Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)

Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA) prebieha v dvoch fázach: prvá je interakcia protilátok s antigénom, druhá je enzymatická indikácia komplexu antigén-protilátka v dôsledku objavenia sa farby v reakčnej zmesi a registrácie farby vizuálne alebo spektrofotometrickou metódou .

Pre ELISA existujú dve možnosti: tuhá fáza a kvapalná fáza, ktoré sa líšia spôsobom oddeľovania zložiek imunochemickej reakcie. V porovnaní s predtým opísanými metódami na detekciu antigénov a protilátok má ELISA významné výhody:

vysoká citlivosť umožňujúca detekciu až 0,05 ng/ml látky;

schopnosť použiť minimálne objemy testovaného materiálu (1--2 µl);

možnosť inštrumentálneho alebo vizuálneho záznamu reakcie;

výraznosť a schopnosť automatizovať všetky štádiá reakcie.

ELISA je v súčasnosti v praxi široko využívaná na diagnostiku mnohých infekčných ochorení bakteriálnej, mykotickej etiológie, protozoálnych infekcií a helmintiáz, ale najmä vírusových infekcií, najmä hepatitídy A, B, C, D, E, G, HIV infekcie, herpesvírusu, rotavírus, adenovírus, astrovírus, parvovírus a iné infekcie.

Imunitný blotting

Princípom metódy imunoblotovania je detekcia protilátok proti jednotlivým antigénom patogénu. Pomocou tejto metódy sa stanovujú protilátky proti antigénom HIV (vírusové obalové glykoproteíny, jadrové proteíny a vírusové enzýmy). Výsledky imunoblotingu sa hodnotia ako pozitívne, pochybné a negatívne v závislosti od kvantitatívneho a kvalitatívneho súboru zistených protilátok.

Treba poznamenať, že imunitné blotovanie je v citlivosti na ELISA nižšie, v niektorých prípadoch môže byť zaznamenaný negatívny výsledok, ak má pacient infekciu HIV. Možnosť registrácie falošne pozitívnych výsledkov v teste ELISA na infekciu HIV si však vyžaduje integrovaný prístup k diagnostike infekcie HIV, berúc do úvahy okrem výsledkov imunologických reakcií (ELISA, immunoblotting) aj epidemiologické a klinické údaje.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Metódu PCR vyvinul americký biochemik Kary Mullis v roku 1983 na základe použitia ním objavenej termostabilnej DNA polymerázy (Tag polymeráza). Princípom metódy je zvýšenie 10 6 -- 10 8-násobku počtu kópií špecifickej oblasti DNA patogénu, katalyzovaného in vitro DNA polymerázou v automatickom režime.

V umelých podmienkach je možná reprodukcia procesu replikácie oblasti genómu špecifickej pre konkrétny druh alebo rod patogénov za predpokladu, že je známa jej nukleotidová sekvencia. Použitie metód na detekciu replikačných produktov takýchto oblastí (amplikónov) nám umožňuje určiť prítomnosť patogénu v testovanej vzorke.

Doplnkové dokončenie reťazcov opísaných vyššie začína iba v určitých východiskových blokoch, ktorými sú krátke dvojvláknové úseky. Keď sú takéto bloky pripojené k špecifickým úsekom DNA, proces syntézy nového reťazca je nasmerovaný len do vybranej časti a nie po celej dĺžke reťazca DNA. Na vytvorenie štartovacích blokov v daných úsekoch DNA sa používajú dva oligonukleotidové priméry, nazývané priméry. Priméry sú komplementárne k sekvenciám DNA na ľavom a pravom okraji špecifického fragmentu a sú orientované tak, že k dokončeniu nového reťazca DNA dochádza iba medzi nimi.

TO výhody metódy PCR by mala obsahovať:

vysoká citlivosť umožňujúca stanovenie 10-1000 buniek vo vzorke;

vysoká špecifickosť, pretože testovaný materiál odhaľuje fragment DNA jedinečný pre daný patogén;

univerzálnosť postupu na detekciu rôznych patogénov z jednej biovzorky;

Vysoká rýchlosť analýzy (4--4,5 h);

Možnosť diagnostiky nielen akútnych, ale aj latentných infekcií.

Použitie PCR je účinné na diagnostiku širokého spektra bakteriálnych a vírusových infekcií.

Nedávno sa pomerne úspešne implementovali kvantitatívne metódy analýzy PCR, ktoré umožňujú určiť koncentráciu patogénu v materiáli (mikrobiálnu alebo vírusovú záťaž), napríklad posúdiť replikačnú aktivitu vírusu hepatitídy B, vírusu HIV C .

Treba si však uvedomiť, že aj metóda PCR má svoje obmedzenia, najmä pri diagnostike infekcií spôsobených oportúnnou autoflórou.

Hybridizácia nukleových kyselín

Hybridizácia nukleových kyselín, podobne ako PCR vám umožňuje identifikovať patogén vo vzorke bez predchádzajúcej izolácie. Na uskutočnenie analýzy sa syntetizuje jednovláknová sonda DNA alebo RNA, komplementárna k špecifickým nukleotidovým sekvenciám patogénu. Sonda je označená rádionuklidom, enzýmom alebo inou ľahko rozpoznateľnou značkou. Skúmaný materiál je podrobený spracovaniu za účelom lýzy mikroorganizmov prítomných v bioteste, izolácii a denaturácii DNA. Potom sa sonda inkubuje s testovanou vzorkou a meria sa množstvo značenej DNA, ktorá vstúpila do hybridizácie s DNA v testovanej vzorke. Reakcia môže prebiehať ako na sorbentoch v pevnej fáze, tak aj v roztoku, ale predpokladom je premytie nenaviazaného množstva značenej sondy. Citlivosť metódy hybridizácie nukleových kyselín je nižšia ako citlivosť PCR a je 103 mikrobiálnych buniek vo vzorke.

Sada reagencií „MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2“ je určená na potvrdenie detekcie protilátok proti jednotlivým proteínom (antigénom) HIV-1 a/alebo HIV-1 skupiny O a/alebo HIV-2 v ľudské sérum alebo plazma metódou imunoblot.

Charakteristické rysy:

• Súprava činidiel „MPBA – Blot – HIV-1, HIV-2“ obsahuje purifikované lyzátové vírusové proteíny HIV 1 a peptid – antigénny determinant gp36 HIV-2;
• Poskytuje detekciu protilátok proti HIV-1, HIV-1 skupiny O, HIV 2 na jednom prúžku;
• Jednoduchý postup prípravy a vykonania testov;
• Interná kontrola kvality reakcie*
• Maximálna rýchlosť analýzy (3 hodiny);
• Malý objem testovanej vzorky - 20 µl;
• Nevyžaduje dodatočné vybavenie na výskum;
• Kvalita súpravy je zaručená použitím ruských a medzinárodných štandardných vzoriek**

* Interná kontrola kvality je zabezpečená prítomnosťou:

• vnútorné kontrolné prúžky, poskytuje kontrolu nad zavedením vzorky séra alebo plazmy;
• kontrolné negatívne sérum (K-);
• kontrolné pozitívne sérum (K+), ktoré umožňuje identifikáciu pásikov detegovaných na prúžku;
• kontrolné slabo pozitívne sérum (K+cl), ktoré poskytuje kontrolu nad citlivosťou reagenčnej súpravy.

**Zabezpečenie kvality:

Charakteristiky reagenčnej súpravy MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 boli stanovené testovaním vzoriek z náhodnej vzorky darcov, pacientov s diagnostikovanou infekciou HIV, komerčných panelov sérokonverzie, štandardných panelov a vzoriek „potenciálne interferujúcich s determinácie“.

Sada reagencií nedáva falošne pozitívne výsledky pri vyšetrovaní štandardných panelových sér, ktoré neobsahujú protilátky proti HIV 1,2 a HIV-1 antigénu („AT (-) HIV Standard“, č. FSR 2007/00953 zo dňa 25. 10. 2007 ). Špecifickosť - 100%.

Diagnostická špecificita bola stanovená štúdiom náhodnej vzorky 200 darcov z rôznych krvných centier a kliník s predtým potvrdenou absenciou infekcie HIV-1 a HIV-2. Špecifickosť pri štúdiu náhodnej vzorky darcov bola 100 %;

Špecifickosť reagenčnej súpravy bola stanovená testovaním 250 vzoriek, vrátane vzoriek séra alebo plazmy získaných od tehotných žien, hospitalizovaných pacientov, pacientov s hepatitídou C a E a vzoriek s „potenciálne interferujúcimi“ zložkami. Pri použití súpravy MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 pre tieto vzorky neboli zistené žiadne falošne pozitívne výsledky.

Diagnostická citlivosť bola stanovená pomocou:
- vzorky plazmy z panelu Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) z rôznych oblastí obsahujúcich rôzne podtypy HIV-1: skupina M (podtypy A, B, C, D, E, F) a skupina O; citlivosť reagenčnej súpravy bola 100 %;

Citlivosť reagenčnej súpravy bola stanovená v štúdii medzinárodných sérokonverzných panelov Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. č. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932

Sada činidiel zisťuje protilátky proti HIV-1 v sére štandardného panelu obsahujúceho protilátky proti HIV-1 („AT (+) HIV-1 Standard“, č. FSR 2007/00953 z 25. októbra 2007), zisťuje protilátky proti HIV-2 v štandardných panelových sérach obsahujúcich protilátky proti HIV-2 („AT (+) HIV-2 štandard“, č. FSR 2007/00953 z 25. októbra 2007). Citlivosť - 100%.

Registračný list č. FSR 2010/07958 zo dňa 13. júla 2011 (platnosť neobmedzená)

zlúčenina:

• Imunosorbent. Prúžky bielej nitrocelulózovej membrány s jednotlivými HIV-1 proteínmi (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) na ne sorbované elektrotransferom a aplikované na prúžok so syntetickým HIV-2 peptidom, analógom proteínu gp36 a ľudskej anti-IgG (vnútorná kontrola) - 18 ks;
• K- - kontrolné negatívne sérum. Ľudské krvné sérum, ktoré neobsahuje protilátky proti HIV-1,2, HCV, HIV antigén, HBsAg, sa inaktivuje zahriatím na 560C; transparentná svetložltá kvapalina - 1 skúmavka (0,08 ml). Obsahuje konzervačné látky: timerosal a azid sodný;
• K+ - kontrolné pozitívne sérum. Ľudské krvné sérum obsahujúce protilátky proti HIV-1,2 (titer nie menší ako 1:10 000), neobsahujúce HBsAg, HIV antigén, protilátky proti HCV, sa inaktivuje zahrievaním na 56 °C; transparentná svetložltá kvapalina - 1 skúmavka (0,08 ml) Obsahuje konzervačné látky: thimerosal a azid sodný.
• K+sl - kontrolné slabo pozitívne sérum. Ľudské krvné sérum obsahujúce protilátky proti HIV-1,2 (titer nie viac ako 1:200), neobsahujúce HBsAg, HIV antigén, protilátky proti HCV, sa inaktivuje zahrievaním na 56 °C; transparentná svetložltá kvapalina - 1 skúmavka (0,08 ml). Obsahuje konzervačné látky: timerosal a azid sodný;
• RPOKk (x10) - roztok na riedenie vzoriek a konjugátu. Koncentrát - Tris pufor obsahujúci vopred upravené normálne kozie sérum; nepriehľadná šedá kvapalina - 1 fľaša (10 ml). Obsahuje konzervačnú látku: thimerosal;
• PRk (x20) - premývací roztok. Koncentrát - Tris pufor obsahujúci Tween-20; priehľadná bezfarebná kvapalina - 1 fľaša (70 ml). Obsahuje konzervačnú látku: thimerosal;
• Konjugovať. kozie anti-humánne IgG protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou; transparentná bezfarebná kvapalina - 1 skúmavka (0,06 ml);
• Substrát (farbiaci roztok). Roztok 5-bróm-4-fluórindolylfosfátu (BCIP) a nitrotetrazoliovej modrej (NBT); transparentná svetložltá kvapalina - 1 fľaša (50 ml);
• Prášok na imunoblotovanie. Sušené odstredené mlieko - amorfný biely alebo svetložltý prášok - 5 balení x 1g;
• Tableta s vekom na nastavenie reakcie - 2 kusy;
• Plastová pinzeta - 1 kus.

HIV imunoblot deteguje protilátky proti vírusovým proteínom umiestnené na špeciálnej nitrocelulózovej membráne. Ide o vysoko presnú štúdiu, ktorá identifikuje prítomnosť frakcií, v ktorých sa hlavné proteíny nachádzajú vo forme malých pásov.

Vírusový obal HIV-1 obsahuje glykoproteíny s molekulovou hmotnosťou v rozmedzí od 41 kd do 160 kd (kilodaltonov). Veľký význam pre imunobloting má HIV-2 glykoproteín s molekulovou hmotnosťou od 32 kd do 140 kd. Jadrové proteíny HIV-1 a vírusové enzýmy sú reprezentované proteínmi p17, p24, p55.

Pôvodca HIV-2 pozostáva z proteínov označených p16, p25, p56. Tvoria jeho vnútornú škrupinu. Genóm obsahuje 6 regulačných a 3 štruktúrne gény. Často pri delení buniek vznikajú genetické nepresnosti a objavuje sa niekoľko podtypov patogénu.

Pozitívne testy

Na odstránenie chýb v laboratórnej diagnostike infekcie HIV je pacientovi predpísaný ďalší test. Jeho výsledky sú integrované ako pozitívne, ak sa zistia protilátky proti 2 alebo 3 proteínom HIV-1 alebo HIV-2.

Imunoblot potvrdzuje všetky dobré výsledky ELISA. V tomto prípade sa detegujú protilátky proti gp120/160, gp41 alebo p24, čo sú štruktúrne jednotky troch hlavných génov AIDS - gag, pol a env. U niektorých pacientov, ktorí majú negatívne výsledky ELISA a PCR, imunoblot ukazuje niekoľko pozitívnych prúžkov. Lekár predpíše dodatočný test p24 na stanovenie správnej diagnózy a vylúčenie skorej fázy infekcie HIV.

Ak sú získané výsledky pochybné, pacient je požiadaný, aby zopakoval test počas nasledujúcich 3 mesiacov. Takmer všetky prípady HIV sú potvrdené pomocou imunoblotovacieho systému – prístroja Sanofi. Vo väčšine prípadov sa detegujú antigény HIV, proteíny p25, gp110/120 a gp160, čo naznačuje infekciu vírusom. Falošne pozitívny test je registrovaný u pacientov trpiacich chorobami spojivového tkaniva so zvýšenou hladinou bilirubínu pri interakcii s rôznymi vírusovými antigénmi.

Negatívny výsledok

Ak chýbajú pozitívne línie zodpovedajúce proteínom vírusu AIDS, imunoblot sa interpretuje ako negatívny výsledok. Analýza jasne potvrdzuje neprítomnosť infekcie vírusom imunodeficiencie alebo naznačuje „obdobie okna“. Ak imunoblot dáva negatívny výsledok, osoba nie je nosičom vírusu AIDS.

Na štúdiu sa odoberú vzorky krvného séra od pacientov infikovaných HIV. Skladujú sa zmrazené pri -20 °C. Analýza sa vykonáva pomocou testovacích systémov:

• antigén;
• rekombinantný-HIV;
• Peptosscreen.

Registrácia negatívneho výsledku indikuje neprítomnosť protilátok proti HIV obalovým glykoproteínom gp120, gp160, Sp41 v sére.

Pacient sa často zaujíma o otázku, či pacient, ktorý má infikovaného sexuálneho partnera, môže mať negatívny výsledok imunoblotu na HIV. Po štúdii sa často získa pochybný výsledok alebo sa zistia protilátky proti proteínom gp120 a gp160, čo naznačuje úplnú absenciu negatívnych údajov. Niekedy je u pacientov s asymptomatickou infekciou zaznamenaná pochybná odpoveď.

Neinterpretovateľné výsledky

Testy vykonané pomocou rôznych testov na protilátky HIV sú niekedy negatívne a nespĺňajú kritériá séropozitivity. Pre lekára je ťažké určiť príčinu pochybného výsledku.

Niektorí pacienti nie sú vystavení riziku infekcie HIV. Lekár môže urobiť chyby pri interpretácii výsledkov testu, ak je infekcia spôsobená iným sérotypom.

Krvné sérum pacienta sa musí časom vyšetriť. Ak sa do 6 mesiacov nepozorujú žiadne klinické prejavy AIDS a neexistujú žiadne rizikové faktory, pacient sa zaznamená ako bez infekcie.

U pacientov s nízkym rizikom infekcie sa získajú sporné výsledky testov. V niektorých prípadoch je výskyt nejasných údajov spôsobený imunitnými komplexmi a autoprotilátkami obsiahnutými v krvnom sére.

U niektorých pacientov je výskyt sporných výsledkov spôsobený vývojom patologických procesov:

• infekčné choroby;
• rakovinový nádor;
• Alergická reakcia.

Pacient pociťuje zmeny v klinickom krvnom teste, zvýšenie C-reaktívneho proteínu alebo zvýšenie ESR. U ľudí trpiacich infekčnými chorobami sa často zistí pochybná imunoblotová reakcia na HIV.

Pacienti s neurčitými výsledkami nemôžu darovať krv a biologické materiály.

Lineárna metóda

Princíp imunoblotovania zahŕňa:

1. Použitie natívnej vírusovej substancie vo formáte HIV alebo antigénov vo formáte Western Blot.
2. Kombinácia HIV proteínov s jednotlivými protilátkami zistenými v krvnom sére.
3. Inkubačný proces, ktorý nastáva po pridaní značených protilátok proti ľudskému Ig.
4. Výklad farebných pruhov.

Analýza umožňuje lekárovi včas interpretovať výsledky štúdie. Pozitívny blot sa dešifruje ako 2ENV+/- GAG+/POL, neurčitý - 1 ENV+/- GAG+/POL. Negatívny výsledok znamená žiadne pruhy.

Na uskutočnenie analýzy sa používajú rekombinantné a lyzátové imunobloty. Štúdia je špecifická a predstavuje 99,5 %.

Pacienti sa pýtajú, či možno výsledok testu interpretovať ako falošný. Získané údaje môžu byť generované ako výsledok stimulácie obranyschopnosti organizmu (tehotenstvo, hemodialýza). Ak je podozrenie na akútny retrovírusový syndróm a odporúča sa kontakt s pacientom s infekciou HIV, pacientovi sa odporúča darovať sérum na PCR reakciu. Opakované sérologické vyšetrenie sa potvrdí meraním vírusovej záťaže v predloženej vzorke biologického materiálu.

Diagnóza HIV u novorodencov

Test na AIDS u malého dieťaťa sa vykonáva, ak bol nadviazaný kontakt s matkou infikovanou HIV. Sérologické reakcie môžu byť pozitívne 1,5 roka. Protilátky v krvnom sére novorodenca sa detegujú pomocou ELISA, RIF a imunoblotovacích reakcií.

Počas 9 mesiacov života dieťaťa sa objaví pozitívny výsledok v dôsledku prítomnosti materských protilátok v krvnom sére. Antigén p24 má špecifickosť približne 65 %. V niektorých prípadoch nie je možné zistiť protilátky u chorého dieťaťa, ak má diagnostikovanú vrodenú nízku hladinu globulínov v krvi. Zistený negatívny výsledok imunoblotu nezaručuje absenciu infekcie.

Testovanie sa vykonáva v niekoľkých fázach:

• 1-2 dni po narodení;
• po 1-2 mesiacoch;
• vo veku šiestich mesiacov.

Ďalšia štúdia protilátok sa uskutočňuje, kým sa nezískajú 2 negatívne výsledky imunoblotu. Diagnóza AIDS u dieťaťa narodeného žene infikovanej HIV je možná na základe 2 pozitívnych výsledkov PCR. Prenos patogénu HIV na novorodenca je vylúčený, ak žena nedojčí.

Tehotenský test

Budúcej matke je predpísaný imunitný a line blotting, ak sa pomocou ELISA získa pozitívny výsledok na HIV. Ak sa škvrna potvrdí, pacient má AIDS. V tomto prípade je od 14. týždňa tehotenstva predpísaná terapia na prevenciu infekcie dieťaťa.

Môže odborník urobiť chybu pri vykonávaní testu krvného séra počas tehotenstva, pýtajú sa pacienti svojho ošetrujúceho lekára. Je povinný dať tehotnej žene kópie testov PCR a ELISA, aby sa vylúčili pochybnosti o ich spoľahlivosti.

Problémy sa niekedy vyskytujú pri vykonávaní imunoblotovania, ale ak sú testy ELISA, blot a PCR pozitívne, diagnóza infekcie HIV sa nakoniec potvrdí. Pravdepodobnosť získania falošne pozitívneho testu počas tehotenstva je vysoká. Ak je ELISA (+) a imunoblot (-), žena je požiadaná, aby znovu odobrala krvné sérum.

Výmenný lístok tehotnej ženy uvádza výsledok štúdie. Ak je jeho hodnota kladná, žena má zakázané kŕmiť svoje dieťa po pôrode, aby sa nenakazila vírusom AIDS. Konečné závery sa robia na základe laboratórnych, klinických a epidemiologických štúdií. Až po ich dešifrovaní je pacientovi diagnostikovaná infekcia HIV.

V kontakte s

Čo je imunoblot? Toto je bežná metóda laboratórnej diagnostiky ľudských vírusových infekcií. Považuje sa za jeden z najpresnejších a najspoľahlivejších spôsobov na zistenie prítomnosti HIV. Vo svojej spoľahlivosti predčí aj výsledky imunoblotu sú považované za nevyvrátiteľné a konečné.

všeobecné informácie

Imunoblot - čo to je? Aby bolo možné u človeka rozpoznať infekciu HIV, je potrebné podstúpiť laboratórny test krvného séra na prítomnosť protilátok. Technika imunoblotovania sa tiež nazýva Western blot. Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako doplnková expertná metóda. Je potrebné potvrdiť ELISA - laboratórny test, ktorý umožňuje určiť prítomnosť HIV protilátok v krvi. Pozitívny test ELISA sa dvakrát kontroluje imunoblotovaním. Považuje sa za najcitlivejšie, komplexné a drahé.

Účel

Čo je imunoblot? Ide o laboratórnu metódu testovania krvného séra na prítomnosť protilátok proti vírusu. Počas štúdie špecialista najprv oddelí vírusové proteíny v géli a prenesie ich na nitrocelulózovú membránu. Postup imunoblotovania je určený na detekciu HIV v rôznych štádiách. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z jeho zložiek podrobí elektroforéze a antigény obsiahnuté v jeho zložení sa oddelia podľa molekulovej hmotnosti.

Rozmnožuje sa v živej bunke a vkladá do nej svoju genetickú informáciu. V tomto štádiu sa človek stáva nosičom vírusu HIV, ak bol infikovaný. Špecifikom choroby je, že sa nemusí prejaviť dlho. Vírus ničí lymfocyty, takže imunita človeka klesá a telo nie je schopné odolávať infekciám. Ak sa HIV lieči správne a včas, pacient sa dožije vysokého veku. Nedostatok terapie nevyhnutne vedie k smrti. Od okamihu infekcie, ale bez liečby, maximálna životnosť nie je dlhšia ako desať rokov.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV antigénom prvého a druhého typu. Ak je človek infikovaný, do dvoch týždňov sa objavia protilátky, ktoré sa dajú zistiť oveľa neskôr. Zvláštnosťou HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, ochorenie sa nemusí prejaviť skôr ako dva a viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne určuje prítomnosť ochorenia, preto je potrebné potvrdenie výsledkov pomocou imunoblotingu a PCR, ak enzýmový imunotest ukazuje pozitívny výsledok.

Indikácie na použitie

Čo je „imunoblot“ už bolo zistené, ale komu je táto štúdia predpísaná? Dôvodom na testovanie pomocou imunoblotingu je pozitívny výsledok testu ELISA. U pacientov, ktorí podstúpia operáciu, je potrebné podstúpiť enzýmový imunotest. Okrem toho by sa mali testovať ženy plánujúce tehotenstvo, ako aj každý, kto je promiskuitný. Imunoblotting sa predpisuje pacientom s HIV, ak sú výsledky testu ELISA pochybné. Nasledujúce alarmujúce príznaky môžu byť dôvodom na konzultáciu s lekárom:

• náhla strata hmotnosti;
• slabosť, strata výkonu;
• črevná nevoľnosť (hnačka), ktorá trvá tri týždne;
• dehydratácia tela;
• horúčka;
• zväčšené lymfatické uzliny na tele;
• rozvoj kandidózy, tuberkulózy, pneumónie, toxoplazmózy, exacerbácie herpesu.

Pacient sa pred darovaním venóznej krvi nemusí pripravovať. 8-10 hodín pred testom by ste nemali jesť jedlo. Deň pred darovaním krvi sa neodporúča piť alkoholické alebo kávové nápoje, venovať sa namáhavému fyzickému cvičeniu alebo prežívať úzkosť.

Kde urobiť analýzu?

Kde sa môžem dať otestovať na HIV? ELISA a imunoblotové štúdie sa vykonávajú na mestských súkromných klinikách, výsledky sa poskytujú do 24 hodín. Je možná aj urgentná diagnóza. Vo verejných zdravotníckych zariadeniach sa testy ELISA a imunoblotting vykonávajú bezplatne v súlade s právnymi predpismi Ruskej federácie. Tehotné ženy, ako aj pacienti, ktorí podstupujú hospitalizáciu alebo operáciu, sú povinní podstúpiť vyšetrenie na infekčné ochorenia.

Ako prebieha výskum?

Ako sa vykonáva analýza ELISA? Pozitívny/negatívny imunoblot potvrdzuje alebo vyvracia výsledky enzýmového imunotestu. Postup výskumu je pomerne jednoduchý. Špecialista odoberie venóznu krv, čo netrvá dlhšie ako päť minút. Po odbere vzoriek treba miesto vpichu dezinfikovať a prelepiť leukoplastom. Odber vzoriek sa vykonáva nalačno, takže po zákroku nezaškodí zjesť tabuľku tmavej čokolády alebo vypiť sladký horúci nápoj.

Aby ste dostali odporúčanie na bezplatný test vo verejnom zdravotníckom zariadení, musíte navštíviť praktického lekára. Vo všeobecnosti sa imunoblotting nelíši od iných krvných testov, pokiaľ ide o metódu odberu vzoriek. Metodológia výskumu je jednoduchá. Ak je v krvi človeka vírus, telo začne produkovať protilátky na jeho zničenie. Každý vírus má svoju vlastnú sadu antigénnych proteínov. Detekcia týchto protilátok je základom imunoblotovacej techniky.

cena

Koľko stojí analýza? Imunoblot na HIV nie je lacný test. V priemere stojí skríningové vyšetrenie pomocou metód enzýmovej imunoanalýzy od 500 do 900 rubľov. Imunoblotting je overovacia štúdia, ktorej náklady sú od troch do piatich tisíc rubľov. Zložitejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad budete musieť zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Interpretácia výsledku

Najbežnejšími metódami diagnostiky infekcie HIV sú enzýmové imunosorbentné testy a imunobloty. Používajú sa na stanovenie protilátok proti vírusu imunodeficiencie v krvnom sére. Prítomnosť infekcie je zvyčajne potvrdená dvoma testami: skríningovým a potvrdzujúcim. Interpretáciu výsledkov štúdie by mal vykonať lekár, ktorý tiež stanoví diagnózu a predpíše liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, znamená to, že v ľudskom tele je prítomný vírus.

Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom na nezávislú liečbu, pretože každý pacient môže mať iný obraz choroby. Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a verifikáciu. Ak pacient nemá vírus, výsledok je označený ako „negatívny“. Ak sa zistí skríningom, vykoná sa dodatočná overovacia štúdia. Imunoblot je test, ktorý potvrdzuje alebo vyvracia skríning. Ak sa na testovacom prúžku v určitých oblastiach (umiestnenia proteínov) objaví stmavnutie, vykoná sa diagnóza HIV. Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonajú do troch mesiacov.

Infekcii vírusom imunodeficiencie môžete zabrániť, ak budete dodržiavať určité pravidlá: vyhýbajte sa náhodnému sexu, počas kontaktu používajte kondóm, neužívajte drogy. Ak sa ochorenie zistí u tehotnej ženy, je dôležité prísne dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára a nezabúdať na vyšetrenia na prítomnosť vírusu.

Imunoblotting -(z anglického „blot“ - spot) - metóda identifikácie antigénov (alebo protilátok) pomocou známych sér (alebo antigénov). Ide o kombináciu gélovej elektroforézy a ELISA. Najprv sa bakteriálne bunky alebo virióny zničia pomocou ultrazvuku a potom sa všetky antigény vírusu alebo bakteriálnych buniek oddelia elektroforézou a na špeciálnom nitrocelulózovom filme sa získa komerčné činidlo. Pri vykonávaní imunoblotingu sa skúmané sérum pacienta aplikuje na film so známymi antigénmi. Po inkubácii a premytí nenaviazaných protilátok pristúpime k ELISA - antisérum na ľudské imunoglobulíny značené enzýmom a na film sa nanesie chromogénny substrát, ktorý pri interakcii s enzýmom mení farbu. V prítomnosti komplexov antigén-protilátka-antisérum až imunoglobulín-enzým sa na nosiči objavujú farebné škvrny. Metóda imunoblotovania vám umožňuje samostatne detegovať protilátky proti rôznym antigénom patogénov (napríklad pri infekcii HIV imunoblotting deteguje protilátky proti gp120, gp24 a iným vírusovým antigénom).

Rádioimunoanalýza (RIA)

Spôsob je založený na reakcii antigén-protilátka s použitím rádionuklidom značeného antigénu alebo protilátky. Ako značky sa používajú 125I, 14C, 3H, 51Cr a ďalšie rádionuklidy. Vzniknuté imunitné komplexy sa izolujú zo systému a ich rádioaktivita sa stanoví na počítadlách (β-žiarenie). Intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky.

Verzia RIA na pevnej fáze využívajúca značené protilátky alebo antigény sorbované v jamkách polystyrénových panelov je rozšírená.

RIA sa používa na detekciu antigénov mikróbov, vírusov, rôznych hormónov, enzýmov, liečiv, imunoglobulínov, ako aj iných látok obsiahnutých v testovanom materiáli v malých koncentráciách 10-12-10-15 g/l.

Kontrolné otázky

Reakcia imunitnej bakteriolýzy: o aký druh reakcie ide; čo je to antigén, čo je to protilátka, mechanizmus reakcie, spôsoby výroby, praktická aplikácia. Imunitná hemolytická reakcia: potrebné zložky, postup; ovládanie, praktická aplikácia. Lokálna hemolytická reakcia v géli (Jerneova reakcia): princíp reakcie, spôsob formulácie, praktická aplikácia. Reakcia fixácie komplementu: princíp reakcie; čo sa tvorí, keď imunitné sérum interaguje so špecifickým antigénom; čo sa stane s doplnkom, ak je prítomný počas tejto interakcie? Aký je osud komplementu, ak medzi antigénom a protilátkami neexistuje špecifická afinita? Akú reakciu možno použiť na určenie toho, čo sa stalo s doplnkom; prečo sa používa táto konkrétna reakcia; Aký je viditeľný pozitívny výsledok RSC? prečo? Aká vlastnosť komplementu sa využíva v prvej fáze RSC? V druhej fáze? Ak je konečným výsledkom RSC hemolýza, znamená to pozitívny alebo negatívny výsledok? Vysvetlite výsledky: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Vymenujte zložky prvého systému RSK a zložky druhého systému RSK. Prečo je potrebné testovacie sérum deaktivovať? Ako sa titruje komplement? Hemolytické sérum: čo obsahuje, ako sa získava, aký je titer a ako sa určuje? Aké zvieratá sa používajú na získanie komponentov RSC? Metodika nastavenia RSC v chlade. Pri stagingu, ktorá z nasledujúcich reakcií vyžaduje účasť komplementu: precipitácia, flokulácia, aglutinácia, detekcia nekompletných protilátok, imunitná bakteriolýza, imunitná hemolýza, Jerne, RSC? Imunofluorescenčná reakcia (RIF) - označujú sled udalostí v priamej Koonsovej reakcii; potrebné prísady. Čo je to antigén, čo je to protilátka, čím sa označujú protilátky, ako sa zohľadňuje výsledok reakcie, ako vyzerá pozitívny výsledok? Praktická aplikácia - čo možno pomocou tejto reakcie určiť? Nepriama imunofluorescenčná reakcia - uveďte sled udalostí počas tejto reakcie, potrebné zložky, aký je antigén, aké imunitné séra sa používajú; praktické využitie; výhoda nepriameho RIF v porovnaní s priamou reakciou. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – princíp reakcie; potrebné zložky; uveďte postupnosť udalostí pri vykonávaní reakcie na detekciu antigénu v testovanom materiáli; potrebné zložky; Čo sa stane, keď je výsledok pozitívny, ako to vyzerá? Uveďte postupnosť činností pri vykonávaní testu ELISA na detekciu protilátok v testovacom sére; potrebné zložky; čo sa stane, ak bude výsledok pozitívny? Imunoblotting – princíp reakcie; hlavné etapy; potrebné zložky; ako sa berie do úvahy výsledok; výhody reakcie. Rádioimunoanalýza (RIA) - aké sú hlavné štádiá reakcie; Čím sú označené protilátky alebo antigény, ako sa berie do úvahy výsledok? Imunoelektrónová mikroskopia - princíp metódy; hlavné etapy; potrebné zložky; čím sú protilátky označené? ako sa berie do úvahy výsledok reakcie. Imobilizačné reakcie – princíp metódy, technika nastavenia, komponenty, záznam výsledkov.

Úlohy, ktoré treba splniť počas samoštúdia.

Vyplňte tabuľku „Imunitné reakcie“ v súvislosti s reakciami diskutovanými v rámci tejto témy.

Imunitné reakcie

Práca študentov počas praktickej hodiny

Okamžite začnite pracovať s nastavením fázy 1 RSK, ale zapíšte si to do poznámkového bloku neskôr (pozri nižšie).

1. Imunitná hemolytická reakcia. Pozrite si demonštračnú reakciu imunitnej hemolýzy, načrtnite ju vo forme diagramu, vysvetlite výsledok v experimentálnej a kontrolnej skúmavke.

2. Reakcia fixácie komplementu

a) analyzovať RSK podľa tabuľky;

b) nakreslite do notebooku schému nastavenia RSC vo forme tabuľky;

c) obliecť si druhú fázu RSK (prvá fáza sa nasadí na začiatku vyučovacej hodiny);

d) analyzovať diagnostické prípravky potrebné pre RSC;

e) vziať do úvahy výsledok. Formulujte záver o prítomnosti špecifických protilátok v testovacom sére.

3. Imunofluorescenčná reakcia. Preštudujte si tabuľku, vytvorte si schému reakcie do zošita; pozrite sa na diagnostické séra; určiť, čo sérum obsahuje, ako sa pripravuje, na akú reakciu (priama alebo nepriama RIF) sa používa. Pozrite sa na demonštračný výsledok RIF vo fluorescenčnom mikroskope.

4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Vo svojom notebooku si vytvorte schému na nastavenie reakcie v dvoch verziách: na detekciu antigénu v skúmanom materiáli a na detekciu protilátok v sére. Prezrite si súpravu zložiek HIV a hepatitídy B Identifikujte, čo každá zložka obsahuje a na čo sa používa.

5. Imunoblotting. Urobte si schému reakcie do svojho zošita; pozrite si ukážku - výsledok reakcie.

6. Rádioimunoanalýza (RIA). Vytvorte si schému reakcie do zošita.

7. Imunitná elektrónová mikroskopia (IEM). Pozrite si ukážku - výsledok reakcie, vytvorte si schému reakcie do zošita, označte šípkami antigén (vírus) a označené protilátky.

Imunoblotting je vysoko citlivá metóda na detekciu proteínov, založená na kombinácii elektroforézy a ELISA alebo RIA. Imunoblotting sa používa ako diagnostická metóda pri infekcii HIV atď.

Vo všeobecnom zmysle sa imunoblotovanie týka analýzy zmesi proteínov prenesených na pevný membránový nosič, ku ktorému sú viazané kovalentnými väzbami, po ktorej nasleduje imunodetekcia.

Môžete analyzovať zmes proteínov priamo nanesených na substrát - dot blot analýza - alebo po jej predbežnej frakcionácii elektrofokusáciou, diskovou elektroforézou alebo dvojrozmernou elektroforézou - Western blot analýzou.

Patogénne antigény sa separujú pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, potom sa prenesú z gélu na aktivovaný papier alebo nitrocelulózovú membránu a vyvinú sa pomocou ELISA.

Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov. Na tieto prúžky sa aplikuje pacientovo sérum. . Potom sa po inkubácii pacient umyje od nenaviazaných protilátok a aplikuje sa sérum proti ľudským imunoglobulínom značené enzýmom . Komplex vytvorený na prúžku (antigén + protilátka pacienta + protilátka proti ľudskému Ig) sa deteguje pridaním chromogénneho substrátu, ktorý pôsobením enzýmu mení farbu.

Táto metodológia sa tiež používa na selekciu klonov baktérií, fágov alebo vírusov, ktoré exprimujú cieľové klonované génové produkty.

Prenos proteínov na membránu sa uskutočňuje buď pasívne alebo pomocou elektrotransferového zariadenia. Účinnosť prenosu proteínov na membránu je ovplyvnená mnohými faktormi, ako je molekulová hmotnosť proteínov, pórovitosť gélu, čas prenosu a zloženie použitého tlmivého roztoku (trans-pufru).

V závislosti od cieľov a podmienok experimentu sa vyberajú podmienky prenosu, ktoré poskytujú najlepšie výsledky. Ako substráty sa bežne používajú nitrocelulózové, polyvinylidéndifluorid (PVDF) alebo kladne nabité nylonové membrány. Nitrocelulóza dokáže viazať až 80 - 100 μg bielkovín na 1 cm2.

Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou (s molekulovou hmotnosťou menšou ako 20 kDa) sa môžu stratiť v dôsledku premývania. To umožňuje predbežne študovať polymorfizmus určitých genetických lokusov na základe dĺžok zodpovedajúcich reštrikčných fragmentov DNA.

Pomocou Southern hybridizácie navyše ľahko zistíte, či cieľový gén má vo svojej vnútornej časti miesto hydrolýzy určitým reštrikčným enzýmom, čo umožňuje zvoliť optimálnu stratégiu klonovania študovanej oblasti genómu.

Pomocou podobnej schémy môžu byť molekuly RNA prenesené z agarózového gélu na nitrocelulózový filter. Táto metóda sa nazývala Northern blotting, na rozdiel od Southern blotting, pretože názov Southern znamená v angličtine „južný“.

Prenos proteínov na filtre z gélu sa preto nazýval Western blotting. Veľké proteíny (>100 kDa) denaturované v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) sa môžu zle preniesť na membránu, ak je v trans pufri prítomný etanol. Alkohol výrazne zlepšuje prenos bielkovín z SDS-polyakrylamidového gélu, ale zužuje póry v géli, čo vedie k zadržiavaniu veľkých bielkovín.

PVDF membrána je optimalizovaná na imunodetekciu a je schopná zadržať až 160 μg/cm2 špecificky viazaných proteínov s veľmi nízkou úrovňou nešpecifickej väzby.

Imunoblotting

Dôležitou vlastnosťou tejto membrány je možnosť jej opakovaného použitia. Nylonové membrány Zeta-Probe účinne viažu proteíny SDS v neprítomnosti alkoholu a táto väzba je odolná voči následným úpravám. Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou sú tiež účinne zadržané. S vysokou väzbovou kapacitou približne 480 μg proteínu na cm2 umožňujú membrány Zeta-Probe detekciu stopových množstiev proteínu v testovacích zmesiach.

Akonáhle je antigén imobilizovaný na membráne, zostávajúce väzbové miesta sú blokované roztokmi želatíny, hovädzieho sérového albumínu alebo odstredeného mlieka.

Potom sa membrána inkubuje v roztoku polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti študovanému antigénu. Po umytí nenaviazaných protilátok sa membrána inkubuje v roztoku sekundárnych protilátok, ktoré sú konjugátom enzýmov alkalická fosfatáza (AP) alebo chrenová peroxidáza (HRP) s protidruhovými protilátkami (kozie protilátky proti králičím, myším alebo ľudským imunoglobulínom ) alebo proteíny A (proteín Staphylococcus aureus) alebo G (proteín Streptococcus sp.), ktoré majú vysokú afinitu k Fc oblasti imunoglobulínov.

Detekcia vytvorených imunitných komplexov sa uskutočňuje chemicky alebo chemiluminiscenčne. Substráty pre chemickú reakciu pri použití konjugátov alkalickej fosfatázy sú 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP) alebo modré tetrazólium (NBT) a pri použití konjugátov chrenovej peroxidázy - 4-chlór-1-naftol a peroxid vodíka .

V dôsledku enzymatických reakcií sa na membráne v mieste lokalizácie komplexu antigén-protilátka vytvorí farebný pás alebo škvrna.

Citlivosť tejto metódy je 100 pg proteínu pri použití AP konjugátov a 100-500 pg pri použití HRP konjugátov. Chemiluminiscenčná detekcia imunitných komplexov umožňuje detekciu menej ako 5 pg antigénu. Princíp tejto metódy spočíva v tom, že pri reakcii HRP s peroxidom vodíka a cyklickým diacylhydrazínluminolom sa vyžaruje svetlo s vlnovou dĺžkou 428 nm, ktoré je možné zaznamenať na fotocitlivý film.

Reakcia imunoblotovania (IB) bola vyvinutá na základe ELISA. Je to najšpecifickejšia a najcitlivejšia metóda imunochemickej analýzy. Imunoblotting (z anglického blot - blot, stain) kombinuje ELISA s elektroforézou. Používa sa na detekciu nie komplexných protilátok proti HIV, ale protilátok proti jeho jednotlivým štruktúrnym proteínom (proteíny p24, glykoproteíny gp120, gp 41 a pod.). Vzťahuje sa na odborné (potvrdzujúce) reakcie na diagnostiku infekcie HIV.

Reakcia sa uskutočňuje v niekoľkých fázach:

Vírus sa deštruuje na zložky - antigény (p24, gp120, gp 41 atď.), ktoré sa podrobia elektroforéze v polyakrylamidovom géli, to znamená separácii antigénov do frakcií podľa molekulovej hmotnosti.

2. Gél sa prekryje nitrocelulózovou membránou a pomocou elektroforézy sa naň prenesú antigénové frakcie. Nitrocelulóza sa správa ako pijavý papier. Membrána je narezaná na pásy. Spoločnosti vyrábajú takéto prúžky s „škvrnami“ antigénov.

Imunoblotting - dodatočná nepriama metóda

Prúžky potiahnuté antigénmi HIV sa ponoria do séra subjektu a potom sa premyjú, aby sa odstránil nenaviazaný materiál.

4. Prúžky sa inkubujú s antiglobulínovým sérom označeným peroxidázou a premyjú sa.

Pridá sa substrát a zaznamená sa počet farebných frakcií (škvŕn), ktoré zodpovedajú lokalizačnej zóne komplexu AG-AT.

Prítomnosť prúžkov v určitých oblastiach prúžku potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným antigénom HIV v testovanom sére. Výsledok imunoblottingu sa považuje za pozitívny, ak sú na membráne viditeľné pásy zodpovedajúce ktorýmkoľvek dvom z troch HIV antigénov - p24, gp41 a gp 120 (obr. 37).

VÝKRESY

ZOZNAM POUŽITÝCH REFERENCIÍ

Hlavná literatúra

Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia: učebnica pre študentov medicíny. univerzity 2. vyd., rev. a dodatočné — 702 s. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiológia, virológia a imunológia: príručka pre laboratórne hodiny: učebnica/(V.B. Sboychakov a ďalší); upravil V.B. Sboychaková, M.M. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: ill.

3. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia [Elektronický zdroj]: učebnica pre med.

univerzity - 760 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petrohrad: Spetslit, 2010.

4. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch / Zv. 1. - 448 s. — Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: učebnica: v 2 zväzkoch T. 2. - 480 s. Režim prístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

doplnková literatúra

1. Imunodiagnostické reakcie: učebnica / komp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z Gabidullin, M.M Alsynbaev - Ufa: Vydavateľstvo Štátnej rozpočtovej vzdelávacej inštitúcie vyššieho odborného vzdelávania BSMU Ministerstva zdravotníctva Ruska, 2016. - 86 s.

2. Vlastnosti niektorých vlastností, ktoré určujú patogénny potenciál kokultivovaných variácií baktérií Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: vedecká publikácia / Yu Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Úvod » Immunoblot – čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Imunoblot - čo to je? Imunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Čo je imunoblot? Toto je bežná metóda laboratórnej diagnostiky ľudských vírusových infekcií. Je to jeden z najpresnejších a najspoľahlivejších spôsobov, ako zistiť prítomnosť HIV.

Kvôli spoľahlivosti je dokonca väčšia ako enzýmová imunoanalýza (elisa). Výsledky imunoblotu sa považujú za presvedčivé a presvedčivé

Imunoblot - čo to je? Aby ste rozpoznali osobu s HIV, musíte podstúpiť laboratórny test na testovanie krvného séra na prítomnosť protilátok.

Sekcie Western blot sa tiež nazývajú Western bloty. Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako doplnková expertná metóda. Je to potrebné na potvrdenie pomocou ELISA - laboratórneho testu, ktorý umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV v krvi. Imunoblot znova skontrolujte pozitívny test ELISA.

Považuje sa za najcitlivejšie, komplexné a drahé.

Cieľ

Čo je imunoblot? Táto metóda laboratórneho testovania krvného séra na prítomnosť protilátok proti vírusu.

Počas špeciálnych štúdií sa celkové vírusové proteíny našli v géli a na nitrocelulózových membránach.

Imunoblotting (detekcia protilátok v sére pacienta proti určitým antigénom patogénov)

Postup sekcie Western blot je určený na určenie infekcie HIV v rôznych štádiách. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z jeho zložiek podrobí elektroforéze a antigény v ňom obsiahnuté sa rozdelia podľa molekulovej hmotnosti.

Vírus ľudskej imunodeficiencie sa rozmnožuje v živých bunkách uložených v jeho genetickej informácii. V tomto štádiu sa človek stáva nosičom vírusu HIV, ak ste boli infikovaní.

Špecifikom tejto choroby je, že sa dlho neprejavuje. Vírus ničí lymfocyty, čím sa znižuje imunita človeka a telo sa stáva neschopným bojovať s infekciami.

Ak sa HIV lieči správne a rýchlo, pacient sa dožije vysokého veku. Nedostatok liečby nevyhnutne vedie k smrti. Od okamihu infekcie, ale bez liečby, maximálne obdobie nie je dlhšie ako desať rokov.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožňuje určiť prítomnosť protilátok proti HIV antigénom prvého a druhého typu.

Ak je osoba infikovaná, po dvoch týždňoch môžu byť protilátky detegované oveľa neskôr. Zvláštnosťou HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, ochorenie sa nemusí prejaviť skôr ako dva a viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne indikuje prítomnosť ochorenia a vyžaduje potvrdenie výsledkov z PCR a Western blot rezov, ak enzýmový imunotest ukázal pozitívny výsledok.

Indikácie pre

Aký druh „imunoblotu“ už bol zistený, ale ktorý sa v štúdii zavádza?

Dôvodom testovania na vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV) bude pozitívny výsledok testu ELISA. U pacientov, ktorí sa chystajú podstúpiť operáciu, je potrebné prejsť enzýmovou imunoanalýzou. Okrem toho by ste mali urobiť analýzu žien plánujúcich tehotenstvo, ako aj tých, ktoré sú promiskuitné. Rezy Western blot sa predpisujú pacientom s infekciou HIV, ak sú výsledky testu elisa nejednoznačné.

Nasledujúce alarmujúce príznaky môžu byť dôvodom pre kontakt s lekárom: rýchla strata hmotnosti, strata funkcie čriev (hnačka), zväčšené lymfatické uzliny v tele; , zápal pľúc, toxoplazmóza, exacerbácia herpesu.

Pacient sa pred darovaním venóznej krvi nemusí pripravovať.

8-10 hodín pred testom nejedzte. Deň pred darovaním krvi sa neodporúča piť alkohol alebo kávové nápoje, robiť ťažké fyzické cvičenia alebo prežívať úzkosť.

Kde urobiť analýzu?

Kde sa môžem dať otestovať na HIV?

ELISA, imunoblotová analýza, vykonaná na mestských súkromných klinikách, poskytuje výsledky do jedného dňa. Je možná aj urgentná diagnóza. Vo verejných inštitúciách sú lekárske testy Elisa a Western blot v súlade s legislatívou Ruskej federácie bezplatné.

Povinný skríning infekčných chorôb u tehotných žien a pacientov vyžadujúcich hospitalizáciu alebo chirurgický zákrok Ako sa tento test vykonáva?

Ako vykonať ELISA? Imunoblot pozitívny/negatívny potvrdzuje alebo vyvracia výsledky testu elisa. Postup je celkom jednoduchý. Špecialista odoberie venóznu krv, čo trvá menej ako päť minút.

Po odbere vzoriek treba miesto vpichu dezinfikovať a prekryť obväzom. Odber vzoriek sa vykonáva nalačno, takže po zákroku nezaškodí zjesť tabuľku horkej čokolády alebo sladký horúci nápoj.

Ak chcete získať odporúčanie na bezplatný test vo verejnej zdravotníckej inštitúcii, musíte navštíviť terapeuta.

Vo všeobecnosti sa imunoblot nelíši od iných krvných testov odberom. Metodológia výskumu je jednoduchá. Ak je vírus prítomný v krvi človeka, telo začne produkovať protilátky na jeho zničenie. Pre každý vírus existuje veľa proteínových antigénov. Detekcia týchto protilátok je základom metódy Western blot section. cena

Ako dlho trvá analýza? HIV imunoblot je jedným z najlacnejších testov.

V priemere sa skríningové metódy imunotestov pohybujú od 500 do 900 rubľov. Sekcie Western blot sú štúdiom kontrol, ktorých náklady sa pohybujú od troch do piatich tisíc rubľov. Zložitejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad za analýzu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) budete musieť zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Interpretácia výsledkov

Najbežnejšími metódami diagnostiky infekcie HIV sú enzýmová imunoanalýza a imunoblot.

Používajú sa na stanovenie protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie v sére. Infekcia je zvyčajne potvrdená dvoma testami: skríningovým a potvrdzujúcim. Výsledky musí interpretovať lekár, ktorý diagnostikuje a predpíše liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, znamená to, že v ľudskom tele je vírus.

Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom na nezávislú liečbu, pretože každý pacient môže mať svoj vlastný obraz choroby.

Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a certifikáciu. Ak sa vírus u pacienta nezistí, výsledok je „negatívny“. Keď sa tento certifikát zistí, vykonajú sa dodatočné skríningové štúdie. Imunoblotová analýza, ktorá potvrdí alebo vyvráti skríning. Ak sa testovacie prúžky objavia v určitých tmavých oblastiach (lokalizácia proteínov), vykoná sa diagnóza HIV.

Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonajú do troch mesiacov.

Aby ste zabránili infekcii vírusom ľudskej imunodeficiencie, je to možné, ak budete dodržiavať určité pravidlá: vyhýbajte sa náhodnému sexuálnemu kontaktu, počas kontaktu používajte kondómy, nepoužívajte drogy.

Ak sa ochorenie zistí u tehotnej ženy, je dôležité dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára a nezabudnúť na test na prítomnosť vírusu.

Čo je Western blotting?

Identifikácia proteínov v komplexných zmesiach alebo extraktoch rôznych tkanív je jedným z často sa vyskytujúcich problémov. Pomocou nástroja, akým sú špecifické protilátky, je možné určiť skúmaný proteín s minimálnymi časovými a finančnými nákladmi.

Pri metóde Western blotting sa v prvom stupni zmes proteínov oddelí elektroforézou v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), potom sa prenesie na nitrocelulózovú membránu elektroblotovaním.

Podstatou tejto metódy je, že po elektroforéze sa gél umiestni na nitrocelulózovú membránu medzi vrstvy filtračného papiera. Takto zostavený „sendvič“ sa umiestni do elektrického poľa, takže komplexy proteín-SDS sa pohybujú cez gélovú platňu a sú imobilizované (v dôsledku nešpecifickej sorpcie) na povrchu nitrocelulózovej membrány.

Väzba komplexu proteín-SDS na nitrocelulózovú membránu zahŕňa najmä sily elektrického charakteru, pričom táto interakcia je viacbodová a vedie k „šíreniu“ proteínov na povrchu membrány. Po elektrotransfere tak získame repliku gélu na nitrocelulóze s proteínmi umiestnenými rovnako ako v polyakrylamidovom géli.

Po SDS elektroforéze, elektrotransfere a sorpcii proteínov z gélu na nitrocelulózovú membránu sa terciárna konformácia proteínu výrazne zmení, ak je vo všeobecnosti správne hovoriť o existencii terciárnej štruktúry proteínu po takomto tvrdom zaobchádzaní. Preto sa na imunochemickú detekciu študovaného proteínu zvyčajne používajú iba mono- alebo polyklonálne protilátky špecifické pre lineárne oblasti molekuly proteínu.

51. Enzýmová imunoanalýza, imunoblotovanie. Mechanizmus, komponenty, aplikácia.

Protilátky špecifické pre konformačné epitopy (alebo oblasti zahŕňajúce medzipodjednotkové kontakty) nie sú všeobecne vhodné na použitie pri Western blottingu.

Po prenose proteínu sa membrána postupne inkubuje s protilátkami špecifickými pre študovaný proteín a potom so sekundárnymi protilátkami špecifickými pre Fc fragmenty primárnych protilátok, konjugované s enzýmovou (alebo inou) značkou (obr.

1A). V prípade, že primárne protilátky špecifické pre študovaný antigén sú priamo konjugované so značkou, sekundárne protilátky nie sú potrebné (obr. 1 B). Imunitné komplexy vytvorené v mieste lokalizácie skúmaného proteínu sa „prejavujú“ pomocou chromogénneho substrátu (v závislosti od typu značky).

Citlivosť a špecifickosť metódy značne závisí od toho, aké protilátky sa pri výskume používajú.

Použité protilátky musia byť špecifické pre jedinečnú aminokyselinovú sekvenciu charakteristickú len pre študovaný proteín. V opačnom prípade je možná interakcia (najmä v prípade surových proteínových extraktov) protilátok s niekoľkými proteínovými molekulami, čo následne povedie k objaveniu sa niekoľkých farebných pásov na membráne.

Identifikácia skúmaného proteínu je v tomto prípade často ťažká alebo dokonca nemožná.

Druhým dôležitým faktorom, ktorý treba mať na pamäti pri výbere protilátok, je afinita. Čím vyššia je afinita použitých protilátok, tým jasnejšie a jasnejšie sú zafarbené proteínové pásy, tým vyššia je citlivosť metódy. Pri použití vysokoafinitných protilátok možno dosiahnuť citlivosť 1 ng alebo aj vyššiu.

Na vizualizáciu výsledku interakcie medzi membránovo viazaným antigénom a protilátkami sa používajú sekundárne protilátky, konjugované s činidlami schopnými produkovať určitý signál za určitých podmienok.

Typicky sa ako také činidlo používa enzým (peroxidáza alebo fosfatáza), ktorého reakčný produkt je zafarbený a vyzráža sa na membráne vo forme nerozpustnej zrazeniny.

V tejto metóde je tiež možné použiť fluorescenčné značky.

Ryža. 1. Schéma imunochemického farbenia študovaného proteínu: A - použitie sekundárnych protilátok konjugovaných s enzýmovou značkou; B - primárna protilátka je priamo konjugovaná s enzýmovou značkou.

Protokol:

I. Príprava gélu a membrány a elektrotransfer proteínov

Po elektroforéze sa polyakrylamidový gél umiestni do kúpeľa s blotovacím pufrom (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol).

Dva listy filtračného papiera, narezané do tvaru sacej kazety a navlhčené savým pufrom, sa umiestnia na časť kazety, ktorá bude obrátená k anóde. Potom sa na filtračný papier umiestni nitrocelulózová membrána vopred navlhčená rovnakým pufrom, aby sa zabezpečilo, že medzi membránou a papierom nie sú žiadne vzduchové bubliny.

Gél by sa mal potom opatrne umiestniť na membránu a opäť venovať osobitnú pozornosť tomu, aby sa medzi gélom a membránou nenachádzali žiadne vzduchové bubliny. Formovanie sendviča je ukončené dvoma vrstvami navlhčeného filtračného papiera, ktoré sú umiestnené na povrchu gélu (obr. 2). Výsledný sendvič je upnutý v kazete a umiestnený medzi elektródy tak, aby membrána smerovala k anóde.

Ryža. 2. Schéma elektrotransferu proteínov na membránu.

II. Elektrický prenos

Elektrotransfer proteínov na nitrocelulózovú membránu sa uskutočňuje v pufri obsahujúcom 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10 % etanol počas 30-50 minút pri konštantnom napätí 100 V.

Čas elektrotransferu závisí od veľkosti prenášaných proteínov, čím väčší je proteín, tým dlhšie trvá elektrotransfer. Kvalita elektrotransferu a umiestnenie proteínových pásov sa hodnotí farbením nitrocelulózovej membrány 0,3 % roztokom Ponceau S v 1 % kyseline octovej. Pred imunochemickým farbením je potrebné membránu niekoľkokrát premyť slabo alkalickým vodným roztokom Tris, aby sa odstránilo farbivo naviazané na proteíny.

III. Imunochemické farbenie proteínov imobilizovaných na nitrocelulózovej membráne

Na blokovanie miest nešpecifickej väzby protilátky sa membrána inkubuje za stáleho miešania pri teplote miestnosti počas 30 minút v PBST (na lepšie blokovanie sa môže použiť roztok PBST obsahujúci 10 % sušeného odstredeného mlieka).

Po zablokovaní sa membrána inkubuje hodinu pri teplote miestnosti za stáleho miešania v PBST obsahujúcom 1-10 ug/ml špecifických protilátok.

Optimálna koncentrácia protilátok sa vyberie empiricky a závisí od afinity interakcie protilátok s antigénom.

Na konci inkubácie membránu 5-krát premyte PBST a preneste ju do roztoku sekundárnych protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou. Riedenie konjugátu je zvyčajne uvedené výrobcom na obale alebo je empiricky vybrané výskumníkom. Membránu inkubujte v roztoku sekundárnej protilátky 1 hodinu za stáleho miešania.

Po dôkladnom premytí (zmena pufor aspoň 5-6 krát) sa membrána PBST prenesie do roztoku chromogénneho substrátu obsahujúceho 3 mg diaminobenzidínu (DAB) a 10 μl 30% peroxidu vodíka v 10 ml 0,1 M Tris-HCl. pH 7,6.

Inkubácia sa uskutočňuje za miešania počas 5 až 10 minút. Po dokončení inkubácie so substrátom by sa membrána mala premyť PBST, vysušiť saním filtračným papierom a okamžite by sa mala vytvoriť elektronická kópia farebným skenovaním. Ak membrána úplne vyschne, maľované proteínové pruhy vyblednú a obraz sa ukáže ako menej jasný a kontrastný.

Poznámka: DAB je toxický a potenciálny karcinogén. Pracujte len s gumenými rukavicami!