktivace fibrinolýzy se t-PA podílí na protizánětlivých reakcích a stimulaci proliferace endotelu. Existují důkazy, že t-PA může aktivovat f.VII.
Funkce t-PA je spojena s přítomností řady receptorů. t-PA receptory se dělí na 2 velké skupiny – aktivační a odstraňovací.
Aktivační t-PA receptory jsou umístěny na buněčných površích a zesilují aktivaci plazminogenu pomocí t-PA. Nejvíce studovaným aktivačním t-PA receptorem je Annexin II. Nadměrná exprese annexinu II u pacientů s promyelocytární leukémií vede k hyperfibrinolýze s hemoragickými projevy.
Systém fibrinolýzy
Ve skupině receptorů, které podporují eliminaci t-PA, manózový receptor a LRP/a2-makroglobulinový receptor. První se nachází
Urokinázový aktivátor plazminogenu (uro-kináza, u-PA) se nachází ve velkém množství v lidské moči. Prekurzorem u-PA je protein prourokináza nebo scu-PA. Prourokináza je syntetizována v různých buňkách. Scu-PA je zvláště aktivně syntetizován epiteliálními buňkami ledvinových kanálků, stejně jako parietálními buňkami téměř všech kanálků, včetně kanálků potních, slzných a dalších žláz. V kanálcích je urokináza nezbytná pro degradaci proteinových složek sekretu. Urokináza vykonává svou hlavní práci ve tkáních, podporuje degradaci extracelulární matrix, což usnadňuje procesy migrace buněk. Role urokinázy je významná v mnoha fyziologických
jeden působí na membránu jaterních endoteliálních buněk a Kupferových buněk, druhý působí na membránu hepatocytů.
a patologické procesy - hojení ran, záněty, embryogeneze, metastázy nádorových buněk.
Kromě aktivace plazminogenu je známa řada dalších funkcí urokinázy. Nejdůležitější z nich jsou aktivace růstových faktorů, modulace buněčné migrace a invaze a zajištění mitogenního účinku na buňky melanomu.
Urokinázový receptor (u-PAR) nalezené na monocytech. Podporuje aktivaci plazminogenu urokinázou, která je nezbytná pro účast monocytů na degradaci fibrinového trombu. Stejný receptor se nachází na krevních destičkách. Byly popsány dva receptory, které eliminují urokinázu a komplex urokináza-serpin z krevního řečiště.
Jiné aktivátory plazminogenu
Kromě hlavních fyziologických aktivátorů plazminogenu uvedených výše byly popsány další fyziologické a nefyziologické aktivátory.
Existují důkazy, že f.XIIa může přímo aktivovat plazminogen. Rychlost aktivace plazminogenu f.XIIa ve srovnání s ekvimolárním množstvím t-PA je 10x nižší, ale jeho
molární koncentrace v cirkulující krvi je 5000krát vyšší. Role přímé aktivace plasminogenu f.XIIa může být tedy poměrně vysoká. Dalšími známými aktivátory plazminogenu jsou streptokináza, stafylokináza a aktivátor plazminogenu izolované ze slin upírů.
Mechanismus aktivace fibrinolýzy
Při fibrinolýze, stejně jako v koagulačním systému, existují 2 cesty: vnější a vnitřní dráha aktivace plazminogenu (obr. 57). Vnější cesta
aktivaci plazminogenu zajišťuje především tkáňový aktivátor, vnitřní cestou je urokináza.
Rýže. 57. Hlavní vazby fibrinolýzy. K tvorbě hlavního enzymu fibrinolýzy, plasminu, dochází pod vlivem faktorů vnitřní nebo vnější dráhy aktivace fibrinolýzy Vnitřní dráha začíná aktivací prourokinázy. Externí dráha je určena vlivem tkáňového aktivátoru plasminogenu (t-PA). Akumulaci volného plasminu v systémové cirkulaci brání skupina proteinů akutní fáze, KK - kalikrein, HMK - vysokomolekulární kininogen, u-PA - urokináza, Cl-Ing - inhibitor 1. složky komplementu, PAI- 1 - inhibitor tkáňového aktivátoru plazminogenu typ 1, PDF - produkty degradace fibrinu
Systém fibrinolýzy
Obsah tématu "Eozinofily. Monocyty. Trombocyty. Hemostáza. Krevní koagulační systém. Antikoagulační systém.":1. Eozinofily. Funkce eozinofilů. Funkce eozinofilních leukocytů. Eozinofilie.
2. Monocyty. Makrofágy. Funkce monocytů - makrofágy. Normální počet monocytů - makrofágů.
3. Regulace granulocytopoézy a monocytopoézy. Faktory stimulující kolonie granulocytů. Keylony.
4. Krevní destičky. Struktura krevních destiček. Funkce krevních destiček. Funkce glykoproteinů. Zóna sol - gel hyaloplazmy.
5. Trombocytopoéza. Regulace trombocytopoézy. Trombopoetin (trombocytopoetin). Megakaryocyty. Trombocytopenie.
6. Hemostáza. Mechanismy srážení krve. Destičková hemostáza. Reakce krevních destiček. Primární hemostáza.
7. Systém srážení krve. Vnější cesta pro aktivaci krevní koagulace. Faktory srážení krve.
8. Vnitřní cesta pro aktivaci krevní koagulace. trombin.
9. Antikoagulační krevní systém. Antikoagulační mechanismy krve. antitrombin. heparin. Proteiny. Prostacyklin. trombomodulin.
10. Aktivátor tkáňového plazminogenu. Ektoenzymy. Role endotelu v antikoagulačním systému. Tkáňový faktor. Inhibitor aktivátoru plazminogenu. von Willebrandův faktor. Antikoagulancia.
Aktivátor tkáňového plazminogenu. Ektoenzymy. Role endotelu v antikoagulačním systému. Tkáňový faktor. Inhibitor aktivátoru plazminogenu. von Willebrandův faktor. Antikoagulancia.
Aktivátor tkáňového plazminogenu je protein reprodukovaný a neustále vylučovaný vaskulárním endotelem. Poskytuje přímou lokální trombolytickou aktivitu proti vytvořenému trombu. V krvi je udržována stálá hladina tohoto faktoru, což zajišťuje systémovou trombolytickou aktivitu krve.
Ektoenzymy- Jedná se o endotelem produkovanou ADPázu, ATPázu a enzym konvertující adenosin. Endoteliální ADPáza rychle rozkládá proagregant ADP, vylučovaný aktivovanými krevními destičkami.
Cévní endoteliální buňky syntetizovat a protrombotické faktory: tkáňový faktor, inhibitory aktivátoru plazminogenu, von Willebrandův faktor.
Rýže. 7.11. Úloha endotelu krevních cév při srážení krve. Pod nápisem „Antikoagulancia“ jsou endoteliální faktory, které mají antikoagulační účinek v důsledku inhibice agregace krevních destiček, tvorby fibrinové sraženiny a aktivace fibrinolýzy. Pod názvem „Prokoagulancia“ jsou označeny endoteliální faktory podílející se na tvorbě trombu krevních destiček, fibrinové sraženiny a potlačení fibrinolýzy (Tkáňový faktor je komplexní protein buněčné membrány o hmotnosti 46 kDa. Když je buňka poškozena, část její molekuly se pevně naváže na koagulační faktor Vila, čímž podporuje její funkci jako urychlovače ve vnější koagulační dráze.
Inhibitor aktivátoru plazminogenu-I je 52 kDa protein nalezený v cirkulující krvi. Těsnou vazbou na aktivátor plazminogenu jej inaktivuje, čímž se podílí na regulaci fibrinolýzy v těle.
von Willebrandův faktor je multidimenzionální molekula o hmotnosti 1-20 milionů Da, syntetizovaná endotelem a uložená v endoteliálních sekrečních granulích. Uvolňuje se z nich, funguje jako adhezivní molekula pro krevní destičky a podporuje jejich agregaci. Zvýšené uvolňování von Willebrandova faktoru z endotelu je indukováno trombinem.
Srážení krve v cévě Hladký povrch endotelu také zabraňuje, zabraňuje zahrnutí vnitřní dráhy pro tvorbu aktivní protrombinázy. Monomolekulární proteinová vrstva adsorbovaná na povrchu endotelu odpuzuje srážecí faktory a krevní destičky a také zabraňuje srážení krve.
Antikoagulancia používané v klinické praxi. Například ke snížení zvýšené srážlivosti krve u pacientů s ischemickou chorobou srdeční, k udržení krve v tekutém stavu při použití kardiopulmonálního bypassu, což způsobuje trauma krevních buněk, v důsledku čehož se aktivuje vnitřní cesta koagulace krve.
Vynález se týká nového zlepšeného tkáňově aktivního plasminogenu (vylepšený TPA), s prodlouženým poločasem rozpadu v těle a zvýšenou stabilitou vůči teplu a kyselinám, který může být použit k potlačení zánětu v oblasti trombózy. Vynález se také týká způsobu výroby uvedeného tkáňového aktivátoru plasminogenu za použití technologie rekombinantní DNA a prostředků použitých pro jeho implementaci. Je známo, že lidský tkáňový aktivátor plazminogenu (TPA) má příznivou fibrinolytickou aktivitu a je extrémně účinný proti plazminogenu vázanému na fibrin, zatímco neaktivuje plazminogen ve fázi volného oběhu v těle tak účinně jako konvenční trombolytická činidla, streptokináza (SK ) a urokináza (UK). Aminokyselinová sekvence lidského APT a nukleotidová sekvence cDNA kódující lidský APT jsou známé (Pennica. D. a kol., Nature, 301, 214-221, 1983). Je také známo, že lidský APT rozpouští žilní a arteriální krevní sraženiny. Velké klinické studie ukazují, že lidský APT podávaný intravenózně je účinný při reperfuzi ucpané koronární arterie u pacienta s akutním infarktem myokardu. Nevýhodou použití tohoto léku při léčbě onemocnění spojeného s tvorbou trombu je však extrémně krátký poločas jeho enzymatické aktivity v krvi (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, E. F. a kol., Blood, 65, 539, 1985). Při použití k léčbě musí být lidský APT podáván jako kontinuální vysokodávková intravenózní injekce. Je známo, že přirozeně se vyskytující lidský APT má doménovou strukturu, počínaje N-koncem molekuly je fingerdoména, doména EGF (epidermální růstový faktor), dvě domény „kringle 1“ a „kringle 2“ a serin proteázový domer. V práci Rijkena a kol. je uvedeno (Rijken D.C. a kol., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), že krátký biologický poločas lidského APT může souviset se všemi doménami. lidského APT, kromě serinových doménových proteáz. Práce Zonnevelda a kol. (Zonneveld, A.J.V., et al, Proč. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) také poznamenává, že doména prstu, doména EGF a doména kringle 2 mohou být důležité pro aktivitu vázající fibrin u přirozeně se vyskytujících lidí. APT, a také k udržení aktivace APT závislé na fibrinu. Dosud však nebyla vyvinuta žádná specifická opatření k udržení fibrin-vazebné aktivity přirozeně se vyskytujícího lidského APT a jeho fibrin-dependentní aktivity, stejně jako k prodloužení biologického poločasu. Publikovaná japonská patentová přihláška č. 48378/1987 popisuje APT získaný delecí aminokyselin 87-175 přirozeně se vyskytujícího lidského APT, ve kterém je deletován "kringle 1". Tento APT se vyznačuje další indukovanou bodovou mutací v oblasti epidermálního růstového faktoru. Japonská patentová přihláška uvádí, že modifikovaný APT má schopnost vázat se na fibrin, ale interakce s inhibitorem tkáňového aktivátoru plasminogenu je oslabena. Evropský patent č. 241208 popisuje APT získaný delecí aminokyselin 92-179 přirozeně se vyskytujícího lidského APT, ve kterém je také deletován "kringle 1". Tato práce uvádí, že tento APT má fibrinolytickou aktivitu. Kromě toho evropský patent č. 231624 popisuje modifikovaný APT s prodlouženým poločasem rozpadu. Modifikovaný APT, který má sekvenci F-EGFK2-A, postrádá doménu kringle 1, ale není uveden žádný specifický způsob jeho přípravy. Ve světle výše uvedeného je jasné, že modifikovaný APT podle vynálezu se musí lišit od přirozeně se vyskytujícího APT v aminokyselinové sekvenci v oblasti vnitřních domén. V důsledku rozsáhlého výzkumu získal žadatel vylepšený APT, který obsahuje doménu prstu, doménu EFR, doménu kringle 2 a doménu serinové proteázy, ale první doména „kringle 1“ je odstraněna na konkrétním místě, a v místě vazby domény byla zavedena kringle 2 a mutace serinové proteázy, což má za následek zlepšený APT, který vykazuje vynikající odolnost vůči teplu a kyselinám, výrazně prodloužený biologický poločas a významnou protizánětlivou aktivitu, přičemž si zachovává požadované vlastnosti přirozeně se vyskytující lidský APT. Vynález se týká zlepšeného APT. APT podle vynálezu se výrazně liší svou chemickou strukturou od přirozeně se vyskytujícího lidského APT a vykazuje vynikající vlastnosti. Zlepšený APT podle vynálezu je polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci reprezentovanou obecným vzorcem ukázaným na OBR. 28-29, kde R je přímá vazba, Y je A-Ile-B (A je Arg nebo Glu a B je lys nebo Ile), výhodně Glu-Jle-Lys. H2N označuje amino-konec a -COOH označuje karboxy-konec). Ve vynálezu se termín "vylepšený APT" používá k označení analogu APT, ve kterém A a B představují aminokyseliny popsané níže, v tomto pořadí:
Vylepšený APT (II): Arg, Lys;
Advanced APT (V): Arg, Ile;
Advanced APT (VI): Glu, Lys;
Vylepšený APT (VIII): Glu, Ile. Vynález je také zaměřen na expresi navrhovaného analogu APT pomocí technik rekombinantní DNA. S tím jsou spojeny nové DNA kódující zlepšené expresní vektory APT a rekombinantní DNA. Obrázky 1, 2 ukazují sekvenci 16 oligodeoxynukleotidů použitých ke konstrukci fragmentu syntetického genu kódujícího zlepšený APT (II); na obr. 3 - 4 - fragment syntetického genu pro konstrukci vylepšeného APT (II) podle vynálezu, obsahující konce restrikčních enzymů Bge 11 a Eco R1, který je zkonstruován pomocí 16 oligodeoxynukleotidů znázorněných na obr. 1 - 2 ; Obr. 5 - způsob konstrukce vylepšeného APT (II) (na obrázku černá plocha, stínovaná plocha a nešrafovaná plocha označují oblast kódující zralý protein APT, oblast kódující propropeptid a nepřekládanou oblast; Obr. 6 - metoda testování fragmentu syntetického genového bloku IV stanovením sekvence bází DNA pomocí dideoxy metody a metody 7-DEAZA na obr. 7 - metoda konstrukce expresního vektoru pVY1 v živočišných buňkách; integrace DNA vylepšeného APT do pVY1 na Obr. 8 - 13 DNA sekvencí kódujících vylepšený APT (II) a vylepšených APT (V Obr. 14 - 19 - aminokyselinové sekvence odvozené ze sekvencí DNA kódujících vylepšený APT (II); 20 - restrikční enzymy a funkční mapa plazmidu pTPA 2 s fragmentem Eco R1-Xho (asi 1000 párů bází) přirozeného genu APT, integrovaným do vektoru pBR322 na Eco Rl a Bam); místa štěpení H1; Obrázek 21 - mp9 (vylepšený APT (II), mající fragment BgL11-Xho 11 (asi 1500 párů bází) genu, vylepšený APT (II) integrovaný do dvouvláknové DNA M13 mp9 v místě štěpení BamH1; Obr. 22 - závislost "dávka-účinek" pro APT aktivitu vylepšeného APT (VI) a přirozeně se vyskytujícího APT pomocí metody S-2251 v přítomnosti (+Fb) a nepřítomnosti (-Fb) fibrinového substituentu Obr. 23 - změna aktivity vylepšeného APT (VI) a nativního APT v krvi králíka v průběhu času Obr. 24 - změna zbytkové aktivity vylepšeného APT (VI) po tepelném ošetření Obr. 25 - inhibice; lymfocyty aktivující faktor (LAF) zlepšeným APT (VI); Obr. 26 - aktivace pomocí denaturovaného proteinu, zlepšený APT (VI); 27 - degradace denaturovaného proteinu pod vlivem zlepšeného APT (VI). Způsob získání rekombinantní DNA a transformovaných buněk je podrobně popsán níže. Způsob získání zlepšeného APT. Gen kódující přirozený APT, ze kterého je APT podle předkládaného vynálezu odvozen, je izolován z banky cDNA připravené z buněk Bowesova lidského melanomu. Poly A+ RNA byla izolována z lidských buněk Bowesova melanomu a frakcionována centrifugací s gradientem hustoty sacharózy. Potom se vybere malé množství frakcionované poly(A) + RNA a mRNA frakce kódující gen APT se identifikuje tečkovou hybridizací za použití oligonukleotidové sondy schopné rozpoznat specifickou sekvenci mRNA APT. Za použití této frakce bohaté na mRNA APT jako výchozího materiálu se připraví banka cDNA a provede se screening pomocí identifikační sondy APT mRNA popsané výše. Protože nebyl izolován jediný klon, který by měl úplnou sekvenci genu APT, chybějící sekvence bází se syntetizuje pomocí syntetizéru DNA, aby se získal požadovaný gen. Požadovaný gen je pak konstruován indukcí místně specifické mutace. Fragment Eco R1-Xho 11 se přirozeně vyskytuje v genu APT (asi 1000 párů bází), jehož část je deletována na N= konci, zavedena do vektoru pBR332 v místech štěpení Eco R1 a BamH1, což vede k pTPA2. Kmen (E. coli HB 101/pTPA2) získaný transformací E. coli tímto plazmidem byl uložen ve Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology Agency of Japan pod registračním číslem P-9649 (FERM BP-2107). Restrikční a funkční mapa plazmidu pTPA2 je ukázána na Obr. Vylepšený gen APT je vložen do plazmidu pVY1. Plazmid pVY1 byl připraven ligací fragmentu BamH1-Kpn1 (asi 2900 párů bází) plazmidu pRSV10 (vyrobeno Fine Chemicals) s fragmentem z Eco R1 štěpení plazmidu pAdD26SV (A) N 3 (N) (získaného od Dr. Hiroshi Handa z University of Tokyo (po obdržení na obou tupých koncích. V souladu s tím tento vektor obsahuje cDNA myšího genu dihydrofolát reduktázy pod transkripční kontrolou adenovirového hlavního pozdního promotoru (Ad2), časného promotoru SV 40 proti směru transkripce od místa inzerce vylepšený gen APT a intron a polyadenylační sekvence umístěné po směru genu podle vynálezu mohou být vloženy do jiného vhodného expresního vektoru. Expresní vektor je dále zaveden do vhodné hostitelské buňky, aby se získaly transformanty. Jako hostitelské buňky mohou být použity prokaryotické buňky, jako je E. coli, Bacillus subtilis atd., eukaryotické mikroorganismy, jako jsou kvasinky atd., a buňky vyšších živočichů. Jako zástupce E. coli se obvykle používá kmen JM109, kmen W3110, Q atd. patřící do kmene K12 a kmen BD170, kmen BR151 atd. se používají jako zástupci Bacillus subtilis. Z kvasnic lze použít kmen RH218, kmen SHY1 atd. kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Pro expresi se typicky používá plazmidový vektor nebo fágový vektor obsahující replikon odvozený od druhu kompatibilního s hostitelskými buňkami a regulační sekvenci. Příklady vektoru pro E. coli jsou například plazmidy pBR322, pUC18, pUC19 atd., fág, například qt, Charon 4A atd., fág M13 atd. pUB110 může být použit jako vektor pro Bacillus subtilis , pSA2100, atd., a YRp7, YEp61 atd. mohou být použity jako vektor pro kvasinky. Vektor musí nést promotor schopný exprimovat požadovaný protein. Jako promotor pro gen E. coli nebo fágový gen lze použít například Lae, trp, tac, trc, pL atd. Jako hostitel mohou být kultivované živočišné buňky, jako jsou ledvinové buňky makaka rhesus, buňky larev komára, ledvinové buňky afrického zeleného opice, myší fetální fibroblast, buňky vaječníků čínského křečka, buňky lidské fetální ledviny, buňky tkáně motýlího vajíčka, buňky podobné lidskému cervikálnímu epitelu. buňky, lidské myelomové buňky, myší fibroblasty a tak dále. Jako vektor můžete použít časný promotor SV40, pozdní promotor SV40, SV40 nesoucí promotor z eukaryotického genu (například gen pro ptačí ovalbumin indukovatelný estrogenem, gen pro interferon, gen tyrosinaminotransferázy indukovatelné glukokortikoidy, gen thymidinkinázy, časný gen a pozdní adenovirové geny, gen fosfoglycerát kinázy, gen faktoru atd.), bovinní papilloma virus nebo vektory z nich odvozené. Kromě toho je známo, že APT secernované a produkované buňkami mají různé N-konce v závislosti na rozdílech v místech štěpení. V případě sekrece a produkce APT za použití kultivačních buněk jako hostitele se způsob štěpení signální peptidázou nebo proteázou liší v závislosti na typu buňky, takže lze získat druhy APT s různými N-koncemi. Tento jev není vhodný pouze pro případ sekrece a produkce pomocí kultivačních buněk, protože se předpokládá, že podobný jev může nastat také při získávání APT prostřednictvím E. coli, Bacillus sublitis, kvasinek a dalších buněk podrobených speciální modifikaci. Pro transformaci hostitele pomocí expresního vektoru s integrovaným vylepšeným genem APT lze v případě E. coli použít metodu Hanahana, Hanahana, D.J.Mol. Biol., 166, 557, 1983), v případě manipulace s živočišnými buňkami lze použít metodu fosforečnanu vápenatého (Vander Eb, A. J. a Graham, F. L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) a již brzy. Jak je popsáno výše, vylepšený APT je užitečný pro léčbu různých získaných onemocnění, včetně vaskulární koagulace (dokonce i hlubokých žil), plicní embolie, periferní arteriální trombózy, srdeční nebo periferní arteriální embolie, akutního infarktu myokardu a trombotického záchvatu. Stejně jako přirozeně se vyskytující lidský APT je vylepšený APT zvláště vhodný pro léčbu akutního infarktu myokardu. Přirozeně se vyskytující lidský APT se nedávno ukázal jako účinný při rozpouštění trombu uzavírajícího koronární arterii, regeneraci myokardiální perfuze a obnově většiny částí v ischemické vrstvě myokardu, když je podáván intravenózně v dávce 30 až 70 mg po dobu 1 až 3 hodin. Zlepšený APT má prodloužený biologický poločas v krvi a je proto účinný ve stejných případech jako přirozeně se vyskytující lidský APT. Očekává se, že zlepšený APT může vyvolat klinický účinek podobný přirozeně se vyskytujícímu lidskému APT v dávce přibližně 10 % dávky doporučené pro přirozeně se vyskytující lidský APT, i když je podáván jako jediná dávka. Kromě toho vylepšený APT podle předkládaného vynálezu vykazuje následující cenné vlastnosti, které byly dosud neznámé pro nativní lidský APT a modifikovaný APT. a) Protizánětlivá aktivita. V místě trombu se zjišťuje nejen vznik samotného trombu, ale i tvorba produktů degradace fibrinu nebo stopového množství kininu. O těchto látkách je známo, že mají aktivitu vyvolávající zánět, a tak způsobují zánět v oblasti trombu. Z tohoto důvodu je žádoucí, aby činidlo používané k léčbě trombózy mělo nejen trombolytickou aktivitu, ale také protizánětlivou aktivitu. Jako výsledek výzkumu byl žadatel schopen udělit protizánětlivou aktivitu vylepšenému APT na základě dvou funkcí. Jedním z nich je, že vylepšený APT inhibuje biologickou aktivitu interleukinu 1 (IL-1), který je jedním z mediátorů zánětlivé reakce. Předpokládá se, že IL-1 produkovaný makrofágem se účastní zánětlivé reakce prostřednictvím hypertermie, zrychlením růstu fibroblastů, produkcí kolagenázy v synoviální buněčné membráně a tak dále nebo urychlením syntézy prostacyklinu ve vaskulárních endoteliálních buňkách. Je také známo, že IL-1 působí na jaterní buňky k urychlení produkce proteinů (sérový amyloidní protein, fibrinogen atd.) v akutní fázi, která se zvyšuje se zánětem. Přihlašovatel zjistil, že zlepšený APT inhibuje aktivitu (LAF aktivitu) pro zvýšení mitogenní reaktivity myšího thymocytu, což je jedna z biologických aktivit IL-1. Další funkcí je, že pokročilý APT má afinitu k denaturovanému proteinu (denaturovaný imunoglobulin G, denaturovaný albumin atd.), který je výsledkem zánětu v místě trombu, a dále má tu vlastnost, že je tímto denaturovaným proteinem aktivován. Díky této aktivitě vylepšený APT degraduje pouze denaturovaný protein v oblasti zánětu a zánět lze dočasně zmírnit. Žadatel potvrdil gelovou elektroforézou s dodecylsulfátem sodným, že zlepšený APT degraduje pouze denaturovaný protein. Jak je znázorněno na OBR. 26, aktivace a selektivita vylepšeného APT denaturovaným proteinem je evidentní. S imunoglobulinem G ošetřeným HC1 a při několikanásobně nižších koncentracích byla prokázána stejná aktivita jako u fibrinogenu ošetřeného BrCN. Na druhé straně normální imunoglobulin C nevykazuje aktivační účinek na vylepšený APT ani při koncentraci 500 μg/ml. Prevence opětovného uzavření po obnovení perfuze do uzavřené krevní cévy. Je známo, že při léčbě trombózy přirozeným APT je po obnovení průtoku krve do zablokované krevní cévy pozorována s vysokou frekvencí reokluze. Z tohoto důvodu se kombinovaná terapie provádí s inhibitorem koagulace krevních destiček nebo antikoagulantem. Kombinovaná terapie však zahrnuje problémy s lékovými interakcemi, kontrolou dávkování, podobnými účinky a tak dále. S výhodou má samotný APT navíc aktivitu zabraňující opětovné okluzi. Zlepšený APT podle předkládaného vynálezu má schopnost zabránit reoklusním příhodám prostřednictvím dvou typů aktivity. Prvním typem je prevence rychlého poklesu koncentrace APT po zavedení vylepšeného APT v důsledku prodloužené doby účinku, což vede k eliminaci Stewart-Holmesova příznaku a tím k zamezení vzniku reokluze. Druhým typem je, že prevencí IL-1-indukovaného poškození vaskulárních endoteliálních buněk je nepřímo inhibována koagulace krevních destiček, čímž se zabrání reoklusním jevům. c) Zvýšená stabilita. Proteinové přípravky jsou většinou nestabilní, proto je vhodné přípravky skladovat ve zmrazeném suchém stavu nebo při nízkých teplotách ve formě roztoku. Při podávání aktivátoru plazminogenu pacientovi s akutním infarktem myokardu je potřeba provést zákrok do několika hodin po začátku záchvatu, aby se snížila úmrtnost. V tomto případě jsou žádoucí stabilní přípravky, které lze skladovat při pokojové teplotě. Navíc zvýšená stabilita umožňuje tepelné zpracování, ošetření kyselinou atd. při přípravě léků. Zejména s ohledem na vylepšený APT podle předkládaného vynálezu, který je produkován buněčnými kulturami, je možné odstranit retrovirus pocházející z buňky, o kterém je známo, že je citlivý na teplo. Vynález je dále popsán konkrétněji s odkazem na příklady, ale není na ně omezen. Pokud není uvedeno jinak, rekombinantní DNA se vyrábí podle laboratorních pokynů. Maniatis T a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). Příklad 1. Klonování do APT DNA. Buňky Bowesova lidského melanomu (zakoupené od Dr. Roblina, R., National Cancer Research Institute, USA) byly kultivovány podle metody Opdenakker et al. (Opdenakker, G., a kol., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Pro indukci APT mRNA byl ke kultivační směsi přidán TPA (12-0-tetradekanoylforbol-13-acetát) v konečné koncentraci 100 ng/ml, následovala kultivace po dobu 16 hodin. Celková buněčná RNA byla poté extrahována z kultivovaných buněk podle modifikované metody Freemana et al. ((Okayama)Berqa DNA Manual, str. 3, 1985, Pharmacy Fine Chemicals). Pomocí kolony s oligo-dT celulózou (vyrobené Pharmacia Fine Chemicals) se poly(A) + RNA oddělí od celkové buněčné RNA. Výsledkem je, že z přibližně 10 o buněk se získá asi 400 μg poly(A) + RNA. Tato poly(A) + RNA se frakcionuje konvenčním způsobem centrifugací v gradientu hustoty sacharózy. Vybere se část frakcionované poly(A) + RNA a provede se dot blot hybridizace (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc) s použitím oligonukleotidové sondy specifické pro APT mRNA. . Zde použitá sonda (sonda Y) má sekvenci bází 5"-GCNNGGCAAAGATGGCA-3", která je komplementární k oblasti mRNA kódující aminokyselinové zbytky +291 až +297 v sekvenci APT popsané Pennicaetalem a je syntetizována -kyanofosfamidátová metoda za použití syntetizátoru DNA, model 380A, (vyrábí Applied Biosystems). Syntéza DNA oligomeru, deprotekce, štěpení pryskyřice a purifikace se provádějí v souladu s návodem k použití syntetizéru DNA, Model 380A. Radioaktivní značení Y sondy na 5" konci se provádí v souladu s laboratorním manuálem pomocí T4 polynukleotidkinázy (vyrábí Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) a -(32P) ATP. Y sonda silně hybridizuje, převážně s 20-30S poly(A) + RNA (tato frakce se nazývá M frakce Z M frakce se syntetizuje 10 μg poly(A) + RNA; za použití reverzní transkriptázy (vyrábí Biochemical Industry Co., Ltd.) v souladu s Gubler-Hoffmanovou metodou (Gubler, U. a Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983) a přidané k dvouvláknové cDNA v 3" konce deoxy C-řetězce v souladu s Denq-Wu metodou (Denq, G. R. a Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). Dvouřetězcová cDNA rozšířená o deoxy C řetězec se pak podrobí gelové filtraci na Sepharose CL 4B (vyrobeno Fine Chemicals), aby se odstranily nukleové kyseliny s nízkou molekulovou hmotností, které mají méně než 500 párů bází. cDNA byla poté hybridizována s pBR322 (vyrábí Bethesda Research) obsahujícím deoxy G řetězec v místě Pst 1 za použití běžných technik. Směs získaná po žíhání byla transformována do kompetentních buněk HB101 E. coli (vyráběné společností Takara Shuzo Co. , Ltd). Výsledkem je banka cDNA sestávající z přibližně 4000 nezávislých transformantů. Tato cDNA se podrobí hybridizaci kolonií za použití sondy Y popsané výše podle metody Woodse (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, Bethesda Research Lab.), čímž se získají klony, které reagují se sondou Y. Mezi klony je identifikován klon pTPA1 obsahující nejdelší cDNA APT. Potom se provede dideoxy metoda (Carlson, J., a kol., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), za použití fágového vektoru M13 a metody 7-DEAZA (Mizusawa S., a kol., Nucleis Acids Res., 14, 1319, 1986). V důsledku toho bylo zjištěno, že plazmid pTPA1 obsahuje sekvenci bází od Ty+441 do Ay+2544 pro gen APT popsaný Pennicaetalem. Příklad 2. Návrh vylepšeného APT (II). V plazmidu pTPA1 ukázaném v příkladu 1 je N-terminální oblast nedostatečná pro konstrukci vylepšeného APT (II), který postrádá doménu smyčky 1. Deficitní segment DNA se tedy syntetizuje, jak je popsáno výše, za použití syntetizátoru DNA 380A (vyrobeného společností Applied Biosystems). Sekvence bází syntetizovaného oligomeru a kompletní syntetizovaná sekvence jsou ukázány na OBR. 1-4. Specifické techniky pro konstrukci zlepšeného APT (II) s použitím těchto oligomerů jsou ukázány na OBR. 5-6. 2-1). Konstrukce bloku IV (fragment Bql II-Eco R1, asi 480 párů bází). Fragment bloku IV na Obr. 5 se získá následovně. Nejprve, podle laboratorní příručky, 40 pmol každého ze syntetických oligonukleotidů 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 a 15 znázorněných na Obr. 1-2 byly fosforylovány 10 jednotkami T4 polynukleotidkinázy (vyráběné společností Takara Shuzo Co., Ltd.) při 37 °C po dobu jedné hodiny v 50 ul reakčního roztoku pro každou z nich. Na reakční roztok se působí fenolem. Po vysrážení ethanolem se sraženina suší za sníženého tlaku a rozpustí se ve sterilní destilované vodě. Po usazení 40 pmol každého oligomeru ve 150 μl roztoku obsahujícího 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2 a 0,1 mM EDTA při teplotě 80 °C po dobu 5 minut při teplotě 60 o C po dobu 5 minut a při pokojové teplotě po dobu jedné hodiny, v odpovídajících blocích bloku I (oligomery 1, 2, 3 a 4), bloku II (oligomery 5, 6, 7, 8, 9 a 10) a bloku III (oligomery 11, 12, 13, 14, 15 a 16) provádějí srážení ethanolem a sušení za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve 40 ul sterilní destilované vody. Reakce byla prováděna ve 400 ul reakčního roztoku při 4 °C po dobu 15 hodin za použití DNA ligační soupravy (vyrobené firmou Takara Shuzo Co., Ltd.). Po vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženina rozpustí ve sterilní destilované vodě: v případě bloku I (1) se gelová elektroforéza provádí v 5% polyakrylamidu (laboratorní příručka), separuje a čistí se tradičním způsobem (laboratorní příručka), fragment asi 100 párů bází a v případě bloku II (2) a bloku III (3) se gelová elektroforéza provádí v 3% agarózovém gelu (LMP agaróza, výrobce BRL) (laboratorní příručka ) a fragmenty asi 190 párů jsou izolovány a purifikovány elektroelucí (laboratorní příručka). Poté bylo 0,1 ug, 0,2 ug a 0,2 ug fragmentů bloku I, bloku II a bloku III ligováno pomocí výše uvedené DNA ligační soupravy. Gelová elektroforéza se provádí při koncentraci agarózy 1,5 %, aby se izoloval fragment Bgl II-Eco Rl (blok IV) o velikosti přibližně 480 párů bází. DNA je poté izolována z agarózového gelu pomocí elektroeluce. Tato DNA se potom fosforyluje ve 100 ul reakčního roztoku při 37 °C po dobu jedné hodiny za použití 10 jednotek výše uvedené T4 polynukleotidkinázy, potom se zpracuje s fenolem, vysráží se ethanolem a suší se za sníženého tlaku. Tento syntetický genový fragment a sekvence bází bloku IV jsou potvrzeny stanovením sekvence bází dideoxy metodou za použití fágového vektoru M13. Specifické techniky jsou znázorněny na Obr. 6. Po ligaci výše popsaného fragmentu Bgl II-Eco Rl bloku IV s M13 mp18 DNA (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) štěpenou restrikčními enzymy BamH1 (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd. .) a Eco R1 (výrobce Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) je jeho základní sekvence určena pomocí sekvenační sady M13 (vyrábí Taraka Shuzo K., Ltd.) a sekvenační sady 7-DEAZA (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.). Místo štěpení restrikčního enzymu Bgl1 a místo štěpení restrikčního enzymu BamH1 jsou ligovány v isoschimerickém uspořádání prostřednictvím (BamH1 - Bgl1 štěpící konec-místo štěpení) a ligovaný fragment může být štěpen restrikčním enzymem Xho 11, což vede k přirozenému Bgl 11, respektive Bamh1 štěpné konce. Pro přesnější určení sekvence bází je kmen E.cjli JM109 infikován fágem M 13mp18 (včetně fragmentu bloku IV) v souladu s metodou Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983). )), načež se získá dvouvláknová DNA (replikativní typ). Po štěpení této DNA (50 μg) restrikčními enzymy Xho 11 (výrobce Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) a Eco R1 byla provedena gelová elektroforéza na 1,5% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment (blok IV) o velikosti asi 480 bází. páry. Tato DNA je extrahována elektroelucí. Po ligaci extrahované DNA s M13mp19 DNA (vyrobeno společností Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd) štěpenou restrikčními enzymy Eco Rl a BamHl stejným způsobem, jak je popsáno výše, byla určena sekvence bází pomocí DNA ligační soupravy. Jak je popsáno výše, tuto sekvenci lze přesněji ověřit sekvenováním obou DNA pomocí M13mP18 a M13mp19. Kromě toho byla popsaným způsobem připravena dvouvláknová replikativní DNA M13mp19 (s blokem IV). Po štěpení této DNA (50 ug) restrikčními enzymy Eco R1 a Xho 11 se provede gelová elektroforéza v 1,5% agarose, přičemž se izoluje fragment (blok IV) o velikosti asi 480 párů bází. 2-2). Izolace bloku V (fragment Eco R1-Bal1, asi 1250 párů bází). Z klonu pTRA1 získaného v příkladu 1 byla plazmidová DNA izolována ve velkých množstvích podle metody popsané v laboratorní příručce, jak je ukázáno na OBR. 5. Po štěpení 70 μg této DNA restrikčními enzymy Bal1 (výrobce Takara Shuzo Co., Ltd.) a Nar1 (výrobce Nirro Gen Co., Ltd.) se provede elektroforéza v 0,8% agarózovém gelu, izolaci fragmentu Nar1-Bal1 (asi 1540 párů bází). DNA se izoluje elektroelucí. Po dalším částečném štěpení této DNA restrikčním enzymem EcoRl se provede elektroforéza na 0,7% agarózovém gelu, přičemž se izoluje fragment EcoRl-Bal1 (asi 1250 párů bází). DNA se izoluje elektroelucí. 2-3). Konstrukce vylepšeného genu APT (II) z bloku IV a bloku V. Jak je ukázáno na Obr. 5, zlepšený gen APT se získá následovně. Po dopingu bloku IV (fragment Bgl11-Eco R1, asi 480 bp) získaného v příkladu 2-1 blokem V (fragment Eco R1-Bal1, asi 1250 bp) získaným v příkladu 2-2 za použití soupravy pro doping DNA popsané výše, dopovaný produkt se podrobí srážení ethanolem. Po vysušení za sníženého tlaku se sraženina obvyklým způsobem štěpí restrikčním enzymem Xho 11. Poté se provede elektroforéza v 0,8% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment Bgl 11-Xho 11 (asi 1500 párů bází, obsahuje gen pro zlepšený APT). DNA je poté izolována elektroelucí. Kompletní sekvence bází vylepšeného genu APT (II) získaná tímto způsobem je znázorněna na Obr. 8-13. Odvozená aminokyselinová sekvence je také ukázána na OBR. 14-19. Příklad 3. Konstrukce genu pro zlepšené APT V, VI a VIII. Konstrukce vylepšeného genu APT V, VI nebo VIII se provádí na základě vylepšeného genu APT (II) s odkazem na následující publikace. Genetická konverze se provádí indukcí místně specifické mutace. Publikace: Zoller M. J. a Smith M., Method in Fermentology, 100, str. 468-500 (1983), Zoller M. J. a Smith. M. DNA, 3, str. 479-488 (1984), Morinaga Y. a kol. Biotechnology, str. 636-630 (červenec 1984), Adelman J. P. a kol., DNA, 2, str. 183-193 (1983). ), 6. M13 Sequencing Manual (puC) publikovaný Gene Science Room Co., Ltd.). 3-1). Konstrukce vylepšeného genu APT (V). A) Vytvoření M13mp19 (APT/P/) pro mutaci. Vylepšený fragment genu APT (II), podrobně popsaný v příkladu 2, 2-3, byl ligován do dvouřetězcové DNA M13mp9 ošetřené restrikčním enzymem BamH1 a alkalickou fosfatázou (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační produkt byl transfekován do kompetentních buněk E. cjli JM109 (vyrobeno společností Takara Shuzo Co., Ltd.). Každý klon, který vytvoří bezbarvou sterilní skvrnu, se použije k infekci E. coli JM109. Jednořetězcová DNA se izoluje ze supernatantu kultury a dvouřetězcová (replikativní) DNA se izoluje z buněk E. cli podle Messingovy metody (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, str. 20-78, 1983). ). Analýzou povahy těchto dvouvláknových DNA se po štěpení restrikčním enzymem Pst1 elektroforézou na agarózovém gelu získá klon mp9 (vylepšený APT(II)), ve kterém je gen APT(II) vložen do mp9 DNA v požadovaný směr, jak je znázorněno na obr. 21. Po štěpení části těchto DNA restrikčním enzymem Pst se provádí elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu, kde klon mp9 (vylepšený APT (II) vykazuje jednoduchý pás v pozicích 7300 bp, 840 bp, 430 bp a 80 bp, přibližně jednovláknová DNA z tohoto klonu se použije v následném experimentu k indukci místně specifické mutace. B) Syntéza primeru schopného vyvolat místně specifickou mutaci. Syntetický oligonukleotid použitý k indukci místně specifické mutace ve vylepšeném genu APT (II) se syntetizuje a-kyanoethylfosfoamidátovou metodou za použití syntetizéru DNA Model 380 A (vyrábí Applied Biosystems). Syntéza oligomeru DNA, odstranění ochranné skupiny, odštěpení z pryskyřice a čištění se provádějí v souladu s provozními pokyny pro syntetizér DNA 380 A. Pro vyvolání mutace na konkrétním místě se použije primer (1) schopný indukující místně specifickou mutaci a primer (2) pro dideoxy sekvenování za použití fágového vektoru M13 (J. Carlson a kol., Journal of Biotechnology, 1, str. 253, 1984). Jsou uvedeny aminokyselinové a nukleotidové sekvence pro vylepšený APT (II). Primer (1), schopný vyvolat mutaci, se liší podtrženou bází od genové sekvence vylepšeného APT (II) (viz tabulka 1). C) Indukce místně specifické mutace. Níže je uveden způsob vytvoření klonu obsahujícího sekvenci bází primeru (1) schopného produkovat mutaci, konkrétně vylepšený gen APT (IV). Po nasednutí (renaturaci) jednovláknové DNA popsané v příkladu 3.3-1, A) klonu mp9 (vylepšený APT (II) a primer (1), je produkt renaturace převeden na dvouvláknovou DNA, která je následně transformována na E. coli JM109 Poté se pomocí sekvenačního primeru skrínují sekvence DNA, přičemž se izoluje fágový klon nesoucí mutovaný vylepšený gen APT (II), konkrétně se extrahuje vylepšený gen APT (V). z tohoto klonu a zlepšený APT gen (V) se izoluje 5"-koncová fosforylace syntetického oligomeru. Primer DNA (1) pro indukci místně specifické mutace se fosforyluje způsobem popsaným v příkladu 2.2-1. Příprava. heteroduplexní DHE 0,5 ug jednovláknové DNA M13mp9 (vylepšený APT (II). )) a 1,5 ug dvouvláknové DNA M13mp9, štěpené restrikčním enzymem BamH1, se zahřívá v 30 ug roztoku obsahujícím 2 pmol fosforylovaného primeru. (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA a 50 mM NaCl, při 90 °C (2 min), 50 °C (5 min), 37 °C (5 min) a při teplotě místnosti ( 10 minut). K roztoku přidejte 36 μl 50 mM Tris-HCl roztoku (pH 8,0) obsahujícího 4 jednotky Klenowova enzymu, 7 jednotek T4 fágové DNA ligázy, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0,7 mM ATP 0,07 dATP a 0,2 mM každého z dGTP, dTTP a dCTP pro stimulaci prodloužení primeru. Směs se nechá reagovat při teplotě 20 °C po dobu 2 hodin a při teplotě 4 °C po dobu 15 hodin. Transformace se provádí za použití výše popsaného roztoku a kompetentních buněk E. coli JM109 (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.), dokud se nevytvoří lyzační skvrny. Po oddělení bezbarvé skvrny je fág infikován E. coli JN109 pro proliferaci. Templátová jednovláknová DNA se pak získá ze supernatantu kultury pro každý klon. Tyto jednořetězcové DNA jsou podrobeny pouze „T" reakci (reakce „A" a „T" v příkladu 3-2) dideoxy metody za použití sekvenačního primeru (2), následované elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Po vysušení se gel analyzuje autoradiografií. Na základě výsledků je identifikován klon mající požadovanou mutantní sekvenci. Kultivační supernatant klonu se použije k infekci buněk E. coli JM109 a znovu se naočkuje na plotnu, aby se izolovala jediná skvrna. Z výsledné jediné skvrny se výše uvedeným způsobem izoluje jednovláknová DNA. Pomocí těchto DNA se nejprve určí sekvence bází DNA dideoxy metodou za použití sekvenačního primeru (2), čímž se získá klon mutovaný na požadovanou sekvenci bází. Po infekci tohoto fágového klonu buňkami JM-109 E. coli za použití Messingovy metody popsané v příkladu 2 se získá dvouvláknová DNA. Tato dvouvláknová DNA je štěpena restrikčním enzymem Xho 11, elektroforéza se provádí v 0,8% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment (vylepšený gen APT (V) o přibližně 1500 párech bází obsahující vylepšený gen APT. Poté se DNA se extrahuje elektroelucí Kromě toho se pomocí dideoxy metody určí úplná sekvence bází takto získané DNA, přičemž se zjistí, že DNA je vylepšený gen APT (V) Kompletní sekvence bází takto získaného vylepšeného APT (. V) gen (obsahující však signální peptid -35 až -1) je ukázán na obr. 11 - 13. Aminokyselinová sekvence z něj odvozená je také znázorněna na obr. 17 - 19. 3-2) Konstrukce vylepšeného). APT (VI) a (VIII). Techniky jsou podobné těm popsaným v příkladu 3, 3-1). Nejprve se zkonstruuje M13mp3 (vylepšený APT (II)) a poté se syntetizují primery pro indukci místně specifické mutace. Sekvence bází těchto primerů je však popsána výše, aby se zkonstruoval vylepšený gen APT (VI) a vylepšený gen APT (VIII), fosforylovaný primer s 5" koncem (3) a fosforylovaný primer s 5" koncem (5 ) se používají, respektive (viz stůl 2). Po indukci místně specifické mutace je kompletní sekvence bází určena dideoxy metodou. Bylo potvrzeno, že mají požadované sekvence bází. Tak jsou získány geny pro zlepšený APT (VI) a zlepšený APT (VIII). Tyto geny jsou poté integrovány do vektoru pVY1 v souladu s postupem popsaným v příkladech 4 a 5. Příklad 4. Integrace vylepšeného genu APT (II) do vektoru pVY1. 4-1) Konstrukce vektoru pVY1. Vektor pVY1 se připraví tak, jak je ukázáno na OBR. 7. A) Konstrukce pAdD26SV (A) N3 (N) a tupé zakončení místa štěpení Eco R1. Nejprve se DNA pAdD26SV(A) N3 (zakoupená od Dr. Hiroshi Handa na Tokijské univerzitě, známá z abstraktů v Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) štěpí restrikčním enzymem Bgl11 (vyrobeno od Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tradičním způsobem DNA se poté zatupí konvenčním způsobem za použití Klenowova enzymu (vyrábí Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) po ošetření fenolem a vysrážením ethanolem. a sušení za sníženého tlaku, precipitáty se rozpustí ve sterilní destilované vodě. Ligace transformují kompetentní buňky HB101 E. coli (vyrobené společností Takra Shuzo Co. Ltd.) pomocí reakční směsi z transformantů vykazujících rezistenci na tetracyklin Po štěpení části těchto DNA restrikčním enzymem BgL 1 se provede elektroforéza na 0,7 % - agaróze. Výsledkem je klon nesoucí DNA, která není štěpena restrikčním enzymem BgL 11. Po štěpení (pAdD26SV). (A) N3 (N)) DNA tohoto klonu restrikčním enzymem EcoRl tradičním způsobem, DNA se zatupí pomocí Klenowova enzymu, jak je popsáno výše. Po ošetření fenolem, vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženina rozpustí v destilované sterilní vodě. B) Izolace fragmentu Kpn 1-BamHl (asi 2900 bp) z pKSV10 a vytvoření tupých konců. Poté, co je pKSV10 DNA (vyrobeno Fine Chemicals) štěpena restrikčními enzymy Kpn1 a BamH1 tradičním způsobem, jsou DNA tupé konce pomocí T4 DNA polymerázy (laboratorní příručka, str. 114 - 121). Poté se provede elektroforéza v 0,7% agarózovém gelu, aby se izoloval fragment o velikosti asi 2900 párů bází. Fragment je poté elektroeluován pro extrakci DNA
C) Konstrukce pVY1. Po ligaci fragmentu DNA získaného v A) a fragmentu DNA získaného v B) se provede transformace kompetentních buněk E. coli HB101 (popsáno výše). Plazmidová DNA se získá z transformantů vykazujících rezistenci k tetracyklinu za použití tradiční metody. Poté, co byla část těchto plasmidových DNA štěpena restrikčním enzymem Pst1 (vyrábí Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), byla provedena elektroforéza na 1,0% agarózovém gelu. Výsledkem je klon (plazmid pVY1) charakterizovaný pásy o délce přibližně 3400 párů bazí, přibližně 3200 párů bazí a přibližně 1400 párů bazí. Tento klon E/coli HB101 (pVY1 byl uložen ve Fermentačním výzkumném ústavu Agentury pro průmyslovou vědu a technologii Japonska pod registračním číslem P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Integrace vylepšeného genu APT (II ) do vektoru pVY1. Poté, co byla DNA plazmidu pVY1 získaného v příkladu 4-1) štěpena restrikčním enzymem BgL 11 běžným způsobem, byla provedena defosforylace za použití alkalické fosfatázy (vyrobeno firmou Takara Shuzo. Co. Ltd.). Poté se třikrát provede ošetření fenolem. A po vysrážení ethanolem a vysušení za sníženého tlaku se sraženiny rozpustí ve sterilní destilované vodě. Po ligaci této DNA s BgL fragmentem 11-Xho 11 (asi 1500 párů bází) získaným v příkladech 3, 3-1) a HB101 kompetentní buňky E. coli byly transformovány ligačním produktem v souladu s metodou popsanou výše. Plazmidová DNA se připravuje z transformantů rezistentních na tetracyklin tradičním způsobem. Po štěpení těchto DNA restrikčními enzymy (BqL 11, Pst 1) se vybere klon se zlepšeným genem APT (II) ve vektoru pVY1 integrovaným v požadovaném směru a selekce se provede na základě analýzy vzor elektroforézy na agarózovém gelu. Nejprve se část těchto DNA štěpí restrikčním enzymem BqL 11, následuje elektroforéza na 0,8% agarózovém gelu, čímž se získá klon s pásem fragmentu o velikosti přibližně 1500 bp, když se fragment BqL 11-Xho 11 liguje do BqL. fragment 11 plasmidů pVY1, ligovaná část Xho 11 a BqL 11 může být odříznuta restrikčním enzymem BqL 11. Část plasmidové DNA těchto klonů je dále štěpena restrikčním enzymem Pst1 a DNA je podrobena elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu pro získání klonu majícího jeden pás o velikosti přibližně 3400 bp, dva pruhy přibližně 2300 bp, jeden pruh přibližně 1400 bp a jeden pruh přibližně 80 bp. Pomocí tohoto klonu (plazmid pVY1-APT (II) podle laboratorní příručky se získá plazmidová DNA. Příklad 5. Integrace genů vylepšeného APT (V), (VI) a (VIII) do vektoru pVY1. Po štěpení DNA plazmidu pVY1 získaného v příkladu 4-1) se defosforylace restrikčního enzymu BqL 11 provedla konvenčním způsobem za použití alkalické fosfatázy (vyrábí Takara Shuzo Co., Ltd.) a poté se ošetřila (třikrát) fenolem, vysrážením ethanolem a sušením za sníženého tlaku. Sediment se poté rozpustí ve sterilní destilované vodě. Po ligaci této DNA s fragmentem BqLII-Xho 11 o velikosti přibližně 1500 párů bází získaným v příkladech 2, 2-3) se ligační produkt transformuje do výše kompetentních buněk HB101 E. coli. Plazmidové DNA se připraví z transformantů vykazujících rezistenci k tetracyklinu podle běžné metody. Po štěpení těchto DNA restrikčními enzymy BqL11 a Pstl se provede elektroforéza na agarózovém gelu. Analýzou separačního vzoru v agarózovém gelu se vyberou klony, ve kterých je vylepšený gen APT (V) vložen do vektoru pVYI v požadovaném směru. Nejprve se po štěpení některých z těchto DNA restrikčním enzymem BqL11 provede elektroforéza na 0,8% agarózovém gelu, aby se získaly klony a získal se pás o přibližně 1500 párech bází. Když je fragment BqL11-Xholl spojen s fragmentem BqL11 vektoru pVYI, část Xholl a BqL11 může být odštěpena restrikčním enzymem BqL11 díky výše uvedené konfiguraci izoschizomeru. Po dalším štěpení části plazmové DNA těchto klonů restrikčním enzymem Pstl se provede elektroforéza při koncentraci agarózového gelu 0,8 % a získá se klon poskytující pás přibližně 3400 bp, pás přibližně 2300 bp, dvě pásma asi 1400 bp, jedno pásmo asi 800 bp a jedno pásmo asi 80 bp. Pomocí klonu (plazmid pVYI-APT (V)) se získá plazmidová DNA ve velkém množství na základě laboratorní příručky. Podobně jsou geny pro zlepšené APT (VI) a (VIII) integrovány do vektoru pVYI. Příklad 6 Exprese pokročilého APT v buňkách CHO. Plazmid pVYI - vylepšený APT (VI), APT (II), APT (V) nebo APT (VIII) je transfekován do DHFR-deficientních CHO buněk (Urlaub, et al., Proč. Nati., Acad. Sci. USA, 77 (7), 4216-4224, 1980) metodou fosforečnanu vápenatého (Graham, et al. Viroloqy, 52, 456, 1973). Bylo zjištěno, že klon transformantů získaný na selektivním médiu (MEM A LPHA (-), GIBCO) v přítomnosti methotrexátu (MTX) vykazuje aktivitu APT 50 až 100 jednotek/ml (hodnota stanovená popsanou metodou fibrin/agaróza níže). Tento klon se použije pro následné studie. Použitým produkčním médiem je médium GIT (vyrábí Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.) doplněné 20 mezinárodními jednotkami/ml (SIGMA) aprotininu. Příklad 7. Purifikace zlepšeného APT ze supernatantu kultury CHO buněk. Kultivační supernatant získaný v příkladu 6 byl částečně purifikován pomocí afinitní kolony anti-APT monoklonální protilátky. Pro APT pocházející z lidských melanomových buněk se tradičním způsobem připraví hybrid produkující monoklonální protilátky. Hybrid produkující protilátku je naočkován do myší a monoklonální protilátka (podtřída: IgGM1) vyvinutá v ascitu je extrahována a purifikována pomocí Cellulophin Protein A (vyrábí Biochemical Industry Co., Ltd.) a MAPS monoklonální protilátkový purifikační pufrovací systém vyrobený od Biorad Laboratories. Protilátka se tradičním způsobem váže na CN3r-aktivovanou Sepharosu (vyrábí Pharmacia Fine Chemicals) rychlostí 4 mg na 1 ml gelu. Gel protilátky (24 ml) se smíchá se čtyřmi litry supernatantu kultury. Po mírném protřepávání přes noc při 4 °C se gel vloží do kolony (průměr 1,5 cm x 20 cm). Gel se poté postupně promyje 125 ml každého z následujících roztoků (1) Tris-HCl pufr pH 7,4 (pufr A) obsahující 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu (vyrábí SIGMA) a 0,01 % (w/v) Tween 80 (2) pufr A obsahující 0,5 M NaCl, (3) pufr A obsahující 4 M močovinu a (4) pufr A. Pokročilý gel navázaný APT byl eluován pufrem 0,2 M glycin-HCl pH 2 obsahujícím 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (w/v) Tween 80. Aktivní frakce se zredukují a spojí. Po dialýze proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, obsahujícímu 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (w/v) Tween 80 přes noc, se dialyzát koncentruje 20-30krát pomocí vakuového odstředivého koncentrátu (Speed VAC, vyrobeno od SAVANT Inc.). Koncentrát se znovu dialyzoval proti 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, obsahujícímu 0,15 M NaCl, 25 mezinárodních jednotek/ml aprotininu a 0,01 % (hmotn./obj.) Tween 80, přes noc a použil se pro následná hodnocení in vitro a in vivo. . Nakonec se specifická aktivita zvýší 3700-5000krát a výtěžek je od 36 do 42 % aktivity APT (stanoveno metodou fibrin/agaróza). Tato aktivní frakce se analyzuje elektroforézou s dodecylsulfátem sodným a barvením stříbrem. Za redukčních podmínek je pozorován velmi silný pás při 54 kilodaltonech spolu s několika dalšími pásy. Na elektroforetický gel se potom působí 2,5% (hmotn./obj.) Triton X-100 a umístí se na fibrin/agarózovou desku k autogramu fibrinu při 37 °C, přičemž rozpuštěný pás je detekován při asi 50 kilodaltonech. Na stejné desce se přirozený APT objevuje asi 60 kilodaltonů. Výsledky naznačují, že APT adsorbovaný na protilátkové afinitní koloně a eluovaný tímto způsobem odpovídá zlepšenému APT s molekulovou hmotností, která je přibližně o 10 000 nižší než molekulová hmotnost přirozeně se vyskytujícího typu. Příklad 8. Měření specifické aktivity zlepšeného APT. Množství proteinu v částečně purifikovaném pokročilém APT se stanoví měřením celkového proteinu podle BradFordovy metody (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), s použitím hovězího sérového albuminu jako referenčního proteinu. Množství antigenu APT se měří pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA). Fibrinolytická aktivita byla stanovena metodou fibrin/agaróza a metodou rozpouštění 125 1-značeného fibrinového filmu. Fibrin/agaróza se připraví přidáním agaru k 95% koagulovanému fibrinogenu. Způsob rozpouštění 1-značeného fibrinového filmu 125 se provádí tak, jak je popsáno v Hoyraeerts et al. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), s použitím jako standardu APT z lidských melanomových buněk vyrobených Bioscott Inc. a standardizovány podle mezinárodního standardu APT (Gaffuey a Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Hodnota specifické aktivity, vypočítaná z hodnoty aktivity stanovené metodou rozpouštění 125 1-fibrinového filmu a množství antigenu stanoveného enzymatickým imunosorbentním testem (ELISA), se pohybovala v rozmezí od 300 000 do 420 000 jednotek/mg antigenu. Příklad 9. Afinita zlepšeného APT k fibrinu a aktivace fibrinem
V souladu s prací Verheijena a kol./EMBOJ, 5, 3525, 1986) byla studována afinita zlepšeného APT k fibrinu. Zlepšený nebo přirozeně se vyskytující APT (1000 jednotek/ml) se přidá k fibrinogenu v různých koncentracích, poté se přidá jedna jednotka trombonu a následuje reakce při teplotě místnosti po dobu 3 minut. Výsledná fibrinová sraženina se vysráží odstředěním při 16 000 otáčkách za minutu po dobu 8 minut a množství APT, které není navázáno na fibrin, se stanoví měřením aktivity metodou fibrin/agaróza. V důsledku toho bylo zjištěno, že zlepšený APT (VI) vykazuje stejnou afinitu k fibrinu jako přírodní forma. Aby se prozkoumal stupeň aktivace plazminogenu zlepšeným APT v přítomnosti nebo nepřítomnosti fibrinu, byl proveden následující experiment. S použitím titrační destičky se přirozeně se vyskytující nebo zesílený APT přidá k 0,1 M Tris-HCl pufru, pH 7,5, obsahujícímu 0,3 mM syntetický substrát p-niroanilid tripeptid S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA. HCl, výrobce Kabi Inc .), 0,13 uM plasminogenu bez plasminu, 120 ug/ml DESAFIB TM (vyrobeno American Diagnostics Inc.) a 0,1 % Tween 80, což dává celkový objem 200 ul. Systém se udržuje při 37 °C. Po určité době se měří absorbance (optická hustota) při vlnové délce 405 nm pomocí Titertech Multiscan 310 Model. Křivka dávka-odpověď pro amidolytickou aktivitu zlepšeného APT (VI) a přirozeně se vyskytujícího APT je ukázána na OBR. 22. Posun křivky dávka-odpověď v důsledku přidání DESAFIB TM pro přirozeně se vyskytující APT odpovídá hodnotě 158krát, zatímco u vylepšeného APT dosahuje 100krát. To je způsobeno skutečností, že aktivita vylepšeného APT (VI) v nepřítomnosti léku DESAFIB TM je nižší, přibližně 1/20, než aktivita přirozeného APT. Příklad 10. Analýza zlepšeného APT na fibrinolytickou aktivitu v krevním řečišti králíka. Farmakinetika porovnáním aktivity přirozeně se vyskytujícího APT (n-APT) a zlepšeného APT podle předkládaného vynálezu u králíka. Jak je patrné z Obr. 23, vylepšený APT vykazuje znatelné prodloužení biologického poločasu existence v aktivním stavu (přirozený APT vykazuje poločas 1-2 minuty, zatímco vylepšený APT je biologicky aktivní 8-15 minut). Navíc je evidentní, že hodnota aktivity 5 % (hodnota 30 sekund po podání je 100 %) stále zůstává ve vylepšeném APT i 60 minut po jeho podání (přirozený APT vykazuje aktivitu rovnou 0,1 po 60 minutách) . Tento experiment se provádí následovně
K testování je vybrán japonský bílý králík o hmotnosti 2,4 kg. V pentobarbitalové anestezii se APT podává periferní ušní žílou. Dávka je 15 400 jednotek (0,8 ml) zlepšeného APT na králíka a 5 400 jednotek (0,8 ml) n-APT na králíka (hodnoty stanovené metodou fibrinové plotny). Poté se z femorální tepny pomocí katetru v různých časových intervalech (0,5 až 60 minut) odebere 2,5 ml krve a přidá se k 1/9 objemu citrátu sodného (3,8 %). Do 30 minut po odběru krve se provádí centrifugace při nízké rychlosti, čímž se oddělí plazma. Pomocí separované plazmy se měří aktivita APT v krvi. (1) Měření aktivity APT. Po 16násobném zředění 0,2 ml plazmy 3 mM ledovou kyselinou octovou se zředěný produkt odstředí při nízké rychlosti rotace, aby se získaly precipitáty. Precipitáty se rozpustí ve 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, se 140 mM NaCl v objemu ekvivalentním objemu plazmy, aby se získala euglobulinová frakce. Aktivita APT se stanoví přidáním této euglobulinové frakce do misky s fibrinem/agarózou. Po inkubaci destičky při 37 °C po dobu 16 hodin je aktivita APT pozorována jako plak. Standardní křivka pro metodu fibrin/agaróza se připraví zředěním APT použitého k podání zvířeti na 0,1 až 10 000 jednotek/ml. Aktivita APT v krvi stanovená tímto způsobem je vyjádřena v procentech s použitím aktivity APT získané odběrem krve 30 s po podání, brané jako 100 %. Příklad 11. Stabilita zlepšeného APT (VI) vůči teplu a kyselinám. Pro stanovení tepelné odolnosti byly zlepšené APT (VI) a přírodní APT zředěny 50 mM Tris pufrem obsahujícím 100 mM NaCl a 0,01 % Tween 80, pH 7,4, na koncentraci 100 ug/ml, v daném pořadí. Každý roztok se ponechá ve vroucí vodě (teplota 98 o C) po dobu 2-60 minut. Po ochlazení se zbytková aktivita stanoví metodou fibrinové destičky. Jak je znázorněno na OBR. 24, pokles aktivity zlepšeného APT (VI) je nevýznamný ve srovnání s poklesem aktivity přirozeného APT. Například po tepelném zpracování po dobu 2 minut se aktivita přirozeného APT sníží na 25 %, zatímco vylepšený APT (VI) si stále udržuje aktivitu na 71 %. Ke studiu odolnosti vůči kyselinám se vylepšený APT (VI) a přírodní APT rozpustí v 0,5N. roztokem HCl o koncentraci 100 μg/ml a následným usazením při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po neutralizaci se aktivita stanoví metodou fibrinové destičky. Zlepšený APT nevykazuje žádnou změnu aktivity, zatímco aktivita přirozeného APT je snížena o 50 %. Příklad 12 Inhibice aktivního faktoru stimulujícího lymfocyty zlepšeným APT (VI)
Zlepšené APT (VI) a přirozené APT byly vhodně naředěny v médiu pro tkáňové kultury PPM1 1640 obsahujícím 7 % fetálního telecího séra a 58 uM 2-merkaptoethanolu. 100 ul ředění se nanese do 96-jamkové destičky pro tkáňové kultury, poté se 50 ul buněčné suspenze obsahující thymocyty (210 7 buněk/ml) ze samců myší C3H/He J ve věku 4 až 6 týdnů, konkanavalin A (1,2 μg/ml), stejně jako 50 μl IL-1 (4 jednotky/ml, Aenzyme Inc), s následnou kultivací po dobu 48 hodin v inkubátoru při 37 °C s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Poté se přidá H 3 -thymidin v koncentraci 0,5 μ. krychle palec /20 ul/jamka. Po kultivaci po dobu 18 hodin se buňky shromáždí na filtru ze skleněných vláken a množství3H-thymidinu zavedeného do buněk se měří kapalinovým scintilačním počítačem pro stanovení aktivity faktoru stimulujícího lymfocyty. Jak je znázorněno na obr. 25, přirozený APT neinhibuje aktivitu faktoru stimulujícího lymfocyty, ale zlepšený APT ji významně potlačuje. Při testování se samotným rozpouštědlem nebyl pozorován žádný účinek. Příklad 13 Protizánětlivá aktivita založená na denaturovaném proteinu. 1) Získání denaturovaného proteinu. Po inkubaci proteinového roztoku (5 mg/ml) v 0,1 N. roztok HCl nebo 0,1 N. roztokem NaOH při teplotě 37 o C po dobu 2-3 hodin, roztok proteinu se neutralizuje stejným množstvím NaOH nebo HCl. 2) Afinita vylepšeného APT (VI) k denaturovanému proteinu. Metoda: Podle postupu uvedeného níže se denaturovaný protein „přilepí“ na nitrocelulózový film. Potom se měří množství vylepšeného APT spojeného s ošetřením proteinem a nitrocelulózovým filmem, čímž se vyhodnotí afinita vylepšeného APT k denaturovanému proteinu. Kousek nitrocelulózového filmu se ponoří do 20 mM Tris-HCl pufrového roztoku, pH 7,5, obsahujícího 140 mM NaCl. Sušení. Denaturovaný protein (50 μg/10 μl) se po kapkách uvolní na kousek nitrocelulózového filmu. Sušení. Blokování 3% roztokem želatiny. Proplachování. Kousek nitrocelulózové fólie se ponoří do roztoku vylepšeného APT /1 μg/ml/. Proplachování. Přidá se plasminogen a syntetický substrát S-2251 a následuje inkubace při 37 °C (kvantitativní analýza absorbovaného pokročilého APT). Měření absorbance při 405 nm. Výsledky: Jak je uvedeno v tabulce 3, zlepšený APT vykazoval afinitu k imunoglobulinu G ošetřenému HCl, albuminu ošetřenému HCl a albuminu ošetřenému NaOH. Na druhé straně zlepšená APT nevykazuje afinitu k intaktnímu imunoglobulinu G a albuminu. 3) Aktivace zlepšeného APT (VI) denaturovaným proteinem. Metoda: k reakčnímu roztoku vylepšeného aktivátoru APT (denaturovaný protein, BrCN - zpracovaný fibrinogen atd.) se přidá plazminogen (0,0078 jednotek v 10 μl), 100 μl 3 mM syntetického substrátu S-2251 a různá množství pufru TBS. při různých koncentracích, čímž se získá 0,275 ml reakčního roztoku. K reakčnímu roztoku se přidá Advanced APT (2,5 n/g ve 25 ul) pro zahájení reakce. Po reakci po určitou dobu se k reakčnímu roztoku přidá 2% dodecylsulfát sodný (ekvimolární množství), aby se reakce zastavila. Měřením optické hustoty (OD 405) se určuje aktivita vylepšeného APT. Výsledky: Jak ukazuje obr. 26, albumin ošetřený NaOH a imunoglobulin G ošetřený HCl vykazovaly silný aktivační účinek zlepšeného APT. Zejména u imunoglobulinu G ošetřeného HCl je aktivace silná a aktivita imunoglobulinu G ošetřeného HCl je přibližně stejná jako aktivita fibrinogenu ošetřeného BrCN a v koncentraci, která je několikrát nižší. Intaktní albumin a imunoglobulin G nevykazují aktivaci. 4) Degradace denaturovaného proteinu pod vlivem zlepšeného APT (VI). Metoda: Po zreagování denaturovaného proteinu s vylepšeným APT za stejných podmínek jako v metodě popsané v předchozím pododstavci s tím rozdílem, že syntetický substrát S - 2251 není přidán do reakčního systému a množství denaturovaného proteinu je 133 μg/ ml, elektroforéza se provádí v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným v přítomnosti -merkaptoethanolu. Výsledky: Jak je ukázáno na OBR. 27, protein denaturovaný působením NaOH nebo působením HCL má za následek vymizení pásů ef-proteinu ze vzoru a tvorbu degradačních produktů, což ukazuje na jeho rozklad. Na druhou stranu, při použití intaktního albuminu nebyla detekována žádná změna v ef-patternu po interakci se zlepšeným APT, a proto nebyla detekována žádná degradace denaturovaného proteinu.
NÁROK
1. Rekombinantní tkáňový aktivátor plasminogenu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na str. kde Y je Glu-Ile-Lys;H2N - amino konec;
COOH - karboxy konec;
R - přímá vazba nebo podobná sekvence obsahující substituce a/nebo delece a/nebo inzerce nesouvisející se změnami aktivity,
A mající následující vlastnosti: fibrinolytická aktivita, stanovená metodou rozpouštění 1 2 5 I-fibrinového filmu, schopnost aktivace fibrinem a aktivita zlepšeného tpA v nepřítomnosti fibrinu, která je nižší než aktivita fibrinu. přirozený tpA, prodloužený poločas ve srovnání s přírodní formou, zvýšený ve srovnání s přírodním tpA odolnost vůči kyselinám a teplu, schopnost inhibovat faktor aktivující lymfocyty a schopnost aktivace denaturovaným proteinem. 2. Způsob produkce rekombinantního tkáňového aktivátoru plasminogenu, zahrnující kultivaci hostitelských buněk transformovaných rekombinantní DNA obsahující sekvenci kódující analog tpA, a následnou purifikaci cílového produktu, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou kultivovány transformované rekombinantním vektorem obsahujícím DNA sekvence kódující tpA klauzuli 1.
