Антонова O.P., Малюгин B.E.

Използването на рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор при лечение на фибринозен увеит след едновременна кератопластика и операция на катаракта (клиничен случай)

1 Национален медицински изследователски център "MNTK "Микрохирургия на очите" на името на. акад. С.Н. Федоров" на Министерството на здравеопазването на Руската федерация

Фибринозният увеит е едно от тежките усложнения на следоперативния период на операция на катаракта и кератопластика. Дългосрочното наличие на фибрин в предната камера променя и утежнява хода на следоперативния период. Съществува опасност от токсични и механични ефекти върху околните тъкани, по-специално върху ендотелните клетки на присадката, а предните синехии, възникващи между иридолентикуларната диафрагма и присадката, могат да причинят нейното (присадката) отделяне. Наличието на фибринозен излив в предната камера изисква интензивна локална и системна кортикостероидна терапия, което от своя страна забавя процеса на зрителна рехабилитация и продължителното лечение може да не доведе до желания краен резултат. Образуването на фибринозна зенична мембрана влошава функционалния резултат дори от операция, извършена на високо техническо ниво и предизвиква необходимостта от повторни интервенции.

Основните лекарства при лечението на фибринозен увеит са фибринолитици и плазминогенни активатори: фибринолизин, стрептодеказа, урокиназа и др. Въпреки това, всички тези лекарства, с изключение на урокиназата, са протеини, чужди на човешкото тяло и често причиняват алергични реакции. Освен това, в дози, необходими за активна фибринолиза, те са токсични за вътрешните, а в някои случаи и за външните мембрани на окото.

Едно от най-новите лекарства от групата на тромболитиците в офталмохирургията е рекомбинантният тъканен плазминогенен активатор (rTPA). rTPA е алогенен ензим. Неговият естествен аналог се намира в почти всички тъкани и органи на човешкото тяло, включително всички структури на окото. Следователно този ензим няма антигенни свойства. Отличителна черта на rtPA е неговата висока специфичност за фибрин. Активирането на плазминогена се извършва само на повърхността на патологичния субстрат (кръвен съсирек или фибрин), докато активирането на системната фибринолиза не настъпва при използване на rtPA.

Ензимът алтеплаза, съдържащ рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор, има изразен тромболитичен ефект при заболявания като остър миокарден инфаркт, тромбоемболия на белодробната артерия и церебралните съдове. Чуждестранни учени за първи път съобщават за резултатите от използването на rtPA в офталмологията през 80-те години. последния век. Има редица чуждестранни трудове, посветени на изследването на ефекта на rtPA върху вътреочната фибринолиза в експерименти и данни за еднократната му употреба в клиниката. В местната литература първите публикации по този проблем датират от 1995 г.

Към днешна дата са публикувани много трудове, главно от чуждестранни изследователи, относно използването на rtPA при лечението на фибринозен увеит. Редица проучвания са изследвали ефективността на rtPA при различни очни патологии, методите на неговото приложение, еднократни и курсови дози на лекарството и неговата съвместимост с традиционните методи на лечение.

В съвременната вътрешна офталмология rtPA се използва изключително рядко при лечението на постоперативни усложнения, което се обяснява с високата цена на лекарството и следователно не е ежедневен избор в борбата срещу фибринозния увеит.

Мишена- да проучим на собствен клиничен пример ефективността и безопасността на използването на рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор при лечението на следоперативен фибринозен увеит.

материали и методи

Изследвахме 1 пациент на 77 години с диагноза ендотелна корнеална дистрофия на Fuchs, съчетана с катаракта. Зрителната острота при приемане беше 0,05, кератохиметрията беше 650 µm в централната точка, плътността на ендотелните клетки не можеше да бъде определена. Въз основа на горните данни беше решено да се извърши едноетапна операция: факоемулсификация на катаракта с имплантиране на заднокамерна ВОЛ и задна автоматизирана ламелна кератопластика. В първия ден от следоперативния период роговицата е прозрачна, единични гънки на десцеметовата мембрана, предната камера е със средна дълбочина, течността на предната камера е прозрачна, ирисът е структурен, ВОЛ е в капсулния сак, в правилна позиция, PEC - 1340 клетки/mm 2 . През първите четири дни от следоперативния период състоянието на окото остава стабилно. Терапията в следоперативния период е стандартна и включва инстилации на антибиотици, кортикостероиди, антихипертензивни лекарства, кератопротектори и субконюнктивални инжекции на кортикостероиди. На петия ден след операцията биомикроскопски се визуализира фибринозен ексудат в предната камера, представляващ зенична мембрана с предни синехии, фиксирани към краищата на присадката (фиг. 1), поради което горната терапия беше коригирана: честотата на инстилации на антибиотици и кортикостероиди на ден са увеличени, добавени са инстилации на мидриатици, НСПВС и системно приложение на кортикостероиди.

Тази терапия се провежда в продължение на 15 дни, но няма положителна динамика. Въпросът за повторна хирургична интервенция с цел аспирация на фибринозен излив от предната камера беше отхвърлен поради високия риск от отделяне на присадката. Решено е да се използва рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор (Actilyse, Boehringer Ingelheim Pharma, Германия). На 16-ия ден от постоперативния период rtPA се инжектира в предната камера в количество 25 μg/ml, 0,2 ml. Изчисляването на представената доза от лекарството се основава на резултатите от редица изследвания на чуждестранни изследователи.

резултати

Положителната динамика беше отбелязана през следващите няколко часа: до 3 часа след прилагането на лекарството зеничната мембрана намаля наполовина, предните синехии, фиксирани към краищата на присадката, напълно отсъстваха. До 8 часа след приложението на rtPA се наблюдава почти пълна резорбция и малко количество фибрин остава върху предната повърхност на ВОЛ. На следващия ден, по данни на OCT Visante, на предната повърхност на ВОЛ се запазва зеничната мембрана, чиито размери в сагиталната равнина са 0,21-0,28 mm. За да се оцени състоянието на монослоя на ендотелните клетки на присадката след въвеждането на rtPA в предната камера, се извършва PEC броене, което е 1290 клетки / mm 2, зрителна острота - 0,3. На 7-ия ден след прилагане на rtPA, по време на биомикроскопия, се наблюдава фибринозна мембрана на предната повърхност на ВОЛ на зеничния ръб на ириса според OCT Visante, размерите на остатъчния фибрин са както следва: в сагитална равнина - 0,09 мм, във фронтална равнина - 0,54 мм. PEC - 1310 клетки/mm 2, зрителната острота остава стабилна - 0,3. След 1 месец след прилагане на rtPA се наблюдава пълно отзвучаване на фибринозния процес в предната камера, PEC - 1280 клетки/mm 2, зрителна острота - 0,4. Струва си да се отбележи, че през целия следоперативен период, който беше придружен от горната терапия и въвеждането на rtPA в предната камера, присадката остава прозрачна, твърда и е напълно в съседство със задните слоеве на стромата на реципиента (фиг. 2).

заключения

Въз основа на горния клиничен случай можем да заключим, че процесът на резорбция на фибрин в предната камера с еднократно интракамерално приложение на rtPA се ускорява многократно. По този начин, въз основа на нашия собствен клиничен опит, можем да заявим, че използването на рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор е безопасна и ефективна алтернатива за елиминиране на следоперативни фибринозни мембрани. Липсата на нежелани реакции и отрицателни ефекти върху ендотела на роговицата, пълното разрешаване на фибринозния процес под въздействието на rtPA премахва необходимостта от повторни хирургични интервенции, което от своя страна намалява риска от дислокация на присадката и осигурява ускорена зрителна рехабилитация на търпелив. За съжаление, високата цена на това лекарство в повечето случаи изключва използването му в клиниката.

Страница източник: 9

Плазминогенен активатор, урокиназа Обозначения Символи PLAU Entrez Gene ... Wikipedia

I Фибринолитични лекарства (фибрин + гръцки lytikos способен да разтваря; синоним тромболитични лекарства) лекарства, които насърчават разтварянето на вътресъдови кръвни съсиреци и се използват за артериална и венозна тромбоза, както и ... Медицинска енциклопедия

- (от фибрин и гръцки lýsis - разлагане, разтваряне) процесът на разтваряне на кръвни съсиреци и кръвни съсиреци, неразделна част от системата за хемостаза, винаги придружаващ процеса на коагулация на кръвта и култивиран от фактори, участващи в това ... ... Уикипедия

Активна съставка ›› Алтеплаза* (Alteplase*) Латинско наименование Actilyse ATX: ›› B01AD02 Алтеплаза Фармакологична група: Фибринолитици Нозологична класификация (МКБ 10) ›› I21 Остър миокарден инфаркт ›› I74 Емболия и артериална тромбоза… … Речник на лекарствата

Идиограма на 8-мата човешка хромозома 8-мата човешка хромозома е една от 23-те човешки хромозоми, съдържаща около 145 милиона базови двойки, което е от 4,5% до 5% от общия генетичен материал на клетката. За кратък период от време... Уикипедия

ИНФАРКТ НА БЕЛИЯ ДРОБ- пчелен мед Белодробният инфаркт (ИЛ) е хеморагична консолидация на белодробния паренхим в резултат на ПЕ. Етиология и рискови фактори Хиперкоагулационни състояния Полицитемия Сърповидноклетъчна анемия Флебит Дълбока венозна тромбоза на долните крайници ... Справочник на болестите

ИНФАРКТ НА МИОКАРДА- пчелен мед Инфарктът на миокарда (МИ) е остра фокална некроза на сърдечния мускул, дължаща се на абсолютна или относителна недостатъчност на коронарния кръвен поток. В повече от 95% от случаите в основата на МИ е атеросклероза на коронарните артерии, усложнена... ... Справочник на болестите

ОСТРИ ОКЛУЗИИ НА АРТЕРИИ- пчелен мед Острата артериална оклузия е остро нарушение на кръвообращението дистално от мястото на артериална оклузия от ембол или тромб. Състоянието се счита за спешно. Проксимално и дистално от мястото на оклузията се нарушава нормалният кръвен поток, което води до... ... Справочник на болестите

Тъканен тип плазминогенен активатор (t-PA) е серинова протеаза. Той е много специфичен; единственият му доказан субстрат е плазминогенът. Очевидно t-PA е основният физиологичен активатор на фибринолизата в лумена на съда. Основното място на синтеза на t-PA е ендотелиумът. В допълнение към ендотела, t-PA се синтезира в много други клетки: моноцити, мегакариоцити, мезотелиални клетки, васкуларни мускулни клетки, сърдечни фибробласти и др. По-голямата част от плазмения t-PA се свързва с неговия основен инхибитор PAI-1. Както свързаният, така и свободният активатор бързо се отстраняват от кръвния поток от чернодробните клетки.

В допълнение към активирането на фибринолизата, t-PA участва в противовъзпалителни реакции и стимулиране на ендотелната пролиферация. Има доказателства, че t-PA може да активира f.VII.

Функцията на t-PA е свързана с наличието на редица рецептори. t-PA рецепторисе делят на 2 големи групи - активиращи и премахващи.

Активиращите t-PA рецептори са разположени върху клетъчните повърхности и усилват активирането на плазминоген от t-PA. Най-изследваният активиращ t-PA рецептор е Анексин II.Свръхекспресията на анексин II при пациенти с промиелоцитна левкемия води до хиперфибринолиза с хеморагични прояви.

Система за фибринолиза

В групата рецептори, които насърчават елиминирането на t-PA, манозен рецептор и LRP/α2-макроглобулинов рецептор.Първият се намира

Урокиназният плазминогенен активатор (урокиназа, u-PA) се намира в големи количества в човешката урина. Предшественикът на u-PA е протеиновата проурокиназа или scu-PA. Проурокиназата се синтезира в различни клетки. Scu-PA се синтезира особено активно от епителните клетки на бъбречните канали, както и от париеталните клетки на почти всички канали, включително каналите на потните, слъзните и други жлези. В каналите урокиназата е необходима за разграждането на протеиновите компоненти на секретите. Урокиназата изпълнява основната си работа в тъканите, насърчавайки разграждането на извънклетъчния матрикс, което улеснява процесите на клетъчна миграция. Ролята на урокиназата е значителна в много физиологични

единият работи върху мембраната на чернодробните ендотелни клетки и клетките на Купфер, вторият работи върху мембраната на хепатоцитите.

и патологични процеси - зарастване на рани, възпаление, ембриогенеза, метастази на туморни клетки.

Известни са редица други функции на урокиназата в допълнение към активирането на плазминогена. Най-важните от тях са активиране на растежни фактори, модулиране на клетъчната миграция и инвазия и осигуряване на митогенен ефект върху меланомните клетки.

Урокиназен рецептор (u-PAR)открити върху моноцитите. Той насърчава активирането на плазминоген от урокиназа, което е необходимо за участието на моноцитите в разграждането на фибриновия съсирек. Същият рецептор се намира в тромбоцитите. Описани са два рецептора, които елиминират урокиназата и комплекса урокиназа-серпин от кръвния поток.

Други плазминогенни активатори

В допълнение към основните физиологични плазминогенни активатори, споменати по-горе, са описани други физиологични и нефизиологични активатори.

Има доказателства, че f.XIIa може директно да активира плазминогена. Скорост на активиране на плазминогена f.XIIaв сравнение с еквимоларното количество t-PA е 10 пъти по-ниско, но неговото

моларната концентрация в циркулиращата кръв е 5000 пъти по-висока. По този начин ролята на директното активиране на плазминоген f.XIIa може да бъде доста висока. Други известни активатори на плазминоген са стрептокиназа, ста-филокиназа и плазминогенен активатор, изолиран от слюнката на прилепи вампири.

Механизъм на активиране на фибринолизата

При фибринолизата, както и в коагулационната система, има 2 пътя: външен и вътрешен път на активиране на плазминогена (фиг. 57). Външен път

активирането на плазминогена се осигурява главно от тъканен активатор, вътрешният път е урокиназа.

Ориз. 57. Основните връзки на фибринолизата.Образуването на основния фибринолизен ензим, плазмин, възниква под въздействието на фактори на вътрешния или външния път на активиране на фибринолизата. Вътрешният път започва с активирането на проурокиназата. Външният път се определя от влиянието на тъканния плазминогенен активатор (t-PA). Натрупването на свободен плазмин в системното кръвообращение се предотвратява от група острофазови протеини, KK - каликреин, HMK - високомолекулен кининоген, u-PA - урокиназа, Cl-Ing - инхибитор на 1-ви компонент на комплемента, PAI- 1 - инхибитор на тъканен плазминогенен активатор тип 1, PDF - продукти на разграждане на фибрин

Система за фибринолиза

Съдържание на темата "Еозинофили. Моноцити. Тромбоцити. Хемостаза. Система за коагулация на кръвта. Система за антикоагулация.":
1. Еозинофили. Функции на еозинофилите. Функции на еозинофилните левкоцити. Еозинофилия.
2. Моноцити. Макрофаги. Функции на моноцитите - макрофаги. Нормален брой моноцити - макрофаги.
3. Регулиране на гранулоцитопоезата и моноцитопоезата. Фактори, стимулиращи гранулоцитните колонии. Кейлони.
4. Тромбоцити. Структура на тромбоцитите. Функции на тромбоцитите. Функции на гликопротеините. Зона на зол-гел на хиалоплазма.
5. Тромбоцитопоеза. Регулиране на тромбоцитопоезата. Тромбопоетин (тромбоцитопоетин). Мегакариоцити. Тромбоцитопения.
6. Хемостаза. Механизми на кръвосъсирването. Тромбоцитна хемостаза. Тромбоцитна реакция. Първична хемостаза.
7. Система за кръвосъсирване. Външен път за активиране на кръвосъсирването. Фактори на кръвосъсирването.
8. Вътрешен път за активиране на кръвосъсирването. Тромбин.
9. Антикоагулантна кръвна система. Антикоагулантни механизми на кръвта. Антитромбин. Хепарин. протеини. простациклин. Тромбомодулин.
10. Тъканен плазминогенен активатор. Ектоензими. Ролята на ендотела в антикоагулантната система. Тъканен фактор. Инхибитор на плазминогенния активатор. фактор на фон Вилебранд. Антикоагуланти.

Тъканен плазминогенен активатор. Ектоензими. Ролята на ендотела в антикоагулантната система. Тъканен фактор. Инхибитор на плазминогенния активатор. фактор на фон Вилебранд. Антикоагуланти.

Тъканен плазминогенен активаторе протеин, възпроизвеждан и постоянно секретиран от съдовия ендотел. Осигурява директна локална тромболитична активност срещу образувания тромб. В кръвта се поддържа постоянно ниво на този фактор, което осигурява системна тромболитична активност на кръвта.

Ектоензими- Това са произвежданите от ендотелиума ADPase, ATPase и аденозин-конвертиращия ензим. Ендотелната ADP-аза бързо разгражда проагреганта ADP, секретиран от активираните тромбоцити.

Съдови ендотелни клеткисинтезират и протромботични фактори: тъканен фактор, инхибитори на плазминогенния активатор, фактор на фон Вилебранд.

Ориз. 7.11. Ролята на ендотела на кръвоносните съдове в коагулацията на кръвта.Под надписа "Антикоагуланти" са ендотелни фактори, които имат антикоагулантен ефект поради инхибирането на тромбоцитната агрегация, образуването на фибринов съсирек и активирането на фибринолизата. Под наименованието "Прокоагуланти" са посочени ендотелни фактори, участващи в образуването на тромбоцитен тромб, фибринов съсирек и потискане на фибринолизата (

Тъканен факторе сложен протеин на клетъчната мембрана с тегло 46 kDa. Когато една клетка е увредена, част от нейната молекула се свързва здраво с коагулационния фактор Vila, поддържайки функцията му на ускорител във външния път на коагулация.

Инхибитор на плазминогенния активатор-I е 52 kDa протеин, открит в циркулиращата кръв. Свързвайки се тясно с активатора на плазминогена, той го инактивира, като по този начин участва в регулацията на фибринолизата в организма.

фактор на фон Вилебранде многоизмерна молекула с тегло 1-20 милиона Da, синтезирана от ендотела и съхранявана в ендотелни секреторни гранули. Освободен от тях, той функционира като адхезивна молекула за тромбоцитите и подпомага тяхната агрегация. Повишено освобождаване на фактора на фон Вилебранд от ендотела се индуцира от тромбин.

Съсирване на кръвта в съдГладката повърхност на ендотела също предотвратява включването на вътрешния път за образуване на активна протромбиназа. Мономолекулен протеинов слой, адсорбиран върху повърхността на ендотела, отблъсква факторите на кръвосъсирването и тромбоцитите и също така предотвратява съсирването на кръвта.

Антикоагулантиизползвани в клиничната практика. Например, за намаляване на повишеното съсирване на кръвта при пациенти с коронарна болест на сърцето, за поддържане на кръвта в течно състояние при използване на кардиопулмонален байпас, причинявайки травма на кръвните клетки, в резултат на което се активира вътрешният път на кръвосъсирването.

Изобретението се отнася до нов подобрен тъканно активен плазминоген (подобрен TPA), имащ удължен полуживот в тялото и повишена устойчивост на топлина и киселини, който може да се използва за потискане на възпалението около зоната на тромбоза. Изобретението също така се отнася до метод за производство на споменатия тъканен плазминогенен активатор с помощта на рекомбинантна ДНК технология и средствата, използвани за нейното прилагане. Известно е, че човешкият тъканен плазминогенен активатор (TPA) има благоприятна фибринолитична активност и е изключително ефективен срещу фибрин-свързания плазминоген, докато той не активира плазминогена във фазата на свободна циркулация в тялото толкова ефективно, колкото конвенционалните тромболитични агенти, стрептокиназа (SK ) и урокиназа (UK). Аминокиселинната последователност на човешки APT и нуклеотидната последователност на cDNA, кодираща човешки APT, са известни (Pennica. D., et al., Nature, 301, 214-221, 1983). Известно е също, че човешкият APT разтваря венозни и артериални кръвни съсиреци. Големи клинични изпитвания показват, че човешки APT, приложен интравенозно, е ефективен при реперфузия на запушена коронарна артерия при пациент с остър миокарден инфаркт. Въпреки това, недостатъкът на използването на това лекарство при лечението на заболяване, свързано с образуването на тромби, е изключително краткият полуживот на неговата ензимна активност в кръвта (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, E.F., et al., Blood, 65, 539, 1985). Когато се използва за лечение, човешкият APT трябва да се прилага като продължителна интравенозна инжекция с високи дози. Известно е, че естествено срещащият се човешки APT има доменна структура, започвайки от N-края на молекулата, има пръстов домейн, EGF домейн (епидермален растежен фактор), два домейна „крингъл 1” и „крингъл 2” и серин протеазен домер. В работата на Rijken et al. се отбелязва (Rijken D.C., et al., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), че краткият биологичен полуживот на човешки APT може да бъде свързан с всички области на човешки APT, с изключение на протеазите на сериновия домен. Работата на Zonneveld et al. (Zonneveld, A.J.V., et al, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) също така отбелязва, че пръстовият домейн, EGF домейнът и крингъл 2 домейнът могат да бъдат важни за фибрин-свързващата активност на естествено срещащи се човешки APT, а също и за поддържане на фибрин-зависимото активиране на APT. Въпреки това, все още не са разработени специфични мерки за поддържане на фибрин-свързващата активност на естествено срещащия се човешки APT и неговата фибрин-зависима активност, както и за удължаване на биологичния полуживот. Публикуваната японска патентна заявка Laid-Open No. 48378/1987 описва APT, получен чрез изтриване на аминокиселини 87-175 от естествено срещащ се човешки APT, в който "kringle 1" е изтрит. Този APT се отличава с допълнителна индуцирана точкова мутация в областта на епидермалния растежен фактор. Японската патентна заявка разкрива, че модифицираният APT има способността да се свързва с фибрин, но взаимодействието с инхибитора на тъканния плазминогенен активатор е отслабено. Европейски патент No. 241208 описва APT, получен чрез изтриване на аминокиселини 92-179 от естествено срещащ се човешки APT, в който "крингъл 1" също е изтрит. Тази работа споменава, че този APT има фибринолитична активност. В допълнение, Европейски патент No. 231624 разкрива модифициран APT с удължен полуживот. Модифицираният APT, притежаващ последователността F-EGFK2-A, няма домейн kringle 1, но не е показан специфичен метод за неговото получаване. В светлината на горното, ясно е, че модифицираният APT в съответствие с изобретението трябва да се различава от естествено срещащия се APT в аминокиселинната последователност в областта на вътрешните домени. В резултат на задълбочени изследвания кандидатът е получил подобрен APT, който съдържа пръстов домейн, EFR домейн, крингъл 2 домейн и серин протеазен домейн, но първият „крингъл 1“ домейн е изтрит в конкретен сайт, и в мястото на свързване на домейна е въведена мутация на крингъл 2 и серин протеаза, което води до подобрен APT, който проявява превъзходна устойчивост на топлина и киселина, подчертано удължен биологичен полуживот и значителна противовъзпалителна активност, като същевременно запазва желаните свойства на естествено срещащ се човешки APT. Изобретението се отнася до подобрен APT. APT съгласно изобретението е значително различен по своята химична структура от естествено срещащия се човешки APT и проявява превъзходни свойства. Подобреният APT съгласно изобретението е полипептид, имащ аминокиселинна последователност, представена от общата формула, показана на ФИГ. 28-29, където R е директна връзка, Y е A-Ile-B (A е Arg или Glu и B е lys или Ile), за предпочитане Glu-Jle-Lys. H2N означава амино края и -COOH означава карбокси края). В изобретението терминът "подобрен APT" се използва за обозначаване на аналог на APT, в който А и В представляват аминокиселините, описани по-долу, съответно:

Подобрен APT (II): Arg, Lys;

Разширен APT (V): Arg, Ile;

Разширен APT (VI): Glu, Lys;

Подобрен APT (VIII): Glu, Ile. Изобретението също така е насочено към експресията на предложения аналог на APT с помощта на рекомбинантни ДНК техники. Свързани с това са нови ДНК, кодиращи подобрени APT и рекомбинантни ДНК експресионни вектори. Фигури 1, 2 показват последователността от 16 олигодезоксинуклеотиди, използвани за конструиране на фрагмент от синтетичен ген, кодиращ подобрен APT (II); на фиг.3 - 4 - фрагмент от синтетичен ген за конструиране на подобрен APT (II) от изобретението, съдържащ краищата на рестрикционните ензими Bge 11 и Eco R1, който е конструиран с помощта на 16 олигодезоксинуклеотиди, показани на фиг.1 - 2 ; Фиг. 5 - метод за конструиране на подобрен APT (II) (на фигурата черната зона, защрихованата зона и незащрихованата област показват региона, кодиращ съответно зрелия APT протеин, региона, кодиращ пропропептида и нетранслирания регион; Фиг. 6 - метод за тестване на фрагмент от синтетичен генен блок IV чрез определяне на последователността на ДНК базите с помощта на дидезокси метода и метода 7-DEAZA на фиг интегриране на ДНК на подобрения APT в pVY1; на Фиг. ) и подобрен APT (V); Фигура 20 - рестрикционни ензими и функционална карта на плазмид pTPA 2, имащ фрагмент Eco R1-Xho (около 1000 базови двойки) на естествения APT ген, интегриран във вектора pBR322 при Eco R1 и Bam H1 места на разцепване; Фиг. 21 - mp9 (подобрен APT (II), имащ фрагмент BgL11-Xho 11 (около 1500 базови двойки) на гена, подобрен APT (II), интегриран в двойноверижна ДНК M13 mp9 в мястото на разцепване BamH1; Фиг. 22 - зависимост "доза-ефект" за APT активността на подобрения APT (VI) и естествено срещащия се APT с помощта на метода S-2251 в присъствието (+Fb) и отсъствието (-Fb) на фибринов заместител Фиг. 23 - промяна в активността на подобрения APT (VI) и нативния APT в кръвта на заек с течение на времето Фиг лимфоцитен активиращ фактор (LAF) чрез подобрен APT (VI); 27 - разграждане на денатуриран протеин под въздействието на подобрен APT (VI). Методът за получаване на рекомбинантна ДНК и трансформирани клетки е описан подробно по-долу. Метод за получаване на подобрен APT. Генът, кодиращ естествения APT, от който произлиза APT от настоящото изобретение, се изолира от cDNA банка, получена от човешки меланомни клетки на Bowes. Поли А+ РНК се изолира от човешки меланомни клетки на Bowes и се фракционира чрез центрофугиране в градиент на плътност на захароза. След това се избира малко количество фракционирана поли(А) + РНК и тРНК фракцията, кодираща APT гена, се идентифицира чрез точкова хибридизация с помощта на олигонуклеотидна проба, способна да разпознае специфична APT иРНК последователност. Като се използва тази богата на APT mRNA фракция като изходен материал, cDNA банка се приготвя и скринира с помощта на сондата за идентифициране на APT mRNA, описана по-горе. Тъй като не е изолиран нито един клон, който да има пълната последователност на APT гена, липсващата базова последователност се синтезира с ДНК синтезатор, за да се получи желаният ген. След това желаният ген се конструира чрез индуциране на специфична за мястото мутация. Фрагментът Eco R1-Xho 11 се среща естествено в APT гена (около 1000 базови двойки), част от който е изтрит в N = края, въведен във вектора pBR332 в местата на разцепване Eco R1 и BamH1, което води до pTPA2. Щамът (E. coli HB 101/pTPA2), получен чрез трансформиране на E. coli с този плазмид, е депозиран в Института за изследване на ферментацията към Агенцията за индустриални науки и технологии на Япония под регистрационен номер P-9649 (FERM BP-2107). Рестрикционната и функционална карта на плазмид pTPA2 е показана на Фиг. 20. Подобреният APT ген се вмъква в pVY1 плазмида. Плазмидът pVY1 се получава чрез лигиране на BamH1-Kpn1 фрагмента (около 2900 базови двойки) на плазмид pRSV10 (произведен от Fine Chemicals) с фрагмента от Eco R1 смилане на плазмид pAdD26SV (A) N 3 (N) (получен от д-р Hiroshi Handa от Университета на Токио (след получаване в двата тъпи края. Съответно, този вектор съдържа сДНК на миши дихидрофолат редуктазен ген под транскрипционния контрол на основния късен промотор на аденовирус (Ad2), ранния промотор SV 40 нагоре по веригата на мястото на вмъкване на подобреният APT ген и интронът и полиаденилиращата последователност, разположени след гена от изобретението, могат да бъдат вмъкнати в друг подходящ експресионен вектор. Експресионният вектор се въвежда допълнително в подходяща гостоприемна клетка за получаване на трансформанти. Като клетки гостоприемници могат да се използват прокариотни клетки като Е. coli, Bacillus subtilis и др., еукариотни микроорганизми като дрожди и др., и клетки от висши животни. Като представител на Е. coli обикновено се използват щам JM109, щам W3110, Q и т.н., принадлежащ към щам К12, а щам BD170, щам BR151 и т.н. се използват като представител на Bacillus subtilis. От дрождите можете да използвате щам RH218, щам SHY1 и др. дрожди Saccharomyces cerevisiae. За експресия обикновено се използва плазмиден вектор или фагов вектор, съдържащ репликон, получен от вид, съвместим с клетките-гостоприемници, и регулаторна последователност. Примери за вектор за Е. coli са, например, плазмидите pBR322, pUC18, pUC19 и т.н., фаг, например qt, Charon 4A и т.н., фаг М13 и т.н. pUB110 може да се използва като вектор за Bacillus subtilis , pSA2100 и т.н. и YRp7, YEp61 и т.н. могат да се използват като вектор за дрожди. Векторът трябва да носи промотор, способен да експресира желания протеин. Като промотор за ген на Е. coli или ген на фаг могат да се използват например Lae, trp, tac, trc, pL и т.н. Като гостоприемник, култивирани животински клетки като бъбречни клетки на маймуна резус, клетки от ларви на комари, бъбречни клетки на африканска зелена маймуна, фетални фибробластни клетки на мишка, клетки от яйчници на китайски хамстер, бъбречни клетки на човешки фетали, тъканни клетки от яйце на пеперуда, клетки, подобни на човешки цервикален епител могат да се използват клетки, човешки миеломни клетки, миши фибробласти и т.н. Като вектор можете да използвате SV40 ранен промотор, SV40 късен промотор, SV40, носещ промотор от еукариотен ген (например естроген-индуцируем птичи овалбумин ген, интерферон ген, глюкокортикоид-индуцируем тирозин аминотрансферазен ген, тимидин киназен ген, ранен и късни аденовирусни гени, фосфоглицерат киназен ген, факторен ген и т.н.), говежди папилома вирус или вектори, получени от тях. В допълнение, известно е, че APTs, секретирани и произведени от клетки, имат различни N-краища в зависимост от разликите в местата на разцепване. В случай на APT секреция и производство при използване на културни клетки като гостоприемник, методът на разцепване на сигнална пептидаза или протеаза варира в зависимост от клетъчния тип, така че могат да се получат APT видове, имащи различни N-краища. Това явление е подходящо не само за случай на секреция и производство с помощта на културални клетки, тъй като се смята, че подобно явление може да възникне и при получаване на APT чрез Е. coli, Bacillus sublitis, дрожди и други клетки, подложени на специална модификация. За трансформация на гостоприемник с помощта на експресионен вектор с подобрен APT ген, интегриран в него, в случая на Е. coli, може да се използва методът на Hanahan, Hanahan, D.J.Mol. Biol., 166, 557, 1983), в случай на манипулиране на животински клетки може да се използва методът с калциев фосфат (Vander Eb, A.J. и Graham, F.L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) и скоро. Както е описано по-горе, подобреният APT е полезен за лечението на различни придобити заболявания, включително съдова коагулация (дори дълбока вена), белодробна емболия, периферна артериална тромбоза, сърдечна или периферна артериална емболия, остър миокарден инфаркт и тромботичен пристъп. Подобно на естествено срещащия се човешки APT, подобреният APT е особено подходящ за лечение на остър миокарден инфаркт. Естествено срещащият се човешки APT наскоро показа, че е ефективен при разтваряне на запушващ коронарната артерия тромб, регенериране на миокардна перфузия и възстановяване на повечето части в исхемичния миокарден слой, когато се прилага интравенозно в доза от 30 до 70 mg за 1 до 3 часа. Подобреният APT има удължен биологичен полуживот в кръвта и следователно е ефективен в същите случаи като естествено срещащия се при хора APT. Очаква се, че подобреният APT може да доведе до клиничен ефект, подобен на естествено срещащия се при хора APT в доза от около 10% от дозата, препоръчана с естествено срещащ се човешки APT, дори когато се прилага като единична доза. В допълнение, подобреният APT от настоящото изобретение проявява следните ценни свойства, които досега бяха неизвестни за нативния човешки APT и модифицирания APT. а) Противовъзпалителна активност. На мястото на тромба се открива не само образуването на самия тромб, но и образуването на продукти от разграждане на фибрин или следи от кинин. Известно е, че тези вещества имат активност, предизвикваща възпаление и по този начин причиняват възпаление в областта на тромба. Поради тази причина е желателно агентът, използван за лечение на тромбоза, да има не само тромболитична активност, но и противовъзпалителна активност. В резултат на изследването заявителят успя да придаде противовъзпалителна активност на подобрения APT въз основа на две функции. Една от тях е, че подобреният APT инхибира биологичната активност на интерлевкин 1 (IL-1), който е един от медиаторите на възпалителния отговор. Смята се, че IL-1, продуциран от макрофага, участва във възпалителния отговор чрез хипертермия, ускоряване на растежа на фибробластите, производство на колагеназа в синовиалната клетъчна мембрана и т.н., или чрез ускоряване на синтеза на простациклин в съдовите ендотелни клетки. Известно е също, че IL-1 действа върху чернодробните клетки, за да ускори производството на протеини (серумен амилоиден протеин, фибриноген и др.) в острата фаза, което се увеличава с възпаление. Заявителят е открил, че подобреният APT инхибира активността (LAF активност), за да увеличи митогенната реактивност на миши тимоцити, което е една от биологичните активности на IL-1. Друга функция е, че напредналият APT има афинитет към денатуриран протеин (денатуриран имуноглобулин G, денатуриран албумин и т.н.), резултат от възпаление на мястото на тромба, и освен това има свойството да се активира от този денатуриран протеин. Благодарение на тази активност, подобреният APT разгражда само денатурирания протеин в зоната на възпалението и възпалението може временно да бъде облекчено. Заявителят потвърди чрез електрофореза с натриев додецилсулфат гел, че подобреният APT разгражда само денатуриран протеин. Както е показано на фиг. 26, активирането и селективността на подобрения APT от денатуриран протеин е очевидно. При имуноглобулин G, третиран с НС1, и при няколко пъти по-ниски концентрации, се показва същата активност, както при фибриноген, третиран с BrCN. От друга страна, нормалният имуноглобулин С не проявява активиращ ефект срещу подобрен APT дори при концентрация от 500 μg/ml. Предотвратяване на повторно запушване след възстановяване на перфузията към запушен кръвоносен съд. Известно е, че при лечение на тромбоза с естествен APT се наблюдава повторно запушване с висока честота след възстановяване на притока на кръв към запушения кръвоносен съд. Поради тази причина комбинираната терапия се провежда с инхибитор на тромбоцитната коагулация или антикоагулант. Комбинираната терапия обаче включва проблеми с лекарствените взаимодействия, контрола на дозата, подобни ефекти и т.н. За предпочитане самият APT допълнително има активност за предотвратяване на повторна оклузия. Подобреният APT от настоящото изобретение има способността да предотвратява събития на повторно запушване чрез два вида активност. Първият тип е предотвратяване на бързото намаляване на концентрацията на APT след въвеждането на подобрен APT поради удължената продължителност на действие, което води до елиминиране на знака Stewart-Holmes и по този начин предотвратява появата на повторна оклузия. Вторият тип е, че чрез предотвратяване на индуцирано от IL-1 увреждане на васкуларни ендотелни клетки, тромбоцитната коагулация се инхибира косвено, като по този начин се предотвратяват събития на повторно запушване. в) Повишена стабилност. Протеиновите препарати обикновено са нестабилни, затова е препоръчително препаратите да се съхраняват в замразено сухо състояние или при ниски температури под формата на разтвор. При прилагане на плазминогенен активатор на пациент с остър инфаркт на миокарда е необходимо процедурата да се извърши в рамките на няколко часа след началото на атаката, за да се намали смъртността. В този случай са желателни стабилни препарати, които могат да се съхраняват при стайна температура. В допълнение, повишената стабилност позволява топлинна обработка, киселинна обработка и т.н. по време на приготвянето на лекарства. По-специално, по отношение на подобрения APT от настоящото изобретение, който се произвежда от клетъчни култури, става възможно да се отстрани ретровирус, получен от клетка, за който е известно, че е чувствителен към топлина. Изобретението е описано по-долу по-конкретно с позоваване на примери, но не се ограничава до тях. Освен ако не е посочено друго, рекомбинантната ДНК се произвежда съгласно лабораторните указания. Maniatis T et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Ню Йорк (1982). Пример 1. Клониране в APT ДНК. Bowes човешки меланомни клетки (закупени от д-р Roblin, R., Национален институт за изследване на рака, САЩ) се култивират съгласно метода на Opdenakker et al. (Opdenakker, G., et al., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). За да се индуцира APT иРНК, TPA (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат) се добавя към културалната смес при крайна концентрация от 100 ng/ml, последвано от култивиране за 16 часа. След това общата клетъчна РНК се екстрахира от култивирани клетки съгласно модифициран метод на Freeman et al. ((Okayama) Berqa DNA Manual, стр. 3, 1985, Pharmacy Fine Chemicals). Използвайки олиго-dT целулозна колона (произведена от Pharmacia Fine Chemicals), поли(А) + РНК се отделя от общата клетъчна РНК. В резултат на това се получават около 400 μg поли(А) + РНК от приблизително 10 o клетки. Тази поли(А) + РНК се фракционира чрез центрофугиране в градиент на плътност на захароза по конвенционален начин. Селектира се част от фракционираната поли(А) + РНК и се извършва дот блот хибридизация (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc), използвайки олигонуклеотидна проба, специфична за APT иРНК . Пробата (сонда Y), използвана тук, има базовата последователност 5"-GCNNGGCAAAGATGGCA-3", която е комплементарна на областта на mRNA, кодираща аминокиселинни остатъци +291 до +297 в APT последователността, описана от Pennicaetal, и се синтезира от -цианофосфамидатният метод, използващ ДНК синтезатор, модел 380A, (произведен от Applied Biosystems). Синтезът на ДНК олигомер, премахването на защитата, разцепването на смолата и пречистването се извършват в съответствие с ръководството за употреба на ДНК синтезатора, модел 380А. Радиомаркирането на Y сондата в 5" края се извършва в съответствие с лабораторното ръководство, като се използва Т4 полинуклеотидна киназа (произведена от Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) и -(32 P) ATP. Y сондата хибридизира силно, главно с 20-30S поли(А) + РНК (тази фракция се нарича М фракция). С помощта на матрицата се получават 10 μg поли(А) + РНК; синтезират се 3 μg двойноверижна сДНК използвайки обратна транскриптаза (произведена от Biochemical Industry Co., Ltd.) в съответствие с метода на Gubler-Hoffman (Gubler, U. and Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983) и добавен към двойноверижната cDNA при 3" край на дезокси С-веригата в съответствие с метода на Denq-Wu (Denq, G.R. и Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). Двуверижната сДНК, удължена с дезокси С верига, след това се подлага на гел филтрация върху Sepharose CL 4B (произведен от Fine Chemicals) за отстраняване на нуклеинови киселини с ниско молекулно тегло, имащи по-малко от 500 базови двойки. cDNA след това се отгрява с pBR322 (произведен от Bethesda Research), съдържащ дезокси G верига в P st 1 мястото, като се използват конвенционални техники. Сместа, получена след отгряване, се трансформира в компетентни клетки HB101 E. coli (произведени от Takara Shuzo Co. , Ltd). Резултатът е cDNA банка, състояща се от приблизително 4000 независими трансформанти. Тази сДНК се подлага на хибридизация на колонии, като се използва Y сондата, описана по-горе, съгласно метода на Woods (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, Bethesda Research Lab.), като се получават клонове, които реагират с Y сондата Сред клоновете се идентифицира pTPA1 клонингът, съдържащ най-дългата APT cDNA. След това се провежда дидезокси методът (Carlson, J., et al., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), като се използва фагов вектор M13 и методът 7-DEAZA (Mizusawa S., et al., Nucleis Acids Res., 14, 1319, 1986). В резултат на това беше установено, че плазмидът pTPA1 съдържа базовата последователност от T y+441 до A y+2544 за APT гена, описан от Pennicaetal. Пример 2. Проектиране на подобрен APT (II). В плазмид pTPA1, показан в Пример 1, N-терминалният участък е недостатъчен за конструиране на подобрен APT (II), на който липсва крингъл 1 домейн. Следователно, дефицитният ДНК сегмент се синтезира, както е описано по-горе, като се използва 380A ДНК синтезатор (произведен от Applied Biosystems). Базовата последователност на синтезирания олигомер и пълната синтезирана последователност са показани на ФИГ. 1-4. Специфични техники за конструиране на подобрен APT (II) с помощта на тези олигомери са показани на ФИГ. 5-6. 2-1). Изграждане на блок IV (Bql II-Eco R1 фрагмент, около 480 базови двойки). Фрагмент от блок IV на фиг. 5 се получава по следния начин. Първо, съгласно лабораторното ръководство, 40 pmol всеки от синтетичните олигонуклеотиди 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, показани на ФИГ. 1-2 бяха фосфорилирани с 10 единици Т4 полинуклеотидна киназа (произведена от Takara Shuzo Co., Ltd.) при 37°C за един час в 50 μl реакционен разтвор за всяка. Реакционният разтвор се третира с фенол. След утаяване с етанол, утайката се изсушава при понижено налягане и се разтваря в стерилна дестилирана вода. След утаяване на 40 pmol от всеки олигомер в 150 μl разтвор, съдържащ 6 mM Tris-HCl (рН 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 и 0,1 mM EDTA, при температура 80 o C в продължение на 5 минути, при температура 60 o C за 5 минути и при стайна температура за един час, в съответните блокове от блок I (олигомери 1, 2, 3 и 4), блок II (олигомери 5, 6, 7, 8, 9 и 10) и блок III (олигомери 11, 12, 13, 14, 15 и 16) извършват утаяване с етанол и сушене при понижено налягане. Остатъкът се разтваря в 40 µl стерилна дестилирана вода. Реакцията се провежда в 400 μl реакционен разтвор при 4°С в продължение на 15 часа, като се използва комплект за лигиране на ДНК (произведен от Takara Shuzo Co., Ltd.). След утаяване с етанол и изсушаване при понижено налягане, утайката се разтваря в стерилна дестилирана вода: в случай на блок I (1) се извършва гел електрофореза в 5% полиакриламид (лабораторен наръчник), отделя се и се пречиства по традиционния начин (лабораторно ръководство), фрагментирайте около 100 базови двойки, а в случай на блок II (2) и блок III (3), гел електрофореза се извършва в 3% агарозен гел (LMP агароза, произведена от BRL) (лабораторен наръчник ) и фрагменти от около 190 двойки се изолират и пречистват чрез електроелуиране (лабораторен наръчник). След това, 0.1 μg, 0.2 μg и 0.2 μg от блок I, блок II и блок III фрагменти, съответно, бяха лигирани с помощта на горния комплект за лигиране на ДНК. Провежда се гел електрофореза при концентрация на агароза от 1.5%, за да се изолира Bgl II-Eco R1 фрагмент (блок IV) с размер около 480 базови двойки. След това ДНК се изолира от агарозния гел с помощта на електроелуиране. След това тази ДНК се фосфорилира в 100 μl реакционен разтвор при 37°С за един час, като се използват 10 единици от горната Т4 полинуклеотидна киназа, след което се третира с фенол, утаява се с етанол и се изсушава при понижено налягане. Този синтетичен генен фрагмент и базовата последователност на блок IV се потвърждават чрез определяне на базовата последователност съгласно дидезокси метода, като се използва М13 фагов вектор. Специфични техники са показани на ФИГ. 6. След лигиране на описания по-горе Bgl II-Eco R1 фрагмент от блок IV с M13 mp18 ДНК (произведено от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.), усвоено с рестрикционни ензими BamH1 (произведено от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd. .) и Eco R1 (произведен от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) неговата базова последователност се определя с помощта на комплект за секвениране M13 (произведен от Taraka Shuzo K., Ltd.) и комплект за секвениране 7-DEAZA (произведен от Takara Shuzo Co., Ltd.). Мястото на разцепване на рестрикционния ензим Bgl11 и мястото на разцепване на рестрикционния ензим BamH1 са лигирани в изохимерна подредба през (BamH1 - Bgl11 крайно място на разцепване) и лигираният фрагмент може да бъде разцепен от рестрикционния ензим Xho 11, което води до естествения Bgl 11 и Bamh1 разцепването завършва съответно. За по-точно определяне на базовата последователност, щамът E.cjli JM109 се заразява с фаг М 13mp18 (включително фрагмент от блок IV) в съответствие с метода на Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983 г.). )), след което се получава двойноверижна ДНК (репликативен тип). След смилане на тази ДНК (50 μg) с рестрикционните ензими Xho 11 (произведени от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) и Eco R1, беше извършена гел електрофореза върху 1,5% агарозен гел за изолиране на фрагмент (блок IV) от около 480 бази двойки. Тази ДНК се екстрахира чрез електроелуиране. След лигиране на екстрахираната ДНК с M13mp19 ДНК (произведена от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), усвоена с Eco R1 и BamH1 рестрикционни ензими по същия начин, както е описано по-горе, базовата последователност се определя с помощта на комплект за лигиране на ДНК. Както е описано по-горе, тази последователност може да бъде проверена по-точно чрез секвениране на двете ДНК с помощта на M13mP18 и M13mp19. В допълнение, M13mp19 двойноверижна репликативна ДНК (с блок IV) беше получена по описания метод. След смилане на тази ДНК (50 μg) с рестрикционни ензими Eco R1 и Xho 11 се извършва гел електрофореза в 1,5% агароза, като се изолира фрагмент (блок IV) с размер около 480 базови двойки. 2-2). Изолиране на блок V (Eco R1-Bal1 фрагмент, около 1250 базови двойки). От pTRA1 клонинга, получен в Пример 1, се изолира плазмидна ДНК в големи количества съгласно метода, описан в лабораторното ръководство, както е показано на ФИГ. 5. След смилане на 70 μg от тази ДНК с рестрикционните ензими Bal1 (произведени от Takara Shuzo Co., Ltd.) и Nar1 (произведени от Nirro Gen Co., Ltd.), се извършва електрофореза в 0,8% агарозен гел, изолиране на Nar1-Bal1 фрагмента (около 1540 базови двойки). ДНК се изолира чрез електроелуиране. След допълнително частично смилане на тази ДНК с рестрикционния ензим Eco R1, се извършва електрофореза върху 0,7% агарозен гел, като се изолира Eco R1-Bal1 фрагмент (около 1250 базови двойки). ДНК се изолира чрез електроелуиране. 2-3). Конструиране на подобрен APT ген (II) от блок IV и блок V. Както е показано на ФИГ. 5, подобреният APT ген се получава както следва. След допиране на блок IV (фрагмент Bgl11-Eco R1, около 480 bp), получен в пример 2-1 с блок V (фрагмент Eco R1-Bal1, около 1250 bp), получен в пример 2-2, като се използва комплектът за ДНК допинг, описан по-горе, добавеният продукт се подлага на утаяване с етанол. След изсушаване при понижено налягане, утайката се усвоява с рестрикционния ензим Xho 11 по конвенционален начин. След това се извършва електрофореза в 0.8% агарозен гел, за да се изолира фрагментът Bgl 11-Xho 11 (около 1500 базови двойки, съдържа гена за подобрен APT). След това ДНК се изолира чрез електроелуиране. Пълната базова последователност на подобрения APT ген (II), получена по този начин, е показана на ФИГ. 8-13. Изведената аминокиселинна последователност също е показана на ФИГ. 14-19. Пример 3. Конструиране на ген за подобрен APT V, VI и VIII. Конструирането на подобрения APT ген V, VI или VIII се извършва на базата на подобрения APT ген (II) с позоваване на следващите публикации. Генетичното преобразуване се извършва чрез индуциране на специфична за мястото мутация. Публикации: Zoller M.J. and Smith.M., Method in Fermentology, 100, стр. 468-500 (1983), Zoller M.J. and Smith. M. DNA, 3, стр. 479-488 (1984 г.), Morinaga Y. et al. Biotechnology, стр. 636-630 (юли 1984 г.), Adelman J. P. et al., DNA, 2, стр. 183-193 (1983 г.). ), 6. Ръководство за секвениране на M13 (puC), публикувано от Gene Science Room Co., Ltd.). 3-1). Конструиране на подобрен APT ген (V). A) Създаване на M13mp19 (APT/P/) за мутация. Подобреният APT генен фрагмент (II), описан подробно в Пример 2, 2-3), се лигира към M13mp9 двойноверижна ДНК, обработена с BamH1 рестрикционен ензим и алкална фосфатаза (произведено от Takara Shuzo Co., Ltd.). Продуктът на лигиране се трансфектира в Е. cjli JM109 компетентни клетки (произведени от Takara Shuzo Co., Ltd.). Всеки клон, който произвежда безцветно, стерилно петно, се използва за заразяване на E. Coli JM109. Едноверижна ДНК се изолира от супернатантата на културата, а двойноверижна (репликативна) ДНК се изолира от E. cli клетки в съответствие с метода на Messing (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, стр. 20-78, 1983 г. ). Чрез анализиране на природата на тези двойноверижни ДНК, след смилане с рестрикционния ензим Pst1 чрез електрофореза в агарозен гел, се получава клонинг mp9 (подобрен APT(II)), в който APT(II) генът е вмъкнат в mp9 ДНК в желаната посока, както е показано на Фиг. 21. След разцепването на част от тези ДНК с рестрикционния ензим Pst се извършва чрез електрофореза върху 0,8% агарозен гел, където клонът mp9 (подобрен APT (II) показва проста лента в позиции 7300 bp, 840 bp, 430 bp и 80 bp, приблизително Едноверижна ДНК от този клон се използва в последващ експеримент за индуциране на специфична за сайта мутация. B) Синтез на праймер, способен да индуцира сайт-специфична мутация. Синтетичният олигонуклеотид, използван за индуциране на сайт-специфична мутация в подобрения APT (II) ген, се синтезира чрез метода на а-цианоетил фосфоамидат, като се използва модел 380 A ДНК синтезатор (произведен от Applied Biosystems). Синтезът на ДНК олигомера, отстраняването на защитната група, отцепването от смолата и пречистването се извършват в съответствие с инструкциите за работа на ДНК синтезатора 380 A. За индуциране на мутация на специфично място, праймер (1), способен да индуциране на сайт-специфична мутация и праймер (2) са получени за дидезокси секвениране, използвайки М13 фагов вектор (J. Carlson et al., Journal of Biotechnology, 1, p. 253, 1984). Дадени са аминокиселинните и нуклеотидните последователности за подобрения APT (II). Праймер (1), способен да индуцира мутация, се различава по подчертаната основа от генната последователност на подобрения APT (II) (виж Таблица 1). В) Индукция на сайт-специфична мутация. По-долу е даден метод за създаване на клонинг, съдържащ базовата последователност на праймер (1), способен да произведе мутация, а именно подобрения APT ген (IV). След отгряване (ренатурация) на едноверижна ДНК, описана в пример 3.3-1), A) клонинг mp9 (подобрен APT (II) и праймер (1), ренатурационният продукт се превръща в двойноверижна ДНК, която след това се трансформира в E. coli JM109 След това, като се използва праймер за секвениране, ДНК последователностите се изолират, като се изолира фагов клонинг, носещ подобрен APT ген (II), а именно подобрен APT ген (V). от този клон и се изолира подобреният APT ген (V). 5"-терминално фосфорилиране на синтетичния олигомер. Праймер ДНК (1) за индуциране на сайт-специфична мутация се фосфорилира по метода, описан в пример 2.2-1. Получаване на хетеродуплекс DHE. 0,5 μg едноверижна ДНК M13mp9 (подобрен APT (II). )) и 1,5 μg двойноверижна ДНК M13mp9, усвоени с рестрикционния ензим BamH1, се нагряват в 30 μg разтвор, съдържащ 2 pmol фосфорилиран праймер (1) 10 mM Tris-HCl (рН 7,5), 0,1 mM EDTA и 50 mM NaCl, при 90 o C (2 минути), 50 o C (5 минути), 37 o C (5 минути) и при стайна температура ( 10 минути). Добавете към разтвора 36 μl от 50 mM разтвор на Tris-HCl (pH 8,0), съдържащ 4 единици ензим Klenow, 7 единици T4 фагова ДНК лигаза, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl 2, 10 mM дитиотреитол, 0,7 mM ATP, 0.07 dATP и 0.2 mM всеки от dGTP, dTTP и dCTP за стимулиране на удължаването на праймера. Сместа реагира при температура 20°С в продължение на 2 часа и при температура 4°С в продължение на 15 часа. Трансформацията се извършва, като се използва разтворът, описан по-горе, и компетентни Е. coli JM109 клетки (произведени от Takara Shuzo Co., Ltd.), докато се образуват лизисни петна. След като безцветното петно ​​се отдели, фагът се заразява с Е. coli JN109 за пролиферация. След това се получава шаблонна едноверижна ДНК от супернатанта на културата за всеки клон. Тези едноверижни ДНК се подлагат само на "Т" реакция (реакция "А" и "Т" в Пример 3-2) на дидезокси метода, като се използва праймер за секвениране (2), последвано от електрофореза в полиакриламиден гел. След изсушаване гелът се анализира чрез авторадиография. Въз основа на резултатите се идентифицира клонинг с желаната мутантна последователност. Културалният супернатант на клонинга се използва за заразяване на Е. coli JM109 клетки и се инокулира отново върху плочата, за да се изолира едно място. От полученото единично петно ​​се изолира едноверижна ДНК съгласно горния метод. Като се използват тези ДНК, първо се определя ДНК базовата последователност чрез дидезокси метода, като се използва праймер за секвениране (2), като се получава клон, мутирал до желаната базова последователност. След заразяване на този фагов клон с JM-109 Е. coli клетки, използвайки метода на Messing, описан в Пример 2, се получава двойноверижна ДНК. Тази двойноверижна ДНК се смила с рестрикционния ензим Xho 11, провежда се електрофореза в 0,8% агарозен гел за изолиране на фрагмент (подобрения APT ген (V) от около 1500 базови двойки, съдържащ подобрения APT ген. След това ДНК В допълнение, като се използва дидезокси методът, се определя пълната базова последователност на така получената ДНК, при което се установява, че ДНК е подобреният APT (V) ген. V) ген (съдържащ обаче сигналния пептид -35 до -1) е показан на Фиг. 11 - 13. Аминокиселинната последователност, получена от него, също е показана на Фиг. 17 - 19. 3-2) Конструкция на подобрен APT (VI) и (VIII). Техниките са подобни на описаните в пример 3, 3-1). Първо се конструира M13mp3 (подобрен APT (II)) и след това се синтезират праймери, за да индуцират сайт-специфична мутация. Базовата последователност на тези праймери обаче е описана по-горе, за да се конструират подобреният APT ген (VI) и подобреният APT ген (VIII), 5"-краен фосфорилиран праймер (3) и 5"-краен фосфорилиран праймер (5 ) се използват съответно (вж маса 2). След индуцирането на сайт-специфична мутация, пълната базова последователност се определя чрез дидезокси метода. Беше потвърдено, че имат желаните базови последователности. Така се получават гени за подобрен APT (VI) и подобрен APT (VIII). След това тези гени се интегрират в pVY1 вектора в съответствие с процедурата, описана в примери 4 и 5. Пример 4. Интегриране на подобрения APT ген (II) в pVY1 вектора. 4-1) Конструиране на вектора pVY1. Векторът pVY1 се приготвя, както е показано на ФИГ. 7. A) Конструкция на pAdD26SV (A) N3 (N) и тъп край на Eco R1 мястото на разцепване. Първо, ДНК pAdD26SV(A) N3 (закупен от д-р Хироши Ханда в Токийския университет, известен от резюмета в Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) се смила с рестрикционния ензим Bgl11 (произведен от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) по традиционен начин ДНК се затъпява по конвенционален начин, като се използва ензим Klenow (произведен от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) след третиране с фенол, утаяване с етанол. , и изсушаване при понижено налягане, утайките се разтварят в стерилна дестилирана вода, трансформират компетентни клетки на E. coli (произведени от Takra Shuzo Co. Ltd.) с плазмидната ДНК, която се получава от трансформанти, проявяващи резистентност към тетрациклин След смилане на част от тези ДНК с рестрикционния ензим BgL 1, се извършва електрофореза при 0,7% - агароза. (A) N3 (N)) на ДНК на този клонинг с рестрикционния ензим Eco R1 по традиционния начин, ДНК се прави тъпа с помощта на ензима Klenow, както е описано по-горе. След третиране с фенол, утаяване с етанол и сушене при понижено налягане, утайката се разтваря в дестилирана стерилна вода. B) Изолиране на Kpn 1-BamH1 фрагмента (около 2900 bp) от pKSV10 и образуване на тъпи краища. След като pKSV10 ДНК (произведена от Fine Chemicals) се смила с рестрикционните ензими Kpn1 и BamH1 по традиционния начин, ДНК се затъпява с помощта на Т4 ДНК полимераза (лабораторен наръчник, стр. 114 - 121). След това се провежда електрофореза в 0,7% агарозен гел, за да се изолира фрагмент с размер около 2900 базови двойки. След това фрагментът се електроелуира, за да се извлече ДНК

В) Конструиране на pVY1. След лигиране на ДНК фрагмента, получен в А) и ДНК фрагмента, получен в В), се извършва трансформация на компетентни Е. coli HB101 клетки (описани по-горе). Плазмидна ДНК се получава от трансформанти, проявяващи резистентност към тетрациклин, като се използва традиционният метод. След като част от тези плазмидни ДНК се смила с рестрикционния ензим Pst1 (произведен от Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), се провежда електрофореза върху 1.0% агарозен гел. Резултатът е клонинг (плазмид pVY1), характеризиращ се с ивици от около 3400 базови двойки, около 3200 базови двойки и около 1400 базови двойки. Този E/coli клон HB101 (pVY1 е депозиран в Института за изследване на ферментацията към Агенцията за индустриални науки и технологии на Япония под регистрационен номер P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Интегриране на подобрения APT ген (II ) във вектора pVY1. След като ДНК на плазмида pVY1, получен в Пример 4-1), се смила с рестрикционния ензим BgL 11 по конвенционален начин, се извършва дефосфорилиране с помощта на алкална фосфатаза (произведена от Takara Shuzo. Co. Ltd.). След това третирането с фенол се извършва три пъти. И след утаяване с етанол и сушене при понижено налягане, утайките се разтварят в стерилна дестилирана вода. След лигиране на тази ДНК с BgL фрагмента 11-Xho 11 (около 1500 базови двойки), получен в Примери 3, 3-1), и HB101 компетентните клетки на Е. coli се трансформират с продукта на лигиране в съответствие с метода, описан по-горе. Плазмидна ДНК се приготвя от тетрациклин-устойчиви трансформанти по традиционен начин. След смилане на тези ДНК с рестрикционни ензими (BqL 11, Pst 1), се избира клон с подобрен APT ген (II) във вектора pVY1, интегриран в необходимата посока, и селекцията се извършва на базата на анализ на модел на електрофореза в агарозен гел. Първо, част от тези ДНК се смила с рестрикционния ензим BqL 11, последвано от електрофореза върху 0,8% агарозен гел, като се получава клонинг, имащ фрагментна лента от около 1500 bp, когато BqL 11-Xho 11 фрагментът се лигира към BqL фрагмент 11 плазмиди pVY1, лигираната част на Xho 11 и BqL 11 може да бъде отрязана с рестрикционния ензим BqL 11. Част от плазмидната ДНК на тези клонове се усвоява допълнително с рестрикционния ензим Pst1 и ДНК се подлага на електрофореза в 0.8% агарозен гел за получаване на клонинг, имащ размер на единична лента около 3400 bp, две ивици около 2300 bp, една ивица около 1400 bp и една ивица около 80 bp. Използвайки този клон (плазмид pVY1-APT (II) в съответствие с лабораторното ръководство, се получава плазмидна ДНК. Пример 5. Интегриране на гени на подобрен APT (V), (VI) и (VIII) във вектора pVY1. След разцепване от ДНК на плазмида pVY1, получен в Пример 4-1), дефосфорилирането на рестрикционния ензим BqL 11 се провежда по конвенционален начин, като се използва алкална фосфатаза (произведена от Takara Shuzo Co., Ltd.), последвано от третиране (3 пъти) с фенол, утаяване с етанол и сушене при понижено налягане. След това утайката се разтваря в стерилна дестилирана вода. След лигиране на тази ДНК с BqLII-Xho 11 фрагмента с размер около 1500 базови двойки, получен в примери 2, 2-3), продуктът на лигирането се трансформира в горните компетентни HB101 Е. coli клетки. Плазмидни ДНК се приготвят от трансформанти, проявяващи резистентност към тетрациклин, съгласно конвенционален метод. След смилане на тези ДНК с рестрикционни ензими BqL11 и Pstl се извършва електрофореза в агарозен гел. Чрез анализиране на модела на разделяне в агарозен гел се избират клонове, в които подобреният APT (V) ген се вмъква в pVYI вектора в желаната посока. Първо, след смилане на някои от тези ДНК с рестрикционния ензим BqL11, се извършва електрофореза върху 0,8% агарозен гел за получаване на клонове и се получава лента от около 1500 базови двойки. Когато BqL11-Xholl фрагментът е свързан с BqL11 фрагмента на pVYI вектора, Xholl и BqL11 частта могат да бъдат отцепени от BqL11 рестрикционния ензим поради гореспоменатата изошизомерна конфигурация. След по-нататъшно смилане на част от плазмената ДНК на тези клонове с рестрикционния ензим Pstl, се провежда електрофореза при концентрация на агарозен гел от 0,8%, за да се получи клонинг, даващ лента от около 3400 bp, ивица от около 2300 bp, две ленти от около 1400 bp, една лента от около 800 bp и една лента от около 80 bp. С помощта на клонинг (плазмид pVYI-APT (V)) се получава плазмидна ДНК в големи количества въз основа на лабораторното ръководство. По подобен начин, гените за подобрен APT (VI) и (VIII) са интегрирани в pVYI вектора. Пример 6 Експресия на усъвършенстван APT в СНО клетки. Плазмид pVYI - подобрен APT (VI), APT (II), APT (V) или APT (VIII) се трансфектира в DHFR-дефицитни СНО клетки (Urlaub, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77 (7), 4216-4224, 1980) чрез метода с калциев фосфат (Graham, et al. , Viroloqy, 52, 456, 1973). Установено е, че трансформиран клон, получен върху селективна среда (MEM A LPHA (-), GIBCO) в присъствието на метотрексат (MTX), проявява APT активност от 50 до 100 единици/ml (стойност, определена чрез описания метод на фибрин/агарозна плоча По-долу). Този клонинг се използва за последващи изследвания. Използваната производствена среда е GIT среда (произведена от Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.), допълнена с 20 международни единици/ml (SIGMA) апротинин. Пример 7. Пречистване на подобрен APT от културален супернатант на СНО клетки. Супернатантата на културата, получена в Пример 6, беше частично пречистена с помощта на афинитетна колона за анти-АРТ моноклонално антитяло. Хибрид, произвеждащ моноклонални антитела, се приготвя за APT, произхождащи от човешки меланомни клетки по традиционен начин. Произвеждащият антитела хибрид се инокулира в мишки и моноклоналното антитяло (подклас: IgGM1), развито в асцита, се екстрахира и пречиства с помощта на целулофин протеин А (произведен от Biochemical Industry Co., Ltd.) и произведена буферна система за пречистване на моноклонални антитела MAPS от Biorad Laboratories. Антитялото се свързва с CN3r-активирана сефароза (произведена от Pharmacia Fine Chemicals) при скорост от 4 mg на 1 ml гел по традиционния начин. Гел от антитяло (24 ml) се смесва с четири литра супернатант на културата. След леко разклащане в продължение на една нощ при 4°С, гелът се зарежда в колона (диаметър 1.5 cm х 20 cm). След това гелът се промива последователно с 125 ml от всеки от следните разтвори (1) Tris-HCl буфер pH 7,4 (буфер А), съдържащ 25 международни единици/ml апротинин (произведен от SIGMA) и 0,01% (w/v) Tween 80 , (2) буфер А, съдържащ 0,5 М NaCl, (3) буфер А, съдържащ 4 М урея, и (4) буфер А. Усъвършенстваният гел-свързан APT се елуира с 0,2 М глицин-HCl pH 2 буфер, съдържащ 25 международни единици/ml апротинин и 0,01% (w/v) Tween 80. Активните фракции се редуцират и обединяват. След диализа срещу 10 mM Tris-HCl буфер, pH 7,4, съдържащ 25 международни единици/ml апротинин и 0,01% (w/v) Tween 80 за една нощ, диализатът се концентрира 20-30 пъти с вакуумен центрофужен концентрат (Speed ​​VAC, произведен от SAVANT Inc.). Концентратът се диализира отново срещу 10 mM Tris-HCl буфер, рН 7,4, съдържащ 0,15 М NaCl, 25 международни единици/ml апротинин и 0,01% (wt/vol) Tween 80, за една нощ, и се използва за последващи in vitro и in vivo оценки . Накрая, специфичната активност се увеличава с 3700-5000 пъти, а добивът е от 36 до 42% от активността на APT (определена чрез метода на фибрин/агарозна плоча). Тази активна фракция се анализира чрез електрофореза с натриев додецилсулфат и оцветяване със сребро. При редуциращи условия се наблюдава много силна лента при 54 килодалтона, заедно с няколко други ленти. Гелът за електрофореза след това се третира с 2.5% (w/v) Triton X-100 и се поставя върху фибрин/агарозна плака за автограф на фибрин при 37°С, при което разтворената лента се открива при около 50 килодалтона. На същата плоча естественият APT се появява при около 60 килодалтона. Резултатите показват, че APT, адсорбиран върху колоната за афинитет на антитяло и елуиран по този метод, съответства на подобрен APT с молекулно тегло, което е приблизително 10 000 по-малко от молекулното тегло на естествено срещащия се тип. Пример 8. Измерване на специфичната активност на подобрен APT. Количеството протеин в частично пречистения напреднал APT се определя чрез измерване на общия протеин съгласно метода на BradFord (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), като се използва говежди серумен албумин като референтен протеин. Количеството APT антиген се измерва чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Фибринолитичната активност се определя чрез метода на фибрин/агарозна плака и метода за разтваряне на 125 1-белязан фибринов филм. Плака с фибрин/агароза се приготвя чрез добавяне на агар към 95% коагулиран фибриноген. Методът за разтваряне на 1-белязан фибринов филм 125 се провежда, както е описано от Hoyraeerts et al. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), използвайки като стандарт APT от човешки меланомни клетки, произведени от Bioscott Inc. и стандартизиран в съответствие с международния стандарт за APT (Gaffuey and Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Стойността на специфичната активност, изчислена от стойността на активността, определена чрез метода за разтваряне на 125 1-фибринов филм и количеството антиген, определено чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), варира от 300 000 до 420 000 единици/mg антиген. Пример 9. Афинитет на подобрен APT към фибрин и активиране от фибрин

В съответствие с работата на Verheijen, et al./EMBOJ, 5, 3525, 1986) е изследван афинитетът на подобрения APT към фибрин. Подобрен или естествено срещащ се APT (1000 единици/ml) се добавя към фибриноген в различни концентрации, последвано от добавяне на една единица тромбон, последвано от реакция при стайна температура за 3 минути. Полученият фибринов съсирек се утаява чрез центрофугиране при 16 000 rpm за 8 минути и количеството APT, което не е свързано с фибрина, се определя чрез измерване на активността по метода на фибрин/агарозна плоча. В резултат на това беше установено, че подобреният APT (VI) проявява същия афинитет към фибрина като естествената форма. За да се изследва степента на активиране на плазминогена чрез подобрен APT в присъствието или отсъствието на фибрин, беше проведен следният експеримент. Като се използва титруваща плоча, естествено срещащ се или усилен APT се добавя към 0,1 М Tris-HCl буфер, pH 7,5, съдържащ 0,3 mM синтетичен субстрат p-нироанилид трипептид S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA. HCl, произведен от Kabi Inc. .), 0.13 uM плазминоген без плазмин, 120 ug/ml DESAFIB TM (произведен от American Diagnostics Inc.) и 0.1% Tween 80, давайки общ обем от 200 ul. Системата се поддържа при 37°C. След определен период от време се измерва абсорбцията (оптична плътност) при дължина на вълната от 405 nm, като се използва Titertech Multiscan 310 Model. Кривата доза-отговор за амидолитичната активност на подобрения APT (VI) и естествено възникващия APT е показана на ФИГ. 22. Изместването на кривата доза-отговор, дължащо се на добавянето на DESAFIB TM за естествено срещащ се APT, съответства на стойност от 158 пъти, докато за подобрен APT достига 100 пъти. Това се дължи на факта, че активността на подобрения APT (VI) в отсъствието на лекарството DESAFIB TM е по-ниска, приблизително 1/20, от активността на естествения APT. Пример 10. Анализ на подобрен APT за фибринолитична активност в кръвния поток на заек. Фармакинетика чрез сравняване на активността на естествено срещащ се APT (n-APT) и подобрения APT от настоящото изобретение при заек. Както може да се види от фиг. 23, подобреният APT показва забележимо удължаване на биологичния полуживот на съществуване в активно състояние (естественият APT показва полуживот от 1-2 минути, докато подобреният APT е биологично активен за 8-15 минути). В допълнение, очевидно е, че стойността на активност от 5% (стойността на 30 секунди след прилагане е 100%) все още остава в подобрения APT дори 60 минути след прилагането му (естественият APT показва активност, равна на 0,1 след 60 минути) .% от първоначалния). Този експеримент се провежда по следния начин

За тестване е избран японски бял заек с тегло 2,4 кг. При анестезия с пентобарбитал APT се прилага през периферна ушна вена. Дозата е 15 400 единици (0,8 ml) подобрен APT на заек и 5 400 единици (0,8 ml) n-APT на заек (стойности, определени чрез метода на фибриновата плоча). След това 2,5 ml кръв се събират от феморалната артерия с помощта на катетър на различни интервали от време (от 0,5 до 60 минути) и се добавят към 1/9 обем натриев цитрат (3,8%). В рамките на 30 минути след вземането на кръв се извършва центрофугиране при ниска скорост, като се отделя плазмата. С помощта на отделена плазма се измерва APT активността в кръвта. (1) Измерване на APT активността. След разреждане на 0,2 ml плазма с 3 mM ледена оцетна киселина 16 пъти, разреденият продукт се центрофугира при ниска скорост на въртене, за да се получат преципитати. Утайките се разтварят в 20 mM Tris-HCl, рН 7.4, със 140 mM NaCl в обем, еквивалентен на плазмения обем, за да се получи еуглобулиновата фракция. APT активността се определя чрез добавяне на тази еуглобулинова фракция към фибринова/агарозна паничка. След инкубиране на плаката при 37°C в продължение на 16 часа, APT активността се наблюдава като плака. Стандартната крива за метода на фибрин/агарозна плака се приготвя чрез разреждане на APT, използван за прилагане на животното, до 0,1-10 000 единици/ml. Активността на APT в кръвта, определена по този начин, се изразява като процент, като се използва APT активността, получена чрез събиране на кръв 30 s след прилагане, взета за 100%. Пример 11. Стабилност на подобрен APT (VI) към топлина и киселини. За да се определи устойчивостта на топлина, подобреният APT (VI) и естественият APT бяха разредени с 50 mM Tris буфер, съдържащ 100 mM NaCl и 0.01% Tween 80, рН 7.4, до концентрация от 100 μg/ml, съответно. Всеки разтвор се държи във вряща вода (температура 98 o C) за 2-60 минути. След охлаждане се определя остатъчната активност чрез метода на фибриновата плоча. Както е показано на фиг. 24, намаляването на активността на подобрения APT (VI) е незначително в сравнение с намаляването на активността на естествения APT. Например, след термична обработка за 2 минути, активността на естествения APT се намалява до 25%, докато подобреният APT (VI) все още запазва активността си на 71%. За да се изследва киселинната устойчивост, подобреният APT (VI) и естественият APT се разтварят в 0,5 N. Разтвор на HCl с концентрация 100 μg/ml, последвано от утаяване при стайна температура за 30 минути. След неутрализация активността се определя с помощта на метода на фибриновата плоча. Подобреният APT не показва никаква промяна в активността, докато активността на естествения APT е намалена с 50%. Пример 12 Инхибиране на активен лимфоцитен стимулиращ фактор чрез подобрен APT (VI)

Подобреният APT (VI) и естественият APT бяха подходящо разредени в среда за тъканна култура PPM1 1640, съдържаща 7% фетален телешки серум и 58 μM 2-меркаптоетанол. 100 µl от разреждането се зарежда в 96-ямкова плака за тъканни култури, след което 50 µl от клетъчна суспензия, съдържаща тимоцити (210 7 клетки/ml) от мъжки C3H/He J мишки на възраст от 4 до 6 седмици, конканавалин А (1,2 μg/ml), както и 50 μl IL-1 (4 единици/ml, Aenzyme Inc), последвано от култивиране за 48 часа в инкубатор при 37 o C, съдържащ 5% въглероден диоксид. След това се добавя Н3-тимидин в концентрация от 0,5 μ. куб инч /20 µl/ямка. След култивиране в продължение на 18 часа, клетките се събират върху филтър от стъклени влакна и количеството на3Н-тимидин, въведено в клетките, се измерва с течен сцинтилационен брояч, за да се определи активността на лимфоцит стимулиращия фактор. Както е показано на фиг. 25, естественият APT не инхибира активността на лимфоцитния стимулиращ фактор, но подобреният APT значително го потиска. При тестване само с разтворител не се наблюдава ефект. Пример 13 Противовъзпалителна активност на базата на денатуриран протеин. 1) Получаване на денатуриран протеин. След инкубиране на протеиновия разтвор (5 mg/ml) в 0,1 N. разтвор на HCl или 0,1 N. разтвор на NaOH при температура 37 o C за 2-3 часа, протеиновият разтвор се неутрализира със същото количество NaOH или HCl. 2) Афинитетът на подобрения APT (VI) към денатурирания протеин. Метод: Съгласно процедурата, дадена по-долу, денатурираният протеин се „залепва“ към нитроцелулозен филм. След това се измерва количеството на подобрения APT, свързан с третирането с протеин и нитроцелулозен филм, като по този начин се оценява афинитета на подобрения APT към денатурирания протеин. Парче нитроцелулозен филм се потапя в 20 mM Tris-HCl буферен разтвор, рН 7.5, съдържащ 140 mM NaCl. Сушене. Денатуриран протеин (50 μg/10 μl) се освобождава на капки върху парче нитроцелулозен филм. Сушене. Блокиране с 3% разтвор на желатин. Зачервяване. Парче нитроцелулозен филм се потапя в разтвор на подобрен АПТ /1 μg/ml/. Зачервяване. Добавят се плазминоген и синтетичен субстрат S-2251, последвано от инкубиране при 37°С (количествен анализ на абсорбирания напреднал APT). Измерване на абсорбция при 405 nm. Резултати: Както е показано в Таблица 3, подобреният APT показва афинитет към третиран с HCl имуноглобулин G, третиран с HCl албумин и третиран с NaOH албумин. От друга страна, подобреният APT не показва афинитет към интактен имуноглобулин G и албумин. 3) Активиране на подобрен APT (VI) чрез денатуриран протеин. Метод: плазминоген (0,0078 единици в 10 μl), 100 μl 3 mM синтетичен субстрат S-2251 и различни количества TBS буфер се добавят към реакционния разтвор на подобрения APT активатор (денатуриран протеин, BrCN - обработен фибриноген и др.) при различни концентрации, като се получават 0,275 ml реакционен разтвор. Разширен APT (2,5 n/g в 25 ul) се добавя към реакционния разтвор, за да се инициира реакцията. След реакция за определен период от време, 2% натриев додецилсулфат (еквимоларно количество) се добавя към реакционния разтвор, за да се спре реакцията. Чрез измерване на оптичната плътност (OD 405) се определя активността на подобрения APT. Резултати: Както е показано на Фиг. 26, третираният с NaOH албумин и третираният с HCI имуноглобулин G показват силен активиращ ефект на подобрения APT. По-специално, в третирания с HCl имуноглобулин G активирането е силно и активността на третирания с HCl имуноглобулин G е приблизително равна на активността на третирания с BrCN фибриноген и при концентрация, която е няколко пъти по-ниска. Интактният албумин и имуноглобулин G не показват активиране. 4) Разграждане на денатуриран протеин под въздействието на подобрен APT (VI). Метод: След взаимодействие на денатурирания протеин с подобрения APT при същите условия като в метода, описан в предишния параграф, с изключение на това, че синтетичният субстрат S-2251 не се добавя към реакционната система и количеството на денатурирания протеин е 133 μg/ ml, електрофорезата се провежда в полиакриламиден гел с натриев додецилсулфат в присъствието на -меркаптоетанол. Резултати: Както е показано на ФИГ. 27, протеинът, денатуриран чрез третиране с NaOH или HCL, води до изчезване на ef-протеинови ленти от модела и образуване на продукти на разграждане, което показва неговото разлагане. От друга страна, когато се използва интактен албумин, не е открита промяна в ef-модела след взаимодействие с подобрения APT и следователно не е открито разграждане на денатурирания протеин.

ИСК

1. Рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор с аминокиселинната последователност, дадена на стр. където Y е Glu-Ile-Lys;

H2N - амино край;

COOH - карбокси край;

R - директна връзка или подобна последователност, съдържаща замествания и/или изтривания и/или вмъквания, които не са свързани с промени в активността,

И има следните свойства: фибринолитична активност, определена от метода на разтваряне на 1 2 5 I-фибриновия филм, способността да се активира от фибрин и активността на подобрен tpA в отсъствието на фибрин, която е по-ниска от активността на естествен tpA, увеличен полуживот в сравнение с естествената форма, повишена, в сравнение с естествения tpA, устойчивост на киселини и топлина, способност за инхибиране на лимфоцитния активиращ фактор и способност за активиране от денатуриран протеин. 2. Метод за производство на рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор, включващ култивиране на клетки гостоприемници, трансформирани с рекомбинантна ДНК, съдържаща последователност, кодираща аналог на tpA, и последващо пречистване на целевия продукт, характеризиращ се с това, че клетките гостоприемник се култивират трансформирани с рекомбинантен вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща tpA клауза 1.