Imunoblotting (imunoblotting) je vysoko špecifická a vysoko citlivá referenčná metóda, ktorá potvrdzuje diagnózu u pacientov so získanými pozitívnymi alebo neurčitými výsledkami testov, vr. pomocou RIGA alebo ELISA. Imunoblotting je typ heterogénneho imunotestu.
Táto metóda detekcie protilátok proti jednotlivým antigénom patogénu je založená na vykonávaní ELISA na nitrocelulózových membránach, na ktoré sú nanesené špecifické proteíny vo forme samostatných pásov oddelených gélovou elektroforézou. Ak existujú protilátky proti určitým antigénom, na príslušnom mieste prúžku sa objaví tmavá čiara. Jedinečnosť imunoblotu spočíva vo vysokom informačnom obsahu a spoľahlivosti získaných výsledkov.
Materiálom pre štúdiu je ľudské sérum alebo plazma. Na výskum na jednom prúžku je potrebných 1,5-2 ml krvi alebo 15-25 µl séra.
Laboratory Diagnostics LLC používa imunoblotovacie súpravy na detekciu protilátok proti patogénom rôznych chorôb od EUROIMMUN (Nemecko), MIKROGEN (Nemecko):
HSV 1 a HSV 2 IgM/IgG(infekcia vírusom herpes)
CMV IgM/IgG(cytomegalovírusová infekcia)
IgG proti rubeole
Profil TORCH IgM(Toxoplazmóza, rubeola, cytomegalovírus, HSV 1 a HSV 2)
EBV IgMTIgG(infekcia vírusom Epstein-Barrovej)
HCV IgG(vírusová hepatitída C)
Používajú sa dva typy súprav - Western blot a line blot.
Western blot: Súpravy obsahujú testovacie membránové prúžky s elektroforeticky oddelenými natívnymi antigénmi zodpovedajúcich infekčných agens, t.j. antigény sú usporiadané v poradí podľa molekulovej hmotnosti. Na membrány možno tiež aplikovať 1-2 ďalšie línie s klinicky významnými antigénmi (Western line blot). Ide o spoľahlivú potvrdzujúcu metódu, ktorá eliminuje falošne pozitívne odpovede a krížové reakcie.
Čiarová škvrna: V tomto prípade sa na membrány testovacích prúžkov aplikujú iba klinicky významné antigény (natívne, syntetické alebo rekombinantné) v určitom poradí. Tento prístup sa používa pri diferenciálnej diagnostike niekoľkých infekcií na jednom prúžku.
Jeho podstata spočíva v prenose molekúl skúmanej látky z jedného pevného nosiča používaného na frakcionáciu biopolymérov do druhého, kde sú špecificky identifikované pomocou imunochemickej reakcie. Moderná vysoko citlivá metóda spočíva v identifikácii proteínov vrátane vírusových antigénov. Metóda je založená na kombinácii gélovej elektroforézy a reakcie antigén-protilátka. Vysoký stupeň rozlíšenia sa dosahuje prostredníctvom elektroforetickej separácie proteínov, glyko- a lipoproteínov a maximálnej špecifickosti detekcie imunitných sér alebo monoklonálnych protilátok. Za optimálnych podmienok môže imunoblotting detegovať antigén v množstvách menších ako 1 ng v testovacom objeme. Technicky sa imunoblotovanie vykonáva v troch krokoch:
1) proteíny, ktoré sa majú analyzovať, sa separujú v polyakrylamidovom géli v prítomnosti denaturačných látok: dodecylsulfátu sodného alebo močoviny, tento proces sa často označuje ako SDS-PAGE; separované proteíny je možné vizualizovať po farbení a porovnať s referenčnými vzorkami;
2) oddelené proteíny sa prenesú z gélu prekrytím (blotovaním).
nitrocelulózový filter a pripevnený na ňom; v mnohých prípadoch, ale
Kvantitatívne pomery proteínov nie sú počas prenosu vždy zachované;
3) na filtre sa aplikujú poly- alebo monoklonálne detektory
protilátky obsahujúce rádioizotopovú alebo enzýmovú značku; Pre
na detekciu naviazaných protilátok sa používa aj protidruhový test
označené sérum, inými slovami, v konečnom štádiu blotovania
podobne ako pri imunotestoch na pevnej fáze.
Malo by sa pamätať na to, že v tomto nastavení imunoblotovania sú proteíny v denaturovanom stave, a preto ich protilátky špecifické pre natívny proteín nemusia rozpoznať, ale v prítomnosti séra na všetky zložky peptidov je možné rozpoznať celé antigénne spektrum súčasne sa deteguje testovaný proteín. Imunoblotting je pomerne široko používaný pri štúdiách štruktúry vírusov hepatitídy, najmä na stanovenie antigénneho vzťahu medzi jednotlivými kmeňmi. Vysoké rozlíšenie imunoblotovania umožňuje získať dobré výsledky v diagnostickej praxi, keď je potrebné identifikovať vírus v tkanivách alebo exkrétoch pacienta.
V závislosti od skúmanej látky sa rozlišuje DNA, RNA a proteín - blotting.
Imunochemická detekcia antigénov sa môže uskutočniť použitím protilátok konjugovaných so značkou. V poslednej dobe sa ako značky široko používajú buď rádioaktívne izotopy alebo enzýmy (peroxidáza, alkalická fosfatáza, laktamáza atď.).
Doba blotovania difúziou je 36-48 hodín Ale najrýchlejší a najefektívnejší spôsob prenosu proteínov z gélov je elektroblotovanie, ktoré zvyčajne trvá 1-3 hodiny, pri niektorých vysokomolekulárnych proteínoch aj viac ako 12 hodín.
Konkrétny výber sorbentov pre rôzne modifikácie blotov (podľa toho spracovaný nitrocelulózový alebo papier), výber blokovacích podmienok a imunochemická detekcia antigénov úplne závisí od antigénu, jeho množstva, metódy imunoanalýzy a účelu štúdie.
Schopnosť detegovať protilátky proti špecifickým antigénom patogénu umožňuje posúdiť významnosť týchto protilátok (špecifickosť pre daný etiologický agens) a vylúčiť reakciu na krížové antigény. To odlišuje imunoblotting od ELISA, kde sa môžu ako antigén použiť rôzne kombinácie antigénnych determinantov – špecifické aj nešpecifické, čím dochádza ku krížovým reakciám s inými patogénmi. V inom prípade, ak sa pri ELISA získa pozitívny výsledok, možno len predpokladať, že ide o dôsledok skríženej reakcie, ale v prípade imunoblotingu je to presvedčivé
Z viacerých dôvodov sa metóda informačnej bezpečnosti najviac rozšírila ako metóda vhodná na použitie ako potvrdzovací test.
Nepochybnou výhodou metódy je možnosť testovania protilátok proti slabo alebo úplne nerozpustným antigénom a eliminácia štádia vnášania rádioaktívnej značky do antigénov.
Citlivosť v prípade IB sa posudzuje podľa maximálneho množstva antigénu aplikovaného na gél, ktorý je možné pri frakcionácii proteínov imunochemicky detegovať po prenose z gélu do pevnej fázy (nitrocelulóza). Celková citlivosť testu závisí od mnohých dôvodov: od podmienok frakcionácie a imobilizácie antigénu na pevnom nosiči, od úrovne pozadia, od špecificity a afinity protilátok. Dôležitý je typ použitej značky a spôsob jej identifikácie.
Metóda imunoblotovania teda umožňuje identifikovať antigénové zóny na pevnej fáze bez toho, aby sa celý proteín viazal na špecifické sérové protilátky. Imunoblotting a jeho modifikácie sa používajú najmä na typizáciu bakteriálnych a vírusových antigénov a protilátok, najmä v prípade nedostatočného rozlíšenia konvenčných systémov, ako aj pri analýze imunoglobulínov, nukleových kyselín alebo ako konfirmačný test v kombinácii s inými metódami.
Existujú veľké ťažkosti pri interpretácii prierezových výsledkov v reakciách a v prípadoch počiatočných štádií sérokonverzie. V prvej situácii sa počas opakovanej štúdie po určitom čase nezistia žiadne protilátky, ale v druhom imunoblote sa objavia nové pásy, ktoré naznačujú výskyt protilátok proti HIV proteínom alebo glykoproteínom, ktoré charakterizujú dynamiku odozvy imunitnej reakcie na vírusové antigény.
Je to vlastne posledná overovacia metóda v reťazci sérologických štúdií, ktorá umožňuje urobiť konečný záver o HIV pozitivite pacienta alebo ju odmietnuť. Na uskutočnenie IB sa používajú nitrocelulózové prúžky, na ktoré sa HIV proteíny vopred prenesú horizontálnou a potom vertikálnou imunoforézou v poradí so zvyšujúcou sa molekulovou hmotnosťou. Protilátky v testovaných sérach interagujú s proteínmi v určitých oblastiach prúžku. Ďalší priebeh reakcie sa nelíši od ELISA, to znamená, že zahŕňa ošetrenie prúžku konjugátom a chromogénovým substrátom, zmytie nenaviazaných zložiek a zastavenie reakcie destilovanou vodou. Predbežná elektroforetická separácia proteínov a ich fixácia na nitrocelulóze umožňuje identifikovať protilátky proti špecifickým proteínom v súlade s prítomnosťou (alebo absenciou) zafarbenia (sivomodrej) zodpovedajúcich zón prúžku. Imunoblotting nie je možné použiť na hromadné skríningové štúdie kvôli jeho vysokej cene a je to metóda individuálneho rozhodovania v konečnom štádiu sérologickej štúdie.
Existuje pomerne jasná korelácia medzi výsledkami testovania séra v IB a ELISA. Séra, ktoré sú dvakrát pozitívne v ELISA (v rôznych testovacích systémoch), sú potom v IB interpretované ako HIV pozitívne v 97-98 % prípadov. Séra, ktoré sú pozitívne v ELISA len v jednom z dvoch použitých testovacích systémov, sa ukážu ako HIV-pozitívne pri IB nie častejšie ako v 4 % prípadov. Pri vykonávaní potvrdzujúcich štúdií môže približne 5 % IB poskytnúť takzvané „neurčité“ výsledky, ktoré spravidla zodpovedajú pozitívnemu testu ELISA, ale nie RIP. V približne 20 % prípadov sú „neurčené“ IB spôsobené protilátkami proti HIV-1 gag proteínom (p55, p25, p18). Ak sa získajú pochybné výsledky imunoblottingu, štúdia sa musí zopakovať po 3 mesiacoch a ak výsledok zostane neistý, po 6 mesiacoch.
Rádioimunoanalýza (RIM) (rádioimunoanalýza, RIA) Rádioimunoanalýza je metóda kvantitatívneho stanovenia biologicky aktívnych látok (hormónov, enzýmov, liečiv a pod.) v biologických tekutinách, založená na kompetitívnej väzbe požadovaných stabilných a podobných rádionuklidom značených látok so špecifickými väzbovými systémami. Posledne menované sú najčastejšie špecifické protilátky. Vďaka tomu, že sa značený antigén pridáva v určitom množstve, je možné určiť časť látky, ktorá je na protilátky naviazaná a časť, ktorá zostáva neviazaná v dôsledku konkurencie s detekovaným neznačeným antigénom. Štúdia sa uskutočňuje in vitro. Pre R. a. vyrábať štandardné sady činidiel, z ktorých každé je určené na stanovenie koncentrácie jednej látky. Štúdia prebieha v niekoľkých fázach: biologický materiál sa zmieša s činidlami, zmes sa inkubuje niekoľko hodín, oddelia sa voľné a viazané rádioaktívne látky, vykoná sa rádiometria vzorky a vypočítajú sa výsledky. Metóda je vysoko citlivá, možno ju použiť v diagnostike ochorení kardiovaskulárneho, endokrinného a iného systému, na zisťovanie príčin neplodnosti, porúch vývoja plodu, v onkológii na stanovenie nádorových markerov a sledovanie účinnosti liečby, na stanovenie koncentrácia imunoglobulínov, enzýmov a liečivých látok. V niektorých prípadoch sa štúdie vykonávajú na pozadí stresových funkčných testov (napríklad stanovenie hladín inzulínu v krvnom sére na pozadí glukózového tolerančného testu) alebo v dynamike (napríklad stanovenie pohlavných hormónov v krvi počas menštruačný cyklus).
Pomocou komerčnej súpravy od ABBOTT - Austria II-I 125 je možné detekovať HBsAg v koncentráciách až do 0,1 ng/ml. Medzi výhody metódy patrí možnosť štandardizácie a automatizácie metódy so získavaním odpovedí v digitálnych termínoch. Nevýhodou metódy sú obmedzenia dané spôsobom práce s rádioaktívnym materiálom a relatívne krátka doba použiteľnosti diagnostickej súpravy, ktorá je spojená s rozpadom rádioaktívnej značky.
Diagnostické súpravy na identifikáciu rôznych antigénov vírusov hepatitídy A, B a D a protilátok proti nim vyrába Izotop (Tashkent) a niektoré zahraničné spoločnosti (napríklad ABBOTT). Ako pevná fáza sa používajú polystyrénové guľôčky („EBBOTT“) alebo skúmavky („Izotop“). Na značenie protilátok alebo antigénov sa najčastejšie používa izotop I 125, ktorý má polčas rozpadu 60 dní a vysokú špecifickú rádioaktivitu. Meranie rádioaktívneho indikátora, t.j. žiarenia, sa vykonáva na špeciálnych počítadlách - rádiových spektrometroch. Počítanie rádioaktívnych impulzov v kontrolných aj skúšobných vzorkách sa vykonáva v jedinom pevne stanovenom čase, zvyčajne do 1 minúty. Pri analýze výsledkov reakcie je potrebné vziať do úvahy prítomnosť rádioaktivity pozadia, ktorá môže ovplyvniť konečný výsledok reakcie. Príčiny zvýšeného pozadia môžu byť: kontaminácia nádobky na vzorku alebo hniezda; nesprávne nastavenia zariadenia; prítomnosť zdroja silného žiarenia v blízkosti zariadenia.
Na potvrdenie pozitívneho výsledku získaného počas počiatočného skríningu vzoriek sa odporúča opakované testovanie pomocou RIA alebo alternatívny test. Ak sa zistí HBsAg, musí sa vykonať potvrdzovací test.
Tabuľka 1. Klasifikácia vakcín
Bibliografia:
Povinné:
1. Khaitov R.M., Ignatieva G.A., Sidorovič I.G. Imunológia: Učebnica.-M.: Medicína, 2000.- 432 s.: il. (Učebnica pre študentov lekárskych vysokých škôl).
2. Kovalchuk L.V. Imunológia: workshop: učebnica. manuál – M.: GEOTAR-Media, 2012. – 176 s.
3. Pozdeev O.K. Lekárska mikrobiológia / vyd. akad. RAMS V.I. Pokrovsky - M.: GEOTAR-Media, 2001. – 768 s.
4. Borisov L.B. Sprievodca praktickými hodinami mikrobiológie. M. 1997
Ďalšie:
1. Genkel P.A., Mikrobiológia so základmi virológie. M., 1974
2. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia: učebnica pre med. univerzity - 3. vydanie, prepracované. a dodatočné – Petrohrad, SpetsLit. 2002. – 591 s.
3. Borisov L.B., Smirnova A.M., Lekárska mikrobiológia, virológia, imunológia, M., Medicína. 1994
4. Timakov V.D., Levašov V.S., Borisov L.B. Mikrobiológia. M. 1983
HIV imunoblot zisťuje protilátky proti vírusovým proteínom umiestnené na špeciálnej nitrocelulózovej membráne. Ide o vysoko presnú štúdiu, ktorá identifikuje prítomnosť frakcií, v ktorých sa hlavné proteíny nachádzajú vo forme malých pásikov.
Vírusový obal HIV-1 obsahuje glykoproteíny s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí od 41 kd do 160 kd (kilodaltonov). Veľký význam pre imunobloting má HIV-2 glykoproteín s molekulovou hmotnosťou od 32 kd do 140 kd. Jadrové proteíny HIV-1 a vírusové enzýmy sú reprezentované proteínmi p17, p24, p55.
Pôvodca HIV-2 pozostáva z proteínov označených p16, p25, p56. Tvoria jeho vnútornú škrupinu. Genóm obsahuje 6 regulačných a 3 štruktúrne gény. Často pri delení buniek vznikajú genetické nepresnosti a objavuje sa niekoľko podtypov patogénu.
Pozitívne testy
Na odstránenie chýb v laboratórnej diagnostike infekcie HIV je pacientovi predpísaný ďalší test. Jeho výsledky sú integrované ako pozitívne, ak sa zistia protilátky proti 2 alebo 3 proteínom HIV-1 alebo HIV-2.
Imunoblot potvrdzuje všetky dobré výsledky ELISA. V tomto prípade sa detegujú protilátky proti gp120/160, gp41 alebo p24, čo sú štruktúrne jednotky troch hlavných génov AIDS - gag, pol a env. U niektorých pacientov, ktorí majú negatívne výsledky ELISA a PCR, imunoblot ukazuje niekoľko pozitívnych prúžkov. Lekár predpíše dodatočný test p24 na stanovenie správnej diagnózy a vylúčenie skorej fázy infekcie HIV.
Ak sú získané výsledky pochybné, pacient je požiadaný, aby zopakoval test počas nasledujúcich 3 mesiacov. Takmer všetky prípady HIV sú potvrdené pomocou imunoblotovacieho systému – prístroja Sanofi. Vo väčšine prípadov sa detegujú antigény HIV, proteíny p25, gp110/120 a gp160, čo naznačuje infekciu vírusom. Falošne pozitívny test je registrovaný u pacientov trpiacich chorobami spojivového tkaniva so zvýšenými hladinami bilirubínu pri interakcii s rôznymi vírusovými antigénmi.
Negatívny výsledok
Ak chýbajú pozitívne línie zodpovedajúce proteínom vírusu AIDS, imunoblot sa interpretuje ako negatívny výsledok. Analýza jasne potvrdzuje neprítomnosť infekcie vírusom imunodeficiencie alebo naznačuje „obdobie okna“. Ak imunoblot dáva negatívny výsledok, osoba nie je nosičom vírusu AIDS.
Na štúdiu sa odoberú vzorky krvného séra od pacientov infikovaných HIV. Skladujú sa zmrazené pri -20 °C. Analýza sa vykonáva pomocou testovacích systémov:
- antigén;
- rekombinantný-HIV;
- Peptosscreen.
Registrácia negatívneho výsledku indikuje neprítomnosť protilátok proti HIV obalovým glykoproteínom gp120, gp160, Sp41 v sére.
Pacient sa často zaujíma o otázku, či pacient, ktorý má infikovaného sexuálneho partnera, môže mať negatívny výsledok imunoblotu na HIV. Po štúdii sa často získa pochybný výsledok alebo sa zistia protilátky proti proteínom gp120 a gp160, čo naznačuje úplnú absenciu negatívnych údajov. Niekedy je u pacientov s asymptomatickou infekciou zaznamenaná pochybná odpoveď.
Neinterpretovateľné výsledky
Testy vykonané pomocou rôznych testov na protilátky HIV sú niekedy negatívne a nespĺňajú kritériá séropozitivity. Pre lekára je ťažké určiť príčinu pochybného výsledku.
Niektorí pacienti nie sú vystavení riziku infekcie HIV. Lekár môže urobiť chyby pri interpretácii výsledkov testu, ak je infekcia spôsobená iným sérotypom.
Krvné sérum pacienta sa musí časom vyšetriť. Ak sa do 6 mesiacov nepozorujú žiadne klinické prejavy AIDS a neexistujú žiadne rizikové faktory, pacient sa zaznamená ako bez infekcie.
U pacientov s nízkym rizikom infekcie sa získajú sporné výsledky testov. V niektorých prípadoch je výskyt nejasných údajov spôsobený imunitnými komplexmi a autoprotilátkami obsiahnutými v krvnom sére.
U niektorých pacientov je výskyt sporných výsledkov spôsobený vývojom patologických procesov:
- infekčné choroby;
- rakovinový nádor;
- Alergická reakcia.
Pacient pociťuje zmeny v klinickom krvnom teste, zvýšenie C-reaktívneho proteínu alebo zvýšenie ESR. U ľudí trpiacich infekčnými chorobami sa často zistí pochybná imunoblotová reakcia na HIV.
Pacienti s neurčitými výsledkami nemôžu darovať krv a biologické materiály.
Lineárna metóda
Princíp imunoblotovania zahŕňa:
- Použitie natívnej vírusovej substancie vo formáte HIV alebo antigénov vo formáte Western Blot.
- Kombinácia HIV proteínov s jednotlivými protilátkami zistenými v krvnom sére.
- Inkubačný proces, ktorý nastáva po pridaní značených protilátok proti ľudskému Ig.
- Výklad farebných pruhov.
Analýza umožňuje lekárovi včas interpretovať výsledky štúdie. Pozitívny blot sa dešifruje ako 2ENV+/- GAG+/POL, neurčitý - 1 ENV+/- GAG+/POL. Negatívny výsledok znamená žiadne pruhy.
Na uskutočnenie analýzy sa používajú rekombinantné a lyzátové imunobloty. Štúdia je špecifická a predstavuje 99,5 %.
Pacienti sa pýtajú, či možno výsledok testu interpretovať ako falošný. Získané údaje môžu byť generované ako výsledok stimulácie obranyschopnosti organizmu (tehotenstvo, hemodialýza). Ak je podozrenie na akútny retrovírusový syndróm a odporúča sa kontakt s pacientom s infekciou HIV, pacientovi sa odporúča darovať sérum na PCR reakciu. Opakované sérologické vyšetrenie sa potvrdí meraním vírusovej záťaže v predloženej vzorke biologického materiálu.
Diagnóza HIV u novorodencov
Test na AIDS u malého dieťaťa sa vykonáva, ak sa nadviaže kontakt s matkou infikovanou HIV. Sérologické reakcie môžu byť pozitívne 1,5 roka. Protilátky v krvnom sére novorodenca sa detegujú pomocou ELISA, RIF a imunoblotovacích reakcií.
Počas 9 mesiacov života dieťaťa sa objaví pozitívny výsledok v dôsledku prítomnosti materských protilátok v krvnom sére. Antigén p24 má špecifickosť približne 65 %. V niektorých prípadoch nie je možné zistiť protilátky u chorého dieťaťa, ak má diagnostikovanú vrodenú nízku hladinu globulínov v krvi. Zistený negatívny výsledok imunoblotu nezaručuje absenciu infekcie.
Testovanie sa vykonáva v niekoľkých fázach:
- 1-2 dni po narodení;
- po 1-2 mesiacoch;
- vo veku šiestich mesiacov.
Ďalšia štúdia protilátok sa uskutočňuje, kým sa nezískajú 2 negatívne výsledky imunoblotu. Diagnóza AIDS u dieťaťa narodeného žene infikovanej HIV je možná na základe 2 pozitívnych výsledkov PCR. Prenos patogénu HIV na novorodenca je vylúčený, ak žena nedojčí.
Tehotenský test
Nastávajúcej matke je predpísaný imunitný a line blotting, ak sa pomocou ELISA získa pozitívny výsledok na HIV. Ak sa škvrna potvrdí, pacient má AIDS. V tomto prípade je od 14. týždňa tehotenstva predpísaná terapia na prevenciu infekcie dieťaťa.
Môže odborník urobiť chybu pri vykonávaní testu krvného séra počas tehotenstva, pýtajú sa pacienti svojho ošetrujúceho lekára. Je povinný dať tehotnej žene kópie testov PCR a ELISA, aby sa vylúčili pochybnosti o ich spoľahlivosti.
Problémy sa niekedy vyskytujú pri vykonávaní imunoblotingu, ale ak sú testy ELISA, blot a PCR pozitívne, diagnóza infekcie HIV sa nakoniec potvrdí. Pravdepodobnosť získania falošne pozitívneho testu počas tehotenstva je vysoká. Ak je ELISA (+) a imunoblot (-), žena je požiadaná, aby znovu odobrala krvné sérum.
Výmenný lístok tehotnej ženy uvádza výsledok štúdie. Ak je jeho hodnota kladná, žena má zakázané kŕmiť svoje dieťa po pôrode, aby sa nenakazila vírusom AIDS. Konečné závery sa robia na základe laboratórnych, klinických a epidemiologických štúdií. Až po ich dešifrovaní je pacientovi diagnostikovaná infekcia HIV.
V kontakte s
Keď som bol testovaný na pohlavne prenosné choroby, rozhodol som sa dať sa otestovať na HIV. Na druhý deň mi prišli hotové testy na ifa okrem HIV a nakoniec mi zistili chlamýdie. Herpes a mikroplazmóza. Ale HIV nikdy neprišiel. O 3 dni mi volali a povedali mi, že musíte prísť do AIDS centra, aby vám preniesli krv. Odobral som imunoblot a ten ukázal pozitívny. Môže byť imunablot falošne pozitívny na choroby chlamýdie mikraplazmóza HPV herpes
Experti Woman.ru
Zistite si názor odborníka na vašu tému
Anastasia Šesteriková
Rusina Irina Vladimirovna
Psychológ, úľava od stresu. Špecialista zo stránky b17.ru
Oľga Yurievna Diganaeva
Psychologička. Špecialista zo stránky b17.ru
Oľga Borisenko
Psychológ, Gestalt terapeut. Špecialista zo stránky b17.ru
Dmitrij Valerijevič Tišakov
Psychológ, supervízor, systemický rodinný terapeut. Špecialista zo stránky b17.ru
Shiyan Olga Vasilievna
Psychológ, psychológ-poradca. Špecialista zo stránky b17.ru
Oksana Lushankina
Psychológ, rodinné vzťahy. Špecialista zo stránky b17.ru
Anna Dashevskaya
Psychológ, Skype konzultácie. Špecialista zo stránky b17.ru
Irina Bukina
Psychologička. Špecialista zo stránky b17.ru
Aksenová Anna Mikhailovna
Psychológ, kandidát na skupinovú analýzu. Špecialista zo stránky b17.ru
Nechcem ťa strašiť, ale keď ťa zavolajú do AIDS centra, je to takmer vždy pozitívne, nepreberaj to, nech sa ti darí, hlavná vec je brať terapiu a dlho žiť
Jeden kamarát žije s HIV už desať rokov a stará sa o seba.
Hovoria, že o tri roky možno nájdu liek.
V každom prípade nezúfajte a nešírte to, dajte sa liečiť
Nie, IB nemôže byť falošne pozitívna a žiadne pohlavne prenosné choroby neovplyvňujú tento test, ak je pozitívny, potom bohužiaľ, máte HIV, musíte sledovať svoje imunitné bunky a začať liečbu včas.
bohužiaľ, nie ((ak vás zavolali do centra, potom je to určite HIV
Pokiaľ viem, prvé a dokonca aj následné výsledky imunoblotu môžu byť otázne. nie falošne pozitívne, ale skôr pochybné. a potom je predpísaná opakovaná analýza. Citujem text zo stránky:
„Imunitný blotting sa najčastejšie používa na potvrdenie diagnózy infekcie HIV. WHO považuje za pozitívne séra, v ktorých sa imunoblotovaním detegujú protilátky proti dvom obalovým proteínom HIV. Podľa týchto odporúčaní, ak dôjde k reakcii len s jedným z obalových proteínov (gp160, gp120, gp41) v kombinácii alebo bez reakcie s inými proteínmi, výsledok sa považuje za pochybný a odporúča sa opätovné testovanie pomocou súpravy od z inej série alebo od inej spoločnosti. Ak aj potom zostane výsledok pochybný, štúdie pokračujú každé 3 mesiace.
môžeš si to vygoogliť. Ak áno, dúfam, že sa nepotvrdí, že si HIV pozitívny. ale ak sa to potvrdí, vedzte, že dnes ľudia žijú s touto diagnózou a žijú tak dlho ako zdraví ľudia a rodia deti. Hlavnou podmienkou je disciplína v liečbe. zdravie pre vás!
Antiretrovírusová terapia online
Kalkulačky
Stránka je určená pre zdravotníckych a farmaceutických pracovníkov vo veku 18+
Vysvetlenie analýzy - imunoblot
Prosím, pomôžte mi rozlúštiť analýzu
ENV(GP160)+
ENV(GP110/120)+
ENV(GP41)+
GAG(P55)+
GAG(P40)+
GAG(P25)+
POL(P68)+
POL(P52)+
POL(P34)+
Ahoj! Pred 2,5 rokmi som si urobil test na HIV a bol tam tento imunoblot:
Gp-160+, Gp-110/120+, Gp-41+, p17+, p25+, p31+, p34+, p52+, p55+, p68+. A tu je imunoblot z 30.5.2018: Gp-160+, Gp-41+, GAG 1 -, poll+, env2-. Nie je jasné, čo znamená roll+? Je tam jediný alebo sa neprezradil? A kam sa podel zvyšok veveričiek?
Pol a Env sú gény, ktoré kódujú skupiny proteínov. Považujte to len za inú nahrávku. Otázka je iná. na čo čakáme? Prečo uvažujeme o škvrne? Všetko je celkom jasné. Je potrebné niečo urobiť.
Už som si zvykol, že mám HIV. A pripravený na terapiu.
Len ma zaujíma váš názor. Je to nedávna infekcia alebo mi niečo chýba? Alebo sa niekedy stane, že sa imunoblot otvára veľmi pomaly?
Dnes som si pozrel svoje testy v mojom osobnom spise (vykonané na SC):
ELISA na prvom testovacom systéme - pozitívny
ELISA na druhom testovacom systéme - negatívny (ako je to?)
Ďalej je IB (vykonaná in vitro a SC pred mesiacom):
imunoblot na prvom testovacom systéme: gp 160+, gp 41+
imunoblot na inom testovacom systéme: gp41+, p24+, p17+
imunoblot na treťom testovacom systéme: gp160+, gp120+, gp41+, p24+
Podľa mojich predpovedí som sa mohol nakaziť pred rokom (akútne štádium bolo niekde v apríli), alebo pred 9 mesiacmi, ale vo všeobecnosti neviem kedy) vždy som používal ochranu a sex bez kondómov som mal len raz na jeseň roku 2017.
Dnes som opäť absolvovala testy VN a IS. Začnem tera o mesiac, keď príde objednávka.
K spomínaným testom pridajte dátumy.
Prvý blot pred testom ELISA? Nebije. Neexistuje žiadny bod, ktorý by nám umožnil povedať, že čerstvá infekcia alebo opak je vysoko pravdepodobný.
Zostane záhadou, pokiaľ náhodou nenájdete zdroj a neporovnáte ho.
Aby som to teda objasnil
Vzal som to do Invitro.
Prvý test ELISA je 11. mája.
Potom sa to isté sérum odsalo a vrátil sa pozitívny test, kde boli zistené dva proteíny.
gp 160+, gp 41+
Potom som to znova zobral do SC.
Krv som daroval 29. mája.
A tam prešiel niekoľkými testovacími systémami, kde prvý ukázal negatívny, druhý pozitívny. Negatívna ELISA je stále vtipná.
Ďalej to isté sérum ide na blot, odkiaľ pochádzajú údaje:
Prvý testovací systém: gp41+, p24+, p17+
Druhý testovací systém: gp160+, gp120+, gp41+, p24+
Ale o to nejde.
Prišla nová analýza IP - 754. To je povzbudivé. VN ešte nie je pripravený. Hneď ako to príde, pravdepodobne to už začnem trieť.
Som si na 80% istý, že infekcia sa stala pred rokom. Ale skutočnosť, že blot sa otvára pomaly a test ELISA je negatívny, je zvláštny. Alebo je to v medziach normy?
Negatívna ELISA je stále vtipná. Kiežby som vedel názov systému, aby som si ho mohol zapísať do čierneho zošita. Aj keď tento moment, ak neberiete teóriu s manželstvom, výrazne podporuje skorú infekciu.
Som si na 80% istý, že infekcia sa stala pred rokom. Škvrna je na toto obdobie dosť chudobná. Nie nemožné, ale nepravdepodobné.
V určitom okamihu som dokonca začal pochybovať o výsledkoch testov HIV - takže čakám na VN.
Tu je položený posledný bod v otázke.
Považuje sa za normálny rozsah aj skutočnosť, že IP sa za mesiac rozrástla o 200 kópií bez tera? Teraz beriem Ursosan na polyp v žlčníku - v príbalovom letáku je napísané, že liek zlepšuje imunitu.
Je potrebné hodnotiť oboje s relatívnym obsahom a brať do úvahy údaje jedného laboratória pomocou jednej metódy výpočtu. Pretože Boh vie, čo sa deje s CD4.
Vo všeobecnosti je CD4 780 buniek/μl. VN - 250 kópií/ml.
Toto je bez terapie. To znamená, že CD4 zo 486 vyskočilo na 780 za mesiac.
VN klesli z 550 na 250 kópií.
Napriek tomu, nie je to zvláštne alebo sú takéto skoky v normálnom rozsahu? Je čas, aby Teru začal?)
Ahoj! Trikrát som si dal IFA, zakaždým +, imunoblot p24+ p18+ prišiel z SC. Potenciálne riziko bolo pred viac ako šiestimi mesiacmi. p24 naznačuje, že je to stále HIV?
Blot je pochybný, zopakujte ho o 6-8 týždňov. S najväčšou pravdepodobnosťou ide o falošný poplach.
Dobrý deň!
Prišli výsledky testu vrátane blotu:
Nebezpečný kontakt: 24.04.2018
HIV ELISA test 23.05.2018 (4 týždne od nebezpečného kontaktu alebo 29 dní) výsledok „+“
HIV ELISA test 28.05.2018 (5 týždňov od nebezpečného kontaktu alebo 34 dní) výsledok „opätovného odberu“
HIV ELISA test 06.01.2018 (5 týždňov od nebezpečného kontaktu alebo 38 dní) výsledok „+“
Blot prišiel z prvej analýzy (23.5.18):
GP160 sl.
P24 nasl.
V miestnom AIDS centre boli dňa 6.6.2018 urobené nové testy ELISA a HIV RNA PCR. Na výsledky ešte čakáme.
Otázky o blote:
1. Ak je prítomný P24, je to nevyhnutne antigén HIV alebo je možné takýto proteín zistiť aj pri iných ochoreniach?
2. Čo znamená skratka „sl“ vedľa proteínu? Popísané bloty zvyčajne obsahujú + alebo –
3. Čo určuje nasadenie blotu? Závisí to od obdobia alebo od individuálnych charakteristík tela?
4. Pri takejto škvrne v 4. týždni z nebezpečného kontaktu je šanca, že to nie je HIV?
Prajem pekný deň a ďakujem.
1. nie, môže to byť len podobný proteín iného charakteru. 2. slabý. tie. pochybný. 3. termíny a realizovať jednotlivé charakteristiky, ale v priemere je všetko veľmi blízko. 4. Otázka je zlá, vždy je šanca, kým sa nestanoví diagnóza.
Ahoj!
Prosím, pomôžte mi orientovať sa vo výsledkoch testov a pochopiť, ako sa správne správať, aby opakované testy boli správne.
Testy sa uskutočnili 25. mája 2018
IB HIV
NEW LAV BLOT 1 – nedefinované. zo dňa 29.05.2018
IB HIV markery
gp 160+
gp 120 —
gp 41 -
p55+
p40 —
p24+
p18 —
s. 68 —
str. 52 —
s. 34 —
HIV ELISA
ADVIA Centaur HIV Ag-Ab ELISA reaktivita 12,00 pozitívny. (28.05.2018)
Po 2 týždňoch sa odporúča analýzu zopakovať.
V novembri 2017 prebehla zákonná registrácia, po ktorej som absolvoval testy pomocou testovacieho systému HIV Ag\Ab Combo Abbott Architect, potom bol výsledok negatívny.
Zároveň som absolvoval všeobecný krvný test. Lymfocyty su mierne zvysene, eozinofily presne 0 (ale podobne hladiny eozinofilov som mala aj predtym.
Hlavná otázka znie:
Aké lieky sa môžu a nemôžu užívať počas týchto dvoch týždňov? (Nechcem, aby bolo niečo „faulované“)
Pravidelne mám alergické záchvaty, zvyčajne užívam Tavegil. Malo by sa to opustiť?
Môžem pred testom užívať antibiotiká? (ak to predpíše lekár na liečbu iných infekcií a chorôb)
Imunitný blotting pri diagnostike HIV
Imunoblot (imunoblot, western blot, western blot)— kombinuje enzýmovú imunoanalýzu (ELISA) s predbežným elektroforetickým prenosom vírusových antigénov na nitrocelulózový prúžok (prúžok).
V tomto krásnom vedeckom názve sa „blot“ s najväčšou pravdepodobnosťou prekladá ako „škvrna“ a „západný“ ako „západný“ odráža smer distribúcie tejto „škvrny“ na papieri zľava doprava, teda na geografickom mapa to zodpovedá smeru zo západu na východ. Podstatou metódy „imunitného blotu“ je, že imunoenzýmová reakcia sa neuskutočňuje so zmesou antigénov, ale s antigénmi HIV, ktoré sa predtým rozdelili imunoforézou do frakcií umiestnených podľa molekulovej hmotnosti na povrchu nitrocelulózovej membrány. Výsledkom je, že hlavné proteíny HIV, nosiče antigénnych determinantov, sú distribuované po povrchu vo forme samostatných prúžkov, ktoré sa objavujú počas enzýmovo viazanej imunosorbčnej reakcie.
Imunoblot zahŕňa niekoľko fáz:
Príprava pásu. Vírus imunodeficiencie (HIV), predtým purifikovaný a zničený na svoje základné zložky, sa podrobí elektroforéze a antigény, ktoré tvoria HIV, sa oddelia podľa molekulovej hmotnosti. Potom sa pomocou blotovacej metódy (analogicky s vytlačením prebytočného atramentu na saciu podložku) antigény prenesú na prúžok nitrocelulózy, ktorý teraz obsahuje spektrum antigénových pásov charakteristických pre HIV, ktoré je okom stále neviditeľné.
Ukážkové vyšetrenie. Testovaný materiál (sérum, krvná plazma pacienta a pod.) sa nanesie na prúžok nitrocelulózy a ak sú vo vzorke špecifické protilátky, naviažu sa na striktne zodpovedajúce (komplementárne) antigénne pásy. V dôsledku následných manipulácií sa výsledok tejto interakcie vizualizuje – zviditeľní.
Interpretácia výsledku. Prítomnosť pásov v určitých oblastiach nitrocelulózovej platne potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným HIV antigénom v testovanom sére.
V súčasnosti je hlavnou metódou na potvrdenie prítomnosti vírusovo špecifických protilátok v testovacom sére imunoblotovanie (imunoblot). V niektorých prípadoch infekcie HIV, skôr než dôjde k sérokonverzii, sú špecifické protilátky účinnejšie detegované imunoblotovaním ako testom ELISA. Pri štúdiu metódou imunoblotovania sa zistilo, že protilátky proti gp 41 sa najčastejšie detegujú v sére pacientov s AIDS a detekcia p24 u ľudí vyšetrených na preventívne účely si vyžaduje ďalší výskum, aby sa zistilo, či majú infekciu HIV. Imunoblotovacie testovacie systémy založené na geneticky upravených rekombinantných proteínoch sa ukázali byť špecifickejšie ako konvenčné systémy založené na purifikovanom vírusovom lyzáte. Pri použití rekombinantného antigénu sa nevytvorí difúzny, ale jasne definovaný úzky prúžok antigénu, ktorý je ľahko dostupný pre záznam a vyhodnotenie.
Séra jedincov infikovaných HIV-1 odhalili protilátky proti nasledujúcim hlavným proteínom a glykoproteínom - štruktúrne obalové proteíny (env) - gp160, gp120, gp41; jadro (gag) - p17, p24, p55, ako aj vírusové enzýmy (pol) - p31, p51, p66. Protilátky proti env sú typické pre HIV-2 - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.
Spomedzi laboratórnych metód potrebných na stanovenie špecifickosti reakcie je najrozšírenejšia detekcia protilátok proti obalovým proteínom HIV-1 - gp41, gp120, gp160 a HIV-2 - gp36, gp105, gp140.
WHO považuje za pozitívne séra, v ktorých sa imunoblotovaním detegujú protilátky proti ktorýmkoľvek dvom HIV glykoproteínom. Podľa týchto odporúčaní, ak dôjde k reakcii len s jedným z obalových proteínov (gp 160, gp 120, gp 41) v kombinácii alebo bez reakcie s inými proteínmi, výsledok sa považuje za pochybný a odporúča sa opätovné testovanie pomocou súprava z inej série alebo od inej spoločnosti. Ak aj potom zostane výsledok pochybný, odporúča sa pozorovanie 6 mesiacov (výskum po 3 mesiacoch).
Prítomnosť pozitívnej reakcie s antigénom p24 môže naznačovať obdobie sérokonverzie, pretože protilátky proti tomuto proteínu sa niekedy objavia ako prvé. V tomto prípade sa odporúča, v závislosti od klinických a epidemiologických údajov, zopakovať štúdiu so vzorkou séra odobratou najmenej o 2 týždne neskôr, a to je presne ten prípad, keď je testovanie párových sér potrebné pri infekcii HIV.
Pozitívne reakcie s proteínmi gag a pol bez reakcie s proteínmi env môžu odrážať skorú sérokonverziu a môžu tiež naznačovať infekciu HIV-2 alebo nešpecifickú reakciu. Jedinci s týmito výsledkami po testovaní na HIV-2 sú opätovne testovaní po 3 mesiacoch (do 6 mesiacov).
Otázka: Opakovaný test na HIV?
Bol som vyšetrený na sexuálne prenosné infekcie (bez príznakov - chcel som mať dôveru vo vzťah so ženou). HIV test bol pozitívny. Ďalej ultrazvuk ukázal nádor na obličke, ktorý bol odstránený (ukázalo sa, že je zhubný).
Čítal som knihu I. M. Sazonovej, v ktorej sa píše, že zhubný nádor môže dať pozitívny výsledok testu na HIV.
Môže to byť presne tento prípad, alebo niet v čo dúfať?
Musíte vykonať kontrolný test na HIV. Ak bol prvý test na HIV stanovený pomocou ELISA, potom môže byť výsledok falošne pozitívny. Jeho spoľahlivosť možno overiť citlivejšou diagnostickou metódou – PCR (polymerázová reťazová reakcia), ktorá zisťuje DNA vírusu v krvi.
Pomoc. 12/16/10 ELISA (+) IB(+), potom od 23. 3. 11 do 19. 5. 2011 deväť negatívnych ELISA (-) a kvantitatívna PCR. nebude určená. v roku 2002 počas tehotenstva bola ELISA buď (+) alebo (-), ale IB bola vždy (-). od 2004 do 2008 som brala ELISA (-) 2x do roka, ale 30.4.2008 IFA (+) a IB bola neurčitá. potom znova každé 2 mesiace som si robil test ELISA vždy (-). a od decembra 2010 sa to pise vyssie zaroven som si nikdy nepichala, manzel ma vzdy ELISA (-). CD4 980 bunky. a krvný test na syfilis 29. apríla vyšiel 3+++ a potom trikrát. negatívne každých 10 dní. hepatitída všetky (-). mal niekto nieco taketo? Ďakujem.
Objasnite, či ste podstúpili RIBT (reakcia imobilizácie treponema pallidum), a ak áno, aké sú výsledky tejto štúdie.
nie, nikto mi nenavrhol urobiť taký rozbor, čo to ukáže? Dúfam, že chápete, že som hovoril o testoch na HIV. Ďakujem. Vyskytli sa podobné prípady vo vašej praxi? Mimochodom, informačná bezpečnosť bola v roku 2008 nejasná, pretože... bol tam proteín p24/25. v roku 2010 IB(+) proteíny gp160.41.120 p24.17.31. potom ked bola IFA zase 3x (-) poslali ma do IB 4.4. výsledok bol pozitívny, ale bielkoviny gp 120 a 41. ostatné sú prečiarknuté červenou pastou a dole červenou IB REPEAT. ale PCR popiera rovnaké číslo. Po 4. apríli som si urobila test ELISA a už bol 4x zamietnutý. všetko v rýchlostnom centre vrátane testovania antigénov a protilátok. Teraz čakám na opakovanú IB a kvalitnú PCR. to je všetko. SOM VEĽMI UNAVENÝ Z MYSLENIA A ČAKANIA. Dúfajúc v to najlepšie. ĎAKUJEM. NAOZAJ sa teším na tvoju odpoveď.
Ak máte nejakú otázku, skúste ju nabudúce sformulovať konkrétnejšie a objasniť diagnózu. RIBT sa používa na potvrdenie diagnózy syfilisu. Na presnú diagnostiku infekcie HIV sa protilátky proti HIV v krvi stanovujú testom ELISA a imunoblotom. Diagnóza je potvrdená iba vtedy, ak sú oba tieto výsledky pozitívne.
Ospravedlňujem sa za nepresnú formuláciu otázky. Napísal som, že v decembri ELISA a Imunoblot testy na HIV vyšli pozitívne. ale od marca bola IFA 9-krát negatívna na HIV. Ak som bol zaregistrovaný v rýchlostnom centre, tak sa to skutočne deje? HIV je buď vždy pozitívny alebo negatívny. a ako sa dá použiť imunoblot, ak je výsledok HIV ELISA negatívny? potom každý popiera ifa, treba skontrolovať imunoblot, tak čo sa stane? Naše rýchlostné centrum mi nevie nič odpovedať. Tak som sa obrátil na vás. Ďakujem.
Bohužiaľ, ELISA aj imunoblot môžu poskytnúť falošne pozitívne výsledky. Preto sa diagnóza HIV považuje za konečnú až pri súčasnej detekcii HIV pomocou ELISA a metódy imunoblot.
Dobry den, dnes mi prisli vysledky kvalitneho PCR testu na HIV - virus nezistili a opakovany imunoblot na HIV dopadol neurčito kvoli proteinu 41. AIDS CENTRUM povedali, ze najpravdepodobnejsie nie je HIV, ale v r. v mojom tele sú telá podobné štruktúre ako HIV. Čo si však myslíte, berúc do úvahy moje otázky z 15. a 16. júna (pozri vyššie), existuje alebo nie je HIV? ĎAKUJEM.
V tomto prípade je diagnóza infekcie HIV pochybná.
Píšete, že až pri súčasnej detekcii HIV pomocou IFA a imunoblotu sa diagnóza HIV považuje za konečnú. Ale čo potom v mojom prípade? veď PCR budú všetci popierať. a blot a ifa neustále poskakujú. na 9 rokov. Povedz mi, ak by bol vírus v mojej krvi, jeho RNA a DNA by sa po toľkých rokoch dali presne určiť. a môže inkubačná doba alebo „okno“ trvať toľko rokov? Existujú nejaké falošne negatívne výsledky PCR pre HIV počas takého časového obdobia? Áno, zabudol som povedať, že expresné testy na HIV, ktoré robím na CVD, sú vždy negatívne alebo sa na ne nemôžete spoľahnúť? Ďakujem.
V tomto prípade nie je diagnostika PCR hlavnou metódou na identifikáciu dynamiky procesu - sérologické metódy sú informatívnejšie. V tomto prípade je pravdepodobnosť falošne negatívnych výsledkov vysoká. Expresné testy na HIV majú vysoký prah citlivosti, takže môžu poskytnúť aj falošne negatívny výsledok.
Prepáč. Určite som to napísal na nesprávne miesto. prosím odpovedzte v téme HIV alebo nie HIV. Ďakujem.
V prípade, že na váš e-mail nebolo doručené upozornenie, že ste dostali odpoveď, odpoveď na vašu otázku si môžete pozrieť na tejto adrese http://tiensmed.ru/news/answers/vich-ili-ne-vich-. html
Ahoj! Prosím, povedzte mi, ako sa zaregistrovať na LCD (momentálne som v 10. týždni tehotenstva), robila som si testy na HIV, pred pár dňami mi zavolal lekár a povedal, že predbežné testy na HIV sú pozitívne (prvý bol vykonaný v Kirovograde, ale ešte nie je oficiálny výsledok z Kyjeva ), v ten istý deň sme v našom mestskom laboratóriu robili dva rýchle testy od Pharmaco firmy CITO TEST HIV 1/2, oba výsledky boli negatívne, laborantka povedala, že tieto testy su spolahlive a nemusim sa bat, kedze sa to v tehotenstve deje a tie testy by sa jednoducho mohli pomiesat. Lekár mi povedal, aby som znova daroval krv a nechal som si krv ešte dvakrát otestovať v rôznych nemocniciach (stále nemám ani jeden z troch výsledkov). Veľmi sa bojím, nie som narkoman, nemal som žiadne sporné sexuálne vzťahy, a aj keď ochoriem, ochoriem veľmi zriedka, ostatné testy sú v norme. Dá sa rýchlym testom dôverovať? Naozaj sa to deje počas tehotenstva? Doktor ma príliš vystrašil. Ďakujem
V prvom rade sa treba upokojiť a nemyslieť na to zlé. Niekedy počas tehotenstva sú falošne pozitívne výsledky. Je potrebné znovu otestovať krv na HIV a počkať na výsledky vyšetrenia.
Ahoj! Faktom je, že pred 2 mesiacmi som mal sexuálny kontakt s dievčaťom (stále spolu chodíme). po 1,5 týždni teplota stúpla na 37,4. Čoskoro zaspala. Pre istotu sme si urobili test IFA po 2 týždňoch a znova po 1,5 mesiaci. Obe odpovede sú negatívne. Ale stále mám horúčku a kašeľ, s premenlivým zlepšením. Povedz mi, prosím, existuje nejaké riziko? Okrem toho som dlho pracoval bez dní voľna a pred týždňom som bol na nemocenskej (so SARS). Krvné a pľúcne testy sú normálne. Ďakujem.
Táto teplota môže súvisieť s vírusovým ochorením, telo sa ešte nespamätalo alebo chronickou únavou. V prípade, že je vylúčená organická patológia, všeobecný test krvi a moču je v normálnych medziach, ako aj údaje z fluorografického vyšetrenia sú v normálnych medziach, potom je potrebné vylúčiť sexuálne prenosné choroby: chlamýdie, mykoplazmóza, ureaplazmóza, ktoré môžu spôsobiť zápal malých orgánov panvy a močovej trubice a v dôsledku toho zvýšenie telesnej teploty. Prečítajte si viac o príčinách zvýšenej telesnej teploty kliknutím na odkaz: Vysoká teplota.
Ahoj. Tu je vec: Pred viac ako rokom som mal nechránený sexuálny kontakt s dievčaťom, ktoré išlo okolo. Trvala na tom, že nie je chorá, ale nemohol som jej na 100 percent dôverovať. Taktiež ubezpečila, že pred uchádzaním sa o prácu absolvovala lekársku prehliadku (pracovala ako predavačka) a všetko je v poriadku. 7 mesiacov po kontakte som si ešte v laboratóriu citylab urobil test na HIV, výsledok bol negatívny. Ale v poslednej dobe som často chorý, už 3 týždne ma bolí hrdlo a neviem to vyliečiť. Zase som sa začala báť, čo keby som to potom chytila? Povedzte mi, je to možné a mali by sme dôverovať analýze od CityLab? Bojím sa spraviť si test znova, nervy to nevydržia...
Ak je výsledok negatívny, potom s najväčšou pravdepodobnosťou nie ste chorý alebo infikovaný HIV/AIDS. Na objasnenie diagnózy sa však odporúča vykonať druhý test v špecializovaných laboratóriách v štátnych inštitúciách, toto vyšetrenie sa vykonáva anonymne. Ak samoliečba neprinesie požadovaný výsledok, odporúča sa konzultovať s otolaryngológom, aby vykonal primerané vyšetrenie a predpísal vhodnú liečbu. Prečítajte si viac o testovaní na HIV v sérii článkov kliknutím na odkaz: HIV.
Povedzte mi, môžete uviesť nejaké charakteristiky laboratória v mestskom laboratóriu? Napriek tomu nie je vždy možné nechať sa otestovať vo vládnej agentúre. A aká je percentuálna šanca, že sa muž nakazí pri nechránenom kontakte?
Žiaľ, neposkytujeme porovnávacie hodnotenia laboratórií a súkromných zdravotníckych zariadení. Ak máte pochybnosti o spoľahlivosti výsledkov, vykonajte vyšetrenie v inom centre a požiadajte najskôr o licenciu na poskytovanie týchto zdravotných služieb, či má toto centrum právo vykonávať toto vyšetrenie a či všetko zodpovedá prijatým štandardom. Riziko nákazy pri nechránenom pohlavnom styku je u oboch pohlaví rovnaké. Prečítajte si viac o testovaní na HIV v sérii článkov kliknutím na odkaz: HIV.
Dobrý deň Dieťa má 8 mesiacov, bolo testované na HIV pomocou ELISA, v krvi boli nájdené gp160 + a p25 +, zvyšok je všetko negatívne, záver pochybný. Súdiac podľa týchto testov sa ukazuje, že dieťa je +? gp160 + gp110/120 - p68 - p55 - p52 - gp41 - p34 - p25 + p18 -
Žiaľ, na základe získaných údajov nie je možné so 100-percentnou pravdepodobnosťou stanoviť diagnózu, pretože nemožno vylúčiť falošne pozitívny výsledok. Na stanovenie presnej diagnózy budete musieť podstúpiť množstvo vyšetrení, vrátane opakovania tejto analýzy metódou ELISA, ako aj vykonania testu pomocou metódy PCR. Potom by ste sa mali obrátiť na špecializovanú lekársku inštitúciu, kde bude odborník na infekčné choroby schopný komplexne vyhodnotiť získané výsledky. Viac o prejavoch infekcie HIV sa dozviete v tematickej časti našej webovej stránky po kliknutí na odkaz: HIV
Môže ukázať falošne pozitívny výsledok pre akútne respiračné infekcie alebo akútnejšie infekčné ochorenia? Niekde som čítal, že pri 58 ochoreniach alebo aj vyššie sa môže ukázať „+“ vrátane očkovania proti hepatitíde B, ak sú postihnuté obličky atď.?
Existuje možnosť falošne pozitívneho výsledku, preto Vám odporúčam urobiť nasledovné: urobiť test ešte raz - metódou ELISA a metódou PCR a následne opäť navštíviť infektológa. Viac o diagnostike HIV infekcie sa dozviete v tematickej sekcii: HIV
Dobrý deň Imunoblot je neurčitý kvôli proteínu p25. Aká je pravdepodobnosť HIV?
V tejto situácii je potrebné starostlivo preštudovať protokoly štúdie v kombinácii s inými ukazovateľmi, pretože na základe týchto údajov nie je možné urobiť predpoklad. Výsledok možno pravdepodobne považovať za sporný a po 3 mesiacoch je potrebná opakovaná štúdia. Prečítajte si viac v sekcii našej webovej stránky: HIV
Dobrý deň.
Môžete sa vyjadriť k testu HIV ELISA?
1 sérum +3,559 k=13,3
+2,121 k=4,9
p 24 neg
2 sérum +3,696 k=13,9
+2,477 k=5,7
V tomto prípade nie je možné vylúčiť falošne pozitívny výsledok, vzhľadom na to, že metóda ELISA je nepriama, preto vám odporúčam otestovať sa inou, citlivejšou metódou – imunoblottingom. Podrobnejšie informácie o tejto problematike nájdete v príslušnej časti našej webovej stránky kliknutím na nasledujúci odkaz: HIV
Dobré popoludnie, povedzte mi, čo si mám naladiť? Pred rokom pri planovani dietatka sme s manzelom absolvovali vsetky vysetrenia vratane HIV (brali ich velmi vazne a spravne), bola som na vysetreni v Kr Rog, manzel v Kyjeve, jeho odpoved bola negativna povedal, že nejaké činidlo nefungovalo, musím ho znova vziať v Centre AIDS v Kyjeve. Po vykonaní testu v Centre mi aj odpoveď vyšla negatívna. Teraz som na pozícii 14. týždeň t.j. Zaregistroval som sa a prešiel som všetkými testami a opäť sa mi vrátila odpoveď, test na HIV bol neurčitý, urobil som si ho znova na klinike a urobil som si expresný test v Dovir, aby ma upokojili, ale neupokojili ma, expres test ukázal pozitívny výsledok (druhá čiara bola menej výrazná), ihneď po tomto postupe som nestrácal čas kontaktovaním AIDS centra a tiež som si urobil test a čakám na výsledok. (Neviem sa upokojiť) Povedzte mi, do akej miery môžete dôverovať expresným testom a prečo na prvý test na HIV neexistuje žiadna odpoveď? (s manželom vedieme zdravý životný štýl a máme sa radi). Ďakujem.
Netreba panikáriť vopred – expresná diagnostika nie je základom diagnostiky HIV, umožňuje identifikovať skupiny pacientov, ktorí si vyžadujú hlbší výskum. V takýchto situáciách sa odporúča vykonať imunitný blotting a osobne sa poradiť s odborníkom na infekčné choroby. Podrobnejšie informácie o tejto problematike sa dozviete v tematickej časti našej webovej stránky po kliknutí na odkaz: HIV. Ďalšie informácie môžete získať aj v nasledujúcej časti našej webovej stránky: Laboratórna diagnostika
Dobry den, bola som na infekcnom oddeleni, prave dnes ma prepustili pri odchode, lekarka mi volala a vysvetlila, ze mam pozitivnu IFA, najprv pri prijimani do nemocnice bola negativna, potom ked som znova testovala. stal sa pozitivny, poslali testy na imunoblot na horu Sokolniki povedali ze to bude hotove buduci tyzden, bol som v nemocnici s anginou a parainfluenzovymi virusmi, prisiel som v šoku, stale nechapem ako aby som to vyhodnotil, bol tiež vypracovaný výpis pre moju kliniku, ktorý naznačuje, že ak bola zistená a pod tým, že imunoblot funguje, ak budem prepustený na vašu kliniku, v tomto výpise bude všetko uvedené, aká je pravdepodobnosť výskytu HIV môže to byť preto, že som bol liečený na angínu z vírusu parainfluenzy, mám pozitívne výsledky na ifa?
Pravdepodobnosť falošne pozitívneho výsledku je veľmi vysoká. Prítomnosť jedného pozitívneho výsledku ešte nie je dôvodom na stanovenie diagnózy HIV, preto odporúčame počkať na výsledok imunoblottingu a následne osobne konzultovať ďalšie vyšetrenie a pozorovanie s infekčným lekárom. Angína, parainfluenza a iné prechladnutia nemajú významný vplyv na výsledky rozboru.
Chcem tomu veriť, ale koncom augusta mi prišlo zle, teplota stúpla, 37,5-38 riedku stolicu som mala asi 4 dni, bolo to na dovolenke, kde bolo veľa diskoték, pila som vodu z vodovodu ako mnohí iné, lebo čo bolo veľmi drahé, pohár vody stál 300 rubľov, riedku stolicu s takouto teplotou som si spájal s nejakou črevnou infekciou zachytenou vo vode, už si presne nepamätám, ale bola tam aj malá vyrážka v r. vrchnej casti tela, ked som prisla domov s teplotou volala som lekarku, napisala rotavirovu infekciu, po 5 dnoch choroby som sa dobrovolne odhodlala od neho odist do prace, kde som o par dni ochorela na sinusitidu (v tom období som kvôli pracovným povinnostiam potreboval byť vonku) pripisoval som to tomu, že veľký pokles teploty z dovolenky a otravy mi znížil imunitu a preto som opäť prechladol so zápalom dutín, takže toto je opäť nemocenská, podľa pokynov ORL som brala 10 dní Klacid SR 500, prešlo to, po 3 týždňoch som sa vrátila do práce, 3 dni som bola na služobnej ceste v horúcej krajine. Klimatizácie v doprave a hoteli boli nemilosrdné a po návrate domov, v lietadle som mala teplotu už 39,5 Tu som doma s teplotou 40, zavolala som doktorovi domov, napísala akútnu infekciu dýchacích ciest a povedala svoje. hrdlo bolo veľmi červené, mám chronický zápal mandlí a povedal som ORL špecialistovi, sám som napísal, aby som si vzal antibiotikum Levolet r, zavolal som sanitku, pretože som mal horúčku a frekvencia bola 40 a neklesla, hospitalizáciu neponúkli, na druhý deň ten istý príbeh - sanitka mi dala injekciu proti horúčke a odišla Tretí raz, keď som trval na hospitalizácii, ledva ma odviezli na infekčné, kde sa zistila zmiešaná infekcia parainfluenza a adenovírusová infekcia, ale pri prepustení. , povedala lekarka primarka, ze mam diagnostikovanu HIV ifa pozitivnu a ze mi to urobili 2x, som v soku, neviem co mam robit, nemozem jest ani pit .povedala, ze Zjavne mám akútnu infekciu HIV a na kontrolu poslali imunoblotový test mojej krvi do centra AIDS,
Teraz, keď som si nakreslil analógiu udalostí, ktoré sa mi stali za posledný čas, ako aj 3 nemocenské za sebou, vyskúšal som si všetky príznaky a bol som zhrozený tým, čo by to mohlo byť, keď som bol prepustený v ten istý deň. išiel sa anonymne otestovať v invitro a na druhý deň bol výsledok IFA rovnaký +
Ospravedlňujem sa za také podrobné informácie, ale som zmätený a zabitý, pijem silné sedatíva a nemám chuť do jedla a prakticky nejem, výrazne som schudol
mam este otazku: lekar s prepustenim z nemocnice naznacil vysledok HIV zisteneho IFA a pod tym, ze na imunoblote sa pracuje, ale ako zavriem bl v mojej ambulancii na mieste kde bude vsetko napisane tam. Čo mám robiť? Toto už nebude dôverné. Požiadal som ošetrujúcu lekárku, aby tento rozbor nezapisovala do výpisu, čo mi odmietla, do akej miery sú rešpektované moje práva ohľadom nesprístupnenia informácií?
Výsledky štúdií vykonaných v nemocnici sú, žiaľ, súčasťou výpisu, pretože ošetrujúci miestny lekár musí mať úplné informácie o vašom zdravotnom stave. V tejto situácii nehovoríme o sprístupnení informácie, keďže tá sa prenáša iba na iného ošetrujúceho lekára, ktorý vás bude ďalej sledovať.
Ahoj! Urobil som si testy na HIV, pretože som potreboval certifikát na FMS, pár týždňov mi testy nedali, potom ma pozvali k manažérovi a dali mi pozitívny výsledok, zobrali kopu potvrdení a poslali do krajského AIDS centra na ďalšie vyšetrenie, ako je napísané na osvedčení. Chcem si to dať na inej klinike a potom ísť na krajskú, alebo to nemá zmysel preberať? Len nechapem, preco ich tak dlho nedavali, no, doktor povedal, ze vraj urobili nejaky rozbor a vraj im dlhujem dalsich 4 tisic rublov, lebo ak to urobili, tak asi navyse k potvrdeniu by dali podrobné informácie o chorobe?
V tejto situácii by ste nemali panikáriť vopred - získanie jedného pozitívneho výsledku vám neumožňuje spoľahlivo posúdiť možnú infekciu, pretože nie je možné vylúčiť falošne pozitívne výsledky. Odporúčame test zopakovať a v prípade pozitívneho výsledku je potrebné absolvovať ďalšie vyšetrenie – imunoblotting. Laboratórium spravidla neposkytuje podrobné informácie o výsledkoch, čo je bežná a bežná prax. Prípadné otázky Vám zodpovie Váš ošetrujúci lekár po vyšetrení pri osobnej konzultácii.
Zabudla som dodať, že od začiatku júna do polovice septembra som absolvovala kúru anabolických steroidov a to Sustanon 250, zmes testosterónov a stanozololu s primabolanom, chcela som sa pripraviť na leto a dovolenku, či by sa dali dole moja imunita a vsetko co sa mi stalo.
Zhoršená imunita, ako aj prítomnosť autoimunitných ochorení môžu poskytnúť falošne pozitívne výsledky testov na HIV. Preto sa v prípade získania 2 pozitívnych výsledkov metódou ELISA odporúča imunoblotting, ktorý nám umožní presne odpovedať na otázku, či ide o infekciu alebo nie.
Čo to znamená mať autoimunitné ochorenia?
Vo všeobecnosti môžem povedať, že som bol od raného detstva dosť často chorý a ešte pred pár rokmi som žiadal ošetrujúceho lekára, aby sa staral o moju imunitu, pretože som bol neustále unavený a často som chorý, hlavne ucho, hrdlo, nos , ale po celý čas boli negatívne výsledky na HIV, prešiel som nimi celkom ľahko, bez váhania.
Falošne pozitívny výsledok testu na HIV sa môže vyskytnúť po nedávnej vírusovej infekcii, očkovaní proti hepatitíde B, tuberkulóze, hepatitíde, herpesu, ako aj na pozadí autoimunitných ochorení, ako je reumatoidná artritída, systémový lupus erythematosus, dermatomyozitída, sklerodermia, spojivové tkanivo choroby a pod.
Chcel by som doplniť moju otázku, imunoblot mi vyšiel negatívny, ale lekár povedal, že keďže som mal dve IFA +, keď som bol na infekčnom, musím si ešte urobiť test, ale o niečo neskôr
V tomto prípade je lekárska taktika oprávnená - odporúčame znova užívať imunoblot po 1,5-2 mesiacoch.
Aká je pravdepodobnosť: 2 IFA + rozdiel medzi odbermi krvi cca 2 dni, imunoblot - ; Bol som v nemocnici pre infekčné choroby s adenovírusovou infekciou a parainfluenzou, kde mi odobrali krv, imunoblot poslali do AIDS centra
Dobrý deň Zaregistroval som sa v bytovom komplexe, prešiel som všetkými testami, lekár povedal, že mám herpes v krvi, potom mi volali z AIDS centra a povedali, že sa musím znova otestovať, spýtal som sa a povedali mi, že som HIV pozitívny , v panike sme išli s manželom na pretestovanie Urobila som si test a dostala som IFA a imunoblot + manžel to dostal a po mesiaci som to dostala znova. Mám + môj manžel – teraz som v 23. týždni tehotenstva!
V tejto situácii, žiaľ, existuje možnosť infekcie HIV, ale konečnú diagnózu nemožno urobiť ani pri pozitívnom imunoblote, vzhľadom na stav tehotenstva. V tejto situácii je potrebné vylúčiť falošne pozitívne výsledky, preto odporúčame test zopakovať a osobne konzultovať s odborníkom na infekčné choroby.
Ak imunoblot ukazuje pozitívny výsledok na HIV, ale skríning je negatívny, akému výsledku by sme mali veriť?
Imunoblot je presnejší test, preto pri tejto štúdii, ak sa dosiahne pozitívny výsledok, musíte pokračovať v štúdii a osobne navštíviť špecialistu na infekčné choroby.
al hypotenzia, tachykardia, dusnost, cyanóza. V závažných prípadoch ochorenia je možné krvácanie a vracanie zmiešané s krvou. Pečeň a slezina sú zväčšené. Zaznamenáva sa oligúria. Teplota zostáva konštantne vysoká 3-10 dní. V periférnej krvi - neutrofilná leukocytóza s posunom doľava. Okrem popísaných celkových prejavov moru vznikajú lézie charakteristické pre jednotlivé klinické formy ochorenia.
Kožná forma je zriedkavá (3–5 %). V mieste vstupnej brány infekcie sa objaví škvrna, potom papula, vezikula (phlyctena), naplnená seróznym hemoragickým obsahom, obklopená infiltrovanou zónou s hyperémiou a edémom. Phlyctena sa vyznačuje silnou bolesťou. Po otvorení sa vytvorí vred s tmavou chrastou na dne. Morový vred má dlhý priebeh a pomaly sa hojí, tvorí jazvu. Ak je táto forma komplikovaná septikémiou, vznikajú sekundárne pustuly a vredy. Je možný vývoj regionálneho bubo (kožná bubonická forma).
Bubonická forma je najčastejšia (asi 80 %) a má relatívne benígny priebeh. Od prvých dní ochorenia sa objavuje ostrá bolesť v oblasti regionálnych lymfatických uzlín, čo sťažuje pohyb a núti pacienta zaujať nútenú polohu. Primárne bubo je spravidla jedno; viacnásobné bubo sú menej časté. Vo väčšine prípadov sú postihnuté inguinálne a femorálne lymfatické uzliny a o niečo menej často axilárne a cervikálne lymfatické uzliny. Veľkosť bubo sa pohybuje od vlašského orecha po stredne veľké jablko. Živé znaky sú ostrá bolesť, hustá konzistencia, priľnavosť k podkladovým tkanivám, hladkosť obrysov v dôsledku vývoja periadenitídy. Bubo sa začína vytvárať na druhý deň choroby. Ako sa vyvíja, koža nad ním sa stáva červenou, lesklou a často má cyanotický odtieň. Zo začiatku je hustá, potom mäkne, objavuje sa kolísanie, kontúry sa stávajú nejasnými. Na 10.–12. deň choroby sa otvára - fistula a ulcerácia. Pri benígnom priebehu ochorenia a modernej antibiotickej terapii sa pozoruje jeho resorpcia alebo skleróza. V dôsledku hematogénneho zavedenia patogénu sa môžu vytvárať sekundárne bubliny, ktoré sa objavia neskôr a sú malé, menej bolestivé a spravidla nehnisajú. Závažnou komplikáciou tejto formy môže byť rozvoj sekundárnej pľúcnej alebo sekundárnej septickej formy, ktorá prudko zhoršuje stav pacienta, dokonca vedie k smrti.
Primárne pľúcne forma je zriedkavá, v období epidémií v 5–10 % prípadov a predstavuje epidemiologicky najnebezpečnejšiu a najzávažnejšiu klinickú formu ochorenia. Začína prudko, prudko. Na pozadí výrazného syndrómu intoxikácie sa od prvých dní objavuje suchý kašeľ, silná dýchavičnosť a rezná bolesť na hrudníku. Kašeľ sa potom stáva produktívnym, s produkciou hlienu, ktorého množstvo sa môže meniť od niekoľkých pľuvancov až po obrovské množstvá, zriedka vôbec chýba. Spútum, najprv spenené, sklovité, priehľadné, potom nadobúda krvavý vzhľad, neskôr sa stáva čisto krvavým a obsahuje veľké množstvo morových baktérií. Zvyčajne má tekutú konzistenciu - jeden z diagnostických znakov. Fyzické údaje sú skromné: mierne skrátenie perkusného zvuku nad postihnutým lalokom pri auskultácii, nie je veľa jemných sipotov, čo zjavne nezodpovedá celkovému vážnemu stavu pacienta; Terminálne obdobie je charakterizované nárastom dýchavičnosti, cyanózou, rozvojom stuporov, pľúcnym edémom a ITS. Krvný tlak klesá, pulz sa zrýchľuje a stáva sa vláknitým, srdcové ozvy sú tlmené, hypertermia je nahradená hypotermiou. Bez liečby choroba končí smrťou v priebehu 2-6 dní. Pri včasnom užívaní antibiotík je priebeh ochorenia benígny a málo sa líši
Imunoblotting -(z anglického „blot“ - spot) - metóda identifikácie antigénov (alebo protilátok) pomocou známych sér (alebo antigénov). Ide o kombináciu gélovej elektroforézy a ELISA. Najprv sa bakteriálne bunky alebo virióny zničia pomocou ultrazvuku a potom sa všetky antigény vírusu alebo bakteriálnych buniek oddelia elektroforézou a na špeciálnom nitrocelulózovom filme sa získa komerčné činidlo. Pri vykonávaní imunoblotingu sa skúmané sérum pacienta aplikuje na film so známymi antigénmi. Po inkubácii a premytí nenaviazaných protilátok pristúpime k ELISA - antisérum na ľudské imunoglobulíny značené enzýmom a na film sa nanesie chromogénny substrát, ktorý pri interakcii s enzýmom mení farbu. V prítomnosti komplexov antigén-protilátka-antisérum až imunoglobulín-enzým sa na nosiči objavujú farebné škvrny. Metóda imunoblotovania vám umožňuje samostatne detegovať protilátky proti rôznym antigénom patogénov (napríklad pri infekcii HIV imunoblotting deteguje protilátky proti gp120, gp24 a iným vírusovým antigénom).
Rádioimunoanalýza (RIA)
Spôsob je založený na reakcii antigén-protilátka s použitím rádionuklidom značeného antigénu alebo protilátky. Ako značky sa používajú 125I, 14C, 3H, 51Cr a ďalšie rádionuklidy. Vzniknuté imunitné komplexy sa izolujú zo systému a ich rádioaktivita sa stanoví na počítadlách (β-žiarenie). Intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.
Verzia RIA na pevnej fáze využívajúca značené protilátky alebo antigény sorbované v jamkách polystyrénových panelov je rozšírená.
RIA sa používa na detekciu antigénov mikróbov, vírusov, rôznych hormónov, enzýmov, liečiv, imunoglobulínov, ako aj iných látok obsiahnutých v testovanom materiáli v malých koncentráciách 10-12-10-15 g/l.
Kontrolné otázky
Reakcia imunitnej bakteriolýzy: o aký druh reakcie ide; čo je to antigén, čo je to protilátka, mechanizmus reakcie, spôsoby výroby, praktická aplikácia. Imunitná hemolytická reakcia: potrebné zložky, postup; ovládanie, praktická aplikácia. Lokálna hemolytická reakcia v géli (Jerneova reakcia): princíp reakcie, spôsob formulácie, praktická aplikácia. Reakcia fixácie komplementu: princíp reakcie; čo sa tvorí, keď imunitné sérum interaguje so špecifickým antigénom; čo sa stane s doplnkom, ak je prítomný počas tejto interakcie? Aký je osud komplementu, ak medzi antigénom a protilátkami neexistuje špecifická afinita? Akú reakciu možno použiť na určenie toho, čo sa stalo s doplnkom; prečo sa používa táto konkrétna reakcia; Aký je viditeľný pozitívny výsledok RSC? prečo? Aká vlastnosť komplementu sa využíva v prvej fáze RSC? V druhej fáze? Ak je konečným výsledkom RSC hemolýza, znamená to pozitívny alebo negatívny výsledok? Vysvetlite výsledky: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Vymenujte zložky prvého systému RSK a zložky druhého systému RSK. Prečo je potrebné testovacie sérum inaktivovať? Ako sa titruje komplement? Hemolytické sérum: čo obsahuje, ako sa získava, aký je titer a ako sa určuje? Aké zvieratá sa používajú na získanie komponentov RSC? Metodika nastavenia RSC v chlade. Pri stagingu, ktorá z nasledujúcich reakcií vyžaduje účasť komplementu: precipitácia, flokulácia, aglutinácia, detekcia nekompletných protilátok, imunitná bakteriolýza, imunitná hemolýza, Jerne, RSC? Imunofluorescenčná reakcia (RIF) - označujú sled udalostí v priamej Koonsovej reakcii; potrebné prísady. Čo je to antigén, čo je to protilátka, čím sú značené protilátky, ako sa zohľadňuje výsledok reakcie, ako vyzerá pozitívny výsledok? Praktická aplikácia - čo možno pomocou tejto reakcie určiť? Nepriama imunofluorescenčná reakcia - uveďte sled udalostí počas tejto reakcie, potrebné zložky, aký je antigén, aké imunitné séra sa používajú; praktické využitie; výhoda nepriameho RIF v porovnaní s priamou reakciou. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – princíp reakcie; potrebné zložky; uveďte postupnosť udalostí pri vykonávaní reakcie na detekciu antigénu v testovanom materiáli; potrebné zložky; Čo sa stane, keď je výsledok pozitívny, ako to vyzerá? Uveďte postupnosť činností pri vykonávaní testu ELISA na detekciu protilátok v testovacom sére; potrebné zložky; čo sa stane, ak bude výsledok pozitívny? Imunoblotting – princíp reakcie; hlavné etapy; potrebné zložky; ako sa berie do úvahy výsledok; výhody reakcie. Rádioimunoanalýza (RIA) - aké sú hlavné štádiá reakcie; Čím sú označené protilátky alebo antigény, ako sa berie do úvahy výsledok? Imunoelektrónová mikroskopia - princíp metódy; hlavné etapy; potrebné zložky; čím sú protilátky označené? ako sa berie do úvahy výsledok reakcie. Imobilizačné reakcie – princíp metódy, technika nastavenia, komponenty, záznam výsledkov.
Úlohy, ktoré treba splniť počas samoštúdia.
Vyplňte tabuľku „Imunitné reakcie“ v súvislosti s reakciami diskutovanými v rámci tejto témy.
Imunitné reakcie
Práca študentov počas praktickej hodiny
Okamžite začnite pracovať s nastavením fázy 1 RSK, ale zapíšte si to do poznámkového bloku neskôr (pozri nižšie).
1. Imunitná hemolytická reakcia. Pozrite si demonštračnú reakciu imunitnej hemolýzy, načrtnite ju vo forme diagramu, vysvetlite výsledok v experimentálnej a kontrolnej skúmavke.
2. Reakcia fixácie komplementu
a) analyzovať RSK podľa tabuľky;
b) nakreslite do notebooku schému nastavenia RSC vo forme tabuľky;
c) obliecť si druhú fázu RSK (prvá fáza sa nasadí na začiatku vyučovacej hodiny);
d) analyzovať diagnostické prípravky potrebné pre RSC;
e) vziať do úvahy výsledok. Formulujte záver o prítomnosti špecifických protilátok v testovacom sére.
3. Imunofluorescenčná reakcia. Preštudujte si tabuľku, vytvorte si schému reakcie do zošita; pozrite sa na diagnostické séra; určiť, čo sérum obsahuje, ako sa pripravuje, na akú reakciu (priama alebo nepriama RIF) sa používa. Pozrite sa na demonštračný výsledok RIF vo fluorescenčnom mikroskope.
4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). V notebooku si vytvorte schému na nastavenie reakcie v dvoch verziách: na detekciu antigénu v skúmanom materiáli a na detekciu protilátok v sére. Prezrite si súpravu zložiek HIV a hepatitídy B Identifikujte, čo každá zložka obsahuje a na čo sa používa.
5. Imunoblotting. Urobte si diagram reakcie v notebooku; pozrite si ukážku - výsledok reakcie.
6. Rádioimunoanalýza (RIA). Vytvorte si schému reakcie do zošita.
7. Imunitná elektrónová mikroskopia (IEM). Pozrite si ukážku - výsledok reakcie, vytvorte si schému reakcie do zošita, označte šípkami antigén (vírus) a označené protilátky.
Imunoblotting je vysoko citlivá metóda na detekciu proteínov, založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA. Imunoblotting sa používa ako diagnostická metóda pri infekcii HIV atď.
Vo všeobecnom zmysle sa imunoblotovanie týka analýzy zmesi proteínov prenesených na pevný membránový nosič, ku ktorému sú viazané kovalentnými väzbami, po ktorej nasleduje imunodetekcia.
Môžete analyzovať zmes proteínov priamo nanesených na substrát - dot blot analýza - alebo po jej predbežnej frakcionácii elektrofokusáciou, diskovou elektroforézou alebo dvojrozmernou elektroforézou - Western blot analýzou.
Patogénne antigény sa separujú pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, potom sa prenesú z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvinú sa pomocou ELISA.
Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. . Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom . Komplex vytvorený na prúžku (antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig) sa deteguje pridaním chromogénneho substrátu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu.
Táto metodológia sa tiež používa na selekciu klonov baktérií, fágov alebo vírusov, ktoré exprimujú cieľové klonované génové produkty.
Prenos proteínov na membránu sa uskutočňuje buď pasívne alebo pomocou elektrotransferového zariadenia. Účinnosť prenosu proteínov na membránu je ovplyvnená mnohými faktormi, ako je molekulová hmotnosť proteínov, pórovitosť gélu, čas prenosu a zloženie použitého tlmivého roztoku (trans-pufru).
V závislosti od cieľov a podmienok experimentu sa vyberajú podmienky prenosu, ktoré poskytujú najlepšie výsledky. Ako substráty sa bežne používajú nitrocelulózové, polyvinylidéndifluorid (PVDF) alebo kladne nabité nylonové membrány. Nitrocelulóza dokáže viazať až 80 - 100 μg bielkovín na 1 cm2.
Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou (s molekulovou hmotnosťou menšou ako 20 kDa) sa môžu stratiť v dôsledku premývania. To umožňuje predbežne študovať polymorfizmus určitých genetických lokusov na základe dĺžok zodpovedajúcich reštrikčných fragmentov DNA.
Pomocou Southern hybridizácie navyše ľahko zistíte, či cieľový gén má vo svojej vnútornej časti miesto hydrolýzy určitým reštrikčným enzýmom, čo umožňuje zvoliť optimálnu stratégiu klonovania študovanej oblasti genómu.
Pomocou podobnej schémy môžu byť molekuly RNA prenesené z agarózového gélu na nitrocelulózový filter. Táto metóda sa nazývala Northern blotting, na rozdiel od Southern blotting, pretože názov Southern znamená v angličtine „južný“.
Prenos proteínov na filtre z gélu sa preto nazýval Western blotting. Veľké proteíny (>100 kDa) denaturované v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) sa môžu zle preniesť na membránu, ak je v trans pufri prítomný etanol. Alkohol výrazne zlepšuje prenos bielkovín z SDS-polyakrylamidového gélu, ale zužuje póry v géli, čo vedie k zadržiavaniu veľkých bielkovín.
PVDF membrána je optimalizovaná na imunodetekciu a je schopná zadržať až 160 μg/cm2 špecificky viazaných proteínov s veľmi nízkou úrovňou nešpecifickej väzby.
Imunoblotting
Dôležitou vlastnosťou tejto membrány je možnosť jej opakovaného použitia. Nylonové membrány Zeta-Probe účinne viažu proteíny SDS v neprítomnosti alkoholu a táto väzba je odolná voči následným úpravám. Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou sú tiež účinne zadržané. S vysokou väzbovou kapacitou približne 480 μg proteínu na cm2 umožňujú membrány Zeta-Probe detekciu stopových množstiev proteínu v testovacích zmesiach.
Akonáhle je antigén imobilizovaný na membráne, zostávajúce väzbové miesta sú blokované roztokmi želatíny, hovädzieho sérového albumínu alebo odstredeného mlieka.
Potom sa membrána inkubuje v roztoku polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti študovanému antigénu. Po umytí nenaviazaných protilátok sa membrána inkubuje v roztoku sekundárnych protilátok, ktoré sú konjugátom enzýmov alkalická fosfatáza (AP) alebo chrenová peroxidáza (HRP) s protidruhovými protilátkami (kozie protilátky proti králičím, myším alebo ľudským imunoglobulínom ) alebo proteíny A (proteín Staphylococcus aureus) alebo G (proteín Streptococcus sp.), ktoré majú vysokú afinitu k Fc oblasti imunoglobulínov.
Detekcia vytvorených imunitných komplexov sa uskutočňuje chemicky alebo chemiluminiscenčne. Substráty pre chemickú reakciu pri použití konjugátov alkalickej fosfatázy sú 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP) alebo modré tetrazólium (NBT) a pri použití konjugátov chrenovej peroxidázy - 4-chlór-1-naftol a peroxid vodíka .
V dôsledku enzymatických reakcií sa na membráne v mieste lokalizácie komplexu antigén-protilátka vytvorí farebný pás alebo škvrna.
Citlivosť tejto metódy je 100 pg proteínu pri použití AP konjugátov a 100-500 pg pri použití HRP konjugátov. Chemiluminiscenčná detekcia imunitných komplexov umožňuje detekciu menej ako 5 pg antigénu. Princíp tejto metódy spočíva v tom, že pri reakcii HRP s peroxidom vodíka a cyklickým diacylhydrazínluminolom sa vyžaruje svetlo s vlnovou dĺžkou 428 nm, ktoré je možné zaznamenať na fotocitlivý film.
Reakcia imunoblotovania (IB) bola vyvinutá na základe ELISA. Je to najšpecifickejšia a najcitlivejšia metóda imunochemickej analýzy. Imunoblotting (z anglického blot - blot, stain) kombinuje ELISA s elektroforézou. Používa sa na detekciu nie komplexných protilátok proti HIV, ale protilátok proti jeho jednotlivým štruktúrnym proteínom (proteíny p24, glykoproteíny gp120, gp 41 a pod.). Vzťahuje sa na odborné (potvrdzujúce) reakcie na diagnostiku infekcie HIV.
Reakcia sa uskutočňuje v niekoľkých fázach:
Vírus sa deštruuje na zložky - antigény (p24, gp120, gp 41 atď.), ktoré sa podrobia elektroforéze v polyakrylamidovom géli, to znamená separácii antigénov do frakcií podľa molekulovej hmotnosti.
2. Gél sa prekryje nitrocelulózovou membránou a pomocou elektroforézy sa naň prenesú antigénové frakcie. Nitrocelulóza sa správa ako pijavý papier. Membrána je narezaná na pásy. Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov.
Imunoblotting - dodatočná nepriama metóda
Prúžky potiahnuté antigénmi HIV sa ponoria do séra subjektu a potom sa premyjú, aby sa odstránil nenaviazaný materiál.
4. Prúžky sa inkubujú s antiglobulínovým sérom označeným peroxidázou a premyjú sa.
Pridá sa substrát a zaznamená sa počet farebných frakcií (škvŕn), ktoré zodpovedajú lokalizačnej zóne komplexu AG-AT.
Prítomnosť prúžkov v určitých oblastiach prúžku potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným antigénom HIV v testovanom sére. Výsledok imunoblottingu sa považuje za pozitívny, ak sú na membráne viditeľné pásy zodpovedajúce ktorýmkoľvek dvom z troch HIV antigénov - p24, gp41 a gp 120 (obr. 37).
VÝKRESY
ZOZNAM POUŽITÝCH REFERENCIÍ
Hlavná literatúra
Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia: učebnica pre študentov medicíny. univerzity 2. vyd., rev. a dodatočné — 702 s. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.
2. Mikrobiológia, virológia a imunológia: príručka pre laboratórne hodiny: učebnica/(V.B. Sboychakov a ďalší); upravil V.B. Sboychaková, M.M. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: ill.
3. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia [Elektronický zdroj]: učebnica pre med.
univerzity - 760 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petrohrad: Spetslit, 2010.
4. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch / Zv. 1. - 448 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.
M.: Geotar Media, 2010. .
5. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch T. 2. - 480 s. Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.
doplnková literatúra
1. Imunodiagnostické reakcie: učebnica / komp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.
Khusnarizanova, Yu.Z Gabidullin, M.M Alsynbaev - Ufa: Vydavateľstvo Štátnej rozpočtovej vzdelávacej inštitúcie vyššieho odborného vzdelávania BSMU Ministerstva zdravotníctva Ruska, 2016. - 86 s.
2. Vlastnosti niektorých vlastností, ktoré určujú patogénny potenciál kokultivovaných variácií baktérií Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: vedecká publikácia / Yu Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.
Úvod » Immunoblot – čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb
Imunoblot - čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb
Čo je imunoblot? Toto je bežná metóda laboratórnej diagnostiky ľudských vírusových infekcií. Je to jeden z najpresnejších a najspoľahlivejších spôsobov, ako zistiť prítomnosť HIV.
Kvôli spoľahlivosti je dokonca väčšia ako enzýmová imunoanalýza (elisa). Výsledky imunoblotu sa považujú za presvedčivé a presvedčivé
Imunoblot - čo to je? Aby ste rozpoznali osobu s HIV, musíte podstúpiť laboratórny test na testovanie krvného séra na prítomnosť protilátok.
Sekcie Western blot sa tiež nazývajú Western bloty. Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako doplnková expertná metóda. To je potrebné na potvrdenie ELISA - laboratórneho testu, ktorý umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV v krvi. Imunoblot znova skontrolujte pozitívny test ELISA.
Považuje sa za najcitlivejšie, komplexné a drahé.
Cieľ
Čo je imunoblot? Táto metóda laboratórneho testovania krvného séra na prítomnosť protilátok proti vírusu.
Počas špeciálnych štúdií sa celkové vírusové proteíny našli v géli a na nitrocelulózových membránach.
Imunoblotting (detekcia protilátok v sére pacienta proti určitým antigénom patogénov)
Postup sekcie Western blot je určený na určenie infekcie HIV v rôznych štádiách. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z jeho zložiek podrobí elektroforéze a antigény v ňom obsiahnuté sa rozdelia podľa molekulovej hmotnosti.
Vírus ľudskej imunodeficiencie sa rozmnožuje v živých bunkách uložených v jeho genetickej informácii. V tomto štádiu sa človek stáva nosičom vírusu HIV, ak ste boli infikovaní.
Špecifikom tejto choroby je, že sa dlho neprejavuje. Vírus ničí lymfocyty, čím sa znižuje imunita človeka a telo sa stáva neschopným bojovať s infekciami.
Ak sa HIV lieči správne a rýchlo, pacient sa dožije vysokého veku. Nedostatok liečby nevyhnutne vedie k smrti. Od okamihu infekcie, ale bez liečby, maximálne obdobie nie je dlhšie ako desať rokov.
Zvláštnosti
Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV antigénom prvého a druhého typu.
Ak je osoba infikovaná, po dvoch týždňoch môžu byť protilátky detegované oveľa neskôr. Zvláštnosťou HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, ochorenie sa nemusí prejaviť skôr ako dva a viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne indikuje prítomnosť ochorenia a vyžaduje potvrdenie výsledkov z PCR a Western blot rezov, ak enzýmový imunotest ukázal pozitívny výsledok.
Indikácie pre
Aký druh „imunoblotu“ už bol zistený, ale ktorý sa v štúdii zavádza?
Dôvodom testovania na vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV) bude pozitívny výsledok testu ELISA. U pacientov, ktorí sa chystajú podstúpiť operáciu, je potrebné prejsť enzýmovou imunoanalýzou. Okrem toho by ste mali urobiť analýzu žien plánujúcich tehotenstvo, ako aj tých, ktoré sú promiskuitné. Rezy Western blot sa predpisujú pacientom s infekciou HIV, ak sú výsledky Elisy nejednoznačné.
Nasledujúce alarmujúce príznaky môžu byť dôvodom na kontakt s lekárom: rýchla strata hmotnosti, strata funkcie čriev (hnačka), zväčšené lymfatické uzliny v tele; , zápal pľúc, toxoplazmóza, exacerbácia herpesu.
Pacient sa pred darovaním venóznej krvi nemusí pripravovať.
8-10 hodín pred testom nejedzte. Deň pred darovaním krvi sa neodporúča piť alkohol alebo kávové nápoje, robiť ťažké fyzické cvičenia alebo prežívať úzkosť.
Kde urobiť analýzu?
Kde sa môžem otestovať na HIV?
ELISA, imunoblotová analýza, vykonaná na mestských súkromných klinikách, poskytuje výsledky do jedného dňa. Je možná aj urgentná diagnóza. Vo verejných inštitúciách sú lekárske testy Elisa a Western blot v súlade s legislatívou Ruskej federácie bezplatné.
Povinný skríning infekčných chorôb u tehotných žien a pacientov vyžadujúcich hospitalizáciu alebo chirurgický zákrok Ako sa tento test vykonáva?
Ako vykonať ELISA? Imunoblot pozitívny/negatívny potvrdzuje alebo vyvracia výsledky testu elisa. Postup je celkom jednoduchý. Špecialista odoberie venóznu krv, čo trvá menej ako päť minút.
Po odbere vzoriek treba miesto vpichu dezinfikovať a prekryť obväzom. Odber vzoriek sa vykonáva nalačno, takže po zákroku nezaškodí zjesť tabuľku horkej čokolády alebo sladký horúci nápoj.
Ak chcete získať odporúčanie na bezplatný test vo verejnej zdravotníckej inštitúcii, musíte navštíviť terapeuta.
Vo všeobecnosti sa imunoblot nelíši od iných krvných testov odberom. Metodológia výskumu je jednoduchá. Ak je vírus prítomný v krvi človeka, telo začne produkovať protilátky na jeho zničenie. Pre každý vírus existuje veľa proteínových antigénov. Detekcia týchto protilátok je základom metódy Western blot section. cena
Ako dlho trvá analýza? HIV imunoblot je jedným z najlacnejších testov.
V priemere sa skríningové metódy imunotestov pohybujú od 500 do 900 rubľov. Sekcie Western blot sú štúdiom kontrol, ktorých náklady sa pohybujú od troch do piatich tisíc rubľov. Zložitejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad za analýzu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) budete musieť zaplatiť asi 12 000 rubľov.
Interpretácia výsledkov
Najbežnejšími metódami diagnostiky infekcie HIV sú enzýmová imunoanalýza a imunoblot.
Používajú sa na stanovenie protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie v sére. Infekcia je zvyčajne potvrdená dvoma testami: skríningovým a potvrdzujúcim. Výsledky musí interpretovať lekár, ktorý diagnostikuje a predpíše liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, znamená to, že v ľudskom tele je vírus.
Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom na nezávislú liečbu, pretože každý pacient môže mať svoj vlastný obraz choroby.
Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a certifikáciu. Ak sa vírus u pacienta nezistí, výsledok je „negatívny“. Keď sa tento certifikát zistí, vykonajú sa dodatočné skríningové štúdie. Imunoblotová analýza, ktorá potvrdí alebo vyvráti skríning. Ak sa testovacie prúžky objavia v určitých tmavých oblastiach (lokalizácia proteínov), vykoná sa diagnóza HIV.
Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonajú do troch mesiacov.
Aby sa zabránilo infekcii vírusom ľudskej imunodeficiencie, je to možné, ak budete dodržiavať určité pravidlá: vyhýbajte sa náhodnému sexuálnemu kontaktu, počas kontaktu používajte kondómy, nepoužívajte drogy.
Ak sa ochorenie zistí u tehotnej ženy, je dôležité dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára a nezabudnúť na test na prítomnosť vírusu.
Čo je Western blotting?
Identifikácia proteínov v komplexných zmesiach alebo extraktoch rôznych tkanív je jedným z často sa vyskytujúcich problémov. Pomocou nástroja, akým sú špecifické protilátky, je možné určiť skúmaný proteín s minimálnymi časovými a finančnými nákladmi.
Pri metóde Western blotting sa v prvom stupni zmes proteínov oddelí elektroforézou v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), potom sa prenesie na nitrocelulózovú membránu elektroblotovaním.
Podstatou tejto metódy je, že po elektroforéze sa gél umiestni na nitrocelulózovú membránu medzi vrstvy filtračného papiera. Takto zostavený „sendvič“ sa umiestni do elektrického poľa, takže komplexy proteín-SDS sa pohybujú cez gélovú platňu a sú imobilizované (v dôsledku nešpecifickej sorpcie) na povrchu nitrocelulózovej membrány.
Väzba komplexu proteín-SDS na nitrocelulózovú membránu zahŕňa najmä sily elektrického charakteru, pričom táto interakcia je viacbodová a vedie k „šíreniu“ proteínov na povrchu membrány. Po elektrotransfere tak získame repliku gélu na nitrocelulóze s proteínmi umiestnenými rovnako ako v polyakrylamidovom géli.
Po SDS elektroforéze, elektrotransfere a sorpcii proteínov z gélu na nitrocelulózovú membránu sa terciárna konformácia proteínu výrazne zmení, ak je vo všeobecnosti správne hovoriť o existencii terciárnej štruktúry proteínu po takomto tvrdom zaobchádzaní. Preto sa na imunochemickú detekciu študovaného proteínu zvyčajne používajú iba mono- alebo polyklonálne protilátky špecifické pre lineárne oblasti molekuly proteínu.
51. Enzýmová imunoanalýza, imunoblotovanie. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.
Protilátky špecifické pre konformačné epitopy (alebo oblasti zahŕňajúce medzipodjednotkové kontakty) nie sú všeobecne vhodné na použitie pri Western blottingu.
Po prenose proteínu sa membrána postupne inkubuje s protilátkami špecifickými pre študovaný proteín a potom so sekundárnymi protilátkami špecifickými pre Fc fragmenty primárnych protilátok, konjugované s enzýmovou (alebo inou) značkou (obr.
1A). V prípade, že primárne protilátky špecifické pre študovaný antigén sú priamo konjugované so značkou, sekundárne protilátky nie sú potrebné (obr. 1 B). Imunitné komplexy vytvorené v mieste lokalizácie skúmaného proteínu sa „prejavujú“ pomocou chromogénneho substrátu (v závislosti od typu značky).
Citlivosť a špecifickosť metódy veľmi závisí od toho, aké protilátky sa pri výskume používajú.
Použité protilátky musia byť špecifické pre jedinečnú aminokyselinovú sekvenciu charakteristickú len pre študovaný proteín. V opačnom prípade je možná interakcia (najmä v prípade surových proteínových extraktov) protilátok s niekoľkými proteínovými molekulami, čo následne povedie k objaveniu sa niekoľkých farebných pásov na membráne.
Identifikácia skúmaného proteínu je v tomto prípade často ťažká alebo dokonca nemožná.
Druhým dôležitým faktorom, ktorý treba mať na pamäti pri výbere protilátok, je afinita. Čím vyššia je afinita použitých protilátok, tým jasnejšie a jasnejšie sú zafarbené proteínové pásy, tým vyššia je citlivosť metódy. Pri použití vysokoafinitných protilátok možno dosiahnuť citlivosť 1 ng alebo aj vyššiu.
Na vizualizáciu výsledku interakcie medzi membránovo viazaným antigénom a protilátkami sa používajú sekundárne protilátky, konjugované s činidlami schopnými produkovať určitý signál za určitých podmienok.
Typicky sa ako také činidlo používa enzým (peroxidáza alebo fosfatáza), ktorého reakčný produkt je zafarbený a vyzráža sa na membráne vo forme nerozpustnej zrazeniny.
V tejto metóde je tiež možné použiť fluorescenčné značky.
Ryža. 1. Schéma imunochemického farbenia študovaného proteínu: A - použitie sekundárnych protilátok konjugovaných s enzýmovou značkou; B - primárna protilátka je priamo konjugovaná s enzýmovou značkou.
Protokol:
I. Príprava gélu a membrány a elektrotransfer proteínov
Po elektroforéze sa polyakrylamidový gél umiestni do kúpeľa s blotovacím pufrom (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol).
Dva listy filtračného papiera, narezané do tvaru sacej kazety a navlhčené savým pufrom, sa umiestnia na časť kazety, ktorá bude obrátená k anóde. Potom sa na filtračný papier umiestni nitrocelulózová membrána vopred navlhčená rovnakým pufrom, aby sa zabezpečilo, že medzi membránou a papierom nie sú žiadne vzduchové bubliny.
Gél by sa mal potom opatrne umiestniť na membránu a opäť venovať osobitnú pozornosť tomu, aby medzi gélom a membránou neboli žiadne vzduchové bubliny. Formovanie sendviča je ukončené dvoma vrstvami navlhčeného filtračného papiera, ktoré sú umiestnené na povrchu gélu (obr. 2). Výsledný sendvič je upnutý v kazete a umiestnený medzi elektródy tak, aby membrána smerovala k anóde.
Ryža. 2. Schéma elektrotransferu proteínov na membránu.
II. Elektrický prenos
Elektrotransfer proteínov na nitrocelulózovú membránu sa uskutočňuje v pufri obsahujúcom 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol počas 30-50 minút pri konštantnom napätí 100 V.
Čas elektrotransferu závisí od veľkosti prenášaných proteínov, čím väčší je proteín, tým dlhšie trvá elektrotransfer. Kvalita elektrotransferu a umiestnenie proteínových pásov sa hodnotí farbením nitrocelulózovej membrány 0,3 % roztokom Ponceau S v 1 % kyseline octovej. Pred imunochemickým farbením je potrebné membránu niekoľkokrát premyť slabo alkalickým vodným roztokom Tris, aby sa odstránilo farbivo naviazané na proteíny.
III. Imunochemické farbenie proteínov imobilizovaných na nitrocelulózovej membráne
Na blokovanie miest nešpecifickej väzby protilátky sa membrána inkubuje za stáleho miešania pri teplote miestnosti počas 30 minút v PBST (na lepšie blokovanie sa môže použiť roztok PBST obsahujúci 10 % sušeného odstredeného mlieka).
Po zablokovaní sa membrána inkubuje hodinu pri teplote miestnosti za stáleho miešania v PBST obsahujúcom 1-10 ug/ml špecifických protilátok.
Optimálna koncentrácia protilátok sa vyberie empiricky a závisí od afinity interakcie protilátok s antigénom.
Na konci inkubácie membránu 5-krát premyte PBST a preneste ju do roztoku sekundárnych protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou. Riedenie konjugátu je zvyčajne uvedené výrobcom na obale alebo je empiricky vybrané výskumníkom. Membránu inkubujte v roztoku sekundárnej protilátky 1 hodinu za stáleho miešania.
Po dôkladnom premytí (zmena tlmivého roztoku aspoň 5-6 krát) sa membrána PBST prenesie do chromogénneho substrátového roztoku obsahujúceho 3 mg diaminobenzidínu (DAB) a 10 μl 30% peroxidu vodíka v 10 ml 0,1 M Tris-HCl. pH 7,6.
Inkubácia sa uskutočňuje za miešania počas 5 až 10 minút. Po dokončení inkubácie so substrátom by sa membrána mala premyť PBST, vysušiť blotovaním filtračným papierom a okamžite by sa mala vytvoriť elektronická kópia farebným skenovaním. Ak membrána úplne vyschne, maľované proteínové pruhy vyblednú a obraz sa ukáže ako menej jasný a kontrastný.
Poznámka: DAB je toxický a potenciálny karcinogén. Pracujte len s gumenými rukavicami!
