Возможности использования бактериологического исследования при глазных заболеваниях ограничены пределами доступности патологического очага. При расположении его в заднем отрезке глаза получить материал для исследования часто очень Трудно и возможность бактериологической диагностики в таких случаях, естественно, исключается. Основная область применения бактериологической диагностики в глазной практике — это заболевания наружного отдела глаза, а также проникающие ранения, при которых материал для исследования может быть получен во время хирургической обработки раны или при извлечении инородного тела. Вообще надо заметить, что при оперативных вмешательствах круг возможностей для получения бактериологического материала значительно расширяется.
Получение материала для исследования
Для получения материала из конъюнктивального мешка пользуются платиновой петлей (при ее отсутствии можно использовать петлю, изготовленную из нити спирали электроплитки, или другой инструмент (стеклянная палочка, шпатель и т. п.), которую предварительно стерилизуют прокаливанием в пламени спиртовой горелки. Оттянув нижнее веко, остывшей петлей захватывают комочек конъюнктивального отделяемого из глубины нижнего свода. При этом необходимо избегать прикосновения петли к коже и краям век, чтобы не занести в материал постороннюю микрофлору. Брать материал желательно до начала лечения и в утренние часы, когда отделяемое бывает более обильным. При отсутствии слизи и гноя (например, при исследовании здоровой конъюнктивы перед операциями) следует использовать слезную жидкость или слегка поскоблить поверхность соединительной оболочки (по Линднеру). Но лучше в таких случаях применить методику Элыннига: впустить в конъюнктивальный мешок из пастеровской пипетки одну каплю стерильного физиологического раствора или бульона и через несколько секунд отсосать эту каплю.
По тем же общим правилам получают материал из слезного мешка, выдавливая его содержимое, и с края века при язвенном блефарите, сняв предварительно корочку с язвы.
Большая осторожность требуется при взятии материала с роговой оболочки, особенно при наличии ползучей язвы роговицы. Петлю (или другой тупой инструмент) следует направлять косо к поверхности язвы и брать материал из прогрессирующего края ее. При этом необходима анестезия (3 капли 1% дикаина) и фиксация глазного яблока.
В качестве материала для исследования при проникающих ранениях глаза можно использовать отделяемое раны (если оно имеется), захватив его петлей или марлевым тампоном, пунктат передней камеры или извлеченное инородное тело, которое помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора. После встряхивания пробирки раствор используют для исследования.
Из передней камеры материал для исследования может быть получен с режущего инструмента во время парацентеза или посредством пункции. После анестезии роговицы (3 капли 1% раствора дикаина) и фиксации глазного яблока косо у лимба вкалывают иглу шприца, вводят ее в переднюю камеру (осторожно, не ранить радужную оболочку и капсулу хрусталика!) и отсасывают 0,3 мл содержимого передней камеры.
При эндофтальмите может возникнуть потребность в получении материала из стекловидного тела. Пункция глазного яблока проводится после анестезии (1 мл 2% раствора новокаина под конъюнктиву) острой и с достаточно широким просветом иглой, вкалываемой ближе к экватору. Отсасывается 0,3-0,5 мл внутриглазного содержимого.
Полученный материал подвергается изучению с целью выявления микроба и определения его вида (микробиологический диагноз). Материал может изучаться:
- на предметном стекле (бактериоскопический метод);
- в посевах (собственно бактериологический метод);
- в эксперименте на животном (биологический метод).
Бактериоскопический метод
может быть использован в условиях любого глазного стационара при наличии несложного лабораторного оборудования и некоторых реактивов.
Для этого необходимо иметь следующее:
- металлическую петлю;
- чистые предметные стекла (на чистом стекле капля воды расплывается, а не принимает шаровидную форму);
- ванночку с подставками для предметных стекол (стеклянные палочки или толстая медная проволока);
- дистиллированную воду;
- спирт;
- пинцет;
- фильтровальную бумагу;
- раствор Люголя (йода 1 г, йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 300 мл);
- растворы красок (лучше в склянках, закрытых пипетками с резиновыми баллончиками).
Для очистки новые стекла кипятят в 1% растворе соды (можно использовать золу), а затем промывают водой, слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, помещают на 1-2 часа в серную кислоту, после чего кипятят в растворе соды, промывают водой и опускают в 96° спирт. Хранят стекла либо в спирте, либо, вытерев спирт, сухими, в банках с притертой пробкой.
Наиболее употребительные краски: карболовый фуксин Циля (фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта 96° 10 мл, глицерина — несколько капель, дистиллированной воды 100 мл). Для окраски фуксин Циля обычно разводят дистиллированной водой в 10 раз (разведенный, или водный фуксин). Метиленовая синька (метиленовой синьки 10 г, спирта 96° 100 мл). Из нее готовят щелочную синьку Леффлера (спиртового раствора синьки 30 мл, 1% калийной или натриевой щелочи 1 мл, дистиллированной воды 100 мл). Карболовый генцианвиолет (готовится так же, как карболовый фуксин Циля).
Микробов изучают либо в живом виде (способы «раздавленной» и «висячей» капли), либо убитыми (в окрашенном препарате). Исследование в живом виде в основном выявляет способность микробов к активному движению, тогда как окрашенные препараты позволяют хорошо изучить их морфологию.
Различают простые способы окраски, когда обычно употребляется одна краска, и сложные способы окраски, выявляющие некоторые особенности физико-химического строения микробной клетки и имеющие поэтому дифференциально-диагностическое значение.
Техника приготовления окрашенных препаратов сводится к следующему. Материал наносят на чистое предметное стекло и равномерно распределяют по поверхности в виде кружка или овала. Мазок должен быть достаточно тонким. При наличии густого гноя следует предварительно нанести на предметное стекло одну каплю дистиллированной воды и размешать материал в этой капле. Мазок высушивают на воздухе. Стекло с высушенным препаратом берут за края большим и указательным пальцами мазком кверху и фиксируют троекратным проведением через пламя спиртовой горелки (на границе светлой и темной его части). При достаточной фиксации ощущается легкое жжение в пальцах. Зафиксированный мазок окрашивают. Готовят несколько препаратов, по меньшей мере два, один из которых окрашивают простым способом (метиленовая синька Леффлера, разведенный фуксин Циля), другой — по способу Грама.
Окрашивание по Леффлеру:
- на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор синьки Леффлера на 3-5 минут;
- препарат промывают дистиллированной водой и высушивают.
Окрашивание по Граму:
- на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты;
- сливают краску, снимают бумажку и, не промывая водой, наливают яа препарат люголевский раствор на 1 минуту; при этом мазок чернеет;
- сливают люголевский раствор и обесцвечивают мазок спиртом (лучше путем погружения препарата в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек);
- тщательно промывают водой;
- заливают мазок разведенным фуксином на 1-2 минуты;
- сливают краску, промывают препарат водой и высушивают.
Удобный способ Грама в модификации Синева, который предложил пользоваться заранее приготовленными кусочками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генцианвиолета и высушенной. На мазок предварительно наносят 2-3 капли воды и затем кладут эти кусочки бумаги. Дальше поступают, как описано выше.
Микроскопию мазков производят с иммерсионным объективом. При окраске по Леффлеру все микробы окрашиваются в синий цвет; при окраске по Граму — либо в сине-фиолетовый (грамположительные микробы), либо в красный цвет (грамотрицательные микробы).
Ограниченное число микробов, участвующих в заболеваниях наружного отдела глаза, и их характерные морфологические признаки нередко позволяют поставить правильный микробиологический диагноз уже с помощью одного только бактериоскопического исследования.
Бактериологический метод
становится необходимым в тех случаях, когда изучение в мазках оказывается недостаточным для установления вида микроба или возникает потребность в определении чувствительности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам.
Отсылая за подробным ознакомлением с бактериологическим методом к специальным руководствам по микробиологии, остановимся здесь лишь на принципах этого метода. Первый этап работы сводится к выделению отдельных видов микробов, т. е. к получению чистых культур. Для этого прибегают к механическому разобщению материала при посеве и к использованию сред, наиболее пригодных для развития предполагаемых возбудителей (элективные среды). Путем пересева отдельных колоний, выросших на среде, получают чистую культуру, которую исследуют под микроскопом (готовят мазки) и пересевают на дифференциально-диагностические среды для изучения биохимических свойств возбудителя.
Высокая требовательность большинства патогенных для глаза микробов в условиях культивирования обусловила преимущественное применение для их выделения элективных сред, содержащих нативный белок. Таковы, например, среда Эльшнига (одна часть лошадиной сыворотки или асцитической жидкости и две части бульона), свернутая сыворотка Леффлера (три части сыворотки и одна часть бульона с 1% пептона, 0,5% NaCl и 1% виноградного сахара), кровяной агар Левенталя (агар и 5-10% дефибринированной крови).
Что касается определения чувствительности микробов к антибиотикам, то наиболее простой способ такого определения заключается в использовании специально изготовляемых промышленностью дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных растворами антибиотиков и высушенных в вакууме. Материал для исследования (гной, пунктат, извлеченное инородное тело) помещают в стерильную пробирку с физиологическим раствором (1,5-2 мл). После встряхивания жидкость выливают в чашки Петри, лучше в две — одну с сахарным, другую с кровяным агаром — и покачиванием равномерно распределяют по поверхности среды. Затем на поверхность агара накладывают диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашек. Чашки ставят в термостат (37°) и на следующий день по величине зоны задержки роста вокруг дисков судят о степени чувствительности микроба к испытуемым антибиотикам. Отсутствие зоны задержки роста указывает на нечувствительность микроба к данному антибиотику.
Биологический метод
в глазной практике применяется только в тех случаях, когда при затрудненной диагностике токсигенное свойство может оказаться решающим в определении вида микроба (например, при дифференциальной диагностике дифтерийной палочки и палочки ксероза).
Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаза
В настоящее время специальное изучение вирусов, в том числе вируса трахомы (рис. 77), осуществляется с помощью культивирования их в культурах тканей (куриный эмбрион, асцит-карцинома мышей и др.) и электронной микроскопии.
Рис. 77. Клеточные включения при трахоме.
В клинической практике для диагностики трахомы применяется метод цитологического изучения соскоба конъюнктивы на наличие или отсутствие телец (включений) Провачека—Гальберштедтера. Для этого тупым скальпелем или краем предметного стекла соскабливают эпителиальный покров конъюнктивы (без крови), который наносят тонким слоем на предметное стекло, в течение 5 минут подсушивают на воздухе и фиксируют путем опускания на 15-20 минут в стаканчик с метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый эфир и абсолютный спирт в равном количестве). Окраску производят в течение 3-4 часов свежеприготовленным раствором краски Романовского—Гимза (из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем препарат промывают текучей водой, подсушивают на воздухе и исследуют под микроскопом. При этом ядра эпителиальных клеток оказываются окрашенными в розовый цвет, протоплазма — в светло-синий, включения — в синий, сине-фиолетовый цвет (рис. 77). Последние представляются в виде кокковидных образований, расположенных среди мелкозернистой массы, и признаются носителями трахоматозного вируса. Они чаще обнаруживаются в свежих случаях нелеченой трахомы, но могут встречаться и при паратрахомных конъюнктивитах.
Исследования последних лет выявили новую форму контагиозного вирусного заболевания глаз — эпидемический кератоконъюнктивит, а цитологическое изучение конъюнктивального соскоба при этом заболевании позволило обнаружить в эпителиальных клетках своеобразные включения, совершенно отличные от телец Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошинская).
Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.
К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
- взятие материала до начала этиотропного лечения;
- соблюдение условий стерильности при сборе материала;
- техническую правильность сбора материала;
- достаточное количество материала;
- обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
- сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.
Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.
Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.
Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.
Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.
Цель:
1. Освоить III этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
Знать:
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
2. Понятие «вид». Критерии вида.
3. Метаболизм микроорганизмов и его особенности.
4. Принцип и методы изучения биохимической активности микроорганизмов.
5. Цель и методы определения антибиотикограмм микроорганизмов в клинической микробиологии.
Уметь:
1. Определить чистоту исследуемой культуры.
2. Посеять исследуемую культуру на «пестрый ряд», среду для определения подвижности.
3. Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения аэробов.
2. Методы определения чистоты исследуемой культуры.
3. Классификация микроорганизмов по типам питания. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.
4. Ферменты микроорганизмов; их значение в метаболизме клетки. Конститутивные и индуцибельные ферменты.
5. Цель и методы изучения биохимической активности микроорганизмов в микробиологической практике.
6. Прямые и косвенные методы определения подвижности микроорганизмов.
7. Диско-диффузионный метод определения антибиотикограмм: сущность, методика постановки.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести III этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
Определить чистоту выделенной культуры;
Посеять чистую исследуемую культуру на короткий «пестрый ряд»;
Посеять исследуемую культуру в столбик полужидкого агара;
Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
2. Ознакомиться с системами для биохимической идентификации бактерий.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Проведение III этапа бак. метода выделения чистых культур аэробов:
1.1. Определение чистоты выделенной культуры.
О чистоте культуры свидетельствует однородность роста и наличие в препарате микроорганизмов одного вида. Поэтому при макроскопическом исследовании роста, отмечая его интенсивность (скудный, умеренный, обильный), прозрачность, цвет обратите внимание на его однородность. Приготовьте фиксированный препарат, коснувшись петлей нижней, средней и верхней части косяка, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Полученные результаты внесите в протокол и сделайте вывод. В том случае, если выделенная Вами культура чистая, приступайте к дальнейшему ее исследованию.
1.2. Посев культуры на «пестрый ряд».
Проведите посев чистой исследуемой культуры на «пестрый ряд»: полужидкие среды Гисса с индикатором ВР, углеводами (глюкоза, лактоза, маннит) и МПБ.
Пересев в полужидкие среды осуществляется бактериологической иглой или бак. петлей диаметром 1 мм уколом в толщу агара, не доходя до дна пробирки »1 мм. При пересеве в жидкие среды петлю с биомассой исследуемой культуры погружают в жидкость, растирают на стенке пробирки и смывают. После этого между стенкой пробирки и пробкой помещают индикаторные бумажки для определения индола и сероводорода (H 2 S), не допуская смачивания краев пробирки и пробки питательной средой!
Основой изучения биохимических свойств микроорганизмов с целью их идентификации является определение промежуточных и (или) конечных продуктов метаболизма. Таксономическое значение имеют сахаролитические и протеолитические свойства бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах, входящих в состав «пестрого ряда».
Определение сахаролитических свойств производится на средах Гисса. Их состав: пептонная вода, 1% углевода, индикатор Андреде (ВР или др.), 0,3-0,5% агара, если среда полужидкая; если среда жидкая, то в пробирки опускают поплавки (короткие стеклянные трубочки, запаянные с одного конца).
Критерии учета результатов:
· цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;
· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот);
· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке - культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов.
Определения протеолитических свойств производится на пептонной воде (ПВ) или мясо-пептонном бульоне (МПБ) с учетом образования конечных продуктов метаболизма белков (пептона, аминокислот) – индола, H 2 S, а в ряде случаев аммиака.
Образование индола сопровождается окрашиванием в розовый цвет индикаторной бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (метод Мореля); образование сероводорода – почернение индикаторной бумажки, пропитанной ацетатом свинца; образование аммиака – посинением лакмусовой бумажки.
МПБ и ПВ предназначены также для изучения характера роста микроорганизмов в жидкой питательной среде. Рост микробов может быть в виде диффузного помутнения, придонного осадка, пленки на поверхности среды.
1.3. Посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара.
Произведите посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара уколом с помощью бак. иглы или бак. петли диаметром 1 мм.
Посев культуры в столбик полужидкого агара позволяет определить ее отношение к молекулярному кислороду, а значит и косвенно составить представление о способе получения энергии. Критерием учета и оценки является характер роста: рост только сверху среды – культура является аэробом , только в нижней чсти среды – анаэробом ; сверху и по уколу – факультативным анаэробом ; рост на некотором расстоянии от поверхности среды – микроаэрофиллом .
При этом способе посева у факультативно-анаэробных микроорганизмов можно определить подвижность. Рост строго по уколу – культура неподвижна, рост диффузный – подвижна.
1.4. Определение антибиотикограммы исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
Этиотропную антимикробную химиотерапию клиницисты проводят с учетом результатов бак. метода, который наряду с выделением возбудителя из клинического материала и его идентификацией включает определение чувствительности к антимикробным химиопрепаратам. Для определения чувствительности в России чаще всего используют диско-диффузионный метод (ДДМ).
Для определения антибиотикограммы приготовьте взвесь исследуемой культуры в стерильном физиологическом растворе и доведите до мутности 0,5 по МакФарланду (1,5 х 10 8 КОЕ/мл). Для посева используйте стерильный ватный тампон, который погрузите в пробирку с суспензией, ротируйте его, чтобы он равномерно пропитался, а затем тщательно отожмите о сухую стенку пробирки выше уровня жидкости путем покручивания. Посев культуры на чашку со средой АГВ проведите штрихами в трех направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. В заключение сделайте несколько вращательных движений тампоном по краям агаровой поверхности. После этого посевам дайте возможность подсохнуть в течение нескольких минут при комнатной t° в чашках с закрытыми крышками. Диски с антибиотиками нанесите не позднее 15 мин после инокуляции стерильным пинцетом или с помощью автоматического диспенсора. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм помещают не более 6 дисков. Каждый диск следует аккуратно прижать пинцетом, чтобы обеспечить его контакт с питательной средой. Чашки непосредственно после наложения дисков подпишите и поместите вверх дном в термостат при 37° на 18-20 ч.
Методика бактериологического исследования . Выделение возбудителя из крови (гемокультура) является ранним методом диагностики заболеваний. Бактериемия у больных тифо-паратифозным заболеванием появляется в конце инкубационного периода и не исчезает в течение всего лихорадочного периода болезни и во время рецидивов. Результаты бактериологического исследования в определенной степени зависят от сроков взятия материала и от количества засеваемой крови. Чем раньше от начала болезни произведен посев крови, тем больше вероятность обнаружения возбудителя. На первой неделе брюшного тифа кровь у больного берут из локтевой вены в количество 10 мл, в более поздние сроки и во время рецидивов - 20 мл.
В первый день исследования кровь засевают в соотношении 1:10 в одну из жидких сред. Указанное соотношение необходимо точно соблюдать, так как при меньшем разведении крови микробы могут погибнуть из-за бактерицидного ее действия. Для посева пользуются: 10% или 20% раствором желчного бульона, разлитого по 50-100 мл во флаконы, мясо-пептонным бульоном с добавлением 1 % глюкозы, стерильной дистиллированной водой - по методу Н. Н. Клодницкого, в которой происходит лизис эритроцитов, продукты их распада при этом служат хорошей питательной средой для размножения бактерий. Можно также использовать стерильную водопроводную воду. Лучшие результаты получаются при посевах материала на желчный бульон. Если невозможно произвести посев крови на месте, сыворотку вместе со сгустком или цитратную кровь (10 мл крови выливают в пробирку с 2 мл 5% стерильного натрия цитрата) направляют в лабораторию. Сгусток крови в лаборатории измельчают и засевают в одну из перечисленных сред. Флаконы помещают в термостат при температуре 37° С.
Второй день исследования . Через 14-24 ч от начала исследования производят посев материала в чашку Петри на среду Эндо или среду с эозином и метиленовым синим (среда Левина). Не рекомендуют использовать для посева среду Плоскирева, так как тифо-паратифозные палочки, находящиеся в крови, являются по типу питания облигатными паратрофами и не сразу меняют этот тип питания на метатрофный (то есть мертвыми органическими субстратами). Поэтому на этой среде, содержащей соли желчных кислот, палочки брюшного тифа растут очень плохо либо совсем не растут. При отсутствии роста бактерий после первого посева производят последующие через 48, 72 ч и на 5-е и 10-е сутки. Если при этом возбудитель выделить не удалось, выдается отрицательный ответ. В сомнительных случаях рекомендуют периодически - 1 раз в 3-4 дня - производить посевы до 24-го дня с момента взятия материала. Отрицательный ответ выдается все же на 7-й день.
Третий день исследования . Выросшие на средах Эндо и Левина «подозрительные» колонии (на среде Эндо колонии патогенных микробов бесцветны) идентифицируют, для чего 2-3 колонии пересевают на скошенный агар и среду Ресселя.
Четвертый день исследования . Учитывают и регистрируют результаты посева на среде Ресселя, изучают морфологические свойства выделенных культур в мазке, окрашенном по Граму. Определяют подвижность - наличие или отсутствие жгутиков - в висячей или раздавленной капле, взятой из 4-6-часовой бульонной культуры. Для этого агаровую культуру (одну петлю) засевают в 1 мл слегка подогретого бульона. Пересевают отобранные культуры (2-3 пробирки) на среды Гисса с маннитом, сахарозой и косой агар, а также в 2 пробирки с мясо-пептонным бульоном, в которые под пробки помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные специальными растворами для определения сероводорода и индола (развернутый «пестрый ряд»).
Пятый день исследования . Регистрируют изменения на развернутом «пестром ряду». При наличии газообразования ставят реакцию агглютинации со смесью сальмонеллезных сывороток. При положительной реакции проводят реакцию агглютинации с О- и Н-сыворотками и выдают окончательный ответ на основании совокупности всех признаков.
Выделение миелокультуры осуществляют путем посева полученного пунктата костного мозга в 3-5 мл бычьей стерильной желчи или в 25-30 мл 10% желчного бульона, ставят его в термостат и на следующий день производят пересев на среды Эндо или Вильсона - Блера. В дальнейшем этапы исследований те же.
Выделение бактерий из кала. С 8- 10-го дня болезни, чаще с третьей недели, у больных брюшным тифом, паратифами выделяются с испражнениями бактерии. Для исследования берут последние порции кала жидкой консистенции, эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида (в соотношении 1:10) и оставляют на 30 мин до оседания крупных частиц. Для посева каплю материала берут с поверхности жидкости.
В первый день исследования материал засевают на среды обогащения - желчный бульон, среды магниевую, Мюллера, Кауфмана - и ставят в термостат. На второй день исследования со среды обогащения делают посев на чашки со средами Плоскирева, Эндо или Левина и Вильсона - Блера (висмут-сульфит-агар). В последующем этапы исследования те же, что при выделении гемокультуры.
Выделение бактерий тифо-паратифозной группы из мочи лучше производить со второй третьей недели болезни. Перед взятием материала следует обмыть стерильным изотоническим раствором натрия хлорида наружное отверстие мочеиспускательного канала; у женщин лучше брать мочу катетером. Для исследования берут 20-30 мл мочи. После центрифугирования осадок засевают в 2 чашки со средой Плоскирева или висмут-сульфит-агаром. Надосадочную жидкость засевают на среду обогащения (10% желчный бульон) и ставят в термостат на 24 ч, после чего производят посев в 2 чашки одной из элективных сред. Выделенные колонии идентифицируют обычным способом.
Исследование дуоденального содержимого - желчи. Метод чаще применяют в стадии реконвалесценции. Желчь собирают во время зондирования в стерильные пробирки. Дуоденальное содержимое засевают во флаконы с 50 мл бульона, а оставшуюся часть материала вместе с посевами помещают в термостат при 37° С. На следующий день делают посев в 2 чашки с плотной дифференциальной средой. Выделенные колонии идентифицируют по описанной методике.
Высокочувствительным и перспективным в ранней диагностике брюшного тифа и паратифов является метод иммунофлюоресценции, с помощью которого исследуют кровь с первых дней болезни, кал с 10-го дня, дуоденальное содержимое на 10-й день нормальной температуры тела. Специфическими флюоресцирующими сыворотками маркируют тифо-паратифозные бактерии, которые в последующем определяют при люминесцентной микроскопии. Метод позволяет диагностировать заболевание через 10-12 ч от начала исследования.
Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний. Со второй недели заболевания в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить с помощью реакции Видаля. При брюшном тифе и паратифах накапливаются О-, а затем и Н-агглютинины. В течение заболевания иногда обнаруживают и Vi-агглютинины, но последние, в отличие от но-сительства, не имеют диагностического значения. Определение в крови больных специфических агглютининов к возбудителю брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля) может оказать помощь в установлении диагноза как в остром периоде болезни, так и во время реконвалесценции.
При сальмонеллезах реакция Видаля является подсобным методом диагностики. Следует помнить, что нередко встречаются формы болезни со слабо выраженным иммунологическим ответом. Особенно часто низкие титры агглютининов, вплоть до их отсутствия, отмечают у больных, леченных антибиотиками.
Для реакции Видаля берут 1-3 мл крови из пальца или локтевой вены в стерильную пробирку. С целью ускорения свертывания крови ее ставят в термостат на 30 мин. Свернувшуюся кровь обводят стеклянной пипеткой и помещают в холодильник до появления прозрачной отстоявшейся сыворотки. Сгусток используют для посева (гемокультура). Реакцию агглютинации ставят с Н- и О-брюшнотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Сыворотку разводят, начиная с титра 1:100 до 1:800, по следующей методике. В пробирку наливают 9,9 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл испытуемой сыворотки - получают разведение 1:100. В 4 опытные пробирки (по числу антигенов, используемых в реакции Видаля), и в одну, служащую контролем сыворотки, разливают 5 мл разведенной сыворотки по 1 мл. Из оставшихся 5 мл сыворотки (разведения 1:100) 1 мл выливают, а к 4 мл добавляют 4 мл изотонического раствора натрия хлорида и получают разведение 1:200. 4 мл из разведения 1:200 разливают также в 4 пробирки по 1 мл, а к оставшимся 4 мл вновь добавляют 4 мл изотонического раствора натрия хлорида для получения разведения 1:400. Последующие разведения (1:800, 1:1600) производят описанным способом. В 4 пробирки, являющиеся контролем антигенов, вливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Во все опытные пробирки, исключая, те, которые служат контролем сыворотки, вливают по 1-2 капли соответствующих диагностикумов. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37° С на 24 ч. Н-агглютинация (крупнохлопчатая) наступает через 2 ч, О-агглютинация (мелкозернистая) - значительно позже. Интенсивность реакции отмечают через 24 ч. Диагностический титр реакции Видаля в разведении не менее чем 1:200 при наличии клинических проявлений.
Следует учитывать, что эта реакция может быть положительной при других заболеваниях - туберкулезе, малярии, бруцеллезе, злокачественных новообразованиях и некоторых состояниях (беременности). Реакция Видаля может быть положительной и у здоровых лиц (бытовая реакция), у привитых и перенесших в прошлом заболевание (анамнестическая реакция). Для повышения специфичности реакции Видаля Фишер предложил разводить сыворотку гипертоническим раствором натрия хлорида (2,9 и 5,8%). Это приводит к ослаблению или ликвидации групповых реакций. Ценность реакции агглютинации повышается при повторных исследованиях, когда с динамикой заболевания устанавливают нарастание титра антител. При паратифе А реакция Видаля может быть отрицательной либо титр специфических антител меньше групповых.
В последние годы для распознавания кишечной группы заболеваний широко применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с парциальными антигенами брюшнотифозных бактерий. РПГА отливается высокой чувствительностью и специфичностью, бывает положительной с 5-го дня болезни. Минимальный диагностический титр у больных брюшным тифом, паратифами, сальмонеллезом с О-антигеном - 1:200. Реакцию ставят в динамике для определения нарастания титра антител.
Методы лабораторной диагностики бактерионосительства при брюшном тифе и паратифах. Бактериологическое исследование кала, мочи и дуоденального содержимого проводят по общепринятым методам. Лучшие результаты получают при использовании селенитовых сред.
В связи с периодичностью выделения бактерий нередко не удается высеять возбудителя. У подавляющего большинства носителей палочек брюшного тифа обнаруживают микробы, содержащие Vi-антиген, в связи с чем в крови острых и хронических носителей появляются Vi-антитела (в крови больных они бывают реже). Диагностический титр реакции 1:20 и выше. Параллельно с реакцией Vi-агглютинации (с прогретой сывороткой) ставится реакция Видаля (с нативной сывороткой) с Н- и О-брюшнотифозными диагностикумами. В сыворотках брюшнотифозных бактерионосителей Н-антитела в титре от 1:200 до 1:800 встречаются в 60-80% случаев. Наличие сочетания Н- и Vi-антител имеет особое диагностическое значение в выявлении носителей палочек брюшного тифа.
Из дополнительных методов исследования для выявления носительства палочек брюшного тифа применяют кожно-аллергическую пробу с тифином, а также РПГА с Vi-антигеном.
Таким образом, важным условием успеха борьбы с тифо-паратифозными заболеваниями является раннее и полное выявление и обезвреживание источника инфекций. В настоящее время брюшной тиф встречается спорадически. При этом течение болезни менее длительное и не сопровождается всеми типичными для классической формы признаками, что затрудняет клиническое распознавание.
В связи с изложенным комплексное лабораторное обследование приобретает важное значение.
