Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA)

Su fermentais susijęs imunosorbentinis tyrimas (ELISA) atliekama dviem etapais: pirmasis yra antikūnų sąveika su antigenu, antrasis yra fermentinis antigeno-antikūno komplekso rodymas dėl spalvos atsiradimo reakcijos mišinyje ir spalvos registravimas vizualiai arba spektrofotometriniu metodu. .

Yra dvi ELISA galimybės: kietosios fazės ir skystosios fazės, kurios skiriasi imunocheminės reakcijos komponentų atskyrimo metodu. Lyginant su anksčiau aprašytais antigenų ir antikūnų nustatymo metodais, ELISA turi didelių pranašumų:

didelis jautrumas, leidžiantis aptikti iki 0,05 ng/ml medžiagos;

galimybė naudoti minimalius tiriamosios medžiagos kiekius (1--2 µl);

galimybė užfiksuoti reakciją instrumentiniu ar vaizdiniu būdu;

išraiškingumas ir galimybė automatizuoti visus reakcijos etapus.

ELISA šiuo metu plačiai taikoma praktikoje diagnozuojant daugelį infekcinių ligų – bakterinės, grybelinės etiologijos, pirmuonių infekcijų ir helmintozės, bet ypač virusinių infekcijų, ypač hepatito A, B, C, D, E, G, ŽIV infekcijos, herpeso viruso, rotavirusas, adenovirusas, astrovirusas, parvovirusas ir kitos infekcijos.

Imuninis blotingas

Imunoblotavimo metodo principas – nustatyti antikūnus prieš atskirus patogeno antigenus. Taikant šį metodą, nustatomi antikūnai prieš ŽIV antigenus (viruso apvalkalo glikoproteinus, šerdies baltymus ir viruso fermentus). Imunoblotavimo rezultatai vertinami kaip teigiami, abejotini ir neigiami, atsižvelgiant į kiekybinį ir kokybinį aptiktų antikūnų rinkinį.

Reikėtų pažymėti, kad imuninio blotingo jautrumas yra mažesnis nei ELISA, o pacientas užsikrėtęs ŽIV gali būti neigiamas. Tačiau galimybė registruoti klaidingai teigiamus ŽIV infekcijos ELISA rezultatus reikalauja integruoto požiūrio į ŽIV infekcijos diagnozę, be imunologinių reakcijų (ELISA, imunoblotingo) rezultatų, atsižvelgiant į epidemiologinius ir klinikinius duomenis.

Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

PGR metodą 1983 m. sukūrė amerikiečių biochemikas Kary Mullis, remdamasis jo atrastos termostabilios DNR polimerazės (Tag polimerazės) naudojimu. Metodo principas – 10 6 – 10 8 kartus padidinti konkrečios patogeno DNR srities kopijų skaičių, katalizuojamą in vitro DNR polimerazės automatiniu režimu.

Dirbtinėmis sąlygomis galima atkurti tam tikrai patogenų rūšiai ar genčiai būdingo genomo regiono replikacijos procesą, jei žinoma jo nukleotidų seka. Tokių sričių replikacijos produktų (amplikonų) aptikimo metodų naudojimas leidžia nustatyti patogeno buvimą tiriamajame mėginyje.

Aukščiau aprašytas papildomos grandinės kūrimas prasideda tik tam tikruose pradiniuose blokuose, kurie yra trumpos dvigrandos dalys. Kai tokie blokai pritvirtinami prie konkrečių DNR sekcijų, naujos grandinės sintezės procesas nukreipiamas tik į pasirinktą atkarpą, o ne per visą DNR grandinės ilgį. Norint sukurti pradinius blokus tam tikrose DNR dalyse, naudojami du oligonukleotidiniai pradmenys, vadinami pradmenimis. Pradmenys papildo DNR sekas kairėje ir dešinėje konkretaus fragmento ribose ir yra orientuoti taip, kad naujos DNR grandinės užbaigimas įvyktų tik tarp jų.

KAM PGR metodo pranašumai turėtų apimti:

didelis jautrumas, leidžiantis aptikti 10-1000 ląstelių mėginyje;

didelis specifiškumas, nes tiriamoji medžiaga atskleidžia tik tam tikram patogenui būdingą DNR fragmentą;

įvairių patogenų nustatymo iš vieno bioėminio procedūros universalumas;

Didelis analizės greitis (4--4,5 val.);

Galimybė diagnozuoti ne tik ūmias, bet ir latentines infekcijas.

PGR naudojimas yra veiksmingas diagnozuojant įvairias bakterines ir virusines infekcijas.

Pastaruoju metu gana sėkmingai diegiami kiekybiniai PGR analizės metodai, leidžiantys nustatyti patogeno koncentraciją medžiagoje (mikrobų ar virusų apkrovą), pavyzdžiui, įvertinti hepatito B viruso, ŽIV C viruso replikacinį aktyvumą. .

Tačiau reikia turėti omenyje, kad PGR metodas taip pat turi savo apribojimų, ypač diagnozuojant infekcijas, kurias sukelia oportunistinė autoflora.

Nukleino rūgščių hibridizacija

Nukleino rūgščių hibridizacija, kaip ir PGR, jis leidžia nustatyti patogeną mėginyje be išankstinės izoliacijos. Analizei atlikti sintetinamas vienos grandinės DNR arba RNR zondas, papildantis specifines patogeno nukleotidų sekas. Zondas paženklintas radionuklidu, fermentu ar kita lengvai atpažįstama etikete. Tiriama medžiaga yra apdorojama biologinio tyrimo metu esančių mikroorganizmų lizės, išskyrimo ir DNR denatūravimo tikslais. Tada zondas inkubuojamas su tiriamuoju mėginiu ir išmatuojamas pažymėtos DNR, kuri hibridizavosi su tiriamojo mėginio DNR, kiekis. Reakcija gali vykti tiek ant kietųjų fazių sorbentų, tiek tirpale, tačiau būtina sąlyga yra nesurišto žymėto zondo kiekių plovimas. Nukleino rūgščių hibridizacijos metodo jautrumas yra mažesnis nei PGR ir yra 10 3 mikrobinių ląstelių mėginyje.

Reagentų rinkinys „MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2“ skirtas patvirtinti antikūnų prieš atskirus ŽIV-1 ir (arba) ŽIV-1 grupės O ir (arba) ŽIV-2 baltymus (antigenus) aptikimą. žmogaus serumas arba plazma imunoblotiniu metodu.

Skiriamieji bruožai:

• Reagentų rinkinyje „MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2“ yra išgryninti lizato viruso baltymai ŽIV 1 ir peptidas - ŽIV-2 antigeninis determinantas gp36;
• Suteikia antikūnų prieš ŽIV-1, ŽIV-1 grupės O, ŽIV 2 aptikimą vienoje juostelėje;
• Paprasta testų paruošimo ir atlikimo procedūra;
• Vidinė reakcijos kokybės kontrolė*
• Maksimalus analizės greitis (3 valandos);
• Mažas tiriamojo mėginio tūris - 20 µl;
• Nereikalauja papildomos įrangos tyrimams;
• Rinkinio kokybę garantuoja rusiškų ir tarptautinių standartų pavyzdžiai**

* Vidinę kokybės kontrolę užtikrina:

• vidinės kontrolės juostelės, užtikrina serumo ar plazmos mėginio įvedimo kontrolę;
• kontrolinis neigiamas serumas (K-);
• kontrolinis teigiamas serumas (K+), leidžiantis identifikuoti juostelėje aptiktas juostas;
• kontrolinis silpnai teigiamas serumas (K+cl), kuris leidžia kontroliuoti reagento rinkinio jautrumą.

**Kokybės užtikrinimas:

MPBA-Blot-HIV-1, ŽIV-2 reagentų rinkinio charakteristikos buvo nustatytos tiriant mėginius iš atsitiktinės donorų imties, pacientų, kuriems diagnozuota ŽIV infekcija, komercines serokonversijos grupes, standartines paneles ir mėginius, kurie „galimai trukdo determinacija“ komponentai.

Reagentų rinkinys neduoda klaidingai teigiamų rezultatų tiriant standartinius skydo serumus, kuriuose nėra antikūnų prieš ŽIV 1,2 ir ŽIV-1 antigeną („AT (-) HIV Standard“, Nr. FSR 2007/00953, 2007-10-25 ). Specifiškumas – 100%.

Diagnostinis specifiškumas buvo nustatytas ištyrus atsitiktinę 200 donorų atranką iš įvairių kraujo centrų ir klinikų, kuriems anksčiau buvo patvirtinta, kad nėra ŽIV-1 ir ŽIV-2 infekcijos. Specifiškumas tiriant atsitiktinę donorų imtį buvo 100 %;

Reagentų rinkinio specifiškumas buvo nustatytas ištyrus 250 mėginių, įskaitant serumo ar plazmos mėginius, gautus iš nėščių moterų, hospitalizuotų pacientų, pacientų, sergančių hepatitu C ir E, ir mėginius su „potencialiai trukdančiais“ komponentais. Šiems mėginiams naudojant MPBA-Blot-HIV-1, ŽIV-2 rinkinį, klaidingai teigiamų rezultatų nebuvo aptikta.

Diagnostinis jautrumas buvo nustatytas naudojant:
- plazmos mėginiai iš Boston Biomedica, Inc ŽIV-1 grupės (WWRB 301) iš skirtingų regionų, kuriuose yra skirtingų ŽIV-1 potipių: M grupės (A, B, C, D, E, F potipiai) ir O grupės; reagento rinkinio jautrumas buvo 100 %;

Reagentų rinkinio jautrumas buvo nustatytas atliekant tarptautinių serokonversijos plokščių tyrimą Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 930.

Reagentų rinkinys aptinka antikūnus prieš ŽIV-1 standartinės grupės, kurioje yra antikūnų prieš ŽIV-1 („AT (+) HIV-1 Standard“, Nr. FSR 2007/00953, 2007 m. spalio 25 d.), serumuose, aptinka antikūnus ŽIV-2 standartiniuose serumuose, kuriuose yra antikūnų prieš ŽIV-2 („AT (+) HIV-2 Standard“, Nr. FSR 2007/00953, 2007 m. spalio 25 d.). Jautrumas – 100%.

2011 m. liepos 13 d. registracijos liudijimas Nr. FSR 2010/07958 (galiojimas neribotas)

Junginys:

• Imunosorbentas. Baltos nitroceliuliozės membranos juostelės su atskirais ŽIV-1 baltymais (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) ant jų buvo sorbuotos elektrotransferiniu būdu ir užteptos ant juostelės sintetiniu ŽIV-2 peptidu, analogu. gp36 baltymo ir anti-IgG-žmogaus (vidinė kontrolė) - 18 vnt.;
• K- – kontrolinis neigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame nėra antikūnų prieš ŽIV-1,2, HCV, ŽIV antigeną, HBsAg, inaktyvuojamas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido;
• K+ – kontrolinis teigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš ŽIV-1,2 (titras ne mažesnis kaip 1:10000), neturintis HBsAg, ŽIV antigeno, antikūnų prieš HCV, inaktyvuojamas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml) Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido.
• K+sl – kontrolinis silpnai teigiamas serumas. Žmogaus kraujo serumas, kuriame yra antikūnų prieš ŽIV-1,2 (titras ne didesnis kaip 1:200), neturintis HBsAg, ŽIV antigeno, antikūnų prieš HCV, inaktyvuojamas kaitinant 560C temperatūroje; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 mėgintuvėlis (0,08 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio ir natrio azido;
• RPOKk (x10) - tirpalas mėginiams ir konjugatui skiesti. Koncentratas – Tris buferis, kuriame yra iš anksto apdorotas normalus ožkos serumas; nepermatomas pilkas skystis - 1 buteliukas (10 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio;
• PRk (x20) - plovimo tirpalas. Koncentratas – Tris buferis, kuriame yra Tween-20; skaidrus bespalvis skystis - 1 buteliukas (70 ml). Sudėtyje yra konservantų: timerosalio;
• Konjugatas. Ožkos anti-žmogaus IgG antikūnai, konjuguoti su šarmine fosfataze; skaidrus bespalvis skystis - 1 mėgintuvėlis (0,06 ml);
• Substratas (dažymasis tirpalas). 5-brom-4-fluorindolilfosfato (BCIP) ir nitromėlynojo tetrazolio (NBT) tirpalas; skaidrus šviesiai geltonas skystis - 1 butelis (50 ml);
• Milteliai imunoblotavimui. Nugriebto pieno milteliai - amorfiniai balti arba šviesiai geltoni milteliai - 5 pak. x 1g;
• Tabletė su dangteliu reakcijai nustatyti - 2 vnt.;
• Plastikiniai pincetai - 1 vnt.

ŽIV imunoblotas aptinka antikūnus prieš viruso baltymus, esančius ant specialios nitroceliuliozės membranos. Tai labai tikslus tyrimas, kuris nustato frakcijų, kuriose pagrindiniai baltymai yra mažų juostų pavidalu, buvimą.

ŽIV-1 viruso apvalkale yra glikoproteinų, kurių molekulinė masė svyruoja nuo 41 kd iki 160 kd (kilodaltonų). Didelę reikšmę imunoblotavimui turi ŽIV-2 glikoproteinas, kurio molekulinė masė nuo 32 kd iki 140 kd. ŽIV-1 šerdies baltymai ir viruso fermentai yra pavaizduoti baltymais p17, p24, p55.

Sukėlėjas ŽIV-2 susideda iš baltymų, žymimų p16, p25, p56. Jie sudaro jo vidinį apvalkalą. Genomas apima 6 reguliavimo ir 3 struktūrinius genus. Dažnai dalijantis ląstelėms atsiranda genetinių netikslumų ir atsiranda keli patogeno potipiai.

Teigiami testai

Siekiant pašalinti ŽIV infekcijos laboratorinės diagnostikos klaidas, pacientui skiriamas papildomas tyrimas. Jo rezultatai integruojami kaip teigiami, jei aptinkami antikūnai prieš 2 ar 3 ŽIV-1 arba ŽIV-2 baltymus.

Imunoblotas patvirtina visus gerus ELISA rezultatus. Tokiu atveju aptinkami antikūnai prieš gp120/160, gp41 arba p24, kurie yra trijų pagrindinių AIDS genų – gag, pol ir env – struktūriniai vienetai. Kai kuriems pacientams, kurių ELISA ir PGR rezultatai neigiami, imunoblotas rodo keletą teigiamų juostelių. Gydytojas paskiria papildomą p24 testą, kad nustatytų teisingą diagnozę ir pašalintų ankstyvą ŽIV infekcijos fazę.

Jei gauti rezultatai kelia abejonių, paciento prašoma tyrimą pakartoti per ateinančius 3 mėnesius. Beveik visi ŽIV atvejai patvirtinami naudojant imunoblotavimo sistemą – Sanofi prietaisą. Daugeliu atvejų aptinkami ŽIV antigenai, p25, gp110/120 ir gp160 baltymai, rodantys užsikrėtimą virusu. Klaidingai teigiamas testas registruojamas pacientams, sergantiems jungiamojo audinio ligomis, kai sąveikaujant su įvairiais viruso antigenais yra padidėjęs bilirubino kiekis.

Neigiamas rezultatas

Jei trūksta teigiamų linijų, atitinkančių AIDS viruso baltymus, imunoblotas interpretuojamas kaip neigiamas rezultatas. Analizė aiškiai patvirtina imunodeficito viruso infekcijos nebuvimą arba rodo „lango laikotarpį“. Jei imunoblotas duoda neigiamą rezultatą, žmogus nėra AIDS viruso nešiotojas.

Tyrimui imami ŽIV infekuotų pacientų kraujo serumo mėginiai. Jie laikomi užšaldyti -20°C temperatūroje. Analizė atliekama naudojant testavimo sistemas:

• antigenas;
• Rekombinantinis-ŽIV;
• Peptosscreen.

Neigiamo rezultato registravimas rodo, kad serume nėra antikūnų prieš ŽIV apvalkalo glikoproteinus gp120, gp160, Sp41.

Dažnai pacientas domisi klausimu, ar paciento, kurio seksualinis partneris yra užsikrėtęs, imunoblotas gali būti neigiamas dėl ŽIV. Po tyrimo dažnai gaunamas abejotinas rezultatas arba aptinkami antikūnai prieš gp120 ir gp160 baltymus, o tai rodo visišką neigiamų duomenų nebuvimą. Kartais pacientams, sergantiems besimptome infekcija, užfiksuojamas abejotinas atsakas.

Neaiškinami rezultatai

Tyrimai, atlikti naudojant įvairius ŽIV antikūnų tyrimus, kartais būna neigiami ir neatitinka seropozityvumo kriterijų. Gydytojui sunku nustatyti abejotino rezultato priežastį.

Kai kuriems pacientams ŽIV infekcija negresia. Gydytojas gali padaryti klaidų interpretuodamas tyrimo rezultatus, jei infekciją sukelia kitoks serotipas.

Laikui bėgant būtina ištirti paciento kraujo serumą. Jei per 6 mėnesius nepastebima jokių AIDS klinikinių apraiškų ir nėra rizikos veiksnių, pacientas registruojamas kaip nesergantis.

Pacientams, kuriems yra nedidelė infekcijos rizika, gaunami abejotinų tyrimų rezultatai. Kai kuriais atvejais neaiškių duomenų atsiradimą sukelia imuniniai kompleksai ir autoantikūnai, esantys kraujo serume.

Kai kuriems pacientams abejotinus rezultatus sukelia patologinių procesų vystymasis:

• užkrečiamos ligos;
• vėžinis navikas;
• alerginė reakcija.

Pacientui pasikeičia klinikinis kraujo tyrimas, padidėja C reaktyvaus baltymo kiekis arba padidėja ESR. Žmonėms, sergantiems infekcinėmis ligomis, dažnai nustatoma abejotina imunoblotinė reakcija į ŽIV.

Pacientai, kurių rezultatai neapibrėžti, negali duoti kraujo ir biologinių medžiagų.

Linijinis metodas

Imunoblotavimo principas apima:

1. Natūralios virusinės medžiagos ŽIV formato arba antigenų naudojimas Western Blot formatu.
2. ŽIV baltymų derinys su atskirais antikūnais, aptiktais kraujo serume.
3. Inkubacijos procesas, kuris vyksta pridedant žymėtų antikūnų prieš žmogaus Ig.
4. Spalvotų juostelių interpretacija.

Analizė leidžia gydytojui laiku interpretuoti tyrimo rezultatus. Teigiamas blotas iššifruojamas kaip 2ENV+/- GAG+/POL, neapibrėžtas - 1 ENV+/- GAG+/POL. Neigiamas rezultatas reiškia, kad nėra dryžių.

Analizei atlikti naudojami rekombinantiniai ir lizatiniai imunoblotai. Tyrimas yra specifinis ir yra 99,5 proc.

Pacientams kyla klausimas, ar tyrimo rezultatas gali būti interpretuojamas kaip klaidingas. Gauti duomenys gali būti generuojami stimuliuojant organizmo apsaugą (nėštumas, hemodializė). Įtarus ūminį retrovirusinį sindromą ir rekomenduojamas kontaktas su ŽIV užsikrėtusiu pacientu, pacientui rekomenduojama duoti serumo PGR reakcijai atlikti. Pakartotinis serologinis tyrimas patvirtinamas išmatavus virusų kiekį pateiktame biologinės medžiagos mėginyje.

ŽIV diagnozė naujagimiams

AIDS testas mažam vaikui atliekamas, jei užmezgamas kontaktas su ŽIV infekuota motina. Serologinės reakcijos gali būti teigiamos 1,5 metų. Antikūnai naujagimio kraujo serume nustatomi naudojant ELISA, RIF ir imunoblotavimo reakcijas.

Per 9 vaiko gyvenimo mėnesius teigiamas rezultatas atsiranda dėl motinos antikūnų buvimo kraujo serume. P24 antigeno specifiškumas yra apie 65%. Kai kuriais atvejais neįmanoma nustatyti antikūnų sergančiam vaikui, jei jam nustatomas įgimtas mažas globulinų kiekis kraujyje. Nustatytas neigiamas imunobloto rezultatas negarantuoja infekcijos nebuvimo.

Bandymas atliekamas keliais etapais:

• 1-2 dienos po gimimo;
• 1-2 mėnesių amžiaus;
• šešių mėnesių amžiaus.

Tolesnis antikūnų tyrimas atliekamas tol, kol gaunami 2 neigiami imunoblotų rezultatai. AIDS diagnozė vaikui, gimusiam ŽIV infekuotai moteriai, galima remiantis 2 teigiamais PGR rezultatais. ŽIV patogeno perdavimas naujagimiui yra atmestas, jei moteris nežindo.

Nėštumo testas

Būsimai mamai skiriamas imuninis ir linijinis blotavimas, jei ELISA būdu gaunamas teigiamas ŽIV rezultatas. Jei dėmė patvirtinama, pacientas serga AIDS. Šiuo atveju, pradedant nuo 14 nėštumo savaitės, skiriamas gydymas, siekiant užkirsti kelią vaiko infekcijai.

Ar nėštumo metu atlikdamas kraujo serumo tyrimą specialistas gali suklysti, pacientės klausia savo gydančio gydytojo. Jis privalo nėščiajai duoti PGR ir ELISA tyrimų kopijas, kad nekiltų abejonių dėl jų patikimumo.

Atliekant imunoblotavimą kartais iškyla problemų, tačiau jei ELISA, blot ir PGR rezultatai teigiami, ŽIV infekcijos diagnozė galutinai patvirtinama. Tikimybė gauti klaidingai teigiamą testą nėštumo metu yra didelė. Jei ELISA yra (+), o imunoblotas yra (-), moters prašoma pakartotinai paimti kraujo serumą.

Nėščios moters mainų kortelėje nurodomas tyrimo rezultatas. Jei jo reikšmė teigiama, moteriai draudžiama maitinti vaiką po gimdymo, kad neužkrėstų AIDS virusu. Galutinės išvados daromos remiantis laboratoriniais, klinikiniais ir epidemiologiniais tyrimais. Tik juos iššifravus pacientui diagnozuojama ŽIV infekcija.

Susisiekus su

Kas yra imunoblotas? Tai yra įprastas žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Tai laikoma vienu tiksliausių ir patikimiausių būdų nustatyti ŽIV buvimą. Savo patikimumu jis pranoksta net imunoblotų rezultatus, kurie laikomi nepaneigiamais ir galutiniais.

Bendra informacija

Imunoblotas - kas tai? Norint atpažinti ŽIV infekciją žmogui, būtina atlikti laboratorinį kraujo serumo tyrimą dėl antikūnų buvimo. Imunoblotavimo metodas taip pat vadinamas Western blot. Jis naudojamas žmogaus virusinėms infekcijoms nustatyti kaip papildomas ekspertinis metodas. Būtina patvirtinti ELISA – laboratorinį tyrimą, leidžiantį nustatyti ŽIV antikūnų buvimą kraujyje. Teigiamas ELISA testas dar kartą patikrinamas imunoblotingu. Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiausiu.

Tikslas

Kas yra imunoblotas? Tai laboratorinis kraujo serumo antikūnų prieš virusą tyrimo metodas. Tyrimo metu specialistas pirmiausia atskiria viruso baltymus gelyje ir perkelia juos į nitroceliuliozės membraną. Imunoblotavimo procedūra skirta ŽIV aptikimui įvairiais etapais. Pirmajame etape išgrynintas virusas iš jo sudedamųjų dalių yra elektroforezuojamas, o jo sudėtyje esantys antigenai yra atskiriami pagal molekulinę masę.

Jis dauginasi gyvoje ląstelėje, įterpdamas į ją savo genetinę informaciją. Šiame etape žmogus tampa ŽIV viruso nešiotoju, jei buvo užsikrėtęs. Ligos specifika yra ta, kad ji gali nepasireikšti ilgą laiką. Virusas naikina limfocitus, todėl sumažėja žmogaus imunitetas, organizmas tampa nebepajėgus atsispirti infekcijoms. Jei ŽIV bus gydomas teisingai ir laiku, pacientas gyvens iki senatvės. Gydymo trūkumas neišvengiamai veda prie mirties. Nuo užsikrėtimo momento, bet be gydymo, maksimali gyvenimo trukmė yra ne daugiau kaip dešimt metų.

Ypatumai

Imunoblotinė analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti, ar yra antikūnų prieš pirmojo ir antrojo tipo ŽIV antigenus. Jei žmogus yra užsikrėtęs, per dvi savaites atsiranda antikūnų, kuriuos galima aptikti daug vėliau. ŽIV ypatumas yra tas, kad antikūnų kiekis greitai didėja ir išlieka paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga gali nepasireikšti dvejus ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nustato ligos buvimą, todėl, jei fermento imunologinis tyrimas rodo teigiamą rezultatą, būtina patvirtinti rezultatus naudojant imunoblotą ir PGR.

Naudojimo indikacijos

Kas yra „imunoblotas“, jau išsiaiškinta, bet kam šis tyrimas skirtas? Imunoblotingo tyrimo priežastis yra teigiamas ELISA rezultatas. Pacientams, kuriems bus atlikta operacija, būtina atlikti fermentinį imuninį tyrimą. Be to, moterys, planuojančios nėštumą, taip pat visi, kurie yra pasimetę, turėtų būti tikrinami. Imunoblotavimas skiriamas ŽIV užsikrėtusiems pacientams, jei kyla abejonių dėl ELISA rezultatų. Šie nerimą keliantys simptomai gali būti priežastis kreiptis į gydytoją:

• staigus svorio kritimas;
• silpnumas, veiklos praradimas;
• žarnyno sutrikimas (viduriavimas), trunkantis tris savaites;
• kūno dehidratacija;
• karščiavimas;
• padidėję limfmazgiai ant kūno;
• kandidozės, tuberkuliozės, pneumonijos, toksoplazmozės vystymasis, herpeso paūmėjimas.

Prieš duodamas veninį kraują pacientui ruoštis nereikia. Jūs neturėtumėte valgyti 8-10 valandų prieš tyrimą. Dieną prieš kraujo davimą nerekomenduojama gerti alkoholinių ar kavos gėrimų, užsiimti sunkiu fiziniu krūviu, jausti nerimą.

Kur atlikti analizę?

Kur galiu išsitirti dėl ŽIV? ELISA ir imunoblotų tyrimai atliekami miesto privačiose klinikose, rezultatai pateikiami per 24 val. Galima ir skubi diagnozė. Valstybinėse gydymo įstaigose ELISA tyrimai ir imunoblotingas atliekami nemokamai, remiantis Rusijos Federacijos teisės aktais. Nėščios moterys, taip pat pacientai, gydomi ligoninėje ar atliekama operacija, privalo pasitikrinti dėl infekcinių ligų.

Kaip atliekamas tyrimas?

Kaip atliekama ELISA analizė? Teigiamas/neigiamas imunoblotas patvirtina arba paneigia fermento imunologinio tyrimo rezultatus. Tyrimo procedūra yra gana paprasta. Specialistas paima veninį kraują, kuris trunka ne ilgiau kaip penkias minutes. Paėmus mėginius, injekcijos vietą reikia dezinfekuoti ir uždengti juostele. Mėginys imamas nevalgius, todėl po procedūros nepakenks suvalgyti plytelę juodojo šokolado ar išgerti saldaus karšto gėrimo.

Norint gauti siuntimą nemokamai pasitikrinti valstybinėje gydymo įstaigoje, reikia apsilankyti pas bendrosios praktikos gydytoją. Apskritai imunoblotingas mėginių ėmimo metodu nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų. Tyrimo metodika paprasta. Jei žmogaus kraujyje yra viruso, organizmas pradeda gaminti antikūnus, kad jį sunaikintų. Kiekvienas virusas turi savo antigenų baltymų rinkinį. Šių antikūnų aptikimas yra imunoblotavimo technikos pagrindas.

Kaina

Kiek kainuoja analizė? ŽIV imunoblotas nėra pigus testas. Vidutiniškai atrankos tyrimas naudojant fermentų imunologinius metodus kainuoja nuo 500 iki 900 rublių. Imunoblotavimas yra patikrinimo tyrimas, kurio kaina yra nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pavyzdžiui, turėsite sumokėti apie 12 000 rublių.

Rezultato interpretacija

Dažniausi ŽIV infekcijos diagnozavimo metodai yra su fermentais susiję imunosorbento tyrimai ir imunoblotai. Jie naudojami imunodeficito viruso antikūnams nustatyti kraujo serume. Infekcijos buvimas paprastai patvirtinamas dviem tyrimais: patikra ir patvirtinamuoju. Tyrimo rezultatų aiškinimą turi atlikti gydytojas, kuris taip pat nustato diagnozę ir paskirs gydymą. Jei imunoblotas teigiamas, tai reiškia, kad žmogaus organizme yra virusas.

Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiško gydymo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti skirtingą ligos vaizdą. Kokybinė analizė apima atranką ir patikrinimą. Jei pacientas neturi viruso, rezultatas nurodomas kaip „neigiamas“. Jei aptinkama atrankos metu, atliekamas papildomas patikros tyrimas. Imunoblotas yra analizė, kuri patvirtina arba paneigia atranką. Jei bandymo juostelėje tam tikrose vietose (baltymų vietose) atsiranda tamsų, nustatoma ŽIV diagnozė. Jei rezultatai abejojami, tyrimai atliekami per tris mėnesius.

Užsikrėsti imunodeficito virusu galite, jei laikysitės tam tikrų taisyklių: venkite atsitiktinių lytinių santykių, kontakto metu naudokitės prezervatyvu, nevartosite vaistų. Jei liga nustatoma nėščiai moteriai, svarbu griežtai laikytis gydančio gydytojo rekomendacijų ir nepamiršti pasitikrinti, ar nėra viruso.

Imunoblotingas -(iš anglų kalbos „blot“ - spot) - antigenų (arba antikūnų) nustatymo metodas naudojant žinomus serumus (arba antigenus). Tai gelio elektroforezės ir ELISA derinys. Iš pradžių bakterijų ląstelės arba virionai sunaikinami ultragarsu, o vėliau visi viruso ar bakterijų ląstelių antigenai yra atskiriami elektroforezės būdu ir ant specialios nitroceliuliozės plėvelės gaunamas komercinis reagentas. Atliekant imunoblotavimą, tiriamas paciento serumas uždedamas ant plėvelės su žinomais antigenais. Po inkubacijos ir neprisijungusių antikūnų plovimo pereikite prie ELISA – ant plėvelės užtepamas antiserumas prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintus fermentu, ir chromogeniniu substratu, kuris keičia spalvą sąveikaudamas su fermentu. Esant antigenui-antikūnui-antiserumui prieš imunoglobulino-fermento kompleksus, ant nešiklio atsiranda spalvotų dėmių. Imunoblotavimo metodas leidžia atskirai aptikti antikūnus prieš įvairius patogenų antigenus (pavyzdžiui, sergant ŽIV infekcija, imunoblotavimas aptinka antikūnus prieš gp120, gp24 ir kitus viruso antigenus).

Radioimuninis tyrimas (RIA)

Metodas pagrįstas antigeno ir antikūno reakcija naudojant radionuklidu pažymėtą antigeną arba antikūną. 125I, 14C, 3H, 51Cr ir kiti radionuklidai naudojami kaip etiketės. Susidarę imuniniai kompleksai išskiriami iš sistemos ir jų radioaktyvumas nustatomas skaitikliais (β-spinduliuotė). Spinduliuotės intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas surištų antigenų ir antikūnų molekulių skaičiui.

Kietosios fazės RIA versija, naudojant žymėtus antikūnus arba antigenus, sorbuotus polistireno plokščių šuliniuose, yra plačiai paplitusi.

RIA naudojama aptikti mikrobų, virusų, įvairių hormonų, fermentų, vaistų, imunoglobulinų antigenus, taip pat kitas medžiagas, esančias tiriamojoje medžiagoje nedidelėmis 10-12-10-15 g/l koncentracijomis.

Kontroliniai klausimai

Imuninės bakteriolizės reakcija: kokia tai reakcija; kas yra antigenas, kas yra antikūnas, reakcijos mechanizmas, gamybos metodai, praktinis pritaikymas. Imuninės hemolizės reakcija: būtini ingredientai, procedūra; valdikliai, praktinis pritaikymas. Vietinė hemolizės reakcija gelyje (Jerne reakcija): reakcijos principas, formulavimo būdas, praktinis pritaikymas. Komplemento fiksavimo reakcija: reakcijos principas; kas susidaro, kai imuninis serumas sąveikauja su konkrečiu antigenu; kas atsitiks su papildymu, jei jis yra šios sąveikos metu? Koks yra komplemento likimas, jei nėra specifinio afiniteto tarp antigeno ir antikūnų? Kokia reakcija gali būti naudojama norint nustatyti, kas nutiko komplementui; kodėl naudojama ši konkreti reakcija; Koks yra matomas teigiamas RSC rezultatas? Kodėl? Kokia komplemento savybė naudojama pirmoje RSC fazėje? Antrame etape? Jei galutinis RSC rezultatas yra hemolizė, ar tai reiškia teigiamą ar neigiamą rezultatą? Paaiškinkite rezultatus: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Pavadinkite pirmosios RSK sistemos sudedamąsias dalis ir antrosios RSK sistemos sudedamąsias dalis. Kodėl tiriamąjį serumą reikia inaktyvuoti? Kaip titruojamas komplementas? Hemolizinis serumas: kas jame yra, kaip jis gaunamas, koks titras ir kaip jis nustatomas? Kokie gyvūnai naudojami RSC komponentams gauti? RSC nustatymo šaltyje metodika. Kurioms iš šių reakcijų inscenizuojant reikalingas komplemento dalyvavimas: nusodinimas, flokuliacija, agliutinacija, nepilnų antikūnų nustatymas, imuninė bakteriolizė, imuninė hemolizė, Jerne, RSC? Imunofluorescencinė reakcija (RIF) – nurodykite tiesioginės Koons reakcijos įvykių seką; reikalingų ingredientų. Kas yra antigenas, kas yra antikūnas, kuo žymimi antikūnai, kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą, kaip atrodo teigiamas rezultatas? Praktinis pritaikymas – ką galima nustatyti naudojant šią reakciją? Netiesioginė imunofluorescencinė reakcija – nurodykite įvykių seką šios reakcijos metu, reikalingus ingredientus, koks yra antigenas, kokie imuniniai serumai naudojami; praktinis naudojimas; netiesioginio RIF pranašumas, palyginti su tiesiogine reakcija. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – reakcijos principas; būtini ingredientai; nurodyti įvykių seką, kai atliekama antigeno nustatymo reakcija tiriamoje medžiagoje; būtini ingredientai; Kas nutinka, kai rezultatas yra teigiamas, kaip jis atrodo? Nurodykite veiksmų seką atliekant ELISA antikūnams aptikti tiriamajame serume; būtini ingredientai; kas atsitiks, jei rezultatas bus teigiamas? Imunoblotingas – reakcijos principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; kaip atsižvelgiama į rezultatą; reakcijos nauda. Radioimuninis tyrimas (RIA) – kokie yra pagrindiniai reakcijos etapai; Kuo paženklinti antikūnai ar antigenai, kaip atsižvelgiama į rezultatą? Imunoelektroninė mikroskopija – metodo principas; pagrindiniai etapai; būtini ingredientai; kuo paženklinti antikūnai? kaip atsižvelgiama į reakcijos rezultatą. Imobilizacijos reakcijos – metodo principas, nustatymo technika, komponentai, rezultatų fiksavimas.

Užduotys, kurias reikia atlikti savarankiško mokymosi metu.

Užpildykite lentelę „Imuninės reakcijos“ pagal šioje temoje aptartas reakcijas.

Imuninės reakcijos

Mokinio darbas praktinės pamokos metu

Nedelsdami pradėkite darbą nustatydami 1 RSK etapą, bet vėliau užsirašykite jį į užrašų knygelę (žr. toliau).

1. Imuninės hemolizės reakcija. Peržiūrėkite demonstracinę imuninės hemolizės reakciją, nubraižykite ją diagramos pavidalu, paaiškinkite rezultatą eksperimentiniuose ir kontroliniuose mėgintuvėliuose.

2. Komplemento fiksavimo reakcija

a) išanalizuoti RSK pagal lentelę;

b) užrašų knygelėje nubraižykite RSC sąrankos schemą lentelės pavidalu;

c) įdėti antrąjį RSK etapą (pirmasis etapas dedamas pamokos pradžioje);

d) analizuoti RSC būtinus diagnostinius preparatus;

d) atsižvelgti į rezultatą. Suformuluokite išvadą apie specifinių antikūnų buvimą tiriamajame serume.

3. Imunofluorescencinė reakcija. Išstudijuokite lentelę, savo sąsiuvinyje pasidarykite reakcijos schemą; pažvelgti į diagnostikos serumus; nustatyti, kas serume yra, kaip jis paruoštas, kokiai reakcijai (tiesioginei ar netiesioginei RIF) naudojamas. Pažiūrėkite į RIF demonstravimo rezultatą fluorescenciniame mikroskope.

4. Su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas (ELISA). Užrašų knygelėje sudarykite dviejų versijų reakcijos nustatymo schemą: antigenui aptikti tiriamoje medžiagoje ir antikūnams serume aptikti. Peržiūrėkite ŽIV ir hepatito B sudedamųjų dalių rinkinį. Nustatykite, ką sudaro kiekvienas ingredientas ir kam jis naudojamas.

5. Imunoblotingas. Padarykite reakcijos schemą savo užrašų knygelėje; žiūrėti demonstraciją – reakcijos rezultatas.

6. Radioimuninis tyrimas (RIA). Savo užrašų knygelėje sudarykite reakcijos diagramą.

7. Imuninė elektroninė mikroskopija (IEM). Stebėkite demonstraciją – reakcijos rezultatą, užrašų knygelėje nubraižykite reakcijos schemą, rodyklėmis nurodykite antigeną (virusą) ir paženklintus antikūnus.

Imunoblotavimas yra labai jautrus baltymų nustatymo metodas, pagrįstas elektroforezės ir ELISA arba RIA deriniu. Imunoblotavimas naudojamas kaip ŽIV infekcijos diagnostikos metodas ir kt.

Bendrąja prasme imunoblotingas reiškia baltymų mišinio, perkelto į kietą membranos atramą, prie kurios jie yra surišti kovalentiniais ryšiais, analizę, po kurios atliekama imunodetekcija.

Baltymų mišinį galite analizuoti tiesiogiai ant substrato – taškinio blotavimo analizę – arba po jo preliminaraus frakcionavimo elektrofokusavimo, disko elektroforezės arba dvimatės elektroforezės būdu – Western blot analizę.

Patogeno antigenai atskiriami naudojant poliakrilamido gelio elektroforezę, po to iš gelio perkeliami į aktyvuotą popierių arba nitroceliuliozės membraną ir sukuriami naudojant ELISA.

Įmonės gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“. Ant šių juostelių tepamas paciento serumas. . Tada po inkubacijos pacientas nuplaunamas nuo neprisijungusių antikūnų ir užtepamas serumu prieš žmogaus imunoglobulinus, paženklintus fermentu. . Ant juostelės susidaręs kompleksas (antigenas + paciento antikūnas + antikūnas prieš žmogaus Ig) aptinkamas pridedant chromogeninį substratą, kuris keičia spalvą veikiant fermentui.

Ši metodika taip pat naudojama atrenkant bakterijų, fagų ar virusų, ekspresuojančių tikslinius klonuotų genų produktus, klonus.

Baltymų perkėlimas į membraną atliekamas pasyviai arba naudojant elektros perdavimo įrangą. Baltymų pernešimo į membraną efektyvumą įtakoja daugelis veiksnių, tokių kaip baltymų molekulinė masė, gelio poringumas, perdavimo laikas ir naudojamo buferinio tirpalo (trans-buferio) sudėtis.

Atsižvelgiant į eksperimento tikslus ir sąlygas, parenkamos perkėlimo sąlygos, kurios užtikrina geriausius rezultatus. Nitroceliuliozė, polivinilideno difluoridas (PVDF) arba teigiamai įkrautos nailono membranos dažniausiai naudojamos kaip substratai. Nitroceliuliozė gali surišti iki 80 - 100 μg baltymų 1 cm2.

Mažos molekulinės masės baltymai (kurių molekulinė masė mažesnė nei 20 kDa) gali būti prarasti dėl plovimo Tai leidžia preliminariai ištirti tam tikrų genetinių lokusų polimorfizmą, remiantis atitinkamų DNR restrikcijos fragmentų ilgiais.

Be to, naudodamiesi Southern hibridizacija galite nesunkiai sužinoti, ar tikslinio geno vidinėje dalyje yra hidrolizės vieta, kurią vykdo tam tikras restrikcijos fermentas, o tai leidžia pasirinkti optimalią tiriamos genomo srities klonavimo strategiją.

Naudojant panašią schemą, RNR molekulės gali būti perkeltos iš agarozės gelio į nitroceliuliozės filtrą. Šis metodas buvo vadinamas Northern blotting, priešingai nei Southern blotting, nes pavadinimas Southern angliškai reiškia „pietinis“.

Baltymų perkėlimas ant filtrų iš gelio buvo atitinkamai vadinamas Western blotting. Dideli baltymai (>100 kDa), denatūruoti natrio dodecilsulfato (SDS) tirpale, gali būti prastai perkelti į membraną, jei transbuferyje yra etanolio. Alkoholis žymiai pagerina baltymų pernešimą iš SDS-poliakrilamido gelio, tačiau susiaurina poras gelyje, dėl ko išlaikomi dideli baltymai.

PVDF membrana yra optimizuota imunodetekcijai ir gali išlaikyti iki 160 μg/cm2 specifiškai surištų baltymų su labai mažu nespecifinio surišimo lygiu.

Imunoblotingas

Svarbi šios membranos savybė yra galimybė ją pakartotinai naudoti. Zeta-Probe nailono membranos veiksmingai suriša SDS baltymus, kai nėra alkoholio, ir šis surišimas yra atsparus tolesniam gydymui. Taip pat efektyviai išlaikomi mažos molekulinės masės baltymai. Zeta-Probe membranos, kurių surišimo geba yra maždaug 480 μg baltymų viename cm2, leidžia aptikti nedidelius baltymų kiekius bandomuosiuose mišiniuose.

Kai antigenas yra imobilizuotas ant membranos, likusios surišimo vietos blokuojamos želatinos, galvijų serumo albumino arba nugriebto pieno tirpalais.

Tada membrana inkubuojama polikloninių arba monokloninių antikūnų prieš tiriamą antigeną tirpale. Nuplovus neprisijungusius antikūnus, membrana inkubuojama antrinių antikūnų tirpale, kurie yra fermentų šarminės fosfatazės (AP) arba krienų peroksidazės (HRP) konjugatas su antikūnais prieš rūšinius (ožkų antikūnus prieš triušių, pelių ar žmogaus imunoglobulinus). ) arba baltymai A (Staphylococcus aureus baltymas) arba G (Streptococcus sp. baltymas), turintys didelį afinitetą imunoglobulinų Fc sričiai.

Susidariusių imuninių kompleksų aptikimas atliekamas cheminiu arba chemiliuminescenciniu būdu. Cheminės reakcijos substratai, kai naudojami šarminės fosfatazės konjugatai, yra 5-bromo-4-chlor-3-indolilfosfatas (BCIP) arba mėlynasis tetrazolis (NBT), o naudojant krienų peroksidazės konjugatus - 4-chlor-1-naftolis ir vandenilio peroksidas. .

Dėl fermentinių reakcijų antigeno-antikūno komplekso lokalizacijos vietoje ant membranos susidaro spalvota juosta arba dėmė.

Šio metodo jautrumas yra 100 pg baltymų naudojant AP konjugatus ir 100-500 pg naudojant HRP konjugatus. Chemiliuminescencinis imuninių kompleksų nustatymas leidžia aptikti mažiau nei 5 pg antigeno. Šio metodo principas – HRP reaguojant su vandenilio peroksidu ir cikliniu diacilhidrazino luminoliu, išspinduliuojama 428 nm bangos ilgio šviesa, kurią galima užfiksuoti šviesai jautrioje plėvelėje.

Imunoblotavimo (IB) reakcija buvo sukurta remiantis ELISA. Tai specifiškiausias ir jautriausias imunocheminės analizės metodas. Imunoblotavimas (iš anglų kalbos blot - blot, stain) sujungia ELISA su elektroforeze. Jis naudojamas aptikti ne sudėtingus antikūnus prieš ŽIV, o antikūnus prieš atskirus jo struktūrinius baltymus (baltymus p24, glikoproteinus gp120, gp 41 ir kt.). Nurodo ekspertų (patvirtinančias) reakcijas diagnozuojant ŽIV infekciją.

Reakcija vyksta keliais etapais:

Virusas sunaikinamas į komponentus - antigenus (p24, gp120, gp 41 ir tt), kuriems atliekama elektroforezė poliakrilamido gelyje, tai yra, antigenų atskyrimas į frakcijas pagal molekulinę masę.

2. Gelis padengiamas nitroceliuliozės membrana ir elektroforezės būdu į ją perkeliamos antigeno frakcijos. Nitroceliuliozė elgiasi kaip blotingasis popierius. Membrana supjaustoma juostelėmis. Įmonės gamina tokias juosteles su antigenų „dėmėmis“.

Imunoblotavimas – papildomas netiesioginis metodas

ŽIV antigenais padengtos juostelės panardinamos į tiriamojo serumą ir nuplaunamos, kad būtų pašalinta nesusijusi medžiaga.

4. Juostelės inkubuojamos su peroksidaze paženklintu antiglobulino serumu ir nuplaunamos.

Pridedamas substratas ir pažymimas spalvotų frakcijų (dėmių), atitinkančių AG-AT komplekso lokalizacijos zoną, skaičius.

Juostų buvimas tam tikrose juostelės vietose patvirtina, kad tiriamame serume yra antikūnų prieš griežtai apibrėžtus ŽIV antigenus. Imunoblotavimo rezultatas laikomas teigiamu, jei membranoje matomos juostos, atitinkančios bet kuriuos du iš trijų ŽIV antigenų – p24, gp41 ir gp 120 (37 pav.).

BRĖŽINIAI

NAUDOTŲ NUORODOS SĄRAŠAS

Pagrindinė literatūra

Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija: vadovėlis medicinos studentams. universitetai 2-asis leidimas, red. ir papildomas – 702 p. Red. A.A. Vorobjova. M.: VRM, 2012 m.

2. Mikrobiologija, virusologija ir imunologija: žinynas laboratoriniams užsiėmimams: vadovėlis/(V.B. Sboičakovas ir kt.); Redaguota V. B. Sboychakova, M. M. Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 p.: iliustr.

3. Medicinos mikrobiologija, imunologija ir virusologija [Elektroninis išteklius]: medaus vadovėlis.

universitetai - 760 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Sankt Peterburgas: Spetslit, 2010 m.

4. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai / T. 1. - 448 p. — Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Medicinos mikrobiologija, virusologija ir imunologija [Elektroninis išteklius]: vadovėlis: 2 tomai T. 2. - 480 p. Prieigos režimas: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010 m.

papildomos literatūros

1. Imunodiagnostinės reakcijos: vadovėlis / komp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Rusijos sveikatos apsaugos ministerijos valstybinės biudžetinės aukštojo mokslo įstaigos BSMU leidykla, 2016 m. - 86 p.

2. Kai kurių savybių, lemiančių kartu auginamų bakterijų Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus patogeninį potencialą, ypatybės: mokslinė publikacija / Yu Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Pagrindinis puslapis » Imunoblotas – kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas

Imunoblotas - kas tai? Imunoblotas diagnozuojant infekcines ligas

Kas yra imunoblotas? Tai yra įprastas žmogaus virusinių infekcijų laboratorinės diagnostikos metodas. Tai vienas tiksliausių ir patikimiausių būdų nustatyti ŽIV buvimą.

Dėl patikimumo jis yra net didesnis nei su fermentu susijęs imunosorbentinis tyrimas (elisa). Imunoblotų rezultatai yra įtikinami ir įtikinama Bendra informacija

Imunoblotas - kas tai? Norėdami atpažinti asmenį užsikrėtusį ŽIV, turite atlikti laboratorinį tyrimą ir ištirti, ar jūsų kraujo serume nėra antikūnų.

Western blot sekcijos taip pat vadinamos Western blot. Jis naudojamas žmogaus virusinėms infekcijoms nustatyti kaip papildomas ekspertinis metodas. Tai būtina patvirtinant ELISA – laboratoriniu tyrimu, leidžiančiu nustatyti antikūnų prieš ŽIV buvimą kraujyje. Imunoblotas dar kartą patikrina teigiamą ELISA.

Jis laikomas jautriausiu, sudėtingiausiu ir brangiausiu.

Tikslas

Kas yra imunoblotas? Šis kraujo serumo laboratorinio tyrimo metodas, siekiant nustatyti antikūnų prieš virusą buvimą.

Specialių tyrimų metu visi viruso baltymai buvo gelyje ir ant nitroceliuliozės membranų.

Imunoblotavimas (antikūnų aptikimas paciento serume prieš tam tikrus patogeno antigenus)

Western blot sekcijos procedūra skirta ŽIV infekcijai nustatyti įvairiais etapais. Pirmajame etape išvalytas virusas iš jo sudedamųjų dalių yra veikiamas elektroforezės ir jame esantys antigenai dalijami pagal molekulinę masę.

Žmogaus imunodeficito virusas dauginasi gyvose ląstelėse, įterptose į jo genetinę informaciją. Šiame etape žmogus tampa ŽIV viruso nešiotojas, jei esate užsikrėtęs.

Šios ligos specifika yra ta, kad ji ilgą laiką nepasireiškia. Virusas naikina limfocitus, todėl sumažėja žmogaus imunitetas, organizmas nebegali kovoti su infekcijomis.

Jei ŽIV bus gydomas teisingai ir greitai, pacientas gyvens iki senatvės. Gydymo trūkumas neišvengiamai sukelia mirtį. Nuo užsikrėtimo momento, bet be gydymo, maksimalus laikotarpis yra ne daugiau kaip dešimt metų.

Ypatumai

Imunoblotinė analizė yra patikimas metodas, leidžiantis nustatyti, ar yra antikūnų prieš pirmojo ir antrojo tipo ŽIV antigenus.

Jei žmogus yra užsikrėtęs, po dviejų savaičių antikūnai gali būti aptikti daug vėliau. Ypatinga ŽIV savybė yra tai, kad antikūnų kiekis greitai didėja ir lieka paciento kraujyje. Net jei jie yra, liga gali nepasireikšti dvejus ar daugiau metų. ELISA metodas ne visada tiksliai nurodo ligos buvimą, todėl reikia patvirtinti PGR ir Western blot sekcijų rezultatus, jei fermento imunologinis tyrimas parodė teigiamą rezultatą.

Indikacijos dėl

Koks „imunoblotas“ jau buvo nustatytas, bet kuris pristatomas tyrime?

Žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) tyrimo priežastis bus teigiamas ELISA rezultatas. Pacientams, kuriems ruošiamasi operuoti, būtina atlikti su fermentu susietą imunosorbento tyrimą. Be to, turėtumėte atlikti nėštumą planuojančių moterų, taip pat palaidūnų analizę. Western blot sekcijos skiriamos ŽIV užsikrėtusiems pacientams, jei Elisa rezultatai yra neaiškūs.

Kreipimosi į gydytoją priežastimi gali būti šie nerimą keliantys simptomai: greitas svorio kritimas (viduriavimas), kuris trunka tris savaites, padidėję limfmazgiai; , pneumonija, toksoplazmozė, pūslelinės paūmėjimas.

Prieš duodamas veninį kraują pacientui ruoštis nereikia.

Nevalgykite 8-10 valandų prieš tyrimą. Dieną prieš kraujo davimą nerekomenduojama gerti alkoholio ar kavos gėrimų, užsiimti sunkiu fiziniu krūviu, jausti nerimą.

Kur atlikti analizę?

Kur galiu išsitirti dėl ŽIV?

ELISA, imunoblotinė analizė, atliekama miesto privačiose klinikose, duoda rezultatus per dieną. Galima ir skubi diagnozė. Valstybinėse įstaigose medicininiai tyrimai Elisa ir Western blot skyriuose pagal Rusijos Federacijos įstatymus yra nemokami.

Privalomas nėščiųjų ir pacientų, kuriems reikia hospitalizuoti ar operuoti, infekcinių ligų patikra. Kaip atliekamas šis tyrimas?

Kaip atlikti ELISA? Imunoblotas teigiamas / neigiamas patvirtina arba paneigia elisa rezultatus. Procedūra gana paprasta. Specialistas renka veninį kraują, kuris trunka mažiau nei penkias minutes.

Paėmus mėginį, injekcijos vietą reikia dezinfekuoti ir uždengti tvarsčiu. Mėginiai imami nevalgius, todėl po procedūros nepakenks suvalgyti plytelę juodojo šokolado ar saldaus karšto gėrimo.

Norėdami gauti siuntimą nemokamai atlikti tyrimą visuomenės sveikatos įstaigoje, turite apsilankyti pas gydytoją.

Apskritai imunoblotas nesiskiria nuo kitų kraujo tyrimų pagal paėmimą. Tyrimo metodika paprasta. Jei žmogaus kraujyje yra viruso, organizmas pradeda gaminti antikūnus, kad jį sunaikintų. Kiekvienam virusui yra daug baltymų antigenų. Šių antikūnų aptikimas yra Western blot sekcijos metodo pagrindas. Kaina

Kiek laiko trunka analizė? ŽIV imunoblotas yra vienas pigiausių tyrimų.

Vidutiniškai imunologinio tyrimo atrankos metodai svyruoja nuo 500 iki 900 rublių. Western blot skyriai yra čekių, kurių kaina svyruoja nuo trijų iki penkių tūkstančių rublių, tyrimas. Sudėtingesni metodai yra daug brangesni. Pavyzdžiui, už polimerazės grandininės reakcijos (PGR) analizę turėsite sumokėti apie 12 000 rublių.

Rezultatų interpretacija

Dažniausi ŽIV infekcijos diagnozavimo metodai yra su fermentais susijęs imunosorbentas ir imunoblotas.

Jie naudojami antikūnams prieš žmogaus imunodeficito virusą nustatyti serume. Infekcija paprastai patvirtinama dviem tyrimais: patikra ir patvirtinamuoju. Rezultatus turi interpretuoti gydytojas, kuris diagnozuoja ir paskirs gydymą. Jei imunoblotas teigiamas, tai reiškia, kad žmogaus organizme yra virusas.

Teigiamas rezultatas neturėtų būti savarankiško gydymo priežastis, nes kiekvienas pacientas gali turėti savo ligos vaizdą.

Kokybinė analizė apima patikrinimą ir sertifikavimą. Jei virusas pacientui neaptinkamas, rezultatas yra „neigiamas“. Nustačius šį pažymėjimą, atliekami papildomi patikros tyrimai. Imunobloto analizė, kuri patvirtina arba paneigia atranką. Jei bandymo juostelės atsiranda tam tikrose tamsiose vietose (baltymų lokalizacija), nustatoma ŽIV diagnozė.

Jei rezultatai abejotini, tyrimai atliekami per tris mėnesius.

Apsisaugoti nuo užsikrėtimo žmogaus imunodeficito virusu galima laikantis tam tikrų taisyklių: vengti atsitiktinio lytinio kontakto, kontakto metu naudoti prezervatyvus, nevartoti narkotikų.

Nustačius ligą nėščiajai, svarbu laikytis gydančio gydytojo rekomendacijų ir nepamiršti išsitirti, ar nėra viruso.

Kas yra Western blotting?

Baltymų identifikavimas sudėtinguose įvairių audinių mišiniuose ar ekstraktuose yra viena iš dažnai sutinkamų problemų. Naudojant tokį įrankį kaip specifiniai antikūnai, galima nustatyti tiriamą baltymą su minimaliomis laiko ir finansinėmis sąnaudomis.

Taikant Western blot metodą, pirmajame etape baltymų mišinys atskiriamas elektroforezės būdu, dalyvaujant natrio dodecilsulfatui (SDS), po to perkeliamas į nitroceliuliozės membraną elektroblotavimo būdu.

Šio metodo esmė ta, kad po elektroforezės gelis dedamas ant nitroceliuliozės membranos tarp filtravimo popieriaus sluoksnių. Taip surinktas „sumuštinis“ dedamas į elektrinį lauką, kad baltymo-SDS kompleksai judėtų per gelio plokštelę ir būtų imobilizuoti (dėl nespecifinės sorbcijos) ant nitroceliuliozės membranos paviršiaus.

Baltymų-SDS komplekso prisijungimas prie nitroceliuliozės membranos daugiausia apima elektrinio pobūdžio jėgas, o ši sąveika yra daugiataškė ir lemia baltymų „skleidimą“ membranos paviršiuje. Taigi po elektrotransferos gauname nitroceliuliozės gelio kopiją su baltymais, esančiais taip pat, kaip ir poliakrilamido gelyje.

Po SDS elektroforezės, elektropernešimo ir baltymų sorbcijos iš gelio ant nitroceliuliozės membranos, tretinė baltymo konformacija labai pasikeičia, jei apskritai teisinga kalbėti apie tretinės baltymo struktūros egzistavimą po tokio atšiauraus apdorojimo. Todėl imunocheminiam tiriamo baltymo aptikimui dažniausiai naudojami tik mono- arba polikloniniai antikūnai, būdingi baltymo molekulės linijinėms sritims.

51. Fermentinis imunologinis tyrimas, imunoblotingas. Mechanizmas, komponentai, taikymas.

Antikūnai, specifiniai konformaciniams epitopams (arba sritims, kuriose yra tarpsubvienetų kontaktai), paprastai netinka naudoti Western blot tyrime.

Po baltymų pernešimo membrana paeiliui inkubuojama su tiriamam baltymui būdingais antikūnais, o po to su antriniais antikūnais, specifiniais pirminių antikūnų Fc fragmentams, konjuguotais su fermento (ar kokiu nors kitu) ženklu (1 pav.).

1 A). Tuo atveju, kai tiriamam antigenui būdingi pirminiai antikūnai yra tiesiogiai konjuguoti su etikete, antrinių antikūnų nereikia (1 B pav.). Imuniniai kompleksai, susidarę tiriamo baltymo lokalizacijos vietoje, „pasireiškia“ naudojant chromogeninį substratą (priklausomai nuo etiketės tipo).

Metodo jautrumas ir specifiškumas labai priklauso nuo to, kokie antikūnai naudojami tyrime.

Naudojami antikūnai turi būti specifiniai unikaliai aminorūgščių sekai, būdingai tik tiriamam baltymui. Priešingu atveju galima antikūnų sąveika (ypač žalių baltymų ekstraktų atveju) su keliomis baltymų molekulėmis, o tai savo ruožtu lems kelių spalvotų juostų atsiradimą ant membranos.

Šiuo atveju tiriamo baltymo nustatymas dažnai būna sunkus arba net neįmanomas.

Antras svarbus veiksnys, į kurį reikia atsižvelgti renkantis antikūnus, yra afinitetas. Kuo didesnis naudojamų antikūnų afinitetas, tuo ryškesnės ir aiškesnės yra baltymų juostos, tuo didesnis metodo jautrumas. Naudojant didelio afiniteto antikūnus, galima pasiekti 1 ng ar net didesnį jautrumą.

Norint vizualizuoti su membrana susieto antigeno ir antikūnų sąveikos rezultatą, naudojami antriniai antikūnai, konjuguoti su agentais, galinčiais tam tikromis sąlygomis duoti tam tikrą signalą.

Paprastai kaip toks agentas naudojamas fermentas (peroksidazė arba fosfatazė), kurio reakcijos produktas yra spalvotas ir nusėda ant membranos netirpių nuosėdų pavidalu.

Šiuo metodu taip pat galima naudoti fluorescencines etiketes.

Ryžiai. 1. Tiriamo baltymo imunocheminio dažymo schema: A - naudojant antrinius antikūnus, konjuguotus su fermento žyme; B – pirminis antikūnas yra tiesiogiai konjuguotas su fermento žyme.

Protokolas:

I. Gelio ir membranos paruošimas ir baltymų elektrotransfera

Po elektroforezės poliakrilamido gelis dedamas į vonią su blotingo buferiu (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10 % etanolio).

Du filtravimo popieriaus lapai, supjaustyti pagal blotingo kasetės formą ir sudrėkinti blotingo buferiu, dedami ant tos kasetės dalies, kuri bus nukreipta į anodą. Tada ant filtravimo popieriaus dedama nitroceliuliozės membrana, iš anksto sudrėkinta tuo pačiu buferiu, užtikrinant, kad tarp membranos ir popieriaus nebūtų oro burbuliukų.

Tada gelį reikia atsargiai uždėti ant membranos, ypatingą dėmesį skiriant tam, kad tarp gelio ir membranos nebūtų oro burbuliukų. Sumuštinio formavimą užbaigia du sudrėkinto filtravimo popieriaus sluoksniai, kurie dedami ant gelio paviršiaus (2 pav.). Gautas sumuštinis įspaudžiamas į kasetę ir dedamas tarp elektrodų taip, kad membrana būtų nukreipta į anodą.

Ryžiai. 2. Baltymų elektros perdavimo į membraną schema.

II. Elektrinis perdavimas

Baltymai perkeliami į nitroceliuliozės membraną buferyje, kuriame yra 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glicino, 10% etanolio, 30-50 min., esant pastoviai 100 V įtampai.

Elektros pernešimo laikas priklauso nuo pernešamų baltymų dydžio, kuo didesnis baltymas, tuo ilgiau trunka pernešimas. Elektrotransferos kokybė ir baltymų juostų išsidėstymas vertinamas nitroceliuliozės membraną nudažant 0,3 % Ponceau S tirpalu 1 % acto rūgštyje. Prieš imunocheminį dažymą, membraną reikia keletą kartų nuplauti silpnai šarminiu vandeniniu Tris tirpalu, kad būtų pašalintas su baltymais susijungęs dažiklis.

III. Ant nitroceliuliozės membranos imobilizuotų baltymų imunocheminis dažymas

Norint blokuoti nespecifinio antikūnų surišimo vietas, membrana inkubuojama nuolat maišant kambario temperatūroje 30 minučių PBST (geresniam blokavimui galima naudoti PBST tirpalą, kuriame yra 10 % nugriebto pieno miltelių).

Po blokavimo membrana inkubuojama valandą kambario temperatūroje, nuolat maišant PBST, kuriame yra 1-10 μg/ml specifinių antikūnų.

Optimali antikūnų koncentracija parenkama empiriškai ir priklauso nuo antikūnų sąveikos su antigenu afiniteto.

Inkubavimo pabaigoje membraną 5 kartus nuplaukite PBST ir perkelkite į antrinių antikūnų, konjuguotų su krienų peroksidaze, tirpalą. Konjugato praskiedimą paprastai nurodo gamintojas ant pakuotės arba empiriškai parenka tyrėjas. Inkubuokite membraną antrinio antikūno tirpale 1 valandą nuolat maišydami.

Po kruopštaus plovimo (pakeiskite buferį bent 5-6 kartus) PBST membrana perkeliama į chromogeninio substrato tirpalą, kuriame yra 3 mg diaminobenzidino (DAB) ir 10 μl 30% vandenilio peroksido 10 ml 0,1 M Tris-HCl. , pH 7,6.

Inkubuojama maišant 5-10 minučių. Pasibaigus inkubacijai su substratu, membraną reikia nuplauti PBST, išdžiovinti filtravimo popieriumi ir nedelsiant nuskaityti spalvotą elektroninę kopiją. Jei membrana visiškai išdžiūsta, nudažytos baltyminės juostelės išblunka, vaizdas tampa ne toks ryškus ir kontrastingas.

Pastaba: DAB yra toksiškas ir galimas kancerogenas. Dirbkite tik su guminėmis pirštinėmis!