Výzkum pro diagnostiku onemocnění virové povahy. To je nezbytné pro identifikaci viru, studium jeho biologie a schopnosti ovlivňovat zvířecí a lidské buňky. Je tak možné porozumět patogenezi virových onemocnění a podle toho zvolit správnou metodu léčby.

Jaká je diagnóza?

V živých buňkách. Pro jeho studium je nutné jej kultivovat na úrovni experimentálního organismu nebo K tomu se v lékařské praxi a mikrobiologii obecně provádějí virologické výzkumné metody, které mají tyto hlavní přístupy:

rovný;
nepřímý;
sérologické.

Materiál lze přímo zkoumat na přítomnost nukleových kyselin, virového antigenu, nebo lze například virus izolovat a identifikovat z klinického materiálu.

Kromě schopnosti stanovit etiologii onemocnění a sledovat terapeutický efekt hrají virologické výzkumné metody důležitou roli v protiepidemických opatřeních. K izolaci se používají kuřecí embrya, laboratorní zvířata nebo buněčné kultury.

Jak se to zkoumá?

Nejrychlejší je přímá metoda. Umožňuje detekovat virus, antigen nebo NA (nukleovou kyselinu) v samotném klinickém materiálu. Trvá to od dvou hodin do jednoho dne.

EM - elektronová mikroskopie. Detekuje virus přímo.
IEM - imunitní elektronová mikroskopie. Využívá specifické protilátky proti virům.
RIF - imunofluorescenční reakce. Využívá protilátky navázané na barvivo. Takové virologické výzkumné metody jsou široce používány k rychlému dešifrování etiologie ARVI (akutní respirační virové infekce), když jsou ze sliznice horních cest dýchacích odebírány otisky prstů.
ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay - stanovení virových antigenů, podobně jako RIF, ale založené na značení protilátek enzymy.
RIA - radioimunoanalýza. Využívá radioaktivní značení protilátek k zajištění vysoké citlivosti při detekci virového antigenu.
Molekulárně - NK hybridizace nebo izolace virových genomů pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce).
Cytologie se používá zřídka, ale u určitých infekcí jsou tyto virologické metody výzkumu velmi účinné. Zkoumají se bioptické materiály, pitvy a nátěry zpracované pro barvení a analýzu pod mikroskopem.

Jaký je smysl výzkumu?

Pro úspěšnou izolaci virů se klinický materiál odebírá v souladu s patogenezí a co nejdříve. Tento proces často vyžaduje několik pasáží před aplikací určitých virologických výzkumných metod.

Mikrobiologie je studium mikroskopických tvorů. A jejím oborem není jen medicína. Je to základní věda pro zemědělství, veterinární lékařství, kosmický a technický průmysl a geologii.

Ale samozřejmě vše bylo stvořeno pro člověka a jeho vývoj na této krásné planetě. Proto je velmi důležité nebezpečí včas odhalit a neutralizovat. Viry se liší od bakterií. Jsou to struktury, které vstupují do těla a způsobují vznik nové generace. Vypadají jako krystaly a jsou zaměřeny na řízení procesu jejich reprodukce, i když se samy nekrmí, nerostou a nevylučují metabolické produkty.

Virus je schopen způsobit vážné onemocnění v jakémkoli živém organismu, do kterého se dostane. Navíc se může vyvíjet. Proto je třeba vyvíjet a zlepšovat virologické výzkumné metody v mikrobiologii, protože lidská civilizace jako celek může být ohrožena.

Materiály

K detekci a identifikaci virů v medicíně se zpravidla používají následující:

výplach nosohltanu (respirační infekce);
návaly horka a stolice (enterovirové infekce);
škrábání, obsah puchýřů (kožní léze, sliznice, jako je herpes, plané neštovice);
návaly horka (exantémové infekce, jako jsou spalničky, zarděnky);
krev, mozkomíšní mok (arbovirové infekce).

Fáze

Všechny fáze virologické výzkumné metody zahrnují:

sběr materiálu;
výběr, získání testovacího systému, stanovení jeho životaschopnosti;
infekce testovacího systému;
indikace viru;
určení typu viru.

Patogenní viry se v zásadě liší přítomností tkáňové a typové specifity. Vezměme si například poliovirus, který se rozmnožuje pouze u primátů (v jejich buňkách). V souladu s tím se k izolaci specifického viru používá specifická tkáňová kultura. Pokud mluvíme o neznámém patogenu, pak by bylo vhodné současně infikovat tři, lépe čtyři buněčné kultury.

Možná tedy jeden z nich bude citlivý. Pro stanovení přítomnosti viru v infikovaných kulturách sledují vývoj specifické buněčné degenerace, intracelulární inkluze, identifikaci specifického antigenu, pozitivní hemaglutinační a hemadsorpční reakce.

Všechny virologické metody výzkumu (přímé i nepřímé, sérologické) by měly být vybrány jako nejvhodnější pro konkrétní případ podezření na infekci.

Nepřímé metody jsou založeny na izolaci a identifikaci viru. Jsou pracné, časově náročné, ale přesné.

Serodiagnostika

Tato diagnóza se týká metody založené na reakci antigen-protilátka. Nejčastěji se používají párová krevní séra odebírající se v intervalech několika týdnů. Pokud se titr protilátek zvýší 4krát nebo více, reakce je považována za pozitivní. K určení typové specifity viru se používá virová neutralizační reakce. Pro stanovení skupinové specificity je nutné získat reakci fixace komplementu.

Široce se používají různé varianty enzymového imunotestu, hemaglutinační inhibiční reakce, pasivní hemaglutinace, reverzní pasivní hemaglutinace a RIF. I v genetickém inženýrství byl vyvinut způsob výroby monoklonálních protilátek. Úzká specificita monoklonů může být překonána použitím několika monoklonálních protilátek proti různým virovým determinantám. Tím byla zvýšena specificita a senzitivita testu detekce antigenu.

Některé funkce

Dnes bylo vytvořeno mnoho různých testovacích systémů pro imunologickou diagnostiku infekcí vzniklých vniknutím viru do živého organismu.

Virologické výzkumné metody jsou tedy metodami pro izolaci virů, studium jejich vlastností a stanovení jejich etiologické souvislosti s určitými chorobami.

lekce č. 2 7

PŘEDMĚT: INTERAKCE VIRŮ S CITLIVÝMI BUŇKAMI. PĚSTOVÁNÍ. METODY INDIKACEa identifikaci.ANTIVIROVÁ IMUNITA.

KONTROLNÍ SEZNAM

1. Viry, podstata a původ. Historie objevů. Etapy vývoje virologie. Pojem virion, jeho struktura. Chemické složení a vlastnosti virů.

2. Principy klasifikace virů - kritéria. Rodiny RNA a DNA virů (kontrola).

3. Tropismus virů. Interakce virů s citlivými buňkami - fáze.

4. Kultivace virů. Indikace a identifikace virů při kultivaci na buněčných kulturách a kuřecích embryích. Buněčné kultury, buněčné linie, příprava, kultivační podmínky.

5. Klasifikace virových infekcí: a) na buněčné úrovni; b) na úrovni organismu.

6. Metody laboratorní diagnostiky virových infekcí. Přímé metody studia klinického materiálu (detekce virů, virových antigenů nebo virových NK). Virologická diagnostická metoda. Serodiagnostika virových infekcí.

7. Antivirová imunita - faktory. Druhová odolnost. Nespecifické antivirové obranné faktory (inhibitory, interferon, komplement, fagocytóza). Získaná imunita (humorální a buněčné mechanismy).

8. Principy specifické prevence a terapie virových infekcí: vakcíny, imunitní séra (imunoglobuliny), interferony, etiotropní chemoterapie.

LABORATORNÍ PRÁCE

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA VIROVÝCH INFEKCÍ


1. Expresní diagnostika	Detekce virového antigenu ve studovaném materiálu pomocí diagnostických antivirových sér v následujících reakcích: RIF, ELISA, RIA, protiimunoelektroforéza (CIEF), pasivní hemaglutinační reakce (RPHA), hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) atd.;
2. Virologická metoda	Kultivace virů v buněčných kulturách, kuřecích embryích, laboratorních zvířatech
3. Sérodiagnostika	Detekce protilátek proti viru v krevním séru pacienta pomocí diagnostických souprav obsahujících viry nebo jejich antigeny v reakcích: ELISA, nepřímý RIF nebo v párových sérech vRN, RTGA, RPGA, RSK.

1. Pro expresní diagnostiku použijte:

A) stanovení virového antigenu ve studovaném materiálu pomocí diagnostických antivirových sér v následujících reakcích: RIF, ELISA, RIA, protiimunoelektroforéza (CIEF), pasivní hemaglutinační reakce (RPHA), hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) atd.;

PROTI) detekce virionů v patologickém materiálu pomocí elektronové mikroskopie nebo IEM.

d) detekce genomů virů molekulárně genetické metody: PCR; molekulární hybridizace nukleových kyselin pomocí značených sond.

2. Virologická metoda

Hlavní fáze:

1. Odběr testovacího materiálu.

2. Selekce na principu cytotropismu a získání citlivého testovacího systému, určujícího jeho životaschopnost.

3. Infekce vybraného systému.

4. Indikace viru na základě průkazu jeho nukleové kyseliny, antigenů, hemaglutininu, CPD, inkluzí.

5. Identifikace a titrace viru se provádí na základě:

a) stanovení virových antigenů pomocí imunologických reakcí (RIF, ELISA, RPGA, RSK, RN, VIEF atd.); b) patohistologické vyšetření orgánů a tkání; c) CPP; d) klinické příznaky, biologické testy (keratokonjunktivální aj.).

Virologická metoda (schéma)

Testovaný materiál (výkaly, výtěry z nosohltanu, řezný materiál atd.)

Léčba antibiotiky k potlačení bakteriálních a plísňových infekcí

mikroflóra, centrifugace, filtrace

Infekční série

Kuřecí embrya

Buněčné kultury

Zvířata

Indikace virů na základě následujících jevů

Vývojové zpoždění

smrt, změna

membrány embrya, RGA

CPP, tvorba plaků, RIF, RGads, interference

Nemoc, smrt,

histologické změny

v tkáních, inkluzích

Titrace izolovaného viru; výběr pracovní dávky.

Titr viru- maximální ředění materiálu obsahujícího virus, u kterého je stále pozorován očekávaný účinek (CPE, RGA, smrt zvířete).

Identifikace izolovaného viru při neutralizačních reakcích, RTGad, RSC, potlačení tvorby plaků atd. s diagnostickými séry. Typ (typ) viru stanoveno neutralizací specifického účinku viru příslušným imunitním sérem.

Poznámka: Titrace a identifikace viru se provádí pomocí stejného jevu.

Kultivace virů

Existují tři hlavní přístupy k laboratorní diagnostice virových infekcí

1) přímé vyšetření materiálu na přítomnost virového antigenu nebo nukleových kyselin;

2) izolace a identifikace viru z klinického materiálu;

Přímé metody diagnostiky klinického materiálu

Přímé metody jsou metody, které umožňují průkaz viru, virového antigenu nebo virové nukleové kyseliny (NA) přímo v klinickém materiálu, to znamená, že jsou nejrychlejší (2–24 hodin).

Elektronová mikroskopie (EM). Pomocí této metody můžete detekovat samotný virus.

imunitní elektronová mikroskopie (IEM), která využívá specifické protilátky proti virům. V důsledku interakce protilátek s viry vznikají komplexy, které jsou po negativním kontrastu snadněji detekovatelné.

Imunofluorescenční reakce (RIF). Metoda je založena na použití protilátek spojených s barvivem

Metoda RIF se široce používá k rychlému dešifrování etiologie akutních respiračních virových infekcí při analýze stěrů otisků prstů ze sliznice horních cest dýchacích.

Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA). Enzymové imunoanalytické metody pro stanovení virových antigenů jsou v principu podobné RIF, ale jsou založeny na značení protilátek spíše enzymy než barvivy.

Radioimunoanalýza (RIA). Metoda je založena na značení protilátek radioizotopy, což zajišťuje vysokou citlivost při stanovení virového antigenu.

Molekulární metody. Zpočátku byla klasická metoda identifikace virového genomu považována za vysoce specifickou metodu hybridizace NA, ale v současnosti se stále více používá izolace virových genomů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

Molekulární hybridizace nukleových kyselin. Metoda je založena na hybridizaci komplementárních řetězců DNA nebo RNA s tvorbou dvouřetězcových struktur a na jejich identifikaci

PCR je založena na principu přirozené replikace DNA. Podstatou metody je opakování více cyklů syntézy (amplifikace) sekvence DNA specifické pro virus pomocí termostabilní Taq DNA polymerázy a dvou specifických primerů - tzv. primerů.

Cytologické metody mají v současnosti omezenou diagnostickou hodnotu, ale přesto by se měly používat u řady infekcí. Zkoumají se pitevní materiály, biopsie a nátěry, které se po vhodném zpracování obarví a analyzují pod mikroskopem.

Pro úspěšnou izolaci virů je nutné odebrat klinický materiál v souladu s patogenezí suspektního onemocnění a co nejdříve.

Zpravidla berou:

– při infekcích dýchacích cest – výplach nosohltanu;

– pro enterovirové infekce – výplachy a stolice (reo-, enteroviry);

– na léze kůže a sliznic – škrábance, obsah puchýřů (opar, plané neštovice);

– při exantémových infekcích – výplachy (spalničky, zarděnky);

– při arbovirových infekcích – krev, mozkomíšní mok.

K izolaci virů se používají buněčné kultury, laboratorní zvířata a kuřecí embrya. Proces je zdlouhavý, někdy vyžaduje několik pasáží, než je virus detekován a identifikován pomocí jedné nebo více metod – neutralizační reakce (RN), RIF, ELISA nebo PCR.

Serodiagnostika

Sérologická diagnostika založená na reakci antigen-protilátka může být použita k určení obou a hraje roli při určování etiologie virové infekce, i když jsou výsledky izolace viru negativní.

RSK je jedním z tradičních sérologických testů a používá se k diagnostice mnoha virových infekcí. Reakce se účastní dva systémy: protilátky ze séra pacienta + standardní virus a ovčí červené krvinky + protilátky proti nim a také titrovaný komplement. Pokud se protilátky a virus shodují, tento komplex váže komplement a nedochází k lýze ovčích červených krvinek (pozitivní reakce). Při negativním RSC komplement podporuje lýzu erytrocytů. Nevýhodou metody je její nedostatečně vysoká citlivost a obtížnost standardizace reagencií Metoda IF se stejně jako ELISA používá ke stanovení protilátek v séru.

Virologická metoda zahrnuje dvě hlavní fáze: izolaci virů a jejich identifikaci. Materiály mohou být krev, jiné biologické a patologické tekutiny, biopsie orgánů a tkání.

K diagnostice arbovirových infekcí se často provádějí virologické krevní testy. Ve slinách lze detekovat viry vztekliny, příušnic a herpes simplex. Výtěry z nosohltanu se používají k izolaci patogenů chřipky a dalších akutních respiračních virových infekcí a spalniček. Adenoviry se nacházejí ve výtěrech spojivek. Ze stolice jsou izolovány různé entero-, adeno-, rheo- a rotaviry.

K izolaci virů se používají buněčné kultury, kuřecí embrya a někdy i laboratorní zvířata. Většina patogenních virů se vyznačuje přítomností tkáňové a typové specifičnosti,“ například poliovirus se množí pouze v buňkách primátů, proto je vhodné k izolaci konkrétního viru použít vhodnou tkáňovou kulturu, která izoluje neznámý patogen současně infikovat 3-4 buněčné kultury, za předpokladu, že jedna z nich může být citlivá, přítomnost viru v infikovaných kulturách je určena rozvojem specifické buněčné degenerace, tj. cytopatogenním působením, detekcí intracelulárních inkluzí, jakož i na. Základem detekce specifického antigenu imunofluorescencí, pozitivní hemadsorpční a hemaglutinační reakce jsou nejčastěji používána ptačí embrya se svými špatně diferencovanými tkáněmi. arboviry), výskyt změn v chorio-alantoidní membráně (viry neštovic) nebo v těle embrya, akumulaci hemaglutininů v embryonálních tekutinách (viry chřipky, příušnice) a virový antigen fixující komplement.

Viry se identifikují pomocí imunologických metod: hemaglutinační inhibiční reakce, fixace komplementu, neutralizace, gelová precipitace, imunofluorescence.

3.4 Biologická metoda

Biologická metoda spočívá v infikování laboratorních zvířat různými materiály (klinickými, laboratorními) k indikaci patogena, jakož i ke stanovení některých vlastností mikroorganismů, které charakterizují jejich patogenitu (toxicita, toxicita, virulence). Jako laboratorní zvířata se používají bílé myši, bílé krysy, morčata, králíci atd.

Rozmnožení onemocnění u zvířete je absolutním důkazem patogenity izolovaného mikroorganismu (v případě vztekliny, tetanu apod.). Biologický test na zvířatech je proto cennou a spolehlivou diagnostickou metodou zejména u těch infekcí, jejichž patogeny jsou ve studovaných biologických médiích lidského těla obsaženy v nízkých koncentracích a na umělých médiích rostou špatně nebo pomalu.

3.5 Imunologická metoda

Imunologická metoda(sérologické) zahrnuje studie krevního séra, stejně jako dalších biologických substrátů k identifikaci specifických protilátek a antigenů. Klasická sérodiagnostika je založena na stanovení protilátek proti identifikovanému nebo suspektnímu patogenu. Pozitivní výsledek reakce indikuje přítomnost protilátek proti patogenním antigenům v testovaném krevním séru, negativní výsledek znamená jejich nepřítomnost; Detekce protilátek proti původci řady infekčních onemocnění ve zkoumaném krevním séru nestačí ke stanovení diagnózy, protože může odrážet přítomnost postinfekční nebo postvakcinační imunity, tedy „párové“ krve Vyšetřují se séra, první odebraná v prvních dnech onemocnění a druhá odebraná v intervalu 7–10 dní. V tomto případě se posuzuje dynamika nárůstu hladiny protilátek.

Diagnosticky signifikantní je zvýšení titru protilátek v testovaném krevním séru alespoň 4krát vzhledem k počáteční hladině. Tento jev se nazývá sérokonverze. U vzácných infekčních onemocnění, stejně jako virové hepatitidy, infekce HIV a některých dalších, přítomnost protilátek naznačuje, že pacient je infikován a má diagnostickou hodnotu.

Kromě stanovení titru protilátek je během sérologických studií možné určit izotyp protilátky. Je známo, že při prvním setkání lidského těla s patogenem v akutním období onemocnění je detekován rychlejší nárůst protilátek patřících k IgM, jejichž hladina po dosažení maximální hodnoty pak klesá. V pozdějších stadiích onemocnění se zvyšuje počet IgG protilátek, které přetrvávají déle a jsou stanoveny v období rekonvalescence. Při opětovném setkání s patogenem se díky imunologické paměti projeví humorální imunitní reakce rychlejší tvorbou IgG protilátek a protilátky třídy M jsou produkovány v malém množství. Detekce IgM protilátek indikuje přítomnost probíhajícího infekčního procesu a přítomnost IgG protilátek indikuje prodělanou infekci nebo postvakcinační imunitu.

S přihlédnutím k charakteristikám primární a sekundární imunitní odpovědi umožňuje analýza poměru IgM a IgG protilátek v některých případech odlišit stadium infekčního procesu (výška onemocnění, rekonvalescence, relaps). Například v případě virové hepatitidy A (HA) je spolehlivou diagnostickou metodou stanovení anti-HAV IgM protilátek v krevním séru. Jejich detekce indikuje aktuální nebo nedávnou infekci HAV.

Sérologické vyšetření k průkazu protilátek u infekčních onemocnění je dostupnější metodou laboratorní diagnostiky než izolace patogenu. Někdy slouží pozitivní sérologická reakce jako jediný důkaz setkání a interakce organismu s původcem odpovídajícího infekčního onemocnění. Navíc řadu onemocnění s podobným klinickým obrazem (například rickettsiózy, enterovirové infekce) lze odlišit pouze sérologicky, což odráží význam sérologických metod v diagnostice infekčních onemocnění.

Virologický výzkum zahrnuje dvě hlavní fáze: izolaci virů a jejich identifikaci. Materiálem pro virologický výzkum může být krev, jiné biologické a patologické tekutiny, biopsie orgánů a tkání.

K diagnostice arbovirových infekcí se často provádějí virologické krevní testy. Viry vztekliny, příušnic a herpes simplex lze nalézt ve slinách výtěry z nosohltanu se používají k izolaci patogenů chřipky a dalších akutních respiračních virových infekcí a spalniček. Adenoviry jsou detekovány ve výtěrech spojivek. Ze stolice jsou izolovány různé entero-, adno-, pso-, nora- a rotaviry.

K izolaci virů se používají buněčné kultury, kuřecí embrya a někdy i laboratorní zvířata.

Většina patogenních virů se vyznačuje přítomností tkáňové a typové specifičnosti, například poliovirus se množí pouze v buňkách primátů, proto se k izolaci konkrétního viru používá vhodná tkáňová kultura. K izolaci neznámého patogena je vhodné současně infikovat 3-4 buněčné kultury za předpokladu, že jedna z nich může být citlivá. Přítomnost viru v infikovaných buněčných kulturách je dána rozvojem specifické buněčné degenerace, tzn. působení cytopatogenu, detekce intracelulárních inkluzí, jakož i na základě detekce specifického antigenu imunofluorescencí, pozitivní hemadsorpční a hemaglutinační reakce.

Ptačí embrya se svými špatně diferencovanými tkáněmi jsou vhodná pro kultivaci mnoha virů. Většinou se používají kuřecí embrya. Při množení v embryích mohou viry způsobit jejich smrt (arboviry), výskyt změn na chorion-alantoidní membráně (viry neštovic) nebo v těle embrya, hromadění lepku v embryonálních tekutinách (viry chřipky, příušnice ) a virový antigen vázající komplement .

Identifikace virů se provádí pomocí imunologických metod: hemaglutinační inhibiční reakce, fixace komplementu, neutralizace, gelová precipitace, imunofluorescence.

Více k tématu Virologická metoda:

Posouzení základních antropometrických dat pomocí parametrické metody (metoda sigma)
Léčba metodou zániku podmíněné komunikace a metodou nuceného tréninku
2. Srovnávací právní metoda - soukromá vědecká metoda právní vědy
MODERNÍ METODY DIAGNOSTIKY A VOLBA LÉČEBNÉ METODY PRO SUBMUKÓZNÍ DĚLOŽNÍ MYOM
5.4. Pojem a struktura obecné vyšetřovací metody jako metody praktické činnosti
Téma 8. MIKROBIOLOGICKÉ METODY STUDOVÁNÍ VARIABILITY A MECHANISMŮ PŘENOSU DĚDITELNÝCH INFORMACÍ. APLIKACE GENETICKÝCH METOD PRO TVORBU NOVÝCH LÉKŮ
Téma 15. PATOGENITA A VIRULENCE MIKROORGANISMŮ. FAKTORY VIRULENCE. METODY INFEKCE LABORATORNÍCH ZVÍŘAT. ANTIGENY, ZPŮSOBY JEJICH ZÍSKÁVÁNÍ. PROTILÁTKY. IMUNITNÍ REAKCE A JEJICH PRAKTICKÉ VYUŽITÍ. FAGOCYTÓZA