Aminokyseliny možno detegovať pomocou farebných reakcií: ninhydrín, xantoproteín, Foly, Milone, biuretový test atď. Tieto reakcie sú nešpecifické, pretože sú založené na detekcii jednotlivých fragmentov v štruktúre aminokyselín, ktoré možno nájsť aj v iných zlúčeninách.
Ninhydrínová reakcia, farebná reakcia používaná na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie aminokyselín, iminokyselín a amínov. Pri zahriatí v alkalické prostredie ninhydrínom (tricetohydrín dihydrát, C 9 H b O 4) s látkami s primárnymi aminoskupinami (-NH 2), vzniká produkt, ktorý má stabilnú intenzívnu modrofialovú farbu s maximálnou absorpciou cca 570 nm. Pretože absorpcia pri tejto vlnovej dĺžke závisí lineárne od počtu voľných aminoskupín, ninhydrínová reakcia slúžila ako základ pre ich kvantitatívne stanovenie kolorimetriou alebo spektrofotometriou. Táto reakcia sa používa aj na stanovenie sekundárnych aminoskupín (>NH) v iminokyselinách - prolíne a hydroxyprolíne; v tomto prípade sa vytvorí jasne žltý produkt. Citlivosť - do 0,01%. Moderná automatická analýza aminokyselín sa vykonáva kombináciou iónomeničovej separácie aminokyselín a ich kvantitatívneho stanovenia pomocou ninhydrínovej reakcie. Pri separácii zmesí aminokyselín pomocou papierovej chromatografie umožňuje stanoviť každú aminokyselinu v množstve minimálne 2-5 μg.
Intenzita farby môže byť použitá na posúdenie množstva aminokyselín.
Táto reakcia je pozitívna nielen pri voľných aminokyselinách, ale aj pri peptidoch, bielkovinách atď.
Xantoproteínová reakcia umožňuje odhaliť aromatické aminokyseliny(fenylalanín, tyrozín, histidín, tryptofán), na základe reakcie elektrofilnej substitúcie v aromatickom kruhu (nitrácia).
Keď koncentrovaná kyselina dusičná pôsobí napríklad na tyrozín, vzniká žlto sfarbený produkt.
Follova reakcia. Toto je reakcia na cysteín a cystín. Počas alkalickej hydrolýzy sa „slabo viazaná síra“ v cysteíne a cystíne pomerne ľahko odštiepi, čo vedie k tvorbe sírovodíka, ktorý pri reakcii s alkáliou produkuje sulfidy sodíka alebo draslíka. Keď sa pridá octan olovnatý, vytvorí sa sivočierna zrazenina sulfidu olovnatého.
Popis zážitku. 1 ml roztoku cystínu sa naleje do skúmavky, pridá sa 0,5 ml 20% roztoku hydroxidu sodného. Zmes sa zahreje do varu a potom sa pridá 0,5 ml roztoku octanu olovnatého. Pozoruje sa šedo-čierna zrazenina sulfidu olovnatého:
Zimmermanova reakcia. Ide o reakciu na aminokyselinu glycín.
Opis zážitku. Do 2 ml 0,1 % roztoku glycínu, upraveného pridaním 10 % alkalického roztoku na pH = 8, pridajte 0,5 ml vodný roztok o-ftalový dialdehyd. Reakčná zmes sa pomaly začína meniť na svetlozelenú. Po niekoľkých minútach sa objaví zelená zrazenina.
Reakcia na tryptofán. Tryptofán, ktorý v kyslom prostredí reaguje s aldehydmi, vytvára farebné kondenzačné produkty. Napríklad s kyselinou glyoxylovou (čo je prímes koncentrovanej kyseliny octovej) reakcia prebieha podľa rovnice:
Reakcia tryptofánu s formaldehydom prebieha podľa podobnej schémy.
Sakaguchiho reakcia. Táto reakcia na aminokyselinu arginín je založená na interakcii arginínu s a-naftolom v prítomnosti oxidačného činidla. Jeho mechanizmus ešte nie je úplne objasnený. Reakcia sa zjavne uskutočňuje podľa nasledujúcej rovnice:
Keďže chinónimínové deriváty (in v tomto prípade naftochinón), v ktorých je vodík iminoskupiny –NH– nahradený alkylovým alebo arylovým radikálom, sú vždy sfarbené do žlto-červena, potom sa oranžovo-červená farba roztoku počas Sakaguchiho reakcie zjavne vysvetľuje objavenie sa derivátu naftochinónimínu. Nemožno však vylúčiť možnosť vytvorenia ešte zložitejšej zlúčeniny v dôsledku ďalšej oxidácie zostávajúcich NH skupín arginínového zvyšku a benzénového kruhu a-naftolu:
Popis zážitku. Do skúmavky sa nalejú 2 ml 0,01 % roztoku arginínu, potom sa pridajú 2 ml 10 % roztoku hydroxidu sodného a niekoľko kvapiek 0,2 %. alkoholový roztok a-naftol. Obsah skúmavky sa dobre premieša, pridá sa 0,5 ml roztoku bromnanu a znova sa premieša. Okamžite pridajte 1 ml 40% roztoku močoviny na stabilizáciu rýchlo sa rozvíjajúceho oranžovo-červeného sfarbenia.
Biuretová reakcia– používa sa ako farebná reakcia na bielkoviny. V alkalickom prostredí v prítomnosti meďnatých solí dávajú fialovú farbu. Farba je spôsobená tvorbou komplexnej zlúčeniny medi (II) v dôsledku peptidovej skupiny -CO-NH-, ktorá je charakteristická pre bielkoviny. Táto reakcia dostala svoj názov podľa derivátu močoviny - biuretu, ktorý vzniká pri zahrievaní močoviny za eliminácie amoniaku:
Okrem bielkovín a biuretu majú rovnaké zafarbenie aj ďalšie zlúčeniny obsahujúce túto skupinu: amidy, imidy karboxylových kyselín, ako aj zlúčeniny obsahujúce v molekule skupiny -CS-NH- alebo =CH-NH-. Reagujú aj bielkoviny, niektoré aminokyseliny, peptidy, biuret a stredné peptóny.
Farba komplexu získaného biuretovou reakciou s rôznymi peptidmi je trochu odlišná a závisí od dĺžky peptidového reťazca. Peptidy s dĺžkou reťazca štyroch aminokyselinových zvyškov a viac tvoria červený komplex, tripeptidy - fialové a dipeptidy - modré.
ketónová forma polypeptidu
enol forma polypeptidu
Keď polypeptid interaguje s Cu (OH) 2, vytvorí sa komplex, ktorého štruktúra môže byť znázornená nasledovne.
Zariadenie a činidlo: chromatografický papier; chromatografická komora; fotoelektrický kolorimeter; nožnice; sklenené taniere (3´32 cm) - 3 ks; držiak na chromatogramy; sušiareň; mikropipety; skúmavky so zemnými zátkami; byreta 25 ml; štandardná zmes aminokyselín; testovacia zmes aminokyselín; butanol, kyselina octová, voda v pomere 15:3:7; 1% roztok ninhydrínu v 95% acetóne; etylalkohol (75 %), nasýtený síranom meďnatým.
Dokončenie práce
Vezmite hárok chromatografického papiera s rozmermi 18 x 28 cm a jednoduchou ceruzkou nakreslite vodorovnú čiaru vo vzdialenosti 3 cm od jeho krátkeho okraja. Potom sa rozdelí na nerovnaké časti v súlade s priloženou schémou a hranice aplikácie štandardnej a skúšobnej zmesi sú označené šípkami a zodpovedajúce nápisy sú vytvorené jednoduchou ceruzkou.
Papier sa nad povrchom stola spevní a na štartovaciu čiaru ohraničenú šípkami sa najskôr nanesie štandardná zmes pomocou špeciálnej mikropipety v tenkej línii, kým sa celý roztok z mikropipety neprenesie na štartovaciu čiaru (mikropipeta sa naplnené na 2-3 cm). Hmotnosť aplikovaného roztoku sa meria odvážením pipety naplnenej štandardnou zmesou (pred aplikáciou roztoku) a prázdnej (po aplikácii roztoku). Na papier sa zvyčajne nanáša 0,02-0,03 g štandardného roztoku. Potom naplňte čistú pipetu testovacou zmesou aminokyselín (vydanú učiteľom na štúdium), odvážte ju a naneste zmes na štartovaciu čiaru s príslušnou značkou.
Pripravený chromatogram sa umiestni do chromatografickej komory, do ktorej sa predtým naleje rozpúšťadlový systém, aby sa oddelila zmes aminokyselín, napríklad zmes butanolu, octová kyselina a vody v pomere 15:3:7. Separácia sa uskutočňuje vzostupnou chromatografiou, kým predná línia nedosiahne 2-3 cm k hornému okraju chromatografického papiera (koncová línia). Potom sa chromatogram vyberie z komory a horný koniec papiera sa ihneď vloží do držiaka z troch sklenených tyčiniek upevnených gumeným krúžkom a umiestni sa na 20 minút do digestora, aby sa z papiera odstránili rozpúšťadlá.
Ryža. 8. Schéma usporiadania aminokyselín na chromatograme:
A - miesto aplikácie zmesi aminokyselín; I - cystín a cysteín;
2 - lyzín; 3 - histidín; 4 - arginín; 5 - kyselina asparágová,
séria a glycín; 6 - kyselina glutámová a treonín; 7 - alanín;
8 - prolín; 9 - tyrozín; 10 - valín a metionín; II - tryptofán;
12 - fenylalanín; 13 – leucín a izoleucín
Vysušený chromatogram sa ponorí do 1 % roztoku ninhydrínu v acetóne, aby sa zistila poloha škvŕn aminokyselín na ňom. Chromatogram sa potom umiestni na 10 minút do digestora, aby sa odstránil acetón, a prenesie sa do sušiacej komory, kde sa nechá 15 minút pri 70 °C. Aminokyseliny štandardnej a testovanej zmesi sa detegujú vo forme modrofialových škvŕn umiestnených v reťazci v smere pohybu systému rozpúšťadiel od štartovacej čiary k hornému okraju chromatogramu.
Identifikácia aminokyselín obsiahnutých v testovacej zmesi sa uskutočňuje zhodou pozícií obsadených aminokyselinami štandardu a testovanej zmesi v chromatograme (obr. 8).
Na stanovenie kvantitatívneho obsahu aminokyselín v testovaných zmesiach sa chromatogram nakreslí jednoduchou ceruzkou tak, aby farebné zóny ležiace na rovnakej úrovni, zodpovedajúce rovnakej aminokyseline, boli obsiahnuté v približne rovnakých obdĺžnikoch (obr. 9). .
I II III IV
Ryža. 9. Rozloženie aminokyselín na chromatograme:
I - zmes č. I; II - zmes č. 2; 1U - zmes č. 3; Ш - štandardné
zmes aminokyselín
Naznačené oblasti papiera sa vystrihnú a vložia do skúmaviek, ktorých čísla musia zodpovedať počtu škvŕn na chromatogramoch. Do každej skúmavky sa z byrety naleje 10 ml 75 % roztoku. etylalkohol nasýtený síranom medovým (do 500 ml etylalkoholu pridajte 0,2 ml nasýteného roztoku síranu meďnatého). Skúmavka sa uzavrie a za občasného miešania sa tehlovočervená farba (Ruhemanova modrofialová medená soľ) úplne prenesie z papiera do roztoku. Trvá to 15-20 minút. Absorpcia (optická hustota) štandardného a testovaného roztoku sa meria na fotoelektrickom kalorimetri s filtrom zeleného svetla (540 nm). V referenčnom toku je inštalovaná kyveta so 75% roztokom etylalkoholu so síranom meďnatým.
Kvantitatívny obsah aminokyselín v testovacom roztoku sa vypočíta z pomeru extinkcií testovanej a štandardnej vzorky.
Príklad výpočtu. Predpokladajme, že štandardná zmes obsahuje 1,8 mg glycínu v 1 ml a na štartovací prúžok sa nanesie 0,02 g tohto štandardného roztoku. Chromatogram teda získal (1,8 x 0,02) = 0,036 mg glycínu. Ďalej sa dohodneme, že absorpcia farebných roztokov bola 0,288 pre štandard a 0,336 pre neznámu zmes. Potom bude obsah glycínu v skúmanej zmesi vynesený na chromatograme (36´0,336): 0,288 = 42 μg. Ak ďalej predpokladáme, že testovanú zmes nanesieme na chromatogram v množstve napríklad 0,0250 g, tak obsah glycínu v 1 ml testovaného roztoku bude (42:0,0250) = 1680 μg, čiže 1,68 mg/ ml.
Prezentujte výsledky vlastného experimentu a vyvodzujte z nich závery.
Laboratórna práca č.15
Separácia iónovFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+
Tento článok sa bude zaoberať metódami na stanovenie aminokyselín, ktoré sa používajú nielen pri analýze produktov, ale aj v biochémii a farmaceutickej analýze.
Celkové množstvo aminokyselín možno určiť fotometrickou metódou založenou na stanovení amoniaku získaného z aminokyselín pomocou Kjeldahlovej metódy.
Reakcia s 1-naftolom. Na stanovenie arginínu, histidínu a tyrozínu bola navrhnutá reakcia s 1-naftolom. V prítomnosti chlórnanu sodného (NaOCl) sa roztok sfarbí do červena. Roztok vzorky v 50 % etanole obsahujúci aminokyselinu sa ochladí ľadom a pridá sa 10 % roztok NaOCl a roztok naftolu. Reakčný produkt je sfarbený do červena (lmax = 550 nm). Obsah aminokyselín je určený intenzitou farby výsledného roztoku.
Biuretová reakcia. Jeden z najdôležitejšie reakcie používaná na stanovenie aminokyselín je biuretová reakcia. Reakcia sa uskutočňuje pridaním zriedeného vodného roztoku medenej (II) soli do alkalického roztoku biuretu. V tomto prípade sa roztok sfarbí do intenzívnej fialovej farby v dôsledku tvorby komplexnej zlúčeniny.
Biuretová reakcia zahŕňa zlúčeniny obsahujúce aspoň 2 amidové skupiny alebo aminohydroxyetylénovú skupinu, ako aj amidy a imidy aminokyselín. Táto reakcia sa uskutočňuje pomocou proteínov a koncentrovaných roztokov aminokyselín a amidov. Zriedené roztoky aminokyselín nedávajú biuretovú reakciu, a preto je možné reakciu použiť na určenie konca hydrolýzy bielkovín. Reakcia sa tiež používa na kvalitatívne a kvantitatívne stanovenie bielkovín. Biuretová reakcia je základom pre metódy používané v klinických diagnostických laboratóriách na stanovenie bielkovín v krvi a iné biologické tekutiny.
Ninhydrínová reakcia. Druhou najdôležitejšou reakciou používanou na stanovenie aminokyselín je ninhydrínová reakcia - farebná reakcia na a-aminokyseliny, ktorá sa uskutočňuje ich zahrievaním v alkalickom roztoku prebytočného ninhydrínu.
Ninhydrín vykonáva oxidačnú dekarboxyláciu a-aminokyselín za vzniku amoniaku, oxid uhličitý a aldehyd obsahujúci o jeden atóm uhlíka menej ako materská aminokyselina. Redukovaný ninhydrín ďalej reaguje s uvoľneným amoniakom a druhou molekulou ninhydrínu za vzniku farebného kondenzačného produktu s amoniakom.
Výsledná zlúčenina (pigment) má fialovo-modrú farbu (l max = 570 nm). Tvorba tejto farebnej zlúčeniny sa využíva v kvantitatívnom a-aminokyselinovom teste, ktorý dokáže detegovať aminokyseliny aj v množstvách malých ako 1 µg.
Prolín a hydroxyprolín, ktoré nemajú a-aminoskupinu, reagujú s ninhydrínom za vzniku derivátov žltá farba(lmax = 440 nm). Reakcia nie je konkrétna, pretože amoniak a zlúčeniny obsahujúce aminoskupinu (amíny, proteíny, peptidy) tiež vytvárajú farebný produkt s ninhydrínom. Pri týchto zlúčeninách sa však neuvoľňuje žiadny CO2. Uvoľňovanie oxidu uhličitého je charakteristické len pre a-aminokyseliny. Reakcia sa používa na kolorimetrické kvantitatívne stanovenie a-aminokyselín, vrátane automatických analyzátorov aminokyselín (meranie objemu CO 2 ).
Ninhydrínová reakcia sa používa na stanovenie glycínu, izoleucínu, leucínu; serín, fenylalanín, cysteín, tyrozín, tryptofán atď. poskytujú menej intenzívne sfarbenie.
Výsledné produkty sa vyznačujú pomerne intenzívnou farbou (e = 1,8–3,3·10 4), ale farebné produkty sú nestabilné. Intenzita farby rýchlo klesá. Na stabilizáciu sa pridá CdCl2. S výslednými zlúčeninami tvorí stabilné komplexy. Reakciu urýchľuje aj chlorid kademnatý.
Aminokyseliny a niektoré ďalšie zlúčeniny obsahujúce aminoskupinu kondenzujú v alkalickom prostredí s 1,2-naftochinón-4-sulfoxylátom za vzniku červených, žltých, oranžových derivátov 1,2-naftochinónmonoimínu.
Reakcia sa používa na stanovenie a-aminoxylátov (valín, izoleucín, leucín atď.).
Na stanovenie tryptofánu možno použiť reakciu s 4-dimetylaminobenzaldehydom. Reakčný produkt je sfarbený do fialova a obsah tryptofánu v analyzovanom roztoku je určený intenzitou zafarbenia.
Treba však poznamenať, že táto reakcia sa pri analýze potravín používa len zriedka.
Na kvantitatívne stanovenie aminokyselín obsahujúcich síru sa používa bromatometrická metóda založená na nasledujúcej reakcii:
Roztok cysteínu v 1% roztoku NaOH sa naleje do banky so zabrúsenou zátkou, pridá sa 0,1 N. roztok bromičnanu draselného, suchý bromid draselný a okyslený 10 % HCl.
Br03 – + 5Br – + 6H + → 3Br2 + 3H20
Bróm vytvorený ako výsledok reakcie, ktorého množstvo je ekvivalentné množstvu bromičnanu draselného, reaguje s aminokyselinou. Po 10 minútach sa pridá jodid draselný, ktorý reaguje s nezreagovaným brómom, a uvoľnený jód sa titruje 0,1 N. roztok tiosíranu sodného so škrobom ako indikátorom.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Množstvo tiosíranu použitého na titráciu je ekvivalentné množstvu brómu, ktorý nereagoval s aminokyselinou. Na základe rozdielu medzi množstvom pridaného bromičnanu draselného a tiosíranu sa zistí množstvo brómu, ktoré vstúpilo do reakcie s aminokyselinou, a teda množstvo aminokyseliny.
Metionín sa stanoví podobne. Metionín sa oxiduje na sulfón:
Táto reakcia za určitých podmienok umožňuje veľmi presne určiť obsah metionínu.
Metódy stanovenia aminokyselín
Aminokyseliny sú biologicky účinných látok, hrajú dôležitú úlohu v živote ľudského tela, sú široko používané ako lieky. Niektoré z nich sú nevyhnutné a dostávajú sa do tela s jedlom. V súčasnosti existuje množstvo metód na kvantitatívne stanovenie aminokyselín v liečivých rastlinných materiáloch, vrátane lieky a biologických tekutín v potravinárskych výrobkoch.
Z množstva metód na kvantitatívne stanovenie aminokyselín v rôznych objektoch možno rozlíšiť štyri hlavné skupiny: chromatografické, spektrofotometrické, titrimetrické a elektrochemické metódy analýzy.
Chromatografické metódy
vzadu posledné desaťročia Významný pokrok sa dosiahol v oblasti plyno-kvapalinovej chromatografie aminokyselín. Bol navrhnutý spôsob využívajúci mikroplnené kolóny, ktorý umožňuje relatívne krátky čas oddeliť takmer úplne 17 biologicky dôležitých α-aminokyselín.
Bola vyvinutá metóda na stanovenie aminokyselín pomocou plynovo-kvapalinovej chromatografie vo vzorkách séra, plazmy, moču a cerebrospinálnej tekutiny, na báze prípravy 2,3,4,5,6-pentafluórbenzoyl-izobutyléterov s následnou separáciou na polydimetylsiloxánovej kolóne v režime programovania teploty od 140°C do 250°C s plameňovým ionizačným detektorom. Doba chromatografickej separácie je 28 minút. Výsledkom výskumu bolo oddelených 27 aminokyselín.
Napriek rôznorodosti metód vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie na analýzu aminokyselín je najrýchlejšia a najdostupnejšia verzia s reverznou fázou so spektrofotometrickou detekciou. Na úspešnú separáciu a detekciu sa aminokyseliny prevedú na hydrofóbne a svetlo absorbujúce deriváty, to znamená, že sa uskutoční predkolónová derivatizácia. Ako derivatizačné činidlá sa používajú ortoftalový aldehyd, naftalén-2,3-dikarboxyaldehyd a 9-fluorenylmetylchlórformiát.
Bola vyvinutá metóda na kvantitatívne stanovenie L-cystínu, kyseliny L-glutámovej a glycínu v lieku "Eltacín", ktorý má antioxidačnú aktivitu v kombinácii s antianginóznym účinkom. Kyselina glutámová a glycín boli stanovené vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou na reverznej fáze po predkolónovej derivatizácii s činidlom ortoftalaldehyd/N-acetyl-L-cysteín. Derivatizácia cysteínu je podľa autorov náročná kvôli nestabilite samotnej aminokyseliny a výsledných derivátov. Preto sa analýza cysteínu uskutočnila bromatometrickou titráciou. Zistilo sa, že prítomnosť významného množstva cysteínu vo vzorke neinterferuje so stanovením produktov derivatizácie glycínu a kyseliny glutámovej s činidlom ortoftalový aldehyd/N-acetyl-L-cysteín. Metóda sa vyznačuje vysokou reprodukovateľnosťou a presnosťou stanovenia.
Možnosť použitia 4,7-fenantrolín-5,6-diónu (fanchinónu) ako fluorogénneho značiaceho činidla na predkolónovú tvorbu jeho derivátov za účelom separácie a kvantitatívnej analýzy aminokyselín vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou bola vyšetrované. Fanchinón, ktorý nemá žiadnu vlastnú fluorescenciu, reaguje s aminoskupinami aminokyselín (pri 68 °C počas 160 minút), pričom vytvára iminochinoly, ktorých fluorescencia sa meria pri vlnovej dĺžke 460 nm. Izolované deriváty boli identifikované pomocou Tm, IR, hmotnostného a PMR spektra. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia sa uskutočnila na chromatografe s fluorescenčným detektorom a kolóne s gradientovou elúciou so zmesami: roztok trietylamínu - fosfátový pufor(pH 3) - metanol. Ako vnútorný štandard sa použil chinidín. Táto metóda je celkom sľubný vo veľkých laboratóriách a môže byť navrhnutý na analýzu aminokyselín v hotových liekových formách.
Bola vyvinutá technika vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s potenciometrickým biosenzorom na kvantitatívne stanovenie lyzínu. Biosenzor je skonštruovaný pripojením membrány obsahujúcej lyzínoxidázu k iónovo selektívnej NH4+ elektróde. Amónne ióny generované počas enzymatickej degradácie lyzínu sú detekované potenciometricky. Bola vyvinutá chromatodenzitometrická expresná metóda na analýzu tryptofánu v kultivačných kvapalinách. Chromatografia na tenkej vrstve sa uskutočňovala na platniach Sorbfil. Chromatografia sa uskutočňovala v systéme propanol-2 - 25% roztok hydroxidu amónneho (7:3) počas 25 minút. Chromatogramy sa vysušili pri izbová teplota a udržiaval sa 15 minút pri 120 °C. Na detekciu škvŕn na chromatogramoch sa použilo špecifické činidlo - 4-dimetylaminobenzaldehyd, selektívny pre indolový kruh tryptofánu, vo forme 0,5% roztoku etanolu s prídavkom 5% koncentrovanej kyseliny sírovej. Po vyvolaní chromatogramov ponorením do teflónovej kyvety s čerstvo pripraveným roztokom 4-dimetylaminobenzaldehydu sa chromatogramy udržiavali 5-7 minút pri teplote 110 °C. Skenovanie tryptofánových škvŕn sa uskutočnilo pri vlnovej dĺžke 625 nm na počítačovom video denzitometri. Vyvinutá metóda je napriek vysokej presnosti stanovenia a produktivity špecifická pre tryptofán.
Na analýzu β-aminokyselín v biologických tekutinách, liekoch a potravinových produktoch sa široko používajú metódy kapilárnej elektroforézy, založené na separácii zložiek komplexnej zmesi v kremennej kapiláre pôsobením aplikovaného elektrické pole. Keďže aminokyseliny majú zwitteriónový charakter, možno ich separovať pomocou roztokov elektrolytických pufrov s vhodnou hodnotou pH, najčastejšie sa používajú neutrálne a zásadité separačné pufre.
Pre zvýšenie špecificity a citlivosti metódy kapilárnej elektroforézy na analýzu jednotlivých β-aminokyselín sa využíva ich predbežná derivatizácia s následnou separáciou v kremennej kapiláre a spektrofotometrickým stanovením produktov reakcie. Ako derivatizačné činidlá sa teda používajú 9-fluorenylmetylformiát, 9-(2-karbazol)etylchlórformiát a kyanínové farbivo. Perspektíva metódy vyplýva z takých výhod, ako je rýchla analýza, ľahká príprava vzorky, nízka spotreba činidiel a jednoduchosť prístrojového vybavenia.
A bielkoviny
Je známe, že všetkých 20 odrôd kanonických α-aminokyselín má rovnakú štruktúru s tromi variantmi funkčných skupín (obr. 3.3). Bohužiaľ, reakcie na amino a karboxy skupiny nie sú veľmi špecifické, pretože podľa toho sú charakteristické pre všetky amíny, množstvo amidov a karboxylových kyselín. To isté platí pre väčšinu ich radikálov = R, z ktorých 10 je nepolárnych, to znamená reprezentovaných alifatickými = uhľovodíkovými skupinami, z ktorých väčšina je chemicky inertná. Špecifickosť väčšiny R polárnych aminokyselín, ktoré obsahujú alkohol (Ser, Tre, Tyr), amid (Asn, Gln) a karboxylové skupiny (Asp, Glu), je tiež relatívne nízka. Aminoskupina (Lys), imidazol His a guanidínová skupina Arg sú aktívnejšie a aktivita tioskupiny Cys je maximálna. Preto najväčší praktický význam v kvalite a kvantitatívna analýzaα-aminokyseliny, vrátane analyzátorov aminokyselín, dostali univerzálnu ninhydrínovú reakciu, špecifickú pre súčasnú prítomnosť aminoskupín aj karboxyskupín na atóme a-C.
Ryža. 3.3. Všeobecné vzorceštruktúry α-aminokyselín a produktov ich polymerizácie. Vysvetlivky v texte.
Polymerizácia α-aminokyselín do štruktúry peptidov a proteínov (obr. 3.3) zachováva všetky ich R typy, ale:
1. Ninhydrínová reakcia sa stáva negatívnou, pretože s výnimkou N- a C-koncových sa α-amino a α-karboxyskupiny vynakladajú na tvorbu peptidových väzieb. Pozitívna ninhydrínová reakcia s proteínom s najväčšou pravdepodobnosťou indikuje prítomnosť aminokyselinových nečistôt v prípravku alebo nádobe.
2. Pre všetky peptidy a proteíny je biuretová reakcia špecifická pre peptidovú skupinu, ktorá chýba v monomérnych aminokyselinách.
3. Od viac špecifické reakcie pre R aminokyseliny sú užitočné: xantoproteínová reakcia s koncentrovanou kyselinou dusičnou, pre aromatické R Fen, Tyr, Tri; reakcia s izatínom na päťčlennom Pro kruhu, ako aj reakcie na imidazole R His, tioskupine Cys a guanidínovej skupine Arg. Je dôležité vziať do úvahy, že niektoré z týchto R sú skryté vo vnútri proteínových guľôčok a preto sú kvalitatívne reakcie na ne oslabené. Preto sa proteíny pred ich uskutočnením zvyčajne tak či onak denaturujú.
4. Na rozdiel od skutočných roztokov aminokyselín, koloidné roztoky Charakteristické sú proteíny sedimentárne reakcie , spojené s deštrukciou ich hydratačných obalov a v dôsledku toho znížením ich rozpustnosti pod vplyvom látok odstraňujúcich vodu: neutrálne soli = vysolenie, metanol = MeOH, etanol = EtOH, acetón, močovina a iné činidlá.
Pri vykonávaní kvalitatívnych reakcií by ste mali:
1. Dôsledne dodržiavať pravidlá požiarnej bezpečnosti a pracovať s koncentrovanými kyselinami a zásadami = EZh.
2. Označte 2 rady skúmaviek skleneným grafom alebo fixkou a do jednej z nich vložte maximálne 0,5 ml (2-5 kvapiek) 1% roztoku aminokyselín a približne rovnaký objem 1 % roztoku proteínu v druhom.
3. Do páru skúmaviek s roztokmi aminokyselín a proteínov pridajte 3-5 kvapiek zodpovedajúcich činidiel paralelne a vykonajte zostávajúce postupy uvedené pre príslušnú reakciu.
4. Ak je potrebné zahriať skúmavky, odstráňte veko téglika a zapáľte suché palivo zápalkou. Potom upnite skúmavku do držiaka, ktorého primitívna konštrukcia je veľmi nespoľahlivá. Preto je lepšie zabaliť pár skúmaviek kúskom papiera zloženým do pruhov a držať ich palec dolné polovice skúmaviek rovnomerne pretiahnite plameňom, vyhnúť sa nasmerovaniu krkov na susedov a spôsobeniu prudkého varu roztoku. Po dokončení operácie okamžite uhaste plameň vekom téglika.
5. Vypracujú sa výsledky experimentov v súlade so šablónou o šírení laboratórneho notebooku vo forme tabuľky:
6. Po zvážení získaných výsledkov a po vyplnení protokolu ich spolu so stojanom so skúmavkami predložte učiteľovi na ochranu.
1. Ninhydrínová reakcia. Na základe deaminácie a dekarboxylácie α-aminokyselín alkoholovým roztokom ninhydrínu:
Výsledný amoniak, ktorý reaguje s dvoma molekulami ninhydrínu, vytvára farebný derivát s absorpčným maximom pri 540 nm (pre Pro - 440 nm).
Pokrok: K testovaným vzorkám pridajte 3-5 kvapiek 0,5% alkoholového roztoku ninhydrínu. Skúmavky so zmesami jemne zahrejte na plameni a po 2-3 minútach zaznamenajte vzhľad farby.
2. Xantoproteínová reakcia. Ako je uvedené vyššie, je založený na tvorbe nitroderivátov aminokyselín s aromatickými R: Fen, Tyr, Tri.
Pokrok: Zapnutím odsávania pár opatrne pridajte niekoľko kvapiek koncentrovanej kyseliny dusičnej (HNO 3) do páru skúmaviek s testovacími roztokmi. Skúmavky jemne zahrievajte na plameni, vyhýbajte sa nasmerovaniu hrdla na susedov a zaznamenávajte vývoj farby.
3. Nitroprusidová reakcia. Je založená na alkalickej hydrolýze aminokyseliny cysteínu obsahujúcej síru s uvoľnením sulfidu sodného (Na 2 S), ktorý dáva červený komplex s čerstvo pripraveným roztokom nitroprusidu sodného.
Pokrok: Pridajte rovnaký objem 20 % hydroxidu sodného do oboch skúmaviek s 5 – 10 kvapkami testovacích roztokov a varte aspoň 3 – 5 minút. Pridajte 3-5 kvapiek roztoku nitroprusidu sodného do skúmaviek a zaznamenajte vývoj farby.
4. Biuretová reakcia. Je založená na tvorbe farebného komplexu peptidovej väzby s iónom Cu 2+ v alkalickom prostredí. Slúži ako univerzálny test na identifikáciu peptidov a proteínov v roztokoch. Keďže so zvyšujúcim sa počtom peptidových väzieb sa intenzita farby roztoku lineárne zvyšuje, je široko používaný na fotometrické stanovenie koncentrácií proteínov.
Pokrok. Pridajte rovnaké množstvo 10% roztoku hydroxidu sodného do skúmaviek s 5-10 kvapkami testovacích roztokov. Dobre premiešajte a pridajte 2 kvapky 1% roztoku síranu meďnatého (CuSO 4). Vzorky premiešajte a po niekoľkých minútach zaznamenajte vývoj farby.
5. Test varu. Na základe tepelnej denaturácie bielkovín.
Pokrok. Okyslite obe skúmavky testovacími roztokmi nie viac ako jednou kvapkou 1% roztoku kyseliny octovej (AcOH) a zohrejte do varu. Po varení roztokov počas 2-3 minút zaznamenajte výsledky a vysvetlite mechanizmus javu.
6. Zrážanie soľami ťažkých kovov(meh) . Ich denaturačné vlastnosti sú založené na schopnosti ťažkých katiónov Me reagovať s R funkčnými skupinami proteínovej molekuly: tio-, amino-, karboxy-, aromatické. Tiež ich silné anióny spôsobujú dobíjanie iónových skupín v molekulách bielkovín, čím v nich ničia iónové väzby.
Pokrok. Pridajte niekoľko kvapiek 5 % roztoku síranu meďnatého (CuSO 4) do oboch skúmaviek s testovacími roztokmi. Zaznamenajte a vysvetlite získané výsledky.
7. Zrážanie organickými kyselinami. Založené na kyslej denaturácii bielkovín a tvorbe kovalentných derivátov tio-, amino- a aromatických skupín R aminokyselín s organochlórovými zlúčeninami.
Pokrok. Pridajte niekoľko kvapiek 10% roztoku kyseliny trichlóroctovej (TCA) do skúmaviek s testovacími roztokmi a po niekoľkých minútach zaznamenajte výsledky
