Аминокиселините могат да бъдат открити с помощта на цветни реакции: нинхидрин, ксантопротеин, Фоли, Милон, биурет тест и др. Тези реакции са неспецифични, т.к. се основават на откриването на отделни фрагменти в структурата на аминокиселините, които могат да бъдат намерени и в други съединения.
Нинхидринова реакция, цветна реакция, използвана за качествено и количествено определяне на аминокиселини, иминокиселини и амини. При нагряване в алкална среданинхидрин (трицетохидрин дихидрат, C 9 H b O 4) с вещества с първични аминогрупи (-NH 2), се образува продукт, който има стабилен интензивен синьо-виолетов цвят с максимална абсорбция от около 570 nm. Тъй като абсорбцията при тази дължина на вълната зависи линейно от броя на свободните аминогрупи, нинхидриновата реакция послужи като основа за тяхното количествено определяне чрез колориметрия или спектрофотометрия. Тази реакция се използва и за определяне на вторични аминогрупи (>NH) в иминокиселини - пролин и хидроксипролин; в този случай се образува ярко жълт продукт. Чувствителност - до 0,01%. Съвременният автоматичен аминокиселинен анализ се извършва чрез комбиниране на йонообменно разделяне на аминокиселини и тяхното количествено определяне чрез нинхидринова реакция. При разделяне на смеси от аминокиселини с помощта на хартиена хроматография, това дава възможност да се определи всяка аминокиселина в количество най-малко 2-5 μg.
По интензитета на цвета може да се прецени количеството аминокиселини.
Тази реакция е положителна не само със свободни аминокиселини, но и с пептиди, протеини и др.
Ксантопротеинова реакцияви позволява да откриете ароматни аминокиселини(фенилаланин, тирозин, хистидин, триптофан), въз основа на реакцията на електрофилно заместване в ароматния пръстен (нитриране).
Когато концентрирана азотна киселина действа, например, върху тирозин, се образува продукт с жълт цвят.
Фол реакция.Това е реакция към цистеин и цистин. По време на алкална хидролиза „слабо свързаната сяра“ в цистеина и цистина се отделя доста лесно, което води до образуването на сероводород, който, реагирайки с алкали, произвежда натриеви или калиеви сулфиди. Когато се добави оловен (II) ацетат, се образува сиво-черна утайка от оловен (II) сулфид.
Описание на преживяването. 1 ml разтвор на цистин се излива в епруветка, добавят се 0,5 ml 20% разтвор на натриев хидроксид. Сместа се загрява до кипене и след това се добавят 0,5 ml разтвор на оловен (II) ацетат. Наблюдава се сиво-черна утайка от оловен (II) сулфид:
Реакция на Цимерман.Това е реакция към аминокиселината глицин.
Описание на преживяването. Към 2 ml 0,1% разтвор на глицин, регулиран чрез добавяне на 10% алкален разтвор до pH = 8, добавете 0,5 ml воден разтворо-фталов диалдехид. Реакционната смес бавно започва да става ярко зелена. След няколко минути се появява зелена утайка.
Реакция към триптофан.Триптофанът, реагирайки в кисела среда с алдехиди, образува цветни кондензационни продукти. Например, с глиоксилова киселина (която е смес от концентрирана оцетна киселина), реакцията протича съгласно уравнението:
Реакцията на триптофан с формалдехид протича по подобна схема.
Реакцията на Сакагучи.Тази реакция към аминокиселината аргинин се основава на взаимодействието на аргинин с α-нафтол в присъствието на окислител. Механизмът му все още не е напълно изяснен. Очевидно реакцията се извършва съгласно следното уравнение:
Тъй като хинониминовите производни (в в такъв случайнафтохинон), в които водородът на имино групата –NH– е заменен с алкилов или арилов радикал, винаги са оцветени в жълто-червено, тогава, очевидно, оранжево-червеният цвят на разтвора по време на реакцията на Сакагучи се обяснява с появата на производното на нафтохинонимин. Въпреки това не може да се изключи възможността за образуване на още по-сложно съединение поради по-нататъшно окисляване на останалите NH групи на аргининовия остатък и бензеновия пръстен на α-нафтола:
Описание на преживяването. В епруветка се изсипват 2 ml 0,01% разтвор на аргинин, след което се добавят 2 ml 10% разтвор на натриев хидроксид и няколко капки 0,2%. алкохолен разтвора-нафтол. Съдържанието на епруветката се разбърква добре, добавят се 0,5 ml разтвор на хипобромит и се разбърква отново. Незабавно добавете 1 ml 40% разтвор на урея, за да стабилизирате бързо развиващия се оранжево-червен цвят.
Биуретова реакция– използва се като цветна реакция към протеини. В алкална среда в присъствието на медни (II) соли те дават виолетов цвят. Цветът се дължи на образуването на медно (II) комплексно съединение, дължащо се на пептидната група -CO-NH-, което е характерно за протеините. Тази реакция получи името си от производно на урея - биурет, което се образува при нагряване на урея с елиминиране на амоняк:
В допълнение към протеините и биурета, същото оцветяване се дава от други съединения, съдържащи тази група: амиди, имиди на карбоксилни киселини, както и съединения, съдържащи групите -CS-NH- или =CH-NH- в молекулата. Протеини, някои аминокиселини, пептиди, биурет и средни пептони също реагират.
Цветът на комплекса, получен чрез биуретова реакция с различни пептиди, е малко по-различен и зависи от дължината на пептидната верига. Пептидите с дължина на веригата от четири аминокиселинни остатъка и повече образуват червен комплекс, трипептидите - лилав, а дипептидите - син.
кетонна форма на полипептида
енолна форма на полипептида
Когато полипептид взаимодейства с Cu (OH) 2, се образува комплекс, чиято структура може да бъде показана по следния начин.
Оборудване и реагент: хроматографска хартия; хроматографска камера; фотоелектрически колориметър; ножици; стъклени чинии (3´32 см) - 3 бр.; държач за хроматограми; сушилен шкаф; микропипети; епруветки с шлифовани запушалки; бюрета 25 ml; стандартна смес от аминокиселини; тестова смес от аминокиселини; бутанол, оцетна киселина, вода в съотношение 15:3:7; 1% разтвор на нинхидрин в 95% ацетон; етилов алкохол (75%), наситен с меден сулфат.
Завършване на работата
Вземете лист хроматографска хартия с размери 18 х 28 cm и начертайте хоризонтална линия с обикновен молив на разстояние 3 cm от късия му край. След това се разделя на неравни сегменти в съответствие с приложената схема и със стрелки се отбелязват границите на приложение на стандартните и тестовите смеси и се правят съответните надписи с обикновен молив.
Хартията се заздравява над повърхността на масата и стандартната смес се нанася първо върху стартовата линия, ограничена със стрелките, с помощта на специална микропипета в тънка линия, докато целият разтвор от микропипетата се прехвърли върху стартовата линия (микропипетата е напълнена до 2-3 см). Масата на приложения разтвор се измерва чрез претегляне на пипетата, пълна със стандартната смес (преди прилагане на разтвора) и празна (след прилагане на разтвора). Обикновено върху хартията се нанасят 0,02-0,03 g стандартен разтвор. След това напълнете чиста пипета с тестовата смес от аминокиселини (издадена от учителя за изследването), претеглете я и нанесете сместа върху началната линия със съответния знак.
Приготвената хроматограма се поставя в хроматографска камера с предварително излята в нея система от разтворители за разделяне на смес от аминокиселини, например смес от бутанол, оцетна киселинаи вода в съотношение 15:3:7. Разделянето се извършва чрез възходяща хроматография, докато предната линия достигне 2-3 cm до горния ръб на хроматографската хартия (финалната линия). След това хроматограмата се изважда от камерата и горният край на хартията незабавно се вкарва в държач, направен от три стъклени пръчки, закрепени с гумен пръстен, и се поставя в абсорбатор за 20 минути, за да се отстранят разтворителите от хартията.
Ориз. 8. Схема на подреждане на аминокиселините върху хроматограмата:
А - точка на приложение на смес от аминокиселини; I - цистин и цистеин;
2 - лизин; 3 - хистидин; 4 - аргинин; 5 - аспарагинова киселина,
серия и глицин; 6 - глутаминова киселина и треонин; 7 - аланин;
8 - пролин; 9 - тирозин; 10 - валин и метионин; II - триптофан;
12 - фенилаланин; 13 – левцин и изолевцин
Изсушената хроматограма се потапя в 1% разтвор на нинхидрин в ацетон, за да се открие позицията на аминокиселинните петна върху нея. След това хроматограмата се поставя в абсорбатор за 10 минути за отстраняване на ацетона и се прехвърля в сушилен шкаф, където се оставя за 15 минути при 70°C. Аминокиселините на стандартните и тестовите смеси се откриват под формата на синьо-виолетови петна, разположени във верига по посока на движение на системата от разтворители от началната линия до горния край на хроматограмата.
Идентифицирането на аминокиселините, съдържащи се в тестовата смес, се извършва чрез съвпадение в хроматограмата на позициите, заети от аминокиселините на стандартната и тестовата смес (фиг. 8).
За да се определи количественото съдържание на аминокиселини в тестовите смеси, хроматограмата се начертава с обикновен молив, така че цветните зони, разположени на едно и също ниво, съответстващи на една и съща аминокиселина, се съдържат в приблизително еднакви правоъгълници (фиг. 9) .
I II III IV
Ориз. 9. Схема на подреждане на аминокиселините върху хроматограмата:
I - смес No I; II - смес № 2; 1U - смес No3; Ш - стандарт
смес от аминокиселини
Очертаните участъци от хартията се изрязват и поставят в епруветки, чиито номера трябва да съответстват на броя на петната върху хроматограмите. Във всяка епруветка от бюрета се наливат 10 ml 75% разтвор. етилов алкохолнаситен с меден сулфат (добавете 0,2 ml наситен разтвор на меден сулфат към 500 ml етилов алкохол). Епруветката се затваря и като се разбърква от време на време, керемиденочервеният цвят (синьо-виолетова медна сол Ruheman) се прехвърля изцяло от хартията в разтвора. Това отнема 15-20 минути. Абсорбцията (оптичната плътност) на стандартния и тестовия разтвор се измерва на фотоелектричен калориметър с филтър за зелена светлина (540 nm). В референтния поток се монтира кювета със 75% разтвор на етилов алкохол с меден сулфат.
Количественото съдържание на аминокиселини в тестовия разтвор се изчислява от съотношението на екстинкциите на тестовата и стандартната проба.
Пример за изчисление. Да приемем, че стандартната смес съдържа 1,8 mg глицин в 1 ml и 0,02 g от този стандартен разтвор се прилага към стартовата лента. Следователно получената хроматограма (1,8 × 0,02) = 0,036 mg глицин. Нека освен това се съгласим, че абсорбцията на оцветените разтвори е 0,288 за стандарта и 0,336 за неизвестната смес. Тогава съдържанието на глицин в изследваната смес, нанесено на хроматограмата, ще бъде (36´0,336): 0,288=42 μg. Ако освен това приемем, че тестовата смес се прилага към хроматограмата в количество от например 0,0250 g, тогава съдържанието на глицин в 1 ml от тестовия разтвор ще бъде (42:0,0250) = 1680 μg, или 1,68 mg/ мл.
Представете резултатите от собствения си експеримент и направете изводи от тях.
Лабораторна работа №15
Разделяне на йониFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+
Тази статия ще обсъди методите за определяне на аминокиселини, използвани не само в анализа на продуктите, но и в биохимията и фармацевтичния анализ.
Общото количество аминокиселини може да се определи чрез фотометричен метод, базиран на определянето на амоняк, получен от аминокиселини по метода на Kjeldahl.
Реакция с 1-нафтол. За определяне на аргинин, хистидин и тирозин беше предложена реакция с 1-нафтол. В присъствието на натриев хипохлорит (NaOCl) разтворът става червен. Разтвор на проба в 50% етанол, съдържащ аминокиселина, се охлажда с лед и се добавят 10% разтвор на NaOCl и разтвор на нафтол. Реакционният продукт е оцветен в червено (l max = 550 nm). Съдържанието на аминокиселини се определя от интензитета на цвета на получения разтвор.
Биуретова реакция. Един от най-важните реакцииизползван за определяне на аминокиселините е биуретовата реакция. Реакцията се провежда чрез добавяне на разреден воден разтвор на медна (II) сол към алкален разтвор на биурет. В този случай разтворът става наситено лилав поради образуването на комплексно съединение.
Биуретната реакция включва съединения, съдържащи най-малко 2 амидни групи или аминохидроксиетиленова група, както и амиди и имиди на аминокиселини. Тази реакция се осъществява от протеини и концентрирани разтвори на аминокиселини и амиди. Разредените разтвори на аминокиселини не дават биуретна реакция и следователно реакцията може да се използва за определяне на края на протеиновата хидролиза. Реакцията се използва и за качествено и количествено определяне на протеин. Биуретовата реакция е в основата на методите, използвани в клинико-диагностичните лаборатории за определяне на протеин в кръвта и др. биологични течности.
Нинхидринова реакция. Втората най-важна реакция, използвана за определяне на аминокиселини, е реакцията на нинхидрин - цветна реакция към a-аминокиселини, която се извършва чрез нагряване на последните в алкален разтвор на излишък от нинхидрин.
Нинхидринът извършва окислително декарбоксилиране на а-аминокиселини с образуването на амоняк, въглероден двуокиси алдехид, съдържащ един въглероден атом по-малко от изходната аминокиселина. Редуцираният нинхидрин допълнително реагира с освободения амоняк и втора молекула нинхидрин, образувайки оцветен кондензационен продукт с амоняк.
Полученото съединение (пигмент) има виолетово-син цвят (l max = 570 nm). Образуването на това оцветено съединение се използва в количествения тест за а-аминокиселини, който може да открие аминокиселини дори в количества от толкова малки като 1 µg.
Пролинът и хидроксипролинът, които нямат а-аминогрупа, реагират с нинхидрин, за да образуват производни жълт цвят(l max = 440 nm). Реакцията не е специфична, т.к амоняк и съединения, съдържащи аминогрупа (амини, протеини, пептиди) също произвеждат оцветен продукт с нинхидрин. С тези съединения обаче не се отделя CO 2 . Отделянето на въглероден диоксид е характерно само за а-аминокиселините. Реакцията се използва за колориметрично количествено определяне на a-аминокиселини, включително в автоматични анализатори на аминокиселини (измерване на обем CO 2 ).
Реакцията на нинхидрин се използва за определяне на глицин, изолевцин, левцин; серин, фенилаланин, цистеин, тирозин, триптофан и др. дават по-малко интензивно оцветяване.
Получените продукти се характеризират с доста интензивен цвят (e = 1,8–3,3·10 4), но оцветените продукти са нестабилни. Интензивността на цвета бързо намалява. За стабилизиране се добавя CdCl2. Образува стабилни комплекси с получените съединения. Кадмиевият хлорид също ускорява реакцията.
Аминокиселините и някои други съединения, съдържащи аминогрупа, кондензират в алкална среда с 1,2-нафтохинон-4-сулфоксилат, за да образуват червени, жълти, оранжеви производни на 1,2-нафтохинон моноимин.
Реакцията се използва за определяне на а-аминоксилати (валин, изолевцин, левцин и др.).
За определяне на триптофан може да се използва реакцията с 4-диметиламинобензалдехид. Реакционният продукт е оцветен в лилаво и съдържанието на триптофан в анализирания разтвор се определя от интензитета на цвета.
Трябва да се отбележи обаче, че тази реакция рядко се използва в анализа на храните.
За количествено определяне на аминокиселини, съдържащи сяра, се използва броматометричен метод, базиран на следната реакция:
Разтвор на цистеин в 1% разтвор на NaOH се излива в колба със смляна запушалка, добавя се 0,1 N. разтвор на калиев бромат, сух калиев бромид и подкислен с 10% НС1.
BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O
Образуваният в резултат на реакцията бром, чието количество е еквивалентно на количеството калиев бромат, реагира с аминокиселината. След 10 минути се добавя калиев йодид, който реагира с нереагиралия бром и освободеният йод се титрува с 0,1 N. разтвор на натриев тиосулфат с нишесте като индикатор.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Количеството тиосулфат, използвано за титруване, е еквивалентно на количеството бром, който не е реагирал с аминокиселината. На базата на разликата между количеството добавен калиев бромат и тиосулфат се намира количеството бром, което е влязло в реакцията с аминокиселината и следователно количеството аминокиселина.
Метионинът се определя по подобен начин. Метионинът се окислява до сулфон:
Тази реакция при определени условия дава възможност много точно да се определи съдържанието на метионин.
Методи за определяне на аминокиселини
Аминокиселините са биологично активни вещества, те играят важна роля в живота на човешкото тяло, те се използват широко като лекарства. Някои от тях са есенциални и влизат в организма с храната. Понастоящем съществуват редица методи за количествено определяне на аминокиселини в лекарствени растителни материали, в т.ч. лекарстваи биологични течности, в хранителни продукти.
От разнообразието от методи за количествено определяне на аминокиселини в различни обекти могат да се разграничат четири основни групи: хроматографски, спектрофотометрични, титриметрични и електрохимични методи за анализ.
Хроматографски методи
Отзад последните десетилетияЗначителен напредък е постигнат в областта на газо-течната хроматография на аминокиселини. Предложен е метод, използващ микроопаковани колони, който позволява относително кратко времеотделят почти напълно 17 биологично важни α-аминокиселини.
Разработен е метод за определяне на аминокиселини с помощта на газово-течна хроматография в проби от серум, плазма, урина и гръбначно-мозъчна течност, базиран на получаването на 2,3,4,5,6-пентафлуоробензоил-изобутилови етери, последвано от разделяне на полидиметилсилоксанова колона в режим на температурно програмиране от 140°C до 250°C с пламъчно-йонизационен детектор. Времето за хроматографско разделяне е 28 минути. В резултат на изследването са отделени 27 аминокиселини.
Въпреки разнообразието от методи за високоефективна течна хроматография за анализ на аминокиселини, най-бързият и достъпен е обратнофазовият вариант със спектрофотометрична детекция. За успешно разделяне и откриване, аминокиселините се превръщат в хидрофобни и абсорбиращи светлина производни, т.е. се извършва дериватизация преди колоната. Ортофталов алдехид, нафтален-2,3-дикарбоксиалдехид и 9-флуоренилметилхлороформат се използват като дериватизиращи реагенти.
Разработен е метод за количествено определяне на L-цистин, L-глутаминова киселина и глицин в препарата "Елтацин", който има антиоксидантна активност в комбинация с антиангинален ефект. Глутаминова киселинаи глицин се определят чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза след предколонна дериватизация с ортофталалдехид/N-ацетил-L-цистеинов реагент. Дериватизацията на цистеина, според авторите, е трудна поради нестабилността на самата аминокиселина и получените производни. Следователно, анализът на цистеин се извършва чрез броматометрично титруване. Установено е, че наличието на значителни количества цистеин в пробата не пречи на определянето на продуктите на дериватизация на глицин и глутаминова киселина с реагента ортофталов алдехид/N-ацетил-L-цистеин. Методът се характеризира с висока възпроизводимост и точност на определяне.
Възможността за използване на 4,7-фенантролин-5,6-дион (фанхинон) като флуорогенен маркиращ реагент за предколонното образуване на неговите производни с цел разделяне и количествен анализ на аминокиселини чрез високоефективна течна хроматография беше разследван. Тъй като няма присъща флуоресценция, фанхинонът реагира с аминогрупите на аминокиселините (при 68 °C за 160 минути), образувайки иминохиноли, чиято флуоресценция се измерва при дължина на вълната 460 nm. Изолираните производни се идентифицират чрез Tm, IR, мас и PMR спектри. Високоефективната течна хроматография се провежда на хроматограф с флуоресцентен детектор и колона с градиентно елуиране със смеси: разтвор на триетиламин - фосфатен буфер(pH 3) - метанол. Като вътрешен стандарт се използва хинидин. Този методе доста обещаващ в големи лаборатории и може да бъде предложен за анализ на аминокиселини в готови лекарствени форми.
Разработена е високоефективна течна хроматографска техника с потенциометричен биосензор за количествено определяне на лизин. Биосензорът е конструиран чрез прикрепване на мембрана, съдържаща лизиноксидаза, към йон-селективен NH4+ електрод. Амониеви йони, генерирани по време на ензимно разграждане на лизин, се откриват потенциометрично. Разработен е хроматоденситометричен експресен метод за анализ на триптофан в културални течности. Тънкослойна хроматография се провежда върху Sorbfil плаки. Хроматографията се извършва в системата пропанол-2 - 25% разтвор на амониев хидроксид (7:3) в продължение на 25 минути. Хроматограмите бяха изсушени при стайна температураи се държи 15 минути при 120°С. За откриване на петна върху хроматограмите се използва специфичен реагент - 4-диметиламинобензалдехид, селективен за индоловия пръстен на триптофан, под формата на 0,5% разтвор на етанол с добавяне на 5% концентрирана сярна киселина. След проявяване на хроматограмите чрез потапяне в тефлонова кювета с прясно приготвен разтвор на 4-диметиламинобензалдехид, те се държат 5-7 минути при температура 110°С. Сканирането на петна от триптофан се извършва при дължина на вълната 625 nm на компютърен видео денситометър. Разработеният метод, въпреки високата си точност на определяне и производителност, е специфичен за триптофана.
За анализ на β-аминокиселини в биологични течности, лекарства и хранителни продукти широко се използват методите на капилярна електрофореза, основани на разделянето на компонентите на сложна смес в кварцов капиляр под действието на приложен електрическо поле. Тъй като аминокиселините са цвитерионни по природа, те могат да бъдат разделени с помощта на електролитни буферни разтвори с подходяща рН стойност, като най-често се използват неутрални и основни буфери за разделяне.
За повишаване на специфичността и чувствителността на метода на капилярната електрофореза за анализ на отделни β-аминокиселини се използва тяхната предварителна дериватизация, последвана от разделяне в кварцов капиляр и спектрофотометрично определяне на реакционните продукти. Така 9-флуоренил метилформиат, 9-(2-карбазол)-етил хлороформат и цианиново багрило се използват като дериватизиращи агенти. Перспективите на метода се дължат на такива предимства като бърз анализ, лекота на подготовка на пробите, ниска консумация на реагенти и простота на инструментите.
И протеини
Известно е, че всичките 20 разновидности на каноничните α-аминокиселини имат една и съща структура, с три варианта на функционални групи (фиг. 3.3). За съжаление, реакциите към амино и карбокси групи не са много специфични, т.к съответно те са характерни за всички амини, редица амиди и карбоксилни киселини. Същото се отнася за повечето от техните радикали = R, 10 от които са неполярни, т.е. представени от алифатни = въглеводородни групи, повечето от които са химически инертни. Специфичността на повечето R полярни аминокиселини, които съдържат алкохол (Ser, Tre, Tyr), амид (Asn, Gln) и карбокси групи (Asp, Glu), също е относително ниска. По-активни са аминогрупата (Lys), имидазолът His и гуанидиногрупата Arg, а активността на тиогрупата Cys е максимална. Следователно най-великият практическо значениев качеството и количествен анализα-аминокиселини, включително в аминокиселинни анализатори, получиха универсална нинхидринова реакция, специфична за едновременното присъствие на амино и карбокси групи при α-C атома.
Ориз. 3.3. Общи формулиструктура на α-аминокиселините и техните полимеризационни продукти. Пояснения в текста.
Полимеризацията на α-аминокиселини в структурата на пептидите и протеините (фиг. 3.3) запазва всичките им R типове, но:
1. Реакцията на нинхидрин става отрицателна, т.к с изключение на N- и С-крайните, α-амино и α-карбокси групите се изразходват за образуването на пептидни връзки. Положителната реакция на нинхидрин с протеин най-вероятно показва наличието на аминокиселинни примеси в препарата или контейнера.
2. За всички пептиди и протеини биуретовата реакция е специфична за пептидна група, която отсъства в мономерните аминокиселини.
3. От повече специфични реакцииза R аминокиселини са полезни следните: ксантопротеинова реакция с концентрирана азотна киселина, за ароматни R Fen, Tyr, Tri; реакция с изатин на пет-членния Pro пръстен, както и реакции на имидазола R His, тио групата Cys и гуанидино групата Arg. Важно е да се вземе предвид, че някои от тези R са скрити вътре в протеиновите глобули и следователно качествените реакции към тях са отслабени. Следователно, преди да бъдат извършени, протеините обикновено се денатурират по един или друг начин.
4. За разлика от истинските разтвори на аминокиселини, колоидни разтворипротеините са характерни седиментни реакции , свързани с разрушаването на техните хидратационни черупки и в резултат на това намаляване на тяхната разтворимост под въздействието на средства за отстраняване на вода: неутрални соли = изсоляване, метанол = MeOH, етанол = EtOH, ацетон, урея и други агенти.
Когато извършвате качествени реакции, трябва:
1. Внимателно спазвайте правилата за пожарна безопасност и работете с концентрирани киселини и основи = EZh.
2. Маркирайте 2 реда епруветки със стъклограф или флумастер и в една от тях поставете не повече от 0,5 ml (2-5 капки) 1% разтвор на аминокиселини и приблизително същия обем на 1 % протеинов разтвор в другата.
3. В чифт епруветки с разтвори на аминокиселини и протеини добавете паралелно 3-5 капки от съответните реактиви и извършете останалите процедури, посочени за съответната реакция.
4. Ако е необходимо да се нагреят епруветките, отстранете капака на тигела и запалете сухото гориво с кибрит. След това затегнете епруветката в държач, чийто примитивен дизайн е много ненадежден. Ето защо е по-добре да увиете няколко епруветки с лист хартия, сгънат на лента, и като ги държите палец, прекарайте равномерно долните половини на епруветките през пламъка, избягване на насочване на вратовете към съседите и предизвикване на бурно кипене на разтвора. След приключване на операцията незабавно изгасете пламъка с капака на тигела.
5. Резултатите от експериментите се оформят в съответствие с образеца върху разпространението на лабораторната тетрадкапод формата на таблица:
6. След разглеждане на получените резултати и попълване на протокола, заедно със стелаж с епруветки, ги предайте на учителя за защита.
1. Нинхидринова реакция.Въз основа на дезаминиране и декарбоксилиране на α-аминокиселини с алкохолен разтвор на нинхидрин:
Полученият амоняк, реагирайки с две молекули нинхидрин, образува оцветено производно с максимум на абсорбция при 540 nm (за Pro - 440 nm).
Напредък: Добавете 3-5 капки 0,5% алкохолен разтвор на нинхидрин към тестовите проби. Епруветките със смесите се загряват леко на пламък и след 2-3 минути се записва появата на цвят.
2. Ксантопротеинова реакция.Както бе споменато по-горе, той се основава на образуването на нитро производни на аминокиселини с ароматни R: Fen, Tyr, Tri.
Напредък: Включете течението на абсорбатора, внимателно добавете няколко капки концентрирана азотна киселина (HNO 3) към чифт епруветки с тестовите разтвори. Внимателно загрейте епруветките на пламък, като избягвате да насочвате гърлата към съседите, и запишете развитието на цвета.
3. Реакция на нитропрусид.Основава се на алкална хидролиза на съдържащата сяра аминокиселина цистеин, с освобождаване на натриев сулфид (Na 2 S), който дава червен комплекс с прясно приготвен разтвор на натриев нитропрусид.
Напредък:Добавете равен обем 20% натриев хидроксид към двете епруветки с 5-10 капки от тестовите разтвори и кипете най-малко 3-5 минути. Добавете 3-5 капки разтвор на натриев нитропрусид към епруветките и запишете развитието на цвета.
4. Биуретова реакция.Основава се на образуването на оцветен комплекс от пептидна връзка с Cu 2+ йон в алкална среда. Служи като универсален тест за идентифициране на пептиди и протеини в разтвори. Тъй като с увеличаване на броя на пептидните връзки интензитетът на цвета на разтвора нараства линейно, той се използва широко за фотометрично определяне на протеинови концентрации.
Напредък. Добавете същото количество 10% разтвор на натриев хидроксид към епруветките с 5-10 капки от тестовите разтвори. Разбъркайте добре и добавете 2 капки 1% разтвор на меден сулфат (CuSO 4). Смесете пробите и запишете развитието на цвета след няколко минути.
5. Тест за кипене.Въз основа на термична денатурация на протеини.
Напредък. Подкиселете двете епруветки с тестовите разтвори с не повече от една капка 1% разтвор на оцетна киселина (AcOH) и загрейте до кипене. След варене на разтворите в продължение на 2-3 минути, запишете резултатите и обяснете механизма на явлението.
6. Утаяване на соли на тежки метали(мех) . Техните денатуриращи свойства се основават на способността на тежките Me катиони да реагират с R функционалните групи на протеиновата молекула: тио-, амино-, карбокси-, ароматни. Също така, техните силни аниони предизвикват презареждане на йонните групи в протеиновите молекули, като по този начин разрушават йонните връзки в тях.
Напредък. Добавете няколко капки 5% разтвор на меден сулфат (CuSO 4) към двете епруветки с тестовите разтвори. Запишете и обяснете получените резултати.
7. Утаяване с органични киселини.Въз основа на киселинната денатурация на протеини и образуването на ковалентни производни на тио-, амино- и ароматни групи на R аминокиселини с хлорорганични съединения.
Напредък. Добавете няколко капки от 10% разтвор на трихлороцетна киселина (TCA) към епруветките с тестовите разтвори и след няколко минути запишете резултатите
