Биосинтеза на соматотропин и други човешки хормони. Получаване на интерферони. Характеристики на получаване и използване на интерферони Пример за получаване на рекомбинантен интерферон

№ 7 Интерферони, природа. Методи за приготвяне и употреба.
Интерферон се отнася до важни защитни протеини на имунната система. Открито по време на изследване на вирусната интерференция, т.е. феноменът, когато животни или клетъчни култури, заразени с един вирус, стават нечувствителни към инфекция с друг вирус. Оказа се, че намесата се дължи на получения протеин, който има защитни антивирусни свойства. Този протеин се нарича интерферон.
Интерферонът е семейство гликопротеинови протеини, които се синтезират от клетките на имунната система и съединителната тъкан. В зависимост от това кои клетки синтезират интерферон, има три вида: α, β и γ-интерферони.
Алфа интерферонпроизвежда се от левкоцити и се нарича левкоцит; интерферон бетанаречен фибробластен, тъй като се синтезира от фибробласти - клетки на съединителната тъкан, и гама интерферон- имунен, тъй като се произвежда от активирани Т-лимфоцити, макрофаги, естествени клетки убийци, т.е. имунни клетки.
Интерферонът непрекъснато се синтезира в организма и концентрацията му в кръвта се поддържа на около 2 IU/ml (1 международна единица - M.E. - това е количеството интерферон, което предпазва клетъчната култура от 1 CPD 50 от вируса). Производството на интерферон се увеличава рязко по време на инфекция с вируси, както и при излагане на индуктори на интерферон, като РНК, ДНК и сложни полимери. Такива индуктори на интерферон се наричат интерфероногени.
В допълнение към антивирусния ефект, интерферонът има противотуморна защита, тъй като забавя пролиферацията (размножаването) на туморните клетки, както и имуномодулираща активност, стимулира фагоцитоза, естествени клетки убийци, регулира образуването на антитела от В-клетките, активира експресията на основните комплекс за хистосъвместимост.
Механизъм на действиеИнтерферонът е сложен. Интерферонът не засяга директно вируса извън клетката, но се свързва със специални клетъчни рецептори и засяга процеса на възпроизвеждане на вируса вътре в клетката на етапа на протеиновия синтез.
Използване на интерферон. Действието на интерферона е по-ефективно, колкото по-рано започва да се синтезира или навлиза в тялото отвън. Поради това се използва за профилактични цели на много вирусни инфекции, като грип, както и за терапевтични цели при хронични вирусни инфекции, като парентерален хепатит (В, С,д ), херпес, множествена склероза и др. Интерферонът дава положителни резултати при лечението на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунен дефицит.
Интерфероните са специфични за вида, т.е. човешкият интерферон е по-малко ефективен за животните и обратно. Тази видова специфика обаче е относителна.
Получаване на интерферон. Интерферонът се получава по два начина: а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус, в резултат на което инфектираните клетки синтезират интерферон, който след това се изолира и от него се изграждат интерферонови препарати; б) генно инженерство - чрез отглеждане на рекомбинантни щамове бактерии, способни да произвеждат интерферон при производствени условия. Обикновено се използват рекомбинантни щамове на pseudomonas и Escherichia coli с интерферонови гени, вградени в тяхната ДНК. Интерферонът, получен чрез генно инженерство, се нарича рекомбинантен. В нашата страна рекомбинантният интерферон получи официалното име "Reaferon". Производството на това лекарство е в много отношения по-ефективно и по-евтино от левкоцитното лекарство.
Рекомбинантният интерферон намери широко приложение в медицината като превантивен и терапевтичен агент за вирусни инфекции, неоплазми и имунодефицити.

Изпратете добрата си работа в базата знания е лесно. Използвайте формата по-долу

Студенти, докторанти, млади учени, които използват базата от знания в обучението и работата си, ще ви бъдат много благодарни.

Публикувано на http://www.allbest.ru/

Въведение

1 Класификация на интерфероните

2 Методи за получаване на интерферони

2.1 Производство чрез инфекция на човешки левкоцити

2.2 Получаване на интерферони чрез генно инженерство

3. Механизми на действие на интерфероните

4. Терапевтични употреби на човешки интерферон

Заключение

Списък на използваната литература

Въведение

През 1957 г. Националният институт за медицински изследвания в Лондон установи, че човешки и животински клетки, изложени на вируса, отделят вещества, които правят незасегнатите клетки устойчиви на вирусна инфекция. Те изглежда предотвратяват (пречат) на възпроизвеждането на вируси в клетката и затова се наричат интерферони. Интерфероните помагат на тялото ни да се бори с много вирусни заболявания.

Препарати на основата на различни видове интерферони се използват като имуномодулатори за нормализиране и укрепване на имунната система, включително за лечение на различни тежки заболявания - остър вирусен хепатит, множествена склероза, остеосаркома, миелом и някои видове лимфоми.

Интерфероните са протеинови молекули с молекулно тегло от 15 000 до 21 000 далтона, произведени и секретирани от клетките в отговор на вирусна инфекция или други патогени.

Интерфероните (IFNs) са група автогенни гликопротеини, биомеханизмът на действие на които е свързан с едновременен антивирусен ефект - активиране на клетъчни гени, в резултат на което се синтезират протеини, които инхибират синтеза на вирусна ДНК (РНК) и имат имуномодулиращ ефект - способността да се засили експресията на антигени върху клетъчните мембрани и да се увеличи активността на цитотоксичните Т клетки и естествените клетки убийци.

1. ДА СЕкласификация на интерфероните

В зависимост от вида на произвеждащите клетки, всички интерферони могат да бъдат разделени на:

* b-интерферони.

* β-интерферони.

* g-интерферони.

Според метода на производство интерфероните се разделят на:

1. Естествен, получен от култура на човешки левкоцитни клетки, стимулирани от вируси:

b-интерферон, b-интерферон, интерферон-b Nl;

2. Рекомбинантни, произведени от бактерии с интегриран ген на интерферон в техния геном:

Интерферон-b2A, интерферон-b2B, интерферон-blb.

Интерферон - b се произвежда от левкоцити и се нарича левкоцитен; β-интерферонът се нарича фибробластен, тъй като се синтезира от фибробласти - клетки на съединителната тъкан, а g-интерферонът се нарича имунен, тъй като се произвежда от активирани Т-лимфоцити, макрофаги, естествени клетки убийци, т.е. имунни клетки

Под въздействието на интерферон-g се увеличава производството на цитокини, като интерлевкин-1, интерлевкин-2, интерлевкин-12, IFNb и тумор некрозисфактор-b.

2. Методи за получаване на интерферони

Интерфероните се получават по два начина:

а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус, в резултат на което заразените клетки синтезират интерферон, който след това се изолира и от него се изграждат интерферонови препарати;

б) чрез генно инженерство - чрез отглеждане на рекомбинантни щамове бактерии, способни да произвеждат интерферон при производствени условия.

2 . 1 стрполучаване чрезинфекция на човешки левкоцити

Известни са методи за получаване на човешки левкоцитен интерферон от левкоцити на човешка донорска кръв, индуцирани от вируси и други индуктори.

Левкоцитите в човешката кръв са основните производители на естествен интерферон-алфа, чието количество за производствени цели е ограничено от донорски суровини. В тази връзка решаването на проблемите с оптимизирането на методите за култивиране на левкоцити за увеличаване на добива на целевия продукт и разработването на унифициран ефективен метод за получаване на естествен IFN за създаване на нови лекарствени форми изглежда много важен и уместен за практическото здравеопазване днес.

Известна е технологията за производство на човешки левкоцитен интерферон, която включва следната последователност от операции: изолиране на левкоцити от донорска кръв, левкоцитна или еритроцитна маса, суспендирането им в хранителна среда при температура (37±0,5) o C, добавяне на алантоичен вирус-индуктор към левкоцитите и инкубиране при (30±0,5) o C в продължение на 3 часа. След това вирусът-индуктор се отделя и се добавя хранителна среда към левкоцитния седимент и суспензията се поддържа при (37±0). 0,5) o C за 18-20 часа. На този етап се извършва биосинтеза на интерферон в левкоцитите и неговото натрупване в хранителната среда, получена по тази технология, има антивирусна активност от 800-1000 IU на 1 ml от лекарството.

За да се увеличи производството на интерферон от левкоцитите на етапа на биосинтеза, в друга наредба за производството на човешки левкоцитен интерферон N 302-82, суспензия от левкоцити се поддържа при 37,5 o C в продължение на 2-10 часа в хранителна среда, съдържаща 100-200 единици/ml човешки левкоцитен интерферон и 0,0015 единици/ml инсулин; етап на индуктор на интерферон се добавя за 1-2 часа. След това индукторният вирус се отстранява и се добавя хранителна среда към левкоцитната утайка и суспензията се поддържа при 37,5 o C в продължение на 18-20 часа; етапът на биосинтеза на интерферон се инактивира.

Въвеждането на първичния етап значително увеличава производството на интерферон от левкоцитите, а антивирусната активност на интерферона, получена по този метод, е 4000-5000 IU / ml. Трябва да се отбележи, че във всички горепосочени производствени технологии и други известни методи за получаване на човешки левкоцитен интерферон, левкоцитите се изолират от кръв, която се съхранява при 4-6 o C, а самият процес на изолиране се извършва при същата температура, последвано от въвеждането им в хранителна среда при температура 37,5 o C и провеждане на първичен етап, индукционен етап и биосинтеза на интерферон.

Като прототип е избран следният метод за производство на интерферон, тъй като той е най-близък по техническа същност. Целта на метода е да се увеличи добивът на целевия продукт. За тази цел е предложен метод за производство на интерферон, включващ изолиране на левкоцити, суспендирането им в хранителна среда и праймиране при условия на постепенно повишаване на температурата на суспензията от 20 o до (36,6 ± 0,1) o C за 4-6 часа, индукция с алантоисен вирус Нюкясълска болест, биосинтеза на интерферон и инактивиране на индукторния вирус. Сравнителният анализ на основните характеристики на методите показва, че отличителните характеристики на предложения метод са праймирането на левкоцитите с бавно повишаване на температурата на суспензията от 20 o до (36,6 ± 0,1) o C за 4-6 часа. Предложеният температурен режим за прайминг на левкоцитите осигурява условия за интензивен биосинтез на INF. Методът се осъществява по следния начин. Изолираните левкоцити от донорска кръв, левкоцитна или еритроцитна маса се суспендират в 5 литра хранителна среда (среда 199), съдържаща 0,0015 единици/ml инсулин и 1500-3000 IU/ml човешки левкоцитен интерферон 5-10% човешка кръвна плазма или 1,5-2% човешки албумин и антибиотици. 1 ml хранителна среда съдържа 10 020 милиона левкоцити. Хранителната среда, съдържаща горните изходни компоненти, има начална температура 20 o C. В автоматизиран режим, според програмата, температурата на суспензията се повишава от 20 o C до (36,6 ± 0,1) o C за 4-6 часа След това суспензията се довежда до (36,9±0,1) o C и индукторният вирус се добавя към суспензията в доза от 2000-4000 GAE на 2 милиарда левкоцити, суспензията се инкубира при (36,9±0,1) o C за 18-20 часа, като се разбърква непрекъснато. Левкоцитите се отстраняват чрез центрофугиране и супернатантата в количество от 4,5 литра, съдържаща интерферон, се подкислява с 10% солна киселина до рН 2,2-2,4. Подкисленият полуготов интерферонов продукт се съхранява в продължение на 10 дни, за да се инактивира индукторният вирус. Антивирусната активност на получения по този начин интерферон е 10-12 хиляди IU/ml.

Така предложеният метод за получаване на човешки левкоцитен интерферон осигурява повишаване на неговата антивирусна активност 2 или повече пъти в сравнение с предишния метод. Използването на предложения метод в производството ще помогне да се спестят материални разходи, т.к тя е насочена към по-ефективно използване на левкоцитите, а не към увеличаване на броя им.

Основният недостатък на тези методи за производство на интерферони е вероятността от заразяване на крайния продукт с човешки вируси, като вирус на хепатит B и C, вирус на имунна недостатъчност и др.

2.2 Получаване на интерферонигенетично разработен

интерферон левкоцитен ген вирус

Понастоящем методът за производство на интерферон чрез микробиологичен синтез е признат за по-обещаващ, което прави възможно получаването на целевия продукт със значително по-висок добив от сравнително евтини изходни материали. Подходите, използвани тук, позволяват да се създадат варианти на структурен ген, които са оптимални за бактериална експресия, както и регулаторни елементи, които контролират неговата експресия.

Като изходни микроорганизми се използват различни щамове на Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатъкът на използването на P. pastoris като производител на интерферон е изключително трудните условия на ферментация на този вид дрожди и необходимостта от стриктно поддържане на концентрацията на индуктора, по-специално на метанола, по време на процеса на биосинтеза.

Недостатъкът на използването на Ps. putida е сложността на процеса на ферментация при ниско ниво на експресия (10 mg интерферон на 1 литър културална среда). По-продуктивно е използването на щамове Escherichia coli.

Известни са голям брой плазмиди и създадени на тяхна база щамове E. coli, които експресират интерферон: щамове E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмиди Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli щам pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli щам pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli щам SG 20050 с плазмид p280/21FN, E. Coli щам SG 20050 с плазмид pINF14 (SU 1703691), Е. coli щам SG 20050 с плазмид pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатъкът на технологиите, базирани на използването на тези щамове, е тяхната нестабилност, както и недостатъчното ниво на експресия на интерферон.

Наред с характеристиките на използваните щамове, ефективността на процеса до голяма степен зависи от използваната технология за изолиране и пречистване на интерферона.

Съществува известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на Ps клетки. putida, разрушаване на биомаса, третиране с полиетиленимин, фракциониране с амониев сулфат, хидрофобна хроматография върху фенилсилохром С-80, рН фракциониране на лизата, неговото концентриране и диафилтрация, йонообменна хроматография върху целулоза DE-52, елуиране в рН градиент, йон обменна хроматография на получения елуент върху целулоза SM -52, концентриране чрез преминаване през филтърна касета и гел филтруване върху Sephadex G-100 (SU 1640996). Недостатък на този метод, освен сложната многоетапна ферментация, е и многоетапността на процеса при получаване на крайния продукт.

Съществува и известен метод за производство на интерферон, който включва култивиране на щам E. coli SG 20050/pIF16 в LB бульон в колби в термостатиран шейкър, центрофугиране на биомасата, промиване с буферен разтвор и ултразвукова обработка за унищожаване на клетките. Полученият лизат се центрофугира, промива се с 3М разтвор на урея в буфер, разтваря се в разтвор на гуанидин хлорид в буфер, обработва се с ултразвук, центрофугира се, окислителна сулфитолиза, диализа срещу 8 М урея, ренатурация и крайна двустепенна хроматография върху CM- 52 целулоза и сефадекс G-50 (RU 2054041).

Недостатъците на този метод са неговата относително ниска производителност на основните етапи на процеса на изолиране и пречистване. Това се отнася особено за ултразвуковата обработка на продукта, диализата и окислителната сулфитолиза, което води до нестабилност в добива на интерферон, както и до невъзможността този метод да се използва за промишлено производство на интерферон.

Като най-близък аналог (прототип) може да се посочи метод за получаване на човешки левкоцитен интерферон, който се състои в култивиране на рекомбинантен щам на Е. coli, замразяване на получената биомаса при температура не по-висока от -70 ° C, размразяване, унищожаване на клетки от микроорганизми с лизозим, отстраняване на ДНК и РНК чрез въвеждане в ДНКазния лизат и пречистване на изолираната неразтворима форма на интерферон чрез промиване с буферен разтвор с детергенти, разтваряне на интерфероновата утайка в разтвор на гуанидин хидрохлорид, ренатурация и едноетапно пречистване чрез йони обменна хроматография. Щамът E. coli SS5, получен с помощта на рекомбинантния плазмид pSS5, съдържащ три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и алфа-интерфероновия ген с въведени нуклеотидни замествания се използва като продуцент.

Експресията на интерферон от щам E. coli SS5, съдържащ този плазмид, се контролира от три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp. Нивото на експресия на интерферон е около 800 mg на 1 литър клетъчна суспензия.

Недостатъкът на този метод е ниската технологична ефективност на използването на ензимно разрушаване на клетки, ДНК и РНК на микроорганизма и едноетапно хроматографско пречистване на интерферон. Това причинява нестабилност в процеса на освобождаване на интерферон, води до намаляване на неговото качество и ограничава възможността за използване на горната схема за промишлено производство на интерферон.

Недостатъците на този плазмид и щама, базиран на него, са използването в плазмида на силен нерегулиран промотор на фага Т7 в щам Е. coli BL21 (DE3), в който генът на Т7 РНК полимераза се намира под промотора на lac оперон и който винаги е „течащ“. Следователно синтезът на интерферон се извършва непрекъснато в клетката, което води до дисоциация на плазмида и намаляване на жизнеспособността на клетките на щама и в резултат на това до намаляване на добива на интерферон.

Пример за получаване на рекомбинантен интерферон:

600 g биомаса от клетки на Pseudomonas putida 84, съдържащи рекомбинантния плазмид p VG-3, след култивиране, съдържат 130 mg алфа-2 интерферон. Клетките се зареждат в 5.0 L балистичен дезинтегратор с механична бъркалка и 3.0 L лизисен буфер, съдържащ 1.2% натриев хлорид, 1.2% трис-(хидроксиметил)-аминометан, 10% захароза, 0.15% етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA), 0,02% фенилметилсулфонил флуорид и 0,01% дитиотреитол при рН 7,7. Биомасата се смесва до получаване на хомогенна суспензия в продължение на 30 минути, след което се дезинтегрира в циркулационен режим в балистичен дезинтегратор в съответствие с инструкциите за работа. Времето на разпадане е завършено, когато при микроскопиране на препарата в няколко зрителни полета на микроскопа не се наблюдават цели клетки от микроорганизми. Обемът на лизираната суспензия от биомаса е 3,5 l.

Полученият на този етап лизат след това навлезе в етапа на утаяване на нуклеинова киселина. За да направите това, 180 ml от 5% разтвор на полиетиленимин се добавя към контейнера, съдържащ лизата, като се разбърква със скорост 1-1.2 l/h. Суспензията се разбърква в продължение на 1 час и се центрофугира за отделяне на утайката от нуклеинова киселина в продължение на 1 час при (9500±500) rpm, при температура (5±2)C. След центрофугиране се отделя супернатантата, чийто обем е 3,0 L.

При бавно разбъркване с бъркалка 182 g сух амониев сулфат се изсипват в супернатанта на малки порции (всяка следваща порция се добавя след пълното разтваряне на предходната). След приключване на добавянето на амониев сулфат, разбъркването продължава, докато солта се разтвори напълно и суспензията от протеинов седимент се поддържа при температура (5 ± 2) С в продължение на 16 часа и след това се центрофугира в продължение на 1 час при (13500 ± 500) rpm при температура (5 ± 2) С.

Получената утайка се разтваря в дестилирана вода, довеждайки общия обем до 4 литра. За утаяване на придружаващите протеини се извършва киселинно фракциониране на получения разтвор, съдържащ алфа-2 интерферон. За тази цел към разтвора се добавят 5,0 ml 50% оцетна киселина до рН 4,75. Получената смес се прехвърля в хладилник и се оставя при температура (5±2)C за 3 часа, след което протеиновата суспензия се центрофугира при (13500±500) rpm за 30 минути при (5±2)C.

Към 4 L от супернатанта се добавят 50.0 ml 1 М Tris разтвор до рН (6.9 ± 0.1). Концентрацията на общия протеин, определена по метода на Lowry, е 9,0 mg/ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон (6.80.5) 106 IU/ml. Специфична активност 8.5105 IU/mg. Общото съдържание на алфа-2 интерферон на този етап е 2,91010 IU.

Сорбентът Soloz KG в количество от 0,6 l под формата на водна суспензия се поставя в хроматографска колона. След това с помощта на перисталтична помпа се добавят 2,0 l 0,2 М разтвор на натриев хидроксид, 6,0 l дестилирана вода и 4,5 l 0,05 М трис-ацетатен буферен разтвор при рН (7,1±0,1), което се наблюдава с рН метър при изхода на колоната.

Разтвор на протеин, съдържащ алфа-2 интерферон, се разрежда с дестилирана вода до проводимост (6.0+2.0) mS/cm при стайна температура. Обемът на разтвора е 19,2 литра.

Разтворът се прилага към колоната със скорост 1,5 l/час, след което сорбентът се промива с 2,0 1 трис-ацетатен буфер 0,05 М при рН 7,0. Елуирането се извършва с 1.2 1 0.05 М разтвор на Tris с рН (10.2 ± 0.1) Съдържанието на интерферон във фракциите, събрани с помощта на фракционен колектор, се определя чрез ензимен имуноанализ.

Концентрацията на общия протеин, определена по метода на Lowry, е (2,2 ± 0,2) mg / ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон (2,1 ± 0,5) 107 IU / ml, специфичната активност на лекарството (9,7 ± 0,5 )106 IU/mg. Общото съдържание на алфа-2 интерферон на този етап е (1,5±0,5)1010 IU.

Сорбентът Spherocell qae в количество 0,15 l под формата на водна суспензия се зарежда в колоната и се промива със скорост 0,15 l/h последователно с 0,5 l 2 М разтвор на натриев хлорид, 1,5 l дестилирана вода и 1,0 l. l триацетатен буферен разтвор 0,05 М с рН 8,0, като се наблюдава рН на буферния разтвор на изхода на колоната с рН метър.

0.7 L протеинов разтвор, съдържащ алфа-2 интерферон, се прилага към 0.15 L Spherocell-QAE сорбентна колона при скорост от 0.2 L/час. Колоната се промива с 0.1 L трис-ацетат 0.05 М буферен разтвор (рН 8.0), след това онечистените протеини се промиват с 1.0 L от същия буферен разтвор с добавяне на 0.05 М NaCl. Интерферонът се елуира с 0.8 L 0.1 М буферен разтвор на натриев ацетат при рН 5.0. Съдържанието на алфа-2 интерферон във фракциите, събрани с помощта на колектор, се определя чрез метода на ензимен имуноанализ. Концентрацията на протеин е (0,35±0,05) mg/ml, биологичната активност на алфа-2 интерферон е (1,7±0,2)107 IU/ml. Специфичната активност на лекарството е 5,5107 IU/mg протеин. Елуатът съдържа 1.20 х 1010 ME. Добивът на биологична активност на този етап е 82,5%.

Полученият разтвор се коригира до рН (5.0±0.1) с 50% оцетна киселина и се разрежда с 0.05 М буферен разтвор на натриев ацетат. Специфичната електропроводимост е (0,29±0,02) mS/cm при температура (5±2)C. Полученият по този начин протеинов разтвор се нанася в колона със сорбент Spherocell LP-M със скорост 0,1 l/h, промива се с 0,3 l от горния буферен разтвор и след това интерферонът се елуира с помощта на линеен градиент на концентрацията на натриев хлорид създаден с използване на градиентен миксер Ultragrad. Елуатът се фракционира с помощта на фракционен колектор и се измерва концентрацията на общия протеин и алфа-2 интерферон. Концентрация на протеин в сборни фракции (0,45±0,02) mg/ml. Обемът на разтвора е 0,1 l. Общото съдържание на алфа-2 интерферон (8,6±0,2)109 IU. Специфична активност - e (7,5±0,2)107 IU/mg. Добивът на този етап е 73%.

Полученият 0.1 L разтвор 3 се концентрира до (5.0 ± 0.2) ml с помощта на ултрафилтрационна клетка с използване на Amicon YM-3 мембрана. Така приготвената проба се нанася върху колона със сорбент Sephadex G-100, еквилибриран с фосфатно буфериран физиологичен разтвор със скорост 0,025 l/h. Обемът на фракциите е 10,0 ml. Фракциите, получени след хроматография, се изследват за съдържанието на алфа-2 интерферон, като се използва методът на ензимен имуноанализ и комбиниране на фракции, съдържащи основния пик на алфа-2 интерферон. Обемът на получения разтвор е 30,2 ml. Концентрацията на общия протеин, определена по метода на Lowry, е (0,90 ± 0,02) mg/ml. Общото съдържание на алфа-2 интерферон в разтвора е 5,5109 ME. Специфичната активност на получения алфа-2 интерферонов препарат е 2,3108 IU/mg. Добивът на алфа-2 интерферон на този етап е 90,2%. Полученият продукт се стерилизира и опакова. Общият добив на лекарството е 35,8%, включително 51% на етапа на пречистване.

За получаване на големи количества IFN се използват шестдневни монослойни култури от клетки от пилешки ембриони или култивирани човешки кръвни левкоцити, заразени с определен тип вирус. С други думи, за да се получи IFN, се създава специфична вирусно-клетъчна система.

Генът, отговорен за биосинтезата на IFN, е изолиран от човешка клетка. Екзогенният човешки IFN се произвежда чрез рекомбинантна ДНК технология. Процедурата за изолиране на IFN-s cDNA е както следва:

1) иРНК се изолира от човешки левкоцити, фракционира се по размер, обратно се транскрибира и се вмъква в мястото на модифициран плазмид.

2) Полученият продукт се използва за трансформиране на Е. coli; получените клонове се разделят на групи, които се идентифицират.

3) Всяка група клонинги се хибридизира с IFN - иРНК.

4) От получените хибриди, съдържащи cDNA и chRNA, иРНК се изолира и транслира в системата за протеинов синтез.

5) Определете интерфероновата антивирусна активност на всяка смес, получена в резултат на транслацията. Групите, които показват интерферонова активност, съдържат клон с кДНК, хибридизирана с IFN - иРНК; повторно се идентифицира клонинг, съдържащ пълната дължина на човешки IFN cDNA.

3 . Механизми на действие на интерфероните

Интерфероните проявяват някои активности като лимфокини и имуномодулатори. Тип I IFNs, които действат предимно като инхибитори на вирусната репликация в клетката, упражняват своя ефект чрез стимулиране на производството на клетъчни ензими от рибозомите на клетките гостоприемници, които инхибират производството на вируси, нарушавайки транслацията на вирусна иРНК и синтеза на вирусни протеини.

Интерфероните се произвеждат от повечето животински видове, но проявата на тяхната активност е видоспецифична, т.е. те действат само във видовете животни, в които се произвеждат.

Интерферонипредизвикват индукция на три ензима:

Протеин киназа, която нарушава началния етап на изграждане на пептидната верига;

Олигоизоаденилат синтетаза, която активира РНКаза, която разрушава вирусната РНК;

Фосфодиестераза, която разрушава крайните нуклеотиди на тРНК, което води до нарушаване на пептидното удължаване.

Като се вземат предвид антивирусните и имуномодулиращите ефекти на интерферона, НПО "Биомед" предложи и успешно тества супозитории с IFNan1 и пробиотици за лечение на дисбиоза с вирусна и бактериална етиология, кандидоза; в гинекологичната практика за лечение на ендометрит, колпит, вагинит и гинекологичен херпес.

4. Терапевтично приложение на интерферончовек

Интерфероните (INFs) имат универсално широк спектър на антивирусна активност, тъй като те не действат върху вирионите или техните NKs, но индуцират антивирусно състояние в клетката, стимулирайки образуването на комплекс от протеини, които блокират транскрипцията на вирусна иРНК. INFs не проникват в клетките, но взаимодействат с мембранните рецептори, предизвиквайки образуването на cAMP, който предава сигнал към съответния ДНК оперон. В допълнение, INF активират гени, кодиращи продукти с директен антивирусен ефект - протеин кинази, които нарушават сглобяването на протеиновата молекула, и аденилат синтетази, чийто продукт активира ендонуклеаза, която разрушава вирусните иРНК. Gamma-INF активира цитотоксични лимфоцити, естествени клетки убийци, моноцити, макрофаги, гранулоцити, които допринасят за унищожаването на заразените клетки.

Има две поколения лекарства с интерферон. Първото поколение се характеризира с естествен произход, при което се получава от кръвта на донори. От него се получава сух човешки левкоцитен интерферон, който се използва за инхалация и вливане в носните проходи. Те също произвеждат интерферон в супозитории, пречистен концентриран интерферон в суха форма и Leukinferon.

Този метод за производство на лекарства на базата на интерферон е доста скъп и недостъпен, така че в края на 20 век с помощта на генно инженерство са създадени лекарства с интерферон от второ поколение.

Така беше възможно да се разработят лекарствата Viferon, Interal и други, съдържащи рекомбинантен човешки интерферон-b.

Поради своите уникални свойства, препаратите с интерферон се използват за лечениеи профилактика на всички респираторни заболявания, повечето видове рак, за лечение на много вирусни заболявания и грип. Интерфероновите препарати се използват широко при лечението хепатит Ахепатит В и С: интерферонът ограничава развитието на вируса, предотвратява появата цирозаи изключва смъртта.

Някои лекарства с интерферон имат странични ефекти, като кожни обриви, алергиии заболявания на хемопоетичната система.

При продължителна употреба на интерферон тялото произвежда антитела срещу интерферон, което го прави неспособен да се бори вируси. Причината за тези явления се крие в наличието на албумин в препаратите на базата на интерферон.

Албуминът се получава от кръвта, така че съществува риск (макар и минимален) от инфекция хепатити други болести, предавани по кръвен път.

маса 1

Спектър на активност на интерферона

Име на лекарството	Подтип INF	Начин на получаване	фармакологичен ефект	Показания за употреба
Интерферон		Биосинтеза в култивирани левкоцити на донорска кръв под въздействието на вируси	Антивирусно, имуномодулиращо, антипролиферативно	Вирусни заболявания, левкемия, злокачествен меланом, рак на бъбреците, карциноиден синдром
Блокировка		Биосинтеза в култивирани левкоцити от донорска кръв под влияние на парамиковируси	Потиска активността на редица вируси	Вирусни очни заболявания, хепатит
Интерферон алфа-2		Рекомбинантен	Антивирусно, имуномодулиращо, инхибира пролиферацията на широк спектър от туморни клетки	Епителна форма на остра и рецидивираща вирусна очна инфекция; онкологични заболявания
Интерферон алфа-2а		Рекомбинантен. Протеин, съдържащ 165 аминокиселини	Антивирусно, противотуморно действие	Левкемична ретикулоендотелиоза, сарком на Капоши, рак на бъбреците, рак на пикочния мехур, меланом, херпес зостер
Реаферон		Рекомбинантен INF, произведен от бактериален щам на pseudomonas, чийто генетичен апарат съдържа гена за човешки левкоцитен INF b2. Идентичен на човешки левкоцитен INF b2.		Вирусни, туморни заболявания
Интерферон алфа - n1		Високо пречистен човешки INF	Антивирусно	Хроничен активен инфекциозен хепатит В
Инреферон бета		Суперпродукция на човешки фибробласти от стимулатор в присъствието на метаболитни инхибитори	Антивирусно, имуномодулиращо, противотуморно действие	Хронични вирусни инфекции в офталмологията, гинекологията и урологията, дерматологията, хепатологията, онкологията
Интерферон гама		Рекомбинантен	Антивирусно, имуномодулиращо, противотуморно действие	Хронични грануломатозни заболявания

INF-bИINF-Vпо-сходни един с друг. Техните гени са локализирани на хромозома 9. За производството на двете, вирусите са индуциращият сигнал. Имат изразен антивирусен и противотуморен ефект и в много по-малка степен проявяват имуномодулиращи свойства.

INF-Жима изразен имуномодулиращ ефект, заедно с интерлевкин-2 (IL-2) и тумор некротизиращ фактор (TNF или TNF), той е един от основните провъзпалителни цитокини и е индуктор на клетъчния имунитет. Антивирусните и антитуморните свойства са по-слабо изразени от тези на INF-b и INF-c. Генът INF-g се намира на хромозома 12, основните продуциращи клетки са Т-лимфоцити, естествени клетки убийци (NK клетки). Индуциращият сигнал за производство може да бъде всеки антиген или други цитокини.

Антивирусен ефект на интерфероните се състои в потискане на синтеза на вирусна РНК, потискане на синтеза на протеини на вирусната обвивка. Механизмът на този ефект е активирането на вътреклетъчни ензими, като протеин киназа или аденилат синтетаза. Протеин киназата унищожава фактора за иницииране на протеиновия синтез от информационната РНК, което потиска протеиновия синтез. Аденилат синтетаза - предизвиква синтеза на вещества, които разрушават вирусната РНК.

Имуномодулиращ ефект на интерфероните - способността да се регулира взаимодействието на клетките, участващи в имунния отговор. Интерфероните изпълняват тази функция чрез регулиране на чувствителността на клетките към цитокини и експресията на молекули на главния комплекс на хистосъвместимост тип I (MHC1) върху клетъчните мембрани. Повишената експресия на MHC1 върху инфектирани с вирус клетки значително увеличава вероятността те да бъдат разпознати от имунокомпетентни клетки и елиминирани от тялото. INF-g има най-изразени имуномодулиращи свойства, като продукт на Т-лимфоцитен хелпер тип I, той, заедно с други провъзпалителни цитокини, активира макрофагите, Т-цитотоксичните лимфоцити, естествените клетки убийци (NK клетки), потиска активността на В-лимфоцитите, активира простагландиновата и кортикостероидната система. Всички тези фактори засилват фагоцитните и цитотоксичните реакции в областта на възпалителния фокус и допринасят за ефективното елиминиране на инфекциозния агент.

Антитуморен ефект на интерфероните свързани със способността им да забавят или потискат растежа на клетъчните култури и да активират антитуморните механизми на имунната система. Това свойство на интерфероните е открито отдавна и се използва широко за терапевтични цели. Всички противотуморни ефекти на интерфероните са разделени на директни и индиректни. Пряко свързан със способността за пряко въздействие върху туморните клетки, техния растеж и диференциация. Косвените са свързани с повишаване на способността на имунокомпетентните клетки да откриват и унищожават атипични клетки на тялото.

Директни противотуморни ефекти на интерферона:

· Потискане на синтеза на РНК.

· Потискане на протеиновия синтез.

· Стимулиране на недиференцираните клетки към узряване.

· Повишена експресия на мембранни антигени на туморни клетки и хормонални рецептори.

· Нарушаване на процесите на съдообразуване.

· Неутрализиране на онковируси.

· Потискане ефекта на туморните растежни фактори.

Индиректни противотуморни ефекти на интерферона:

· Стимулиране на активността на клетките на имунната система (макрофаги, NK клетки, Т-цитотоксични лимфоцити).

· Повишена експресия на клас I хистосъвместими молекули върху клетките.

Антипролиферативен ефект на интерфероните се крие в способността на интерфероните да проявяват свойствата на цитостатиците - да потискат клетъчния растеж чрез потискане на синтеза на РНК и протеини, както и инхибиране на растежни фактори, които стимулират клетъчната пролиферация.

Индуктори INFе много разнообразна група от естествени и синтетични съединения, които могат да накарат тялото да образува свой собствен (ендогенен) INF. Подобно на INF, те имат универсално широк спектър на антивирусно действие, както и имуномодулиращ ефект, което определя тяхната ефективност при много невирусни заболявания.

таблица 2

Спектър на антивирусна активност на индукторите на INF

Лекарство	Показания за употреба
Акриданони (циклоферон, неовир)	Грип, енцефалит, бяс, HIV инфекция, СПИН
Флуоренони (амиксин)	Грип, ARVI, херпес, хепатит А, енцефалит, бяс, множествена склероза
Поли (I): поли(U) - ампликен	ХИВ инфекция, СПИН
Поли(G): поли(С)-полигвацил	Грип, хепатит В, енцефалит, бяс
Двуверижна РНК (ларифан, ридостин)	Грип, ARVI, херпес, енцефалит, бяс
Поли(А): поли(U)-полудан	Херпетични очни лезии
Полифеноли (мегазин, кагоцел, саврак, ратозин, гозалидон)	Грип. ARVI, херпес, енцефалит, бяс, хепатит, ентеровирусни инфекции

Заключение

Интерферонът е семейство гликопротеинови протеини, които се синтезират от клетките на имунната система и съединителната тъкан. В зависимост от това кои клетки синтезират интерферон, има три вида: b, c и g интерферони.

Интерферонът се получава по два начина: а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус; б) генно инженерство.

В нашата страна рекомбинантният интерферон получи официалното име "Reaferon". Производството на това лекарство е в много отношения по-ефективно и по-евтино от левкоцитите.

Действието на интерферона е по-ефективно, колкото по-рано започва да се синтезира или навлиза в тялото отвън. Поради това се използва за профилактика на много вирусни инфекции, като грип, както и за терапевтични цели при хронични вирусни инфекции, като парентерален хепатит (B, C, D), херпес, множествена склероза и др. Интерферонът дава положителен ефект. води до лечение на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунодефицити.

Интерфероните са специфични за вида, т.е. човешкият интерферон е по-малко ефективен за животните и обратно. Тази видова специфика обаче е относителна.

Библиография

1. Временна фармакопейна статия 42U-23/60-439-97. Интерферон човешки рекомбинантен алфа-два.

2. Гавриков А.В. Оптимизиране на биотехнологичното производство на рекомбинантни човешки интерферонови вещества - М., 2003 г.

3. Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Potekhina T.S. Основи на фармацевтичната микробиология. Санкт Петербург: Проспект Науки, 2008. -304 с.

4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. М.: Мир, 2002. -589 с.

5. Държавна фармакопея на СССР. XI изд., брой 1.-- С. 175.

6. Държавен регистър на лекарствата / Изд. А.В. Катлински и други - М., 2002.

7. Елинов Н.П. Основи на биотехнологиите. Санкт Петербург: Наука.-1995.-600 с.

8. Елинов Н.П., Зайкина И.А., Соколова И.П. Ръководство за лабораторни занятия по микробиология - М.: Медицина, 1998.

9. Карабелски А.В. Рекомбинантни интерферони.- М.: Книга по поръчка, 2010.- 132 с.

10. Машкина О.С., Буторина А.К. Генно инженерство и биобезопасност. Воронеж: ВГУ, 2005. 71 с.

11. Народицки Б.С. Молекулярна биотехнология на интерферони. // сборник от научно-практическа конференция "Интерферон - 50 години". - М., 2007, стр. 17-23

12. Основи на фармацевтичната биотехнология: Учебник / T.V. Пришчеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л, К. Михалева, Л.С. Белова - Ростов n/a: Финикс; Томск: Издателство NTL, 2006.- 256 с.

13. Фролов А.Ф., Вовк А.Д., Дядюн С.Т. и др.. Ефективност на рекомбинантния алфа-два-интерферон при вирусен хепатит В // Медицински въпроси.- Киев, 1990.- № 9.-- С. 105-108.

14. http://interferon.su/php/content.php?id=577

15. http://ru-patent.info/20/95-99/2098124.html

16. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

17. www.pharmvestnik.ru

Публикувано на Allbest.ru

...

Подобни документи

Класове интерферони: естествени и изкуствено синтезирани. Методи за получаване на човешки левкоцитен интерферон от левкоцити на донорска кръв и микробиологичен синтез. Механизми на действие на интерфероните, терапевтично приложение.

резюме, добавено на 27.01.2010 г

История на откриването на интерфероните, техните характеристики, класификация, механизъм на действие и характеристики на производството; клинични характеристики на тяхното използване. Технологична схема за производство на левкоцитен и рекомбинантен интерферон в препаративни количества.

курсова работа, добавена на 23.12.2012 г

Вроден антивирусен имунитет. Видове интерферони и механизми на антивирусно действие на интерфероните. Способността на антителата и добавките да ограничават разпространението на вируса и да предотвратяват повторно заразяване. Байпас на имунологичния контрол от вируси.

резюме, добавено на 27.09.2009 г

Проучване на свойствата на интерферона. Изследване на основните действия на протеин, който има антивирусен, антипролиферативен и имуномоделиращ ефект. Използването на интерферон при лечението на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунодефицит.

презентация, добавена на 17.11.2015 г

Процесът на кръвопреливане и неговата цел, оценка на безопасността на съвременния етап от развитието на медицината. Патологичният ефект на донорската кръв, неговите причини и методи за рехабилитация на пациента. Използването на реинфузия и автохемотрансфузия на кръв и техните предимства.

резюме, добавено на 13.07.2009 г

Видове имуномодулация. Концепцията за имунотропни лекарства. Интерферони и техните индуктори. Механизмът на имуномодулиращия ефект на бактериалните ваксини. Показания за предписване на a-IF лекарства. Противопоказания за лечение с интерферон.

презентация, добавена на 03.04.2014 г

Анализ на кръвни клетки: червени кръвни клетки, левкоцити, тромбоцити. Хемоглобинът и неговите функции в организма. Гранулоцити, моноцити и лимфоцити като компоненти на левкоцитите. Патологии в състава на кръвта, влиянието им върху функциите на човешкия организъм.

резюме, добавено на 10/06/2008

Терапевтичен и профилактичен механизъм на действие на лечебната кал, тяхната класификация и използване за термични ефекти върху тялото. Показания и противопоказания за топлотерапия. Техника за общи и локални кални апликации и бани.

резюме, добавено на 21.12.2014 г

Функции на кръвта - течна тъкан на сърдечно-съдовата система на гръбначните животни. Неговият състав и формирани елементи. Образуване на червени кръвни клетки, видове патологии. Основната сфера на действие на левкоцитите. Лимфоцитите са основните клетки на имунната система. Промени в кръвта, свързани с възрастта.

презентация, добавена на 14.10.2015 г

Възрастова периодизация на човек. Хемопоеза в ембриогенезата. Промени в концентрацията на еритроцити, левкоцити, лимфоцити и тромбоцити с възрастта. Специфично тегло и вискозитет на кръвта при новородени и възрастни хора. Класификация и време на развитие на левкоцитите.

IFN са разделени на два вида. Първият тип, който действа като инхибитор на вирусната репликация и има предимно антивирусен ефект, включва 22 различни подтипа на IFN-α и един подтип на IFN-β. Вторият тип, който проявява имуномодулираща активност, включва IFN-γ.

Има три имунологично различни класа IFN: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

Естествено срещащите се IFNs включват лимфобластоиден и левкоцитен IFN (IFN-α), синтезиран от съответно стимулирани човешки моноцити и В лимфоцити, които след това се екстрахират и пречистват; фибробластен IFN (IFN-β), получен от култура на човешки фибробласти, и Т-лимфоцитен IFN (IFN-γ).

Изкуствено синтезираните IFNs включват рекомбинантен IFN-α, който е високо пречистен единичен подтип на IFN-α, произведен с помощта на рекомбинантна молекулярна технология.

Като изходни микроорганизми се използват различни щамове на Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Известни са голям брой плазмиди и създадени на тяхна база щамове E. coli, които експресират интерферон: щамове E. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмиди Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli щам pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli щам pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli щам SG 20050 с плазмид p280/21FN (Kravchenko V.V. и др., Биоорганична химия, т. 13, № 9, стр. 1186-1193), щам E. coli SG 20050 с плазмид pINF14 (SU 1703691), щам E. coli SG 20050 с плазмид pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатъкът на технологиите, базирани на използването на тези щамове, е тяхната нестабилност, както и недостатъчното ниво на експресия на интерферон.

За получаване на големи количества IFN се използват шестдневни монослойни култури от клетки от пилешки ембриони или култивирани човешки кръвни левкоцити, заразени с определен тип вирус. С други думи, за да се получи IFN, се създава определена система вирус-клетъчна.

3) Всяка група клонинги се хибридизира с IFN - иРНК.

4) От получените хибриди, съдържащи cDNA и chRNA, иРНК се изолира и транслира в системата за протеинов синтез.

5) Определете интерфероновата антивирусна активност на всяка смес, получена в резултат на транслацията. Групите, които показват интерферонова активност, съдържат клон с кДНК, хибридизирана с IFN - иРНК; повторно се идентифицира клонинг, съдържащ сДНК на човешки IFN с пълна дължина.

2. Механизми на действие на интерфероните

IFNs проявяват някои дейности като лимфокини и имуномодулатори. Тип I IFNs, които действат предимно като инхибитори на вирусната репликация в клетката, упражняват своя ефект чрез стимулиране на производството на клетъчни ензими от рибозомите на клетките гостоприемници, които инхибират производството на вируси, нарушавайки транслацията на вирусна иРНК и синтеза на вирусни протеини.

IFNs се произвеждат от повечето животински видове, но проявата на тяхната активност е видово специфична, т.е. те действат само във видовете животни, в които се произвеждат.

IFN предизвикват индукция на три ензима:

протеин киназа, която нарушава началния етап на изграждане на пептидната верига;

олигоизоаденилат синтетаза, която активира РНКаза, която разрушава вирусната РНК;

фосфодиестераза, която разрушава крайните нуклеотиди на tRNA, което води до нарушаване на пептидното удължаване.

Като се вземат предвид антивирусните и имуномодулиращите ефекти на IFN, NPO Biomed предложи и успешно тества супозитории с IFNan1 и пробиотици за лечение на дисбиоза с вирусна и бактериална етиология, кандидоза; в гинекологичната практика за лечение на ендометрит, колпит, вагинит и гинекологичен херпес.

3. Терапевтично използване на човешки INF

По този начин беше възможно да се разработят лекарства Viferon, Interal и други, съдържащи рекомбинантен човешки интерферон алфа

Благодарение на уникалните си свойства интерфероновите препарати се използват за лечение и профилактика на всички респираторни заболявания, повечето видове рак, както и за лечение на много вирусни заболявания и грип. Интерфероновите препарати се използват широко при лечението на хепатит В и С: интерферонът ограничава развитието на вируса, предотвратява появата на цироза и елиминира смъртта.

Някои лекарства с интерферон имат странични ефекти, като кожни обриви, алергии и заболявания на хемопоетичната система.

При продължителна употреба на интерферон тялото произвежда антитела срещу интерферон, което го прави неспособен да се бори с вирусите. Причината за тези явления се крие в наличието на албумин в препаратите на базата на интерферон.

Албуминът се получава от кръвта, така че съществува риск (макар и минимален) от заразяване с хепатит и други болести, предавани по кръвен път.

Име на лекарството	Подтип INF	Начин на получаване	фармакологичен ефект	Показания за употреба
Интерферон		Биосинтеза в култивирани левкоцити на донорска кръв под въздействието на вируси	Антивирусно, имуномодулиращо, антипролиферативно	Вирусни заболявания, левкемия, злокачествен меланом, рак на бъбреците, карциноиден синдром
Блокировка		Биосинтеза в култивирани левкоцити от донорска кръв под влияние на парамиковируси	Потиска активността на редица вируси	Вирусни очни заболявания, хепатит	Рекомбинантен	Антивирусно, имуномодулиращо, инхибира пролиферацията на широк спектър от туморни клетки	Епителна форма на остра и рецидивираща вирусна очна инфекция; онкологични заболявания
Интерферон алфа-2а		Рекомбинантен. Протеин, съдържащ 165 аминокиселини	Антивирусно, противотуморно действие	Левкемична ретикулоендотелиоза, сарком на Капоши, рак на бъбреците, рак на пикочния мехур, меланом, херпес зостер
Реаферон		Рекомбинантен INF, произведен от бактериален щам на pseudomonas, чийто генетичен апарат съдържа човешкия левкоцитен IFN α2 ген. Идентичен на човешки левкоцитен IFN α2.		Вирусни, туморни заболявания
Интерферон алфа – n1		Високо пречистен човешки INF	Антивирусно	Хроничен активен инфекциозен хепатит В
Инреферон бета		Суперпродукция на човешки фибробласти от стимулатор в присъствието на метаболитни инхибитори	Антивирусно, имуномодулиращо, противотуморно действие	Хронични вирусни инфекции в офталмологията, гинекологията и урологията, дерматологията, хепатологията, онкологията
Интерферон гама		Рекомбинантен	Антивирусно, имуномодулиращо, противотуморно действие	Хронични грануломатозни заболявания

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Временна фармакопейна статия 42U-23/60-439-97. Интерферон човешки рекомбинантен алфа-два.

5. Гавриков А.В. Оптимизиране на биотехнологичното производство на рекомбинантни човешки интерферонови вещества - М., 2003 г.

6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярна биотехнология / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М., Мир, 2002.

7. Държавна фармакопея на СССР. XI изд., брой 1.- С. 175.

8. Държавен регистър на лекарствата / Изд. А.В. Катлински и други - М., 2002.

9. Народицки Б.С. Молекулярна биотехнология на интерферони. // сборник от научно-практическа конференция „Интерферон – 50 години”. – М., 2007, стр. 17-23

10. Основи на фармацевтичната биотехнология: Учебник / T.P. Пришчеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов на Дон.: Феникс; Томск: Издателство NTL, 2006.

11. Фролов А.Ф., Вовк А.Д., Дядюн С.Т. и др.. Ефективност на рекомбинантния алфа-два-интерферон при вирусен хепатит В. - Киев, 1990. - С. 105-108.

Интерферонсе отнася до важни защитни протеини на имунната система. Открито по време на изследване на вирусната интерференция, т.е. феноменът, когато животни или клетъчни култури, заразени с един вирус, стават нечувствителни към инфекция с друг вирус. Оказа се, че намесата се дължи на получения протеин, който има защитни антивирусни свойства. Този протеин се нарича интерферон.

Алфа интерферонпроизвежда се от левкоцити и се нарича левкоцит; интерферон бетанаречен фибробластен, тъй като се синтезира от фибробласти - клетки на съединителната тъкан, и гама интерферон -имунен, тъй като се произвежда от активирани Т-лимфоцити, макрофаги, естествени клетки убийци, т.е. имунни клетки.

Интерферонът непрекъснато се синтезира в тялото и концентрацията му в кръвта се поддържа на около 2 IU/ml (1 международна единица - IU - е количеството интерферон, което предпазва клетъчна култура от 1 CPD 50 от вируса). Производството на интерферон се увеличава рязко по време на инфекция с вируси, както и при излагане на индуктори на интерферон, като РНК, ДНК и сложни полимери. Такива индуктори на интерферон се наричат интерфероногени.

В допълнение към антивирусния ефект, интерферонът има противотуморна защита, тъй като забавя пролиферацията (размножаването) на туморните клетки, както и имуномодулираща активност, стимулира фагоцитоза, естествени клетки убийци, регулира образуването на антитела от В-клетките, активира експресията на основните комплекс за хистосъвместимост.

Механизъм на действиеИнтерферонът е сложен. Интерферонът не засяга директно вируса извън клетката, но се свързва със специални клетъчни рецептори и засяга процеса на възпроизвеждане на вируса вътре в клетката на етапа на протеиновия синтез.

Използване на интерферон. Действието на интерферона е по-ефективно, колкото по-рано започва да се синтезира или навлиза в тялото отвън. Поради това се използва за профилактика на много вирусни инфекции, като грип, както и за терапевтични цели при хронични вирусни инфекции, като парентерален хепатит (B, C, D), херпес, множествена склероза и др. Интерферонът дава положителен ефект. води до лечение на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунодефицити.

Получаване на интерферон. Интерферонът се получава по два начина: а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус, в резултат на което инфектираните клетки синтезират интерферон, който след това се изолира и от него се изграждат интерферонови препарати; б) генно инженерство - чрез отглеждане на рекомбинантни щамове бактерии, способни да произвеждат интерферон при производствени условия. Обикновено се използват рекомбинантни щамове на pseudomonas и Escherichia coli с интерферонови гени, вградени в тяхната ДНК. Интерферонът, получен чрез генно инженерство, се нарича рекомбинантен. В нашата страна рекомбинантният интерферон получи официалното име "Reaferon". Производството на това лекарство е в много отношения по-ефективно и по-евтино от левкоцитното лекарство.

Рекомбинантният интерферон намери широко приложение в медицината като превантивен и терапевтичен агент за вирусни инфекции, неоплазми и имунодефицити.

Антигени. Определение. Концепцията за пълни и дефектни антигени. Изисквания към антигените. Понятия за антигенните свойства на микроорганизмите. Антигенна структура на бактериите.

Антигени(от латински anti - срещу, genos - род) - генетично чужди вещества, които, въведени във вътрешната среда на тялото, са способни да предизвикат имунен отговор под формата на образуване на антитела или имунни Т-лимфоцити и да взаимодействат с тях. Основните свойства на антигена са имуногенност и специфичност. Антигените са структурни и химични елементи на клетките и продуктите на техния метаболизъм.

Антигените са вещества с колоидна структура, чужди на тялото, които, въведени във вътрешната му среда, са способни да предизвикат специфичен имунологичен отговор, проявяващ се по-специално в образуването на специфични антитела, появата на сенсибилизирани лимфоцити или възникване на състояние на толерантност към това вещество.

Веществата, които са антигени, трябва да са чужди на тялото, макромолекулни, в колоидно състояние и да влизат в тялото парентерално, т.е. заобикаляйки стомашно-чревния тракт, в който веществото обикновено се разгражда и чуждостта му се губи. Чуждостта на антигените трябва да се разбира като определена степен на химична разлика между антигена и макромолекулите на организма във вътрешната среда, в която той влиза.

Антигенните свойства са свързани с молекулното тегло на макромолекулата. Колкото по-високо е молекулното тегло на дадено вещество, толкова по-висока е неговата антигенност. Въпреки това е неправилно да се приеме, че високото молекулно тегло е задължително свойство на антигена. По този начин глюкагонът, вазопресинът - ангиотензинът също имат антигенни свойства.

Обичайно е да се прави разлика между пълни антигени, по-ниски антигени (хаптени) и полу-хаптени.

Пълноценните антигени са тези, които предизвикват образуването на антитела или сенсибилизацията на лимфоцитите и са в състояние да реагират с тях както в организма, така и при лабораторни реакции. Протеините, полизахаридите, високомолекулните нуклеинови киселини и сложните съединения на тези вещества имат свойствата на пълноценни антигени.

Дефектните антигени или хаптени сами по себе си не са в състояние да предизвикат образуването на антитела или сенсибилизация на лимфоцитите. Това свойство се проявява само когато към тях се добавят пълноценни антигени („проводници“) и сред получените антитела или сенсибилизирани лимфоцити някои са специфични за „проводника“, а други са специфични за хаптена.

Хемихаптените са сравнително прости вещества, които при навлизане във вътрешната среда на организма могат химически да се комбинират с протеините на този организъм и да им придадат свойствата на антигени. Тези вещества могат да включват и някои лекарства (йод, бром, антипирин и др.).

Молекулата на антигена се състои от две неравни части. Активната (малка част) c се нарича антигенна детерминанта (епитоп) и определя антигенната специфичност. Антигенните детерминанти се намират в онези места на молекулата на антигена, които са в най-голяма връзка с микросредата. В една белтъчна молекула, например, те могат да бъдат разположени не само в краищата на полипептидната верига, но и в други части от нея. Антигенните детерминанти съдържат поне три аминокиселини с твърда структура (тирозин, триптофан, фенилаланин). Специфичността на антигена също е свързана с реда на редуване на аминокиселините на полипептидната верига и комбинацията от техните позиции една спрямо друга. Броят на антигенните детерминанти в една антигенна молекула определя нейната валентност. Колкото по-високо е относителното молекулно тегло на молекулата на антигена, толкова по-високо е то.

Смята се, че останалата (неактивна) част от молекулата на антигена играе ролята на носител на детерминанта и насърчава проникването на антигена във вътрешната среда на тялото, неговата пиноцитоза или фагоцитоза, клетъчната реакция към проникването на антиген, образуването на медиатори на междуклетъчно взаимодействие в имунния отговор (Т лимфоцитите имат рецептори за носителя, В- към антигенната детерминанта).

Според анатомичните структури на бактериалната клетка има Н-антигени (флагеларни, ако бактерията ги има), К-антигени (разположени на повърхността на клетъчната стена), О-антигени (свързани с бактериалната клетъчна стена) , антигени, екскретирани от бактериите в тяхната среда (протеини-екзотоксини, капсулни полизахариди).

Сред многобройните антигени на микробната клетка има такива, които са присъщи само на даден вид микроб (типови антигени), даден вид (видови антигени), както и такива, които са общи за група (семейство) микроорганизми (група антигени).

Така бактериалната клетка (както и микроорганизмите от други микробни царства - вируси, протозои, гъбички) представлява сложен комплекс от множество антигени. Когато навлезе във вътрешната среда на макроорганизма, много от тези антигени ще образуват свои собствени специфични антитела. Някои антигени индуцират образуването на едва забележимо количество антитела (титър), докато други предизвикват бързо и значително образуване на антитела. Съответно се разграничават "слаби" и "силни" антигени.

Не всички антигени на бактериална клетка са еднакво включени в индукцията на имунитет (имунитет) срещу повторното навлизане на патогенни микроби от същия вид в макроорганизма. Способността на антигена да индуцира имунитет се нарича имуногенност, а такъв антиген се нарича имуноген. Установено е също, че определени антигени на определени микроорганизми могат да предизвикат развитието на различни видове свръхчувствителност (алергии). Такива антигени се наричат алергени.

Въз основа на структурата на вирусната частица се разграничават няколко групи антигени: ядрени, капсидни и суперкапсидни. Антигенният състав на вириона зависи от структурата на самата вирусна частица. Антигенната специфичност на просто организираните вируси е свързана с рибо- и деоксинуклеопротеини. При сложните вируси част от антигена е свързана с нуклеокапсида, а другата е локализирана във външната обвивка - суперкапсид.

Имуногенност- способност за предизвикване на имунен отговор.

Специфичност- способността на антигена да взаимодейства със специфични за него антитела или активирани (праймирани) лимфоцити, което води до неутрализиране на този антиген.

Имуногенността се определя:

Чуждостта, тези. веществото трябва да бъде разпознато от имунната система като „несвое“. Освен това, колкото по-слабо изразена е генетичната връзка между организма и приложеното вещество, толкова по-добър е имуногенът;

Молекулно тегло, която трябва да бъде поне 5-10 kDa. Колкото по-голямо е молекулното тегло на антигена, толкова по-силен ще бъде имунният отговор;

Химическа природа. Антигените могат да бъдат протеини, полизахариди, полипептиди, фосфолипиди, нуклеинови киселини и др.

В зависимост от химическата природа и молекулното тегло антигените могат да бъдат пълен И непълна

(хаптени).

Пълни антигени(имуногени) предизвикват специфичен имунен отговор и взаимодействат с антитела и активирани Т-лимфоцити. Това са високомолекулни вещества - протеини, полизахариди, гликопротеини, липополизахариди, липопротеини, нуклеопротеини и корпускулни форми (микроорганизми, чужди клетки и др.). Антигените могат да бъдат екзогенни или ендогенни. Ендогенните Ags са собствените клетки на тялото с променен геном и продуктите, които образуват ( автоантигени).

Хаптени- това са прости химични съединения с ниско молекулно тегло: дизахариди, липиди, пептиди, нуклеинови киселини и др. Те не са имуногенни, но имат високо ниво на специфичност при взаимодействие с продукти на имунния отговор (антитела и Т-лимфоцити). Ако хаптенът се комбинира с протеин, той придобива свойството на имуногенност (т.е. става пълен). Спецификата на този комплекс се определя от хаптена

Полухаптени

Проантигени

Полухаптенисе образуват при свързване на неорганични вещества (йод, бром, азот и др.) с протеини. Такива комплекси могат да индуцират образуването на антитела, специфични за неорганични съединения.

Проантигениса алергени-хаптени или неантигенни вещества (сулфонамиди, антибиотици, фенолфталеин и др.). Когато се комбинират с протеини на макроорганизма, те могат да причинят състояние на сенсибилизация и развитие на алергични реакции.