Biosyntéza somatotropínu a iných ľudských hormónov. Získanie interferónov. Vlastnosti získania a použitia interferónov Príklad získania rekombinantného interferónu

№ 7 Interferóny, príroda. Spôsoby prípravy a použitia.
Interferón označuje dôležité ochranné proteíny imunitného systému. Objavený počas štúdia vírusovej interferencie, t.j. javu, keď sa zvieratá alebo bunkové kultúry infikované jedným vírusom stali necitlivými na infekciu iným vírusom. Ukázalo sa, že rušenie je spôsobené výsledným proteínom, ktorý má ochranné antivírusové vlastnosti. Tento proteín sa nazýval interferón.
Interferón je rodina glykoproteínových proteínov, ktoré sú syntetizované bunkami imunitného systému a spojivového tkaniva. V závislosti od toho, ktoré bunky syntetizujú interferón, existujú tri typy: α, β a γ-interferóny.
Alfa interferónprodukovaný leukocytmi a nazýva sa leukocyt; beta interferón nazývaný fibroblastický, pretože ho syntetizujú fibroblasty – bunky spojivového tkaniva, a gama interferón- imunitný, keďže ho produkujú aktivované T-lymfocyty, makrofágy, prirodzené zabíjačské bunky, t.j. imunitné bunky.
Interferón sa v tele neustále syntetizuje a jeho koncentrácia v krvi sa udržiava na približne 2 IU/ml (1 medzinárodná jednotka - M.E. - je to množstvo interferónu, ktoré chráni bunkovú kultúru pred 1 CPD 50 vírusu). Produkcia interferónu sa prudko zvyšuje počas infekcie vírusmi, ako aj pri vystavení induktorom interferónu, ako je RNA, DNA a komplexné polyméry. Takéto induktory interferónu sa nazývajú interferonogény.
Okrem antivírusového účinku má interferón protinádorovú ochranu, pretože odďaľuje proliferáciu (reprodukciu) nádorových buniek, ako aj imunomodulačnú aktivitu, stimuluje fagocytózu, prirodzené zabíjačské bunky, reguluje tvorbu protilátok B bunkami, aktivuje expresiu hl. histokompatibilný komplex.
Mechanizmus akcieinterferón je komplexný. Interferón priamo neovplyvňuje vírus mimo bunky, ale viaže sa na špeciálne bunkové receptory a ovplyvňuje proces rozmnožovania vírusu vo vnútri bunky v štádiu syntézy proteínov.
Použitie interferónu. Pôsobenie interferónu je tým účinnejšie, čím skôr sa začne syntetizovať alebo vstúpiť do tela zvonku. Preto sa používa na profylaktické účely pri mnohých vírusových infekciách, ako je chrípka, ako aj na terapeutické účely pri chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D ), herpes, roztrúsená skleróza atď. Interferón dáva pozitívne výsledky pri liečbe zhubných nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.
Interferóny sú druhovo špecifické, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto druhová špecifickosť je však relatívna.
Príjem interferónu. Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom, v dôsledku čoho infikované bunky syntetizujú interferón, ktorý sa potom izoluje a z neho sa skonštruujú interferónové prípravky; b) geneticky upravené - pestovaním rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón za produkčných podmienok. Typicky sa používajú rekombinantné kmene pseudomonas a Escherichia coli s interferónovými génmi zabudovanými do ich DNA. Interferón získaný genetickým inžinierstvom sa nazýva rekombinantný. V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov „Reaferon“. Výroba tohto lieku je v mnohých ohľadoch účinnejšia a lacnejšia ako liek na báze leukocytov.
Rekombinantný interferón našiel široké uplatnenie v medicíne ako preventívne a terapeutické činidlo na vírusové infekcie, novotvary a imunodeficiencie.

Odoslanie dobrej práce do databázy znalostí je jednoduché. Použite nižšie uvedený formulár

Študenti, postgraduálni študenti, mladí vedci, ktorí pri štúdiu a práci využívajú vedomostnú základňu, vám budú veľmi vďační.

Uverejnené na http://www.allbest.ru/

Úvod

1 Klasifikácia interferónov

2 Spôsoby získavania interferónov

2.1 Produkcia ľudských leukocytov infekciou

2.2 Získavanie interferónov genetickým inžinierstvom

3. Mechanizmy účinku interferónov

4. Terapeutické použitie ľudského interferónu

Záver

Zoznam použitej literatúry

Úvod

V roku 1957 Národný inštitút pre lekársky výskum v Londýne zistil, že ľudské a zvieracie bunky vystavené vírusu vylučujú látky, vďaka ktorým sú neovplyvnené bunky odolné voči vírusovej infekcii. Zdá sa, že zabraňujú (zasahujú) do reprodukcie vírusov v bunke, a preto sa nazývali interferóny. Interferóny pomáhajú nášmu telu bojovať proti mnohým vírusovým ochoreniam.

Prípravky na báze rôznych typov interferónov sa používajú ako imunomodulátory na normalizáciu a posilnenie imunitného systému, vrátane liečby rôznych závažných ochorení - akútnej vírusovej hepatitídy, roztrúsenej sklerózy, osteosarkómu, myelómu a niektorých typov lymfómov.

Interferóny sú proteínové molekuly s molekulovou hmotnosťou 15 000 až 21 000 daltonov produkované a vylučované bunkami ako odpoveď na vírusovú infekciu alebo iné patogény.

Interferóny (IFN) sú skupinou autogénnych glykoproteínov, ktorých biomechanizmus účinku je spojený so súčasným antivírusovým účinkom - aktiváciou bunkových génov, v dôsledku čoho sa syntetizujú proteíny, ktoré inhibujú syntézu vírusovej DNA (RNA) a majú imunomodulačný účinok - schopnosť zvýšiť expresiu antigénov na bunkových membránach a zvýšiť aktivitu cytotoxických T buniek a prirodzených zabíjačov.

1. TOklasifikácia interferónov

V závislosti od typu produkujúcich buniek možno všetky interferóny rozdeliť na:

b-interferóny.

* β-interferóny.

* interferóny g.

Podľa spôsobu výroby sa interferóny delia na:

1. Prírodné, získané z kultúry ľudských leukocytových buniek stimulovaných vírusmi:

b-interferón, b-interferón, interferón-b Nl;

2. Rekombinant, produkovaný baktériami s integrovaným interferónovým génom v ich genóme:

Interferón-b2A, interferón-b2B, interferón-blb.

Interferón - b je produkovaný leukocytmi a nazýva sa leukocyty; β-interferón sa nazýva fibroblastický, pretože ho syntetizujú fibroblasty - bunky spojivového tkaniva, a interferón g sa nazýva imunitný, pretože ho produkujú aktivované T-lymfocyty, makrofágy, prirodzené zabíjačské bunky, t.j. imunitné bunky.

Pod vplyvom interferónu-g sa zvyšuje produkcia cytokínov, ako je interleukín-1, interleukín-2, interleukín-12, IFNb a tumor nekrotizujúci faktor-b.

2. Spôsoby získavania interferónov

Interferóny sa získavajú dvoma spôsobmi:

a) infekciou ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom, v dôsledku čoho infikované bunky syntetizujú interferón, ktorý sa potom izoluje a z neho sa skonštruujú interferónové prípravky;

b) genetickým inžinierstvom - pestovaním rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón za produkčných podmienok.

2 . 1 Pzískanie podľainfekcia ľudských leukocytov

Sú známe spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov ľudskej darcovskej krvi, indukovaných vírusmi a inými induktormi.

Ľudské krvné leukocyty sú hlavnými producentmi prirodzeného interferónu-alfa, ktorého množstvo je na účely výroby obmedzené darcovskými surovinami. V tomto smere sa ako veľmi dôležité a aktuálne pre praktickú zdravotnú starostlivosť dnes javí riešenie otázok optimalizácie metód kultivácie leukocytov pre zvýšenie výťažnosti cieľového produktu a vývoj jednotnej efektívnej metódy získania prirodzeného IFN pre tvorbu nových liekových foriem.

Známa je technológia výroby ľudského leukocytového interferónu, ktorá zahŕňa nasledujúcu postupnosť operácií: izoláciu leukocytov z darcovskej krvi, leukocytovej alebo erytrocytovej hmoty, ich suspendovanie v živnom médiu pri teplote (37±0,5) o C, pridanie induktor alantoického vírusu do leukocytov a inkubácia pri (30 ± 0,5) °C počas 3 hodín. Potom sa induktor vírus oddelí a k sedimentu leukocytov sa pridá živné médium a suspenzia sa udržiava pri teplote (37 ±). 0,5) o C počas 18-20 hodín V tomto štádiu prebieha biosyntéza interferónu v leukocytoch a jeho akumulácia v živnom médiu získanom touto technológiou má antivírusovú aktivitu 800-1000 IU na 1 ml liečiva.

Aby sa zvýšila produkcia interferónu leukocytmi v štádiu biosyntézy, v inom predpise na produkciu ľudského leukocytového interferónu N 302-82 sa suspenzia leukocytov udržiava pri teplote 37,5 °C počas 2-10 hodín v živnom médiu obsahujúcom 100-200 jednotiek/ml ľudského leukocytového interferónu a 0,0015 jednotiek/ml inzulínového induktora v štádiu indukcie interferónu; Potom sa induktor vírus odstráni a k sedimentu leukocytov sa pridá živné médium a suspenzia sa udržiava pri teplote 37,5 °C počas 18 až 20 hodín v štádiu biosyntézy interferónu a supernatant obsahujúci interferón sa inaktivuje.

Zavedenie primárneho štádia významne zvyšuje produkciu interferónu leukocytmi a antivírusová aktivita interferónu získaná touto metódou je 4000-5000 IU/ml. Je potrebné poznamenať, že vo všetkých vyššie uvedených výrobných technológiách a iných známych metódach získavania ľudského leukocytového interferónu sa leukocyty izolujú z krvi, ktorá sa skladuje pri teplote 4-6 o C, a samotný proces izolácie prebieha pri rovnakej teplote. s následným ich zavedením do živného média pri teplote 37,5 °C a vykonaním fázy aktivácie, indukčnej fázy a biosyntézy interferónu.

Nasledujúci spôsob výroby interferónu je vybraný ako prototyp, pretože je technicky najbližší. Účelom tohto spôsobu je zvýšiť výťažok cieľového produktu. Na tento účel bol navrhnutý spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa izoláciu leukocytov, ich suspendovanie v živnom médiu a aktiváciu za podmienok postupného zvyšovania teploty suspenzie z 20 °C na (36,6 ± 0,1) °C počas 4-6 °C. hodiny, indukcia alantoickým vírusom Newcastleská choroba, biosyntéza interferónu a inaktivácia induktora vírusu. Porovnávacia analýza základných znakov metód ukazuje, že charakteristickými znakmi navrhovanej metódy je aktivácia leukocytov s pomalým nárastom teploty suspenzie z 20 °C na (36,6 ± 0,1) °C počas 4-6 hodín. Navrhovaný teplotný režim primovania leukocytov zabezpečuje podmienky pre intenzívnu biosyntézu INF. Spôsob sa uskutočňuje nasledovne. Izolované leukocyty z darcovskej krvi, leukocytov alebo erytrocytov sa suspendujú v 5 litroch živného média (médium 199) obsahujúceho 0,0015 jednotiek/ml inzulínu a 1500 – 3000 IU/ml ľudského leukocytového interferónu 5 – 10 % ľudskej krvnej plazmy alebo 1,5 – 2 % ľudský albumín a antibiotiká. 1 ml živného média obsahuje 10020 miliónov leukocytov. Živné médium obsahujúce vyššie uvedené východiskové zložky má počiatočnú teplotu 20 o C. V automatizovanom režime sa podľa programu teplota suspenzie zvýši z 20 o C na (36,6 ± 0,1) o C počas 4-6 hodín Potom sa teplota suspenzie upraví na (36,9 ± 0,1) o C a do suspenzie sa pridá induktorový vírus v dávke 2 000-4 000 GAE na 2 miliardy leukocytov, suspenzia sa inkubuje pri (36,9 ± 0,1) o C. 18-20 hodín za stáleho miešania. Leukocyty sa odstránia centrifugáciou a supernatant v množstve 4,5 litra obsahujúci interferón sa okyslí 10% kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,2 až 2,4. Okyslený polotovar interferónu sa uchováva 10 dní, aby sa inaktivoval induktor vírusu. Antivírusová aktivita interferónu získaného týmto spôsobom je 10-12 tisíc IU / ml.

Navrhovaný spôsob získania ľudského leukocytového interferónu teda zaisťuje zvýšenie jeho antivírusovej aktivity 2 alebo viackrát v porovnaní s predchádzajúcou metódou. Použitie navrhovanej metódy vo výrobe pomôže ušetriť náklady na materiál, pretože je zameraná na efektívnejšie využitie leukocytov, a nie na zvýšenie ich počtu.

Hlavnou nevýhodou týchto spôsobov výroby interferónov je pravdepodobnosť kontaminácie konečného produktu ľudskými vírusmi, ako je vírus hepatitídy B a C, vírus imunodeficiencie atď.

2.2 Získanie interferónovgeneticky modifikované

vírus interferónového leukocytového génu

V súčasnosti sa za sľubnejší považuje spôsob výroby interferónu mikrobiologickou syntézou, ktorý umožňuje získať cieľový produkt s výrazne vyšším výťažkom z relatívne lacných východiskových materiálov. Tu použité prístupy umožňujú vytvárať varianty štruktúrneho génu, ktoré sú optimálne pre bakteriálnu expresiu, ako aj regulačné prvky, ktoré riadia jeho expresiu.

Ako zdrojové mikroorganizmy sa používajú rôzne konštrukcie kmeňov Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.

Nevýhodou použitia P. pastoris ako producenta interferónu sú extrémne náročné podmienky fermentácie tohto typu kvasiniek a potreba prísneho udržiavania koncentrácie induktora, najmä metanolu, počas procesu biosyntézy.

Nevýhodou používania Ps. putida je zložitosť fermentačného procesu pri nízkej úrovni expresie (10 mg interferónu na 1 liter kultivačného média). Produktívnejšie je použitie kmeňov Escherichia coli.

Je známy veľký počet plazmidov a kmeňov E. coli vytvorených na ich základe, ktoré exprimujú interferón: kmene E. coli ATCC 31633 a 31644 s plazmidmi Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 alebo Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN35-AHL6 (SU 1764515), E. coli kmeň pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli kmeň pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom p280/21FN, E. Coli kmeň SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom pINF16 (RU 2054041) atď. Nevýhodou technológií založených na použití týchto kmeňov je ich nestabilita, ako aj nedostatočná úroveň expresia interferónu.

Spolu s charakteristikami použitých kmeňov účinnosť procesu do značnej miery závisí od technológie použitej na izoláciu a čistenie interferónu.

Je známy spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa kultiváciu Ps buniek. putida, deštrukcia biomasy, úprava polyetylénimínom, frakcionácia síranom amónnym, hydrofóbna chromatografia na fenylsilochróme C-80, pH frakcionácia lyzátu, jeho zahusťovanie a diafiltrácia, ionexová chromatografia na celulóze DE-52, elúcia v pH gradiente, ión výmenná chromatografia výsledného eluentu na celulóze SM-52, zahustenie prechodom cez filtračnú kazetu a gélová filtrácia na Sephadexe G-100 (SU 1640996). Nevýhodou tohto spôsobu je popri zložitej viacstupňovej fermentácii viacstupňový proces pri získavaní finálneho produktu.

Je tiež známy spôsob výroby interferónu, ktorý zahŕňa kultiváciu kmeňa E. coli SG 20050/pIF16 v LB bujóne vo fľašiach v trepačke s termostatom, odstredenie biomasy, jej premytie tlmivým roztokom a ošetrenie ultrazvukom na zničenie buniek. Výsledný lyzát sa odstredí, premyje 3M roztokom močoviny v tlmivom roztoku, rozpustí v roztoku guanidínchloridu v tlmivom roztoku, spracuje ultrazvukom, centrifuguje, oxidačnou sulfitolýzou, dialýzou proti 8 M močovine, renaturáciou a záverečnou dvojstupňovou chromatografiou na CM- 52 celulóza a Sephadex G-50 (RU 2054041).

Nevýhodou tejto metódy je jej relatívne nízka produktivita hlavných etáp procesu izolácie a čistenia. To platí najmä pre úpravu produktu ultrazvukom, dialýzu a oxidačnú sulfitolýzu, čo vedie k nestabilite výťažku interferónu, ako aj nemožnosti použiť túto metódu na priemyselnú výrobu interferónu.

Ako najbližší analóg (prototyp) možno uviesť metódu získania ľudského leukocytového interferónu, ktorá spočíva v kultivácii rekombinantného kmeňa E. coli, zmrazení výslednej biomasy pri teplote neprevyšujúcej -70 °C, rozmrazení, zničení buniek mikroorganizmov s lyzozýmom, odstránenie DNA a RNA zavedením do lyzátu DNAzy a purifikácia izolovanej nerozpustnej formy interferónu premytím tlmivým roztokom s detergentmi, rozpustenie zrazeniny interferónu v roztoku hydrochloridu guanidínu, renaturácia a jednostupňové čistenie iónom výmenná chromatografia. Ako producent sa použije kmeň E. coli SS5 získaný použitím rekombinantného plazmidu pSS5 obsahujúceho tri promótory: Plac, Pt7 a Ptrp a gén alfa-interferónu so zavedenými nukleotidovými substitúciami.

Expresia interferónu kmeňom E. coli SS5 obsahujúcim tento plazmid je riadená tromi promótormi: Plac, Pt7 a Ptrp. Úroveň expresie interferónu je asi 800 mg na 1 liter bunkovej suspenzie.

Nevýhodou tejto metódy je nízka technologická účinnosť využitia enzymatickej deštrukcie buniek, DNA a RNA mikroorganizmu a jednostupňová chromatografická purifikácia interferónu. To spôsobuje nestabilitu v procese uvoľňovania interferónu, vedie k zníženiu jeho kvality a obmedzuje možnosť použitia vyššie uvedenej schémy na priemyselnú výrobu interferónu.

Nevýhodou tohto plazmidu a kmeňa na ňom založeného je použitie v plazmide silného neregulovaného promótora fága T7 v E. coli kmeň BL21 (DE3), v ktorom je gén T7 RNA polymerázy umiestnený pod promótorom tzv. lac operón a ktorý vždy „tečie“. V dôsledku toho v bunke nepretržite prebieha syntéza interferónu, čo vedie k disociácii plazmidu a zníženiu životaschopnosti buniek kmeňa a v dôsledku toho k zníženiu výťažku interferónu.

Príklad získania rekombinantného interferónu:

600 g biomasy buniek Pseudomonas putida 84 obsahujúcej rekombinantný plazmid pVG-3 po kultivácii obsahovalo 130 mg alfa-2 interferónu. Bunky sa vložili do 5,0 1 balistického dezintegrátora s mechanickým miešadlom a 3,0 1 lyzačného pufra obsahujúceho 1,2 % chloridu sodného, 1,2 % tris-(hydroxymetyl)-aminometánu, 10 % sacharózy, 0,15 % kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA), 0,02 % fenylmetylsulfonylfluoridu a 0,01 % ditiotreitolu pri pH 7,7. Biomasa sa miešala, kým sa nezískala homogénna suspenzia počas 30 minút, potom sa dezintegrovala v cirkulačnom režime v balistickom dezintegrátore podľa návodu na obsluhu. Doba dezintegrácie bola 1,5 hodiny. Proces dezintegrácie bol ukončený, keď pri mikroskopovaní preparátu v niekoľkých zorných poliach mikroskopu neboli pozorované prakticky žiadne celé bunky mikroorganizmov. Objem lyzovanej suspenzie biomasy bol 3,5 l.

Lyzát získaný v tomto štádiu potom vstúpil do štádia zrážania nukleovej kyseliny. Na tento účel sa do nádoby obsahujúcej lyzát pridalo 180 ml 5 % roztoku polyetylénimínu za miešania rýchlosťou 1 až 1,2 l/h. Suspenzia sa miešala 1 hodinu a centrifugovala, aby sa oddelil sediment nukleovej kyseliny 1 hodinu pri (9500 ± 500) ot./min., pri teplote (5 ± 2)C. Po odstredení sa oddelil supernatant, ktorého objem bol 3,0 l.

Za pomalého miešania miešadlom sa do supernatantu po malých častiach nalialo 182 g suchého síranu amónneho (každá ďalšia dávka sa pridala po úplnom rozpustení predchádzajúcej). Po dokončení pridávania síranu amónneho sa v miešaní pokračovalo, kým sa soľ úplne nerozpustila a suspenzia proteínového sedimentu sa udržiavala pri teplote (5 ± 2) C počas 16 hodín a potom sa centrifugovala počas 1 hodiny pri (13 500 ± 500) ot./min pri teplote (5 ± 2) S.

Výsledná zrazenina sa rozpustila v destilovanej vode, čím sa celkový objem upravil na 4 litre. Na vyzrážanie sprievodných proteínov sa uskutočnila kyslá frakcionácia výsledného roztoku obsahujúceho alfa-2 interferón. Na tento účel sa k roztoku pridalo 5,0 ml 50 % kyseliny octovej na pH 4,75. Výsledná zmes bola prenesená do chladničky a ponechaná pri teplote (5±2)C počas 3 hodín, potom bola proteínová suspenzia centrifugovaná pri (13500±500) otáčkach za minútu počas 30 minút pri (5±2)C.

Do 4 1 supernatantu sa pridalo 50,0 ml 1 M roztoku Tris do pH (6,9 ± 0,1). Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou bola 9,0 mg/ml, biologická aktivita alfa-2 interferónu (6,80,5) 106 IU/ml. Špecifická aktivita 8,5105 IU/mg. Celkový obsah interferónu alfa-2 v tomto štádiu je 2,91010 IU.

Sorbent Soloz KG v množstve 0,6 l vo forme vodnej suspenzie bol umiestnený do chromatografickej kolóny. Potom pomocou peristaltického čerpadla 2,0 l 0,2 M roztoku hydroxidu sodného, 6,0 l destilovanej vody a 4,5 l 0,05 M tris-acetátového tlmivého roztoku pri pH (7,1±0,1), ktoré bolo monitorované pH metrom pri výstup z kolóny.

Proteínový roztok obsahujúci alfa-2 interferón sa zriedil destilovanou vodou na vodivosť (6,0 + 2,0) mS/cm pri teplote miestnosti. Objem roztoku bol 19,2 litra.

Roztok sa nanášal na kolónu rýchlosťou 1,5 l/hod., potom sa sorbent premyl 2,0 1 Tris-acetátového tlmivého roztoku 0,05 M pri pH 7,0. Elúcia sa uskutočnila s 1,2 1 0,05 M Tris roztoku s pH (10,2 ± 0,1).

Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou je (2,2±0,2) mg/ml, biologická aktivita interferónu alfa-2 (2,1±0,5)107 IU/ml, špecifická aktivita liečiva (9,7±0,5 )106 IU/mg. Celkový obsah interferónu alfa-2 v tomto štádiu je (1,5±0,5)1010 IU.

Sorbent Spherocell qae v množstve 0,15 l vo forme vodnej suspenzie bol naplnený do kolóny a premývaný rýchlosťou 0,15 l/h postupne 0,5 l 2 M roztoku chloridu sodného, 1,5 l destilovanej vody a 1,0 l. 1 trisacetátového tlmivého roztoku 0,05 M s pH 8,0, sledovanie pH tlmivého roztoku na výstupe z kolóny pomocou pH metra.

0,7 1 proteínový roztok obsahujúci alfa-2 interferón sa aplikoval na 0,15 1 sorbentový stĺpec Spherocell-QAE rýchlosťou 0,2 l/hodinu. Kolóna sa premyla 0,1 1 Tris-acetátového 0,05 M tlmivého roztoku (pH 8,0), potom sa proteíny nečistôt premyli 1,0 1 rovnakého tlmivého roztoku s prídavkom 0,05 M NaCl. Interferón sa eluoval 0,8 1 0,1 M tlmivého roztoku octanu sodného pri pH 5,0. Obsah alfa-2 interferónu vo frakciách zozbieraných pomocou zberača bol stanovený metódou enzýmového imunotestu. Koncentrácia proteínu bola (0,35±0,05) mg/ml, biologická aktivita interferónu alfa-2 bola (1,7±0,2)107 IU/ml. Špecifická aktivita liečiva je 5,5107 IU/mg proteínu. Eluát obsahoval 1,20 x 1010 ME. Výťažok biologickej aktivity v tomto štádiu je 82,5 %.

Výsledný roztok sa upravil na pH (5,0 ± 0,1) 50 % kyselinou octovou a zriedil sa 0,05 M tlmivým roztokom octanu sodného. Špecifická elektrická vodivosť bola (0,29±0,02) mS/cm pri teplote (5±2)C. Takto pripravený proteínový roztok bol nanesený na kolónu so sorbentom Spherocell LP-M rýchlosťou 0,1 l/h, premytý 0,3 l vyššie uvedeného tlmivého roztoku a potom bol interferón eluovaný lineárnym gradientom koncentrácie chloridu sodného. vytvorený použitím Ultragrad gradientového mixéra Eluát sa frakcionoval použitím zberača frakcií a merala sa koncentrácia celkového proteínu a alfa-2 interferónu. Koncentrácia proteínu v spojených frakciách (0,45 ± 0,02) mg/ml. Objem roztoku je 0,1 l. Celkový obsah interferónu alfa-2 (8,6±0,2)109 IU. Špecifická aktivita - e (7,5±0,2)107 IU/mg. Výťažok v tomto štádiu je 73 %.

Výsledný 0,1 1 roztok 3 sa skoncentroval na (5,0 ± 0,2) ml použitím ultrafiltračnej cely s použitím membrány Amicon YM-3. Takto pripravená vzorka bola nanesená na kolónu so sorbentom Sephadex G-100, ekvilibrovanú fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom pri rýchlosti 0,025 l/h. Objem frakcií je 10,0 ml. Frakcie získané po chromatografii sa testovali na obsah alfa-2 interferónu použitím metódy enzýmového imunotestu a kombinovaním frakcií obsahujúcich hlavný vrchol alfa-2 interferónu. Objem výsledného roztoku bol 30,2 ml. Koncentrácia celkového proteínu stanovená Lowryho metódou je (0,90 ± 0,02) mg/ml. Celkový obsah alfa-2 interferónu v roztoku je 5,5109 ME. Špecifická aktivita výsledného prípravku alfa-2 interferónu je 2,3108 IU/mg. Výťažok alfa-2 interferónu v tomto štádiu je 90,2 %. Výsledný produkt bol sterilizovaný a zabalený. Celkový výťažok liečiva je 35,8 %, vrátane 51 % v štádiu čistenia.

Na získanie veľkých množstiev IFN sa používajú šesťdňové jednovrstvové kultúry buniek kuracích embryí alebo kultivovaných ľudských krvných leukocytov infikovaných určitým typom vírusu. Inými slovami, na získanie IFN sa vytvorí špecifický systém vírus-bunka.

Gén zodpovedný za biosyntézu IFN bol izolovaný z ľudskej bunky. Exogénny ľudský IFN sa vyrába pomocou technológie rekombinantnej DNA. Postup izolácie IFN-s cDNA je nasledujúci:

1) mRNA je izolovaná z ľudských leukocytov, frakcionovaná podľa veľkosti, reverzne transkribovaná a vložená do miesta modifikovaného plazmidu.

2) Výsledný produkt sa použije na transformáciu E. coli; výsledné klony sú rozdelené do skupín, ktoré sú identifikované.

3) Každá skupina klonov sa hybridizuje s IFN - mRNA.

4) Z výsledných hybridov obsahujúcich cDNA a chRNA sa izoluje mRNA a preloží sa v systéme syntézy proteínov.

5) Stanovte antivírusovú aktivitu interferónu každej zmesi získanej ako výsledok translácie. Skupiny, ktoré vykazovali aktivitu interferónu, obsahujú klon s cDNA hybridizovaný s IFN-mRNA; znovu sa identifikuje klon obsahujúci humánnu IFN cDNA plnej dĺžky.

3 . Mechanizmy účinku interferónov

Interferóny vykazujú niektoré aktivity ako lymfokíny a imunomodulátory. IFN typu I, ktoré pôsobia primárne ako inhibítory replikácie vírusu v bunke, uplatňujú svoj účinok stimuláciou produkcie bunkových enzýmov ribozómami hostiteľských buniek, ktoré inhibujú produkciu vírusov, narúšajú transláciu vírusovej mRNA a syntézu vírusové proteíny.

Interferóny produkuje väčšina živočíšnych druhov, ale prejav ich aktivity je druhovo špecifický, t.j. účinkujú len v druhu zvierat, v ktorom sú vyrobené.

Interferónyspôsobujú indukciu troch enzýmov:

Proteínkináza, ktorá narúša počiatočnú fázu výstavby peptidového reťazca;

Oligoizoadenylátsyntetáza, ktorá aktivuje RNázu, ktorá ničí vírusovú RNA;

Fosfodiesteráza, ktorá ničí konečné nukleotidy tRNA, čo vedie k narušeniu predlžovania peptidov.

Berúc do úvahy antivírusové a imunomodulačné účinky interferónu, NPO "Biomed" navrhol a úspešne otestoval čapíky s IFNan1 a probiotikami na liečbu dysbiózy vírusovej a bakteriálnej etiológie, kandidózy; v gynekologickej praxi na liečbu endometritídy, kolpitídy, vaginitídy a gynekologického herpesu.

4. Terapeutické použitie interferónuosoba

Interferóny (INF) majú univerzálne široké spektrum antivírusovej aktivity, keďže nepôsobia na virióny ani ich NK, ale vyvolávajú v bunke antivírusový stav, stimulujúc tvorbu komplexu proteínov, ktoré blokujú transkripciu vírusovej mRNA. INF neprenikajú do buniek, ale interagujú s membránovými receptormi, čím vyvolávajú tvorbu cAMP, ktorý prenáša signál na zodpovedajúci DNA operón. Okrem toho INF aktivujú gény kódujúce produkty s priamym antivírusovým účinkom – proteínkinázy, ktoré narúšajú zostavenie molekuly proteínu, a adenylátsyntetázy, ktorých produkt aktivuje endonukleázu, ktorá ničí vírusové mRNA. Gamma-INF aktivuje cytotoxické lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky, monocyty, makrofágy, granulocyty, ktoré prispievajú k deštrukcii infikovaných buniek.

Existujú dve generácie interferónových liekov. Prvá generácia sa vyznačuje prírodným pôvodom, pri ktorom sa získava z krvi darcov. Získava sa z nej suchý ľudský leukocytový interferón, ktorý sa používa na inhaláciu a instiláciu do nosových priechodov. Tiež produkujú interferón v čapíkoch, purifikovaný koncentrovaný interferón v suchej forme a Leukinferon.

Tento spôsob výroby liekov na báze interferónu je dosť drahý a nedostupný, takže koncom 20. storočia boli pomocou genetického inžinierstva vytvorené interferónové lieky druhej generácie.

Tak bolo možné vyvinúť lieky Viferon, Interal a ďalšie obsahujúce rekombinantný ľudský interferón-b.

Pre svoje jedinečné vlastnosti sa používajú interferónové prípravky liečbe a prevencia všetkých ochorení dýchacích ciest, väčšiny rakoviny, na liečbu mnohých vírusových ochorení a chrípky. Pri liečbe sa široko používajú interferónové prípravky hepatitída typu A hepatitída B a C: interferón obmedzuje vývoj vírusu, zabraňuje výskytu cirhóza a vylučuje smrť.

Niektoré interferónové lieky majú vedľajšie účinky, ako sú kožné vyrážky, alergie a choroby krvotvorného systému.

Pri dlhodobom používaní interferónu telo produkuje protilátky proti interferónu, čo mu znemožňuje bojovať vírusy. Príčina týchto javov spočíva v prítomnosti albumínu v prípravkoch na báze interferónu.

Albumín sa získava z krvi, takže existuje riziko (aj keď minimálne) infekcie hepatitída a iné krvou prenosné choroby.

stôl 1

Spektrum aktivity interferónu

Názov lieku	Podtyp INF	Spôsob získania	farmakologický účinok	Indikácie na použitie
Interferón		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom vírusov	Antivírusové, imunomodulačné, antiproliferatívne	Vírusové ochorenia, leukémia, malígny melanóm, rakovina obličiek, karcinoidný syndróm
Blokovanie		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom paramykovírusov	Potláča aktivitu množstva vírusov	Vírusové ochorenia očí, hepatitída
Interferón alfa-2		Rekombinantný	Antivírusový, imunomodulačný, inhibuje proliferáciu širokého spektra nádorových buniek	Epiteliálna forma akútnej a rekurentnej vírusovej infekcie oka; onkologické ochorenia
Interferón alfa-2a		Rekombinantný. Proteín obsahujúci 165 aminokyselín	Antivírusová, protinádorová aktivita	Leukemická retikuloendotelióza, Kaposiho sarkóm, rakovina obličiek, rakovina močového mechúra, melanóm, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantný INF produkovaný bakteriálnym kmeňom pseudomonas, ktorého genetický aparát obsahuje gén pre ľudský leukocytový INF b2. Identické s ľudským leukocytom INF b2.		Vírusové, nádorové ochorenia
Interferón alfa - n1		Vysoko purifikovaný ľudský INF	Antivírusový	Chronická aktívna infekčná hepatitída B
Inreferon beta		Superprodukcia ľudských fibroblastov stimulátorom v prítomnosti metabolických inhibítorov	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické vírusové infekcie v oftalmológii, gynekológii a urológii, dermatológii, hepatológii, onkológii
Interferón gama		Rekombinantný	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické granulomatózne ochorenia

INF-bAINF-V navzájom viac podobné. Ich gény sú lokalizované na 9. chromozóme. Na produkciu oboch sú indukujúcim signálom vírusy. Majú výrazný antivírusový a protinádorový účinok a v oveľa menšej miere vykazujú imunomodulačné vlastnosti.

INF-G má výrazný imunomodulačný účinok, spolu s interleukínom-2 (IL-2) a tumor nekrotizujúcim faktorom (TNF alebo TNF) je jedným z hlavných prozápalových cytokínov a je induktorom bunkovej imunity. Antivírusové a protinádorové vlastnosti sú menej výrazné ako vlastnosti INF-b a INF-c. Gén INF-g sa nachádza na 12. chromozóme, hlavné produkujúce bunky sú T-lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky (NK bunky). Indukčný signál na produkciu môže byť akýkoľvek antigén alebo iné cytokíny.

Antivírusový účinok interferónov spočíva v potlačení syntézy vírusovej RNA, potlačení syntézy vírusových obalových proteínov. Mechanizmom tohto účinku je aktivácia intracelulárnych enzýmov, ako je proteínkináza alebo adenylátsyntetáza. Proteínkináza ničí iniciačný faktor syntézy proteínov z messenger RNA, ktorý potláča syntézu proteínov. Adenylátsyntetáza - spôsobuje syntézu látok, ktoré ničia vírusovú RNA.

Imunomodulačný účinok interferónov - schopnosť regulovať interakciu buniek zapojených do imunitnej odpovede. Interferóny plnia túto funkciu reguláciou citlivosti buniek na cytokíny a expresiou molekúl hlavného histokompatibilného komplexu typu I (MHC1) na bunkových membránach. Zvýšená expresia MHC1 na vírusom infikovaných bunkách výrazne zvyšuje pravdepodobnosť, že budú rozpoznané imunokompetentnými bunkami a eliminované z tela. Najvýraznejšie imunomodulačné vlastnosti má INF-g, ktorý je produktom pomocníka T-lymfocytov typu I, spolu s ďalšími prozápalovými cytokínmi aktivuje makrofágy, T-cytotoxické lymfocyty, prirodzené zabíjačské bunky (NK bunky), potláča aktivitu B-lymfocytov, aktivuje prostaglandínový a kortikosteroidný systém. Všetky tieto faktory zosilňujú fagocytárne a cytotoxické reakcie v oblasti zápalového ložiska a prispievajú k účinnej eliminácii infekčného agens.

Protinádorový účinok interferónov spojené s ich schopnosťou spomaliť alebo potlačiť rast bunkových kultúr a aktivovať protinádorové mechanizmy imunitného systému. Táto vlastnosť interferónov bola objavená už dávno a je široko používaná na terapeutické účely. Všetky protinádorové účinky interferónov sú rozdelené na priame a nepriame. Priamo súvisí so schopnosťou priamo pôsobiť na nádorové bunky, ich rast a diferenciáciu. Nepriame sú spojené so zvýšením schopnosti imunokompetentných buniek detekovať a ničiť atypické bunky tela.

Priame protinádorové účinky interferónu:

· Potlačenie syntézy RNA.

· Potlačenie syntézy bielkovín.

· Stimulácia nediferencovaných buniek k dozrievaniu.

· Zvýšená expresia membránových antigénov nádorových buniek a hormonálnych receptorov.

· Porušenie procesov tvorby ciev.

· Neutralizácia onkovírusov.

· Potlačenie účinku nádorových rastových faktorov.

Nepriame protinádorové účinky interferónu:

· Stimulácia aktivity buniek imunitného systému (makrofágy, NK bunky, T-cytotoxické lymfocyty).

· Zvýšená expresia molekúl histokompatibility I. triedy na bunkách.

Antiproliferatívny účinok interferónov spočíva v schopnosti interferónov prejavovať vlastnosti cytostatík – potláčať rast buniek potlačením syntézy RNA a proteínov, ako aj inhibíciou rastových faktorov stimulujúcich proliferáciu buniek.

Tlmivky INF je veľmi rôznorodá skupina prírodných a syntetických zlúčenín, ktoré môžu spôsobiť, že si telo vytvorí vlastný (endogénny) INF. Podobne ako INF majú univerzálne široké spektrum antivírusovej aktivity, ako aj imunomodulačný účinok, ktorý určuje ich účinnosť pri mnohých nevírusových ochoreniach.

tabuľka 2

Spektrum antivírusovej aktivity induktorov INF

Droga	Indikácie na použitie
Akridanony (cykloferón, neovir)	Chrípka, encefalitída, besnota, infekcia HIV, AIDS
Fluorenóny (amixín)	Chrípka, ARVI, herpes, hepatitída A, encefalitída, besnota, skleróza multiplex
Poly (I): poly(U) - ampligén	HIV infekcia, AIDS
Poly(G): poly(C)-polyguacil	Chrípka, hepatitída B, encefalitída, besnota
Dvojvláknová RNA (larifan, ridostin)	Chrípka, ARVI, herpes, encefalitída, besnota
Poly(A): poly(U)-poludán	Herpetické očné lézie
Polyfenoly (megasín, kagocel, savrac, ratosín, gozalidón)	Chrípka. ARVI, herpes, encefalitída, besnota, hepatitída, enterovírusové infekcie

Záver

Interferón je rodina glykoproteínových proteínov, ktoré sú syntetizované bunkami imunitného systému a spojivového tkaniva. V závislosti od toho, ktoré bunky syntetizujú interferón, existujú tri typy: interferóny b, c a g.

Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom; b) geneticky upravené.

V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov "Reaferon". Výroba tohto lieku je v mnohých ohľadoch účinnejšia a lacnejšia ako leukocyty.

Pôsobenie interferónu je tým účinnejšie, čím skôr sa začne syntetizovať alebo vstúpiť do tela zvonku. Preto sa používa na profylaktické účely pri mnohých vírusových infekciách, ako je chrípka, ako aj na terapeutické účely pri chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D), herpes, roztrúsená skleróza atď. Interferón dáva pozitívny výsledky pri liečbe zhubných nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

Interferóny sú druhovo špecifické, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto druhová špecifickosť je však relatívna.

Bibliografia

1. Dočasný liekopisný článok 42U-23/60-439-97. Ľudský rekombinantný interferón alfa-2.

2. Gavrikov A.V. Optimalizácia biotechnologickej produkcie rekombinantných ľudských interferónových látok - M., 2003,

3. Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Potekhina T.S. Základy farmaceutickej mikrobiológie. Petrohrad: Prospekt Nauki, 2008. -304 s.

4. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Princípy a aplikácia. M.: Mir, 2002. -589 s.

5. Štátny liekopis ZSSR. XI ed., číslo 1.-- S. 175.

6. Štátny register liekov / Ed. A.V. Katlinsky a ďalší - M., 2002.

7. Elinov N.P. Základy biotechnológie. Petrohrad: Nauka.-1995.-600 s.

8. Elinov N.P., Zaikina I.A., Sokolova I.P. Sprievodca laboratórnymi hodinami mikrobiológie - M.: Medicína, 1998.

9. Karabelský A.V. Rekombinantné interferóny.- M.: Book on Demand, 2010.- 132 s.

10. Mashkina O.S., Butorina A.K. Genetické inžinierstvo a biologická bezpečnosť. Voronež: VSU, 2005. 71 s.

11. Naroditsky B.S. Molekulárna biotechnológia interferónov. // zborník vedeckej a praktickej konferencie "Interferón - 50 rokov". - M., 2007, s. 17-23

12. Základy farmaceutickej biotechnológie: Učebnica / T.V. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L, K. Michaleva, L.S. Belova - Rostov n/a: Phoenix; Tomsk: Vydavatestvo NTL, 2006.- 256 s.

13. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. a ďalšie. Účinnosť rekombinantného alfa-dva-interferónu pri vírusovej hepatitíde B // Medical Affairs.- Kyiv, 1990.- No. 9.-- S. 105-108.

14. http://interferon.su/php/content.php?id=577

15. http://ru-patent.info/20/95-99/2098124.html

16. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

17. www.pharmvestnik.ru

Uverejnené na Allbest.ru

...

Podobné dokumenty

Triedy interferónov: prirodzene sa vyskytujúce a umelo syntetizované. Spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov darcovskej krvi a mikrobiologická syntéza. Mechanizmy účinku interferónov, terapeutické využitie.

abstrakt, pridaný 27.01.2010

História objavu interferónov, ich charakteristiky, klasifikácia, mechanizmus účinku a vlastnosti produkcie; klinické znaky ich použitia. Technologická schéma na produkciu leukocytov a rekombinantného interferónu v preparatívnych množstvách.

kurzová práca, pridané 23.12.2012

Vrodená antivírusová imunita. Typy interferónov a mechanizmy antivírusového účinku interferónov. Schopnosť protilátok a komplementov obmedziť šírenie vírusu a zabrániť opätovnej infekcii. Obídenie imunologickej kontroly vírusmi.

abstrakt, pridaný 27.09.2009

Štúdium vlastností interferónu. Štúdium hlavných účinkov proteínu, ktorý má antivírusové, antiproliferatívne a imunomodulačné účinky. Použitie interferónu pri liečbe malígnych nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

prezentácia, pridané 17.11.2015

Proces transfúzie krvi a jej účel, hodnotenie bezpečnosti v súčasnom štádiu vývoja medicíny. Patologický účinok darcovskej krvi, jeho príčiny a spôsoby rehabilitácie pacienta. Použitie reinfúzie a autohemotransfúzie krvi a ich výhody.

abstrakt, pridaný 13.07.2009

Typy imunomodulácie. Koncept imunotropných liekov. Interferóny a ich induktory. Mechanizmus imunomodulačného účinku bakteriálnych vakcín. Indikácie na predpisovanie a-IF liekov. Kontraindikácie liečby interferónovými liekmi.

prezentácia, pridané 04.03.2014

Analýza krvných buniek: červené krvinky, leukocyty, krvné doštičky. Hemoglobín a jeho funkcie v tele. Granulocyty, monocyty a lymfocyty ako zložky leukocytov. Patológie v zložení krvi, ich vplyv na funkcie ľudského tela.

abstrakt, pridaný 10.6.2008

Liečebný a profylaktický mechanizmus účinku liečebného bahna, ich klasifikácia a využitie za účelom tepelných účinkov na organizmus. Indikácie a kontraindikácie pre tepelnú terapiu. Techniky pre všeobecné a lokálne aplikácie bahna a kúpeľov.

abstrakt, pridaný 21.12.2014

Funkcie krvo-tekutého tkaniva kardiovaskulárneho systému stavovcov. Jeho zloženie a tvarové prvky. Tvorba červených krviniek, typy patológií. Hlavná sféra pôsobenia leukocytov. Lymfocyty sú hlavnými bunkami imunitného systému. Zmeny v krvi súvisiace s vekom.

prezentácia, pridané 14.10.2015

Veková periodizácia človeka. Hematopoéza v embryogenéze. Zmeny v koncentrácii erytrocytov, leukocytov, lymfocytov a krvných doštičiek s vekom. Špecifická hmotnosť a viskozita krvi u novorodencov a starších ľudí. Klasifikácia a načasovanie vývoja leukocytov.

Interferóny sú proteínové molekuly s molekulovou hmotnosťou 15 000 až 21 000 daltonov produkované a vylučované bunkami ako odpoveď na vírusovú infekciu alebo iné patogény.

IFN sa delia na dva typy. Prvý typ, ktorý pôsobí ako inhibítory vírusovej replikácie a má prevažne antivírusový účinok, zahŕňa 22 rôznych podtypov IFN-α a jeden podtyp IFN-β. Druhý typ, ktorý vykazuje imunomodulačnú aktivitu, zahŕňa IFN-y.

Existujú tri imunologicky odlišné triedy IFN: IFN-a, IFN-p, IFN-y.

Prirodzene sa vyskytujúce IFN zahŕňajú lymfoblastoidné a leukocytové IFN (IFN-a), syntetizované jednotlivo stimulovanými ľudskými monocytmi a B lymfocytmi, ktoré sú potom extrahované a purifikované; fibroblastový IFN (IFN-p), získaný z kultúry ľudských fibroblastov, a T-lymfocytový IFN (IFN-y).

Umelo syntetizované IFN zahŕňajú rekombinantný IFN-a, čo je vysoko purifikovaný jediný podtyp IFN-a produkovaný pomocou rekombinantnej molekulárnej technológie.

Sú známe spôsoby získania ľudského leukocytového interferónu z leukocytov ľudskej darcovskej krvi, indukovaných vírusmi a inými induktormi.

Hlavnou nevýhodou týchto spôsobov výroby interferónov je pravdepodobnosť kontaminácie konečného produktu ľudskými vírusmi, ako je vírus hepatitídy B a C, vírus imunodeficiencie atď.

Ako zdrojové mikroorganizmy sa používajú rôzne konštrukcie kmeňov Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.

Je známy veľký počet plazmidov a kmeňov E. coli vytvorených na ich základe, ktoré exprimujú interferón: kmene E. coli ATCC 31633 a 31644 s plazmidmi Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 alebo Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN35-AHL6 (SU 1764515), E. coli kmeň pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli kmeň pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli kmeň SG 20050 s plazmidom p280/21FN.VKravchenko (VKrav. Bioorganic chemistry, 1987, zv. 13, č. 9, str. 1186-1193), kmeň E. Coli SG 20050 s plazmidom pINF14 (SU 1703691), kmeň E. coli SG 20050 s plazmidom pINF16 (4051). a pod. Nevýhodou technológií založených na použití týchto kmeňov je ich nestabilita, ako aj nedostatočná úroveň expresie interferónu.

Spolu s charakteristikami použitých kmeňov účinnosť procesu do značnej miery závisí od technológie použitej na izoláciu a čistenie interferónu.

Expresia interferónu kmeňom E. coli SS5 obsahujúcim tento plazmid je riadená tromi promótormi: Plac, Pt7 a Ptrp. Úroveň expresie interferónu je asi 800 mg na 1 liter bunkovej suspenzie.

Gén zodpovedný za biosyntézu IFN bol izolovaný z ľudskej bunky. Exogénny ľudský IFN sa vyrába pomocou technológie rekombinantnej DNA. Postup izolácie IFN-s cDNA je nasledujúci:

1) mRNA je izolovaná z ľudských leukocytov, frakcionovaná podľa veľkosti, reverzne transkribovaná a vložená do miesta modifikovaného plazmidu.

2) Výsledný produkt sa použije na transformáciu E. coli; výsledné klony sú rozdelené do skupín, ktoré sú identifikované.

3) Každá skupina klonov sa hybridizuje s IFN - mRNA.

4) Z výsledných hybridov obsahujúcich cDNA a chRNA sa izoluje mRNA a preloží sa v systéme syntézy proteínov.

2. Mechanizmy účinku interferónov

IFN vykazujú určité aktivity ako lymfokíny a imunomodulátory. IFN typu I, ktoré pôsobia primárne ako inhibítory replikácie vírusu v bunke, uplatňujú svoj účinok stimuláciou produkcie bunkových enzýmov ribozómami hostiteľských buniek, ktoré inhibujú produkciu vírusov, narúšajú transláciu vírusovej mRNA a syntézu vírusové proteíny.

IFN produkuje väčšina živočíšnych druhov, ale prejav ich aktivity je druhovo špecifický, t.j. účinkujú len v druhu zvierat, v ktorom sú vyrobené.

IFN spôsobujú indukciu troch enzýmov:

proteínkináza, ktorá narúša počiatočnú fázu výstavby peptidového reťazca;

oligoizoadenylátsyntetáza, ktorá aktivuje RNázu, ktorá ničí vírusovú RNA;

fosfodiesteráza, ktorá ničí konečné nukleotidy tRNA, čo vedie k narušeniu predlžovania peptidov.

Berúc do úvahy antivírusové a imunomodulačné účinky IFN, NPO Biomed navrhla a úspešne otestovala čapíky s IFNan1 a probiotikami na liečbu dysbakteriózy vírusovej a bakteriálnej etiológie, kandidózy; v gynekologickej praxi na liečbu endometritídy, kolpitídy, vaginitídy a gynekologického herpesu.

3. Terapeutické využitie ľudského INF

Tak bolo možné vyvinúť lieky Viferon, Interal a ďalšie obsahujúce rekombinantný ľudský interferón alfa

Pre svoje jedinečné vlastnosti sa interferónové prípravky používajú pri liečbe a prevencii všetkých ochorení dýchacích ciest, väčšiny nádorových ochorení, pri liečbe mnohých vírusových ochorení a chrípky. Prípravky s interferónom sa široko používajú pri liečbe hepatitídy B a C: interferón obmedzuje vývoj vírusu, zabraňuje vzniku cirhózy a eliminuje smrť.

Niektoré interferónové lieky majú vedľajšie účinky, ako sú kožné vyrážky, alergie a ochorenia hematopoetického systému.

Pri dlhodobom užívaní interferónu si telo vytvára protilátky proti interferónu, vďaka čomu nie je schopné bojovať s vírusmi. Príčina týchto javov spočíva v prítomnosti albumínu v prípravkoch na báze interferónu.

Albumín sa získava z krvi, takže existuje riziko (aj keď minimálne) nákazy hepatitídou a inými krvou prenosnými chorobami.

Názov lieku	Podtyp INF	Spôsob získania	farmakologický účinok	Indikácie na použitie
Interferón		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom vírusov	Antivírusové, imunomodulačné, antiproliferatívne	Vírusové ochorenia, leukémia, malígny melanóm, rakovina obličiek, karcinoidný syndróm
Blokovanie		Biosyntéza v kultivovaných leukocytoch darcovskej krvi pod vplyvom paramykovírusov	Potláča aktivitu množstva vírusov	Vírusové ochorenia očí, hepatitída	Rekombinantný	Antivírusový, imunomodulačný, inhibuje proliferáciu širokého spektra nádorových buniek	Epiteliálna forma akútnej a rekurentnej vírusovej infekcie oka; onkologické ochorenia
Interferón alfa-2a		Rekombinantný. Proteín obsahujúci 165 aminokyselín	Antivírusová, protinádorová aktivita	Leukemická retikuloendotelióza, Kaposiho sarkóm, rakovina obličiek, rakovina močového mechúra, melanóm, herpes zoster
Reaferon		Rekombinantný INF produkovaný bakteriálnym kmeňom pseudomonas, ktorého genetický aparát obsahuje ľudský leukocytový gén IFN α2. Identický s ľudským leukocytovým IFN a2.		Vírusové, nádorové ochorenia
Interferón alfa – n1		Vysoko purifikovaný ľudský INF	Antivírusový	Chronická aktívna infekčná hepatitída B
Inreferon beta		Superprodukcia ľudských fibroblastov stimulátorom v prítomnosti metabolických inhibítorov	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické vírusové infekcie v oftalmológii, gynekológii a urológii, dermatológii, hepatológii, onkológii
Interferón gama		Rekombinantný	Antivírusová, imunomodulačná, protinádorová aktivita	Chronické granulomatózne ochorenia

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Dočasný liekopisný článok 42U-23/60-439-97. Ľudský rekombinantný interferón alfa-2.

5. Gavrikov A.V. Optimalizácia biotechnologickej produkcie rekombinantných ľudských interferónových látok - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.

7. Štátny liekopis ZSSR. Vyd. XI., číslo 1.- S. 175.

8. Štátny register liekov / Ed. A.V. Katlinsky a ďalší - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Molekulárna biotechnológia interferónov. // zborník vedeckej a praktickej konferencie „Interferón – 50 rokov“. – M., 2007, s. 17-23

10. Základy farmaceutickej biotechnológie: Učebnica / T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Michaleva. – Rostov na Done: Phoenix; Tomsk: Vydavateľstvo NTL, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. a ďalšie.

Interferón označuje dôležité ochranné proteíny imunitného systému. Objavený počas štúdia vírusovej interferencie, t.j. javu, keď sa zvieratá alebo bunkové kultúry infikované jedným vírusom stali necitlivými na infekciu iným vírusom. Ukázalo sa, že rušenie je spôsobené výsledným proteínom, ktorý má ochranné antivírusové vlastnosti. Tento proteín sa nazýval interferón.

Alfa interferón produkovaný leukocytmi a nazýva sa leukocyt; beta interferón nazývaný fibroblastický, pretože ho syntetizujú fibroblasty – bunky spojivového tkaniva, a gama interferón - imunitný, keďže ho produkujú aktivované T-lymfocyty, makrofágy, prirodzené zabíjačské bunky, teda imunitné bunky.

Interferón sa v tele neustále syntetizuje a jeho koncentrácia v krvi sa udržiava na približne 2 IU/ml (1 medzinárodná jednotka - IU - je množstvo interferónu, ktoré chráni bunkovú kultúru pred 1 CPD 50 vírusu). Produkcia interferónu sa prudko zvyšuje počas infekcie vírusmi, ako aj pri vystavení induktorom interferónu, ako je RNA, DNA a komplexné polyméry. Takéto induktory interferónu sa nazývajú interferonogény.

Okrem antivírusového účinku má interferón protinádorovú ochranu, pretože odďaľuje proliferáciu (reprodukciu) nádorových buniek, ako aj imunomodulačnú aktivitu, stimuluje fagocytózu, prirodzené zabíjačské bunky, reguluje tvorbu protilátok B bunkami, aktivuje expresiu hl. histokompatibilný komplex.

Mechanizmus akcie interferón je komplexný. Interferón priamo neovplyvňuje vírus mimo bunky, ale viaže sa na špeciálne bunkové receptory a ovplyvňuje proces rozmnožovania vírusu vo vnútri bunky v štádiu syntézy proteínov.

Použitie interferónu. Pôsobenie interferónu je tým účinnejšie, čím skôr sa začne syntetizovať alebo vstúpiť do tela zvonku. Preto sa používa na profylaktické účely pri mnohých vírusových infekciách, ako je chrípka, ako aj na terapeutické účely pri chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D), herpes, roztrúsená skleróza atď. Interferón dáva pozitívny výsledky pri liečbe zhubných nádorov a ochorení spojených s imunodeficienciou.

Interferóny sú druhovo špecifické, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto druhová špecifickosť je však relatívna.

Príjem interferónu. Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním ľudských leukocytov alebo lymfocytov bezpečným vírusom, v dôsledku čoho infikované bunky syntetizujú interferón, ktorý sa potom izoluje a z neho sa skonštruujú interferónové prípravky; b) geneticky upravené - pestovaním rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón za produkčných podmienok. Typicky sa používajú rekombinantné kmene pseudomonas a Escherichia coli s interferónovými génmi zabudovanými do ich DNA. Interferón získaný genetickým inžinierstvom sa nazýva rekombinantný. V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov „Reaferon“. Výroba tohto lieku je v mnohých ohľadoch účinnejšia a lacnejšia ako liek na báze leukocytov.

Rekombinantný interferón našiel široké použitie v medicíne ako preventívne a terapeutické činidlo na vírusové infekcie, novotvary a imunodeficiencie.

Antigény. Definícia. Koncept úplných a defektných antigénov. Požiadavky na antigény. Pojmy o antigénnych vlastnostiach mikroorganizmov. Antigénna štruktúra baktérií.

Antigény(z lat. anti - proti, genos - rod) - geneticky cudzorodé látky, ktoré po zavedení do vnútorného prostredia organizmu sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď v podobe tvorby protilátok alebo imunitných T-lymfocytov a interagovať s ich. Hlavnými vlastnosťami antigénu sú imunogenicita a špecifickosť. Antigény sú štrukturálne a chemické prvky buniek a produkty ich metabolizmu.

Antigény sú telu cudzie látky koloidnej štruktúry, ktoré po zavedení do jeho vnútorného prostredia sú schopné vyvolať špecifickú imunologickú odpoveď prejavujúcu sa najmä tvorbou špecifických protilátok, výskytom senzibilizovaných lymfocytov, resp. vznik stavu tolerancie k tejto látke.

Látky, ktoré sú antigénmi, musia byť pre telo cudzie, makromolekulárne, v koloidnom stave a do organizmu sa dostávajú parenterálne, t.j. obchádzanie gastrointestinálneho traktu, pri ktorom sa látka zvyčajne rozkladá a stráca sa jej cudzorodosť. Cudzosť antigénov treba chápať ako určitú mieru chemickej odlišnosti medzi antigénom a makromolekulami organizmu do vnútorného prostredia, do ktorého vstupuje.

Antigénne vlastnosti sú spojené s molekulovou hmotnosťou makromolekuly. Čím vyššia je molekulová hmotnosť látky, tým vyššia je jej antigenicita. Je však nesprávne predpokladať, že vysoká molekulová hmotnosť je povinnou vlastnosťou antigénu. Antigénne vlastnosti má teda aj glukagón, vazopresín – angiotenzín.

Je zvykom rozlišovať kompletné antigény, nižšie antigény (haptény) a polovičné haptény.

Plnohodnotné antigény sú tie, ktoré spôsobujú tvorbu protilátok alebo senzibilizáciu lymfocytov a sú schopné s nimi reagovať ako v organizme, tak aj v laboratórnych reakciách. Vlastnosti plnohodnotných antigénov majú proteíny, polysacharidy, vysokomolekulárne nukleové kyseliny a komplexné zlúčeniny týchto látok.

Defektné antigény alebo haptény samy o sebe nie sú schopné spôsobiť tvorbu protilátok alebo senzibilizáciu lymfocytov. Táto vlastnosť sa objaví len vtedy, keď sa k nim pridajú plnohodnotné antigény („vodiče“) a medzi výslednými protilátkami alebo senzibilizovanými lymfocytmi sú niektoré špecifické pre „vodič“ a niektoré sú špecifické pre haptén.

Hemihaptény sú pomerne jednoduché látky, ktoré sa pri vstupe do vnútorného prostredia organizmu dokážu chemicky spojiť s bielkovinami tohto organizmu a dať im vlastnosti antigénov. Medzi tieto látky môžu patriť aj niektoré lieky (jód, bróm, antipyrín atď.).

Molekula antigénu pozostáva z dvoch nerovnakých častí. Aktívna (malá časť) c sa nazýva antigénny determinant (epitop) a určuje antigénnu špecifickosť. Antigénne determinanty sa nachádzajú v tých miestach molekuly antigénu, ktoré sú v najväčšom spojení s mikroprostredím. V molekule proteínu sa napríklad môžu nachádzať nielen na koncoch polypeptidového reťazca, ale aj v jeho iných častiach. Antigénne determinanty obsahujú aspoň tri aminokyseliny s rigidnou štruktúrou (tyrozín, tryptofán, fenylalanín). Špecifickosť antigénu súvisí aj s poradím striedania aminokyselín polypeptidového reťazca a kombináciou ich vzájomnej polohy. Počet antigénnych determinantov v molekule antigénu určuje jej valenciu. Čím vyššia je relatívna molekulová hmotnosť molekuly antigénu, tým je vyššia.

Predpokladá sa, že zvyšná (neaktívna) časť molekuly antigénu hrá úlohu nosiča determinantu a podporuje penetráciu antigénu do vnútorného prostredia tela, jeho pinocytózu alebo fagocytózu, teda bunkovú reakciu na penetráciu antigén, tvorba mediátorov medzibunkovej interakcie v imunitnej odpovedi (T lymfocyty majú receptory pre nosič , B- na antigénny determinant).

Podľa anatomických štruktúr bakteriálnej bunky existujú H-antigény (bičíkové, ak ich baktéria má), K-antigény (nachádzajú sa na povrchu bunkovej steny), O-antigény (spojené s bakteriálnou bunkovou stenou) , antigény vylučované baktériami do svojho prostredia (proteíny- exotoxíny, kapsulové polysacharidy).

Medzi početnými antigénmi mikrobiálnej bunky sú tie, ktoré sú vlastné len danému typu mikróbov (typové antigény), danému druhu (druhové antigény), ako aj tie, ktoré sú spoločné pre skupinu (rodinu) mikroorganizmov (skupina antigény).

Bakteriálna bunka (ako aj mikroorganizmy iných mikrobiálnych ríš - vírusy, prvoky, huby) teda predstavujú komplexný komplex početných antigénov. Keď sa dostane do vnútorného prostredia makroorganizmu, mnohé z týchto antigénov si vytvoria svoje vlastné špecifické protilátky. Niektoré antigény vyvolávajú tvorbu sotva znateľného množstva protilátok (titra), zatiaľ čo iné vyvolávajú rýchlu a významnú tvorbu protilátok. Podľa toho sa rozlišujú „slabé“ a „silné“ antigény.

Nie všetky antigény bakteriálnej bunky sa rovnako podieľajú na indukcii imunity (imunity) proti opätovnému vstupu patogénnych mikróbov rovnakého druhu do makroorganizmu. Schopnosť antigénu vyvolať imunitu sa nazýva imunogenicita a takýto antigén sa nazýva imunogén. Zistilo sa tiež, že určité antigény určitých mikroorganizmov môžu spôsobiť rozvoj rôznych typov precitlivenosti (alergií). Takéto antigény sa nazývajú alergény.

Na základe štruktúry vírusovej častice sa rozlišuje niekoľko skupín antigénov: jadrové, kapsidové a superkapsidové. Antigénne zloženie viriónu závisí od štruktúry samotnej vírusovej častice. Antigénna špecifickosť jednoducho organizovaných vírusov je spojená s ribo- a deoxynukleoproteínmi. V komplexných vírusoch je časť antigénu spojená s nukleokapsidom a druhá je lokalizovaná vo vonkajšom obale - superkapside.

Imunogenicita- schopnosť vyvolať imunitnú odpoveď.

Špecifickosť- schopnosť antigénu interagovať s protilátkami preň špecifickými alebo aktivovanými (primovanými) lymfocytmi, čo vedie k neutralizácii tohto antigénu.

Imunogenicita sa stanovuje:

Cudzosť, tie. látka musí byť rozpoznaná imunitným systémom ako „nevlastná“. Navyše, čím menej výrazný je genetický vzťah medzi organizmom a podávanou látkou, tým lepší je imunogén;

Molekulová hmotnosť, čo by malo byť aspoň 5-10 kDa. Čím väčšia je molekulová hmotnosť antigénu, tým silnejšia bude imunitná odpoveď;

Chemická povaha. Antigény môžu byť proteíny, polysacharidy, polypeptidy, fosfolipidy, nukleové kyseliny atď.

V závislosti od chemickej povahy a molekulovej hmotnosti môžu byť antigény plný A neúplné

(haptény).

Úplné antigény(imunogény) vyvolávajú špecifickú imunitnú odpoveď a interagujú s protilátkami a aktivovanými T-lymfocytmi. Ide o vysokomolekulárne látky – bielkoviny, polysacharidy, glykoproteíny, lipopolysacharidy, lipoproteíny, nukleoproteíny a korpuskulárne formy (mikroorganizmy, cudzorodé bunky a pod.). Antigény môžu byť exogénne alebo endogénne. Endogénne Ag sú telu vlastné bunky so zmeneným genómom a produktmi, ktoré tvoria ( autoantigény).

Haptens- sú to jednoduché chemické zlúčeniny s nízkou molekulovou hmotnosťou: disacharidy, lipidy, peptidy, nukleové kyseliny atď. Nie sú imunogénne, ale majú vysokú úroveň špecifickosti pri interakcii s produktmi imunitnej odpovede (protilátky a T-lymfocyty). Ak sa haptén skombinuje s proteínom, získa vlastnosť imunogenicity (t.j. stane sa úplným). Špecifickosť tohto komplexu je určená hapténom

Polovičné haptény

Proantigény

Polovičné haptény vznikajú pri spojení anorganických látok (jód, bróm, dusík atď.) s bielkovinami. Takéto komplexy môžu indukovať tvorbu protilátok špecifických pre anorganické zlúčeniny.

Proantigény sú alergény-haptény alebo neantigénne látky (sulfónamidy, antibiotiká, fenolftaleín atď.). V kombinácii s proteínmi makroorganizmu môžu spôsobiť stav senzibilizácie a rozvoj alergických reakcií.