fagocytóza - komplex bunkových reakcií zameraných na rozpoznanie, absorpciu a elimináciu korpuskulárnych častíc väčších ako 0,5 mikrónu z tela. Proces fagocytózy pozostáva z nasledujúcich etáp: chemotaxia, adhézia, absorpcia, usmrtenie a trávenie objektu.
Testy úrovne I
Absorpčná fáza
Absorpčná aktivita(fagocytárne číslo - FF). Metóda výskumu: mikroskopické. Odhaľuje percento neutrofilov schopných absorbovať korpuskulárne antigény (kvasinky, latex, kultúra stafylokokov). Absorpčná aktivita je narušená menej často ako iné funkcie fagocytujúcich buniek. Norm(objekt fagocytózy – kvasinky): 60-90 %.
Absorpčná aktivita je znížená - myeloproliferatívne ochorenia, ťažké infekcie, sepsa, peritonitída/
Štádium trávenia (úplnosť fagocytózy)
Výskumné metódy: mikroskopické, prietoková cytometria. Mikroskopická metóda je založená na spočítaní počtu živých a mŕtvych mikrobiálnych buniek v 100 neutrofiloch a výpočte baktericídneho indexu (FI = H zabité / H nažive). Metóda prietokovej cytometrie zahŕňa automatizované zaznamenávanie počtu živých a mŕtvych mikrobiálnych buniek pred a po ich interakcii s neutrofilmi. Norm(mikroskopická metóda): 60-70 %.
Znižuje sa tráviaca činnosť - opakujúce sa bakteriálne infekcie; pomalé purulentno-zápalové procesy; dlhodobo nehojace sa rany; myeloidná leukémia, diabetes mellitus, urémia, popáleniny, brušné operácie, imunosupresívna liečba.
Baktericídna aktivita (zabíjanie)
Antimikrobiálne faktory neutrofilov sú rozdelené na kyslíkovo závislé a kyslíkovo nezávislé. Metódy štúdia faktorov závislých od kyslíka: NBT test, chemiluminiscencia.
Test NBT spontánny(test redukcie nitromodrej tetrazólie) je založený na schopnosti častíc nitrotetrazoliovej modrej absorbovanej neutrofilom meniť farbu pod vplyvom reaktívnych foriem kyslíka. Test odhalí percento neutrofilov s reaktívnymi formami kyslíka. Metóda výskumu: mikroskopický. Norm: 4-10%.
Test NBT zvýšený – akútne bakteriálne infekcie (v počiatočnom období), generalizácia fokálnych zápalových procesov, pľúcna tuberkulóza, chronická hepatitída, reumatizmus, reumatoidná artritída.
NBT test znížený – chronický zápalový proces, zhubné novotvary, ťažké popáleniny, trauma, stres, podvýživa, liečba cytostatikami a imunosupresívami.
NBT test je negatívny – vrodená chyba fagocytózy (chronická granulomatózna choroba).
Stimulované testom NBT (fagocytárna rezerva) odráža potenciálnu schopnosť neutrofilov produkovať reaktívne formy kyslíka v reakcii na antigénnu stimuláciu. Norm(fagocytárna rezerva) 2,4-3,5.
Fagocytová rezerva je znížená - purulentno-zápalové procesy, závažné pyogénne kožné infekcie; myeloidná leukémia, diabetes mellitus, urémia, popáleniny, brušné operácie, imunosupresívna liečba.
Imunodiagnostika porúch bunkovej imunity
Testy úrovne I. Fenotypizácia lymfocytov
Pod svetelným mikroskopom vyzerajú všetky lymfocyty rovnako, možno ich však rozlíšiť podľa antigénov na povrchu buniek, označujú sa ako molekuly CD (CD1, CD2, CD3 atď. až po CD130) a detegujú sa pomocou monoklonálnych protilátok. Súbor antigénov závisí od typu buniek a ich funkcií. V súlade s vo svete všeobecne akceptovanou klasifikáciou CD-klastrov sa za marker všetkých T-lymfocytov považuje CD3, marker T-pomocných buniek CD4, marker T-killer/cytotoxický CD8 atď.
Metóda výskumu: prietoková cytometria s použitím monoklonálnych protilátok značených fluorochrómovými farbivami na špecifické povrchové markery týchto buniek a následná automatická registrácia.
Počet hlavných subpopulácií krvných lymfocytov (normálne hodnoty)
| Index | 0-3 mesiace | 3-12 mesiacov | 1-2 roky | 2-6 rokov | 6-16 rokov | 16-80 rokov | |
| CD3+ | % | 55-78 | 45-79 | 53-81 | 62-80 | 66-76 | 55-80 |
| abs *10 9 /l | 2,07-6,54 | 2,28-6,45 | 1,46-5,54 | 1,61-4,23 | 1,40-2,00 | 0,80-2,00 | |
| CD3+CD4+ | % | 41-64 | 36-61 | 31-54 | 35-51 | 33-41 | 31-49 |
| abs *10 9 /l | 1,46-5,12 | 1,69-4,60 | 1,02-3,60 | 0,90-2,86 | 0,7-1,10 | 0,6-1,60 | |
| CD3+CD8+ | % | 16-35 | 16-34 | 16-38 | 22-38 | 27-35 | 12-30 |
| abs *10 9 /l | 0,65-2,45 | 0,72-2,49 | 0,57-2,23 | 0,63-1,91 | 0,60-0,90 | 0,19-0,65 | |
| CD16+CD56+ | % | 2-14 | 2-13 | 3-16 | 4-23 | 4-27 | 6-20 |
| abs *10 9 /l | 0,04-0,92 | 0,04-0,92 | 0,04-0,92 | 0,10-1,33 | 0,10-0,50 | 0,15-0,60 | |
| CD19+ (CD20+) | % | 19-31 | 19-31 | 19-31 | 21-28 | 12-22 | 5-19 |
| abs *10 9 /l | 0,50-1,50 | 0,50-1,50 | 0,50-1,50 | 0,70-1,30 | 0,30-0,50 | 0,10-0,50 | |
| CD3+HLADR+ | % | 1-9 | 1-7 | 3-12 | 3-13 | 3-10 | 0-12 |
T lymfocyty (CD3)
Zvýšená hladina CD3+ – počiatočné obdobie akútneho zápalového procesu, lymfocytová leukémia, exacerbácia chronického zápalového procesu.
Znížená úroveň CD3+ – primárne a sekundárne imunodeficiencie so zhoršenou imunitou T-buniek; zápalové ochorenia, zhubné novotvary, stavy po úraze, operácii, užívaní cytostatík, hormónov, imunosupresív.
Aktivované T lymfocyty (CD25, HLA-DR)
Aktivačné markery – CD25, HLA-DR. sa objavujú na T-lymfocytoch, ktoré sú v štádiu aktivácie a možno ich použiť na diagnostiku, hodnotenie aktivity imunopatologických ochorení a sledovanie liečby.
Hladina CD3 + CD25 + , CD3 + HLA-DR + je zvýšená – aktivácia imunitnej odpovede: akútny alebo chronický zápalový proces, zápal pľúc, infekcia HIV, autoimunitné a onkologické ochorenia. Indikátory klesajú do normálu s priaznivým priebehom ochorenia.
Úroveň CD3 + CD25 + , CD3 + HLA-DR + je znížená – imunodeficiencie s poruchou imunity T-buniek.
T pomocné bunky (CD3CD4)
Úroveň CD3 + CD4 + zvýšená – akútny infekčno-zápalový proces, exacerbácia alergických a autoimunitných ochorení.
Úrovne CD3+CD4+ sú znížené– vrodené a získané imunodeficiencie, HIV infekcia, infekčná mononukleóza, zhubné nádory, dlhodobá liečba cytostatikami, hormónmi, imunosupresívami.
T-cytotoxické (T-killer) bunky (CD3CD8)
Úroveň CD3 + CD8 + znížená – primárne a sekundárne imunodeficiencie, progresívne zhubné nádory, rádioterapia, dlhodobá liečba cytostatikami, hormónmi, imunosupresívami.
Imunoregulačný index
Pre niektoré ochorenia má pomer diagnostický a prognostický význam CD4/CD8 alebo imunologický index (IRI). Norm: 1,2-2,5.
CD4/CD8 (IRI) zvýšené – autoimunitné ochorenia, akútna T-lymfoblastická leukémia, tymóm.
CD4/CD8 (IRI) znížené – vírusové infekcie (herpes, osýpky, vírusová hepatitída, infekčná mononukleóza, HIV/AIDS), chronické ochorenia, nádory, mnohopočetný myelóm. Hodnota IRI menšia ako 1 nepriamo zodpovedá imunodeficiencii.
Prirodzené zabíjačské bunky (HK bunky, CD16CD56)
NK bunky sú veľké granulované lymfocyty, ktoré lyzujú cieľové bunky infikované vírusmi, intracelulárnymi patogénmi, ako aj mutantnými a nádorovými bunkami, bez špecifického rozpoznania, ktoré vyžadujú zabíjačské T bunky.
Hladina NK buniek (CD3 + - CD16 + CD56 +) je zvýšená – akútny zápalový proces, bronchiálna astma, zhubné novotvary, leukémia.
NKT bunky (CD3CD16CD56)
NKT bunky majú receptory pre NK bunky aj T lymfocyty. Vykonávajú regulačnú funkciu syntézou cytokínov.
Úroveň (CD3 + CD16 + CD56 +) zvýšená – pri akútnych ťažkých zápalových procesoch, onkologických ochoreniach.
Úroveň (CD3 + CD16 + CD56 +) znížená – na autoimunitné ochorenia.
B lymfocyty (CD19, CD20)
Úroveň CD19+, CD20+ s nízka - hypo- a agamaglobulinémia (vrodená a získaná); lymfocytová leukémia, non-B-bunkový lymfóm; splenektómia; užívanie imunosupresív.
Hlavnou úlohou T-lymfocytov je rozpoznať cudzie alebo zmenené vlastné antigény ako súčasť komplexu s molekulami MHC. Ak sú na povrchu jeho buniek cudzie alebo zmenené molekuly, T-lymfocyt spustí ich deštrukciu.
Na rozdiel od B lymfocytov, T lymfocyty neprodukujú rozpustné formy molekúl rozpoznávajúcich antigén. Navyše väčšina T lymfocytov nie je schopná rozpoznať a viazať rozpustné antigény.
Aby T-lymfocyt „venoval pozornosť antigénu“, iné bunky musia nejakým spôsobom „prejsť“ antigén cez seba a zobraziť ho na svojej membráne v komplexe s MHC-I alebo MHC-II. Toto je fenomén prezentácie antigénu T lymfocytom. Rozpoznanie takéhoto komplexu T-lymfocytmi je dvojité rozpoznanie alebo MHC obmedzenie T-lymfocytov.
ANTIGÉN ROZPOZNÁVANIE T-LYMFOCYTOVÝ RECEPTOR
Receptory rozpoznávajúce antigén T lymfocytov, TCR, sú zložené z reťazcov patriacich do superrodiny imunoglobulínov (pozri obrázok 5-1). Oblasť rozpoznávania antigénu TCR vyčnievajúca nad povrch bunky je heterodimér, t.j. pozostáva z dvoch rôznych polypeptidových reťazcov. Existujú dva známe varianty TCR, označené ako αβTCR a γδTCR. Tieto varianty sa líšia v zložení polypeptidových reťazcov oblasti rozpoznávania antigénu. Každý T lymfocyt exprimuje iba 1 variant receptora. αβT bunky boli objavené skôr a študované podrobnejšie ako γδT lymfocyty. V tomto ohľade je vhodnejšie opísať štruktúru receptora rozpoznávajúceho antigén T lymfocytov pomocou príkladu aβTCR. Transmembránový komplex TCR pozostáva z 8 polypeptidov
Ryža. 6-1. Schéma T bunkového receptora a s ním spojených molekúl
reťazcov (heterodimér α- a β-reťazcov samotného TCR, dva pomocné ζ reťazce, ako aj jeden heterodimér z ε/δ- a ε/ γ-reťazcov molekuly CD3) (obr. 6- 1).
. Transmembránové reťazceα a β TCR. Ide o 2 polypeptidové reťazce približne rovnakej veľkosti -α (molekulová hmotnosť 40-60 kDa, kyslý glykoproteín) aβ (molekulová hmotnosť 40-50 kDa, neutrálny alebo zásaditý glykoproteín). Každý z týchto reťazcov obsahuje 2 glykozylované domény v extracelulárnej časti receptora, hydrofóbnu (kladne nabitú vďaka lyzínovým a arginínovým zvyškom) transmembránovú časť a krátku (5-12 aminokyselinových zvyškov) cytoplazmatickú oblasť. Extracelulárne časti oboch reťazcov sú spojené jednou disulfidovou väzbou.
- V-región. Vonkajšie extracelulárne (distálne) domény oboch reťazcov majú variabilné zloženie aminokyselín. Sú homológne s V oblasťou imunoglobulínových molekúl a tvoria V oblasť TCR. Sú to V oblasti reťazcov α a β, ktoré interagujú s komplexom MHC-peptid.
-C-oblasť. Proximálne domény oboch reťazcov sú homológne s konštantnými oblasťami imunoglobulínov; toto sú C oblasti TCR.
Krátka cytoplazmatická oblasť (a- aj β-reťazce) nemôže nezávisle zabezpečiť vedenie signálu do bunky. Na tento účel sa používa 6 ďalších polypeptidových reťazcov: γ, 5, 2ε a 2ζ.
.CD3 komplex. reťazeγ, δ, ε tvoria medzi sebou heterodiméryγε a δε (spolu sa nazývajú komplex CD3). Tento komplex je potrebný na vyjadrenieα- a β-reťazcov, ich stabilizácia a prenos signálu do bunky. Tento komplex pozostáva z extracelulárnej, transmembránovej (negatívne nabitej, a preto elektrostaticky spojenej s transmembránovými oblasťamiα- a β-reťazce) a cytoplazmatické časti. Je dôležité nezamieňať reťazce komplexu CD3 sγ 5 reťazcov TCR diméru.
.ζ - Reťaze navzájom spojené disulfidovým mostíkom. Väčšina týchto reťazcov sa nachádza v cytoplazme. ζ-reťazce prenášajú signál do bunky.
.ITAM sekvencie. Cytoplazmatické oblasti polypeptidových reťazcovγ, 5, ε a ζ obsahuje 10 ITAM sekvencií (1 sekvencia v každejγ-, ε- a δ-reťazce a 3 - v každom ζ-reťazci), interagujúce s Fyn, cytosolickou tyrozínkinázou, ktorej aktivácia iniciuje nástup biochemických reakcií na vedenie signálu (pozri obr. 6-1).
Väzba antigénu zahŕňa iónové, vodíkové, van der Waalsove a hydrofóbne sily; výrazne sa mení konformácia receptora. Teoreticky je každý TCR schopný viazať približne 105 rôznych antigénov, nielen príbuzných v štruktúre (skrížene reagujúce), ale tiež nie homológnych v štruktúre. V skutočnosti je však polyšpecifickosť TCR obmedzená na rozpoznanie iba niekoľkých štruktúrne podobných antigénnych peptidov. Štrukturálnym základom tohto javu je vlastnosť súčasného TCR rozpoznania komplexu MHC-peptid.
Molekuly koreceptorov CD4 a CD8
Okrem samotného TCR každý zrelý T lymfocyt exprimuje jednu z takzvaných koreceptorových molekúl - CD4 alebo CD8, ktoré tiež interagujú s molekulami MHC na APC alebo cieľových bunkách. Každý z nich má pridruženú cytoplazmatickú oblasť
s tyrozínkinázou Lck a pravdepodobne prispieva k prenosu signálu do bunky počas rozpoznávania antigénu.
.CD4(β2 doména) molekuly MHC-II (patrí do superrodiny imunoglobulínov, pozri obr. 5-1, b). CD4 má molekulovú hmotnosť 55 kDa a 4 domény v extracelulárnej časti. Keď je aktivovaný T-lymfocyt, jedna molekula TCR je „obsluhovaná“ 2 molekulami CD4: pravdepodobne dochádza k dimerizácii molekúl CD4.
.CD8 spojené s invariantnou časťou(α3-doména) molekuly MHC-I (patrí do superrodiny imunoglobulínov, pozri obr. 5-1, a). CD8 - heterodimér reťazcaα a β, spojené disulfidovou väzbou. V niektorých prípadoch sa nájde homodimér dvoch reťazcov a, ktorý môže tiež interagovať s MHC-I. V extracelulárnej časti má každý z reťazcov jednu doménu podobnú imunoglobulínu.
Gény receptorov T buniek
Gény α-, β-, γ- a δ-reťazce (obr. 6-2, pozri aj obr. 5-4) sú homológne s imunoglobulínovými génmi a pri diferenciácii T-lymfocytov prechádzajú rekombináciou DNA, čo teoreticky zabezpečuje vznik tzv. asi 10 16 -10 18 variantov receptorov viažucich antigén (v skutočnosti je táto rozmanitosť obmedzená počtom lymfocytov v tele na 10 9).
.Gény a-reťazca majú ~54 V-segmentov, 61 J-segmentov a 1 C-segment.
.Gény p-reťazca obsahujú ~65 V segmentov, 2 D segmenty, 13 J segmentov a 2 C segmenty.
.δ-reťazcové gény. Medzi segmentmi V a J α-reťazca sú gény segmentov D-(3), J-(4) a C-(1) δ-reťazcaγ δTCR. V segmenty ô reťazca sú rozptýlené medzi V segmenty a reťazca.
.γ-reťazcové gény γ δTCR majú 2 C segmenty, 3 J segmenty pred prvým C segmentom a 2 J segmenty pred druhým C segmentom, 15 V segmenty.
Preskupenie génov
.K rekombinácii DNA dochádza, keď sa spoja V-, D- a J-segmenty a je katalyzovaná rovnakým komplexom rekombinázy ako pri diferenciácii B lymfocytov.
.Po preskupení VJ v génoch α-reťazca a VDJ v génoch β-reťazca, ako aj po pridaní nekódujúcich N- a P-nukleotidov do DNA
Ryža. 6-2. Gény α- a β-reťazcov ľudského T-lymfocytového receptora na rozpoznávanie antigénu
transkribované RNA. Fúzia s C segmentom a odstránenie nadbytočných (nepoužitých) J segmentov nastáva počas zostrihu primárneho transkriptu.
.Gény α-reťazca sa môžu opakovane preusporiadať, zatiaľ čo gény β-reťazca sú už správne preusporiadané a exprimované. To je dôvod, prečo existuje určitá možnosť, že jedna bunka môže niesť viac ako jeden variant TCR.
.Gény TCR nepodliehajú somatickej hypermutagenéze.
VEDENIE SIGNÁLOV Z ANTIGÉNOVÝCH RECEPTOROV LYMFOCYTOV
TCR a BCR majú množstvo spoločných vzorov registrácie a prenosu aktivačných signálov do bunky (pozri obr. 5-11).
. Klastrovanie receptorov. Na aktiváciu lymfocytu je nevyhnutné zoskupenie receptorov rozpoznávajúcich antigén a koreceptorov, t.j. „sieťovanie“ viacerých receptorov s jedným antigénom.
. Tyrozínkinázy. Procesy fosforylácie/defosforylácie proteínov na tyrozínovom zvyšku pôsobením tyrozínkináz a tyrozínfosfatáz hrajú významnú úlohu pri prenose signálu.
čo vedie k aktivácii alebo inaktivácii týchto proteínov. Tieto procesy sú ľahko reverzibilné a „pohodlné“ pre rýchle a flexibilné reakcie buniek na vonkajšie signály.
. Src kinázy. Sekvencie ITAM bohaté na tyrozín cytoplazmatických oblastí imunoreceptorov sú fosforylované nereceptorovými (cytoplazmatickými) tyrozínkinázami rodiny Src (Fyn, Blk, Lyn v B lymfocytoch, Lck a Fyn v T lymfocytoch).
. kinázy ZAP-70(v T lymfocytoch) príp Syk(v B-lymfocytoch), väzba na fosforylované ITAM sekvencie, adaptorové proteíny sa aktivujú a začnú fosforylovať: LAT (Linker pre aktiváciu T buniek)(ZAP-70 kináza), SLP-76 (ZAP-70 kináza) alebo SLP-65 (Syk kináza).
. Adaptérové proteíny získavajú fosfoinozitid-3-kináza(PI3K). Táto kináza zase aktivuje serín/treonín proteínkinázu Akt, čo spôsobuje zvýšenú biosyntézu proteínov, čo podporuje zrýchlený rast buniek.
. Fosfolipáza Cγ (pozri obr. 4-8). Kinázy rodiny Tec (Btk - v B-lymfocytoch, Itk - v T-lymfocytoch) viažu adaptorové proteíny a aktivujú fosfolipázu Cγ(PLCγ ).
PLCγ štiepi fosfatidylinozitoldifosfát (PIP 2) bunkovej membrány na inozitol 1,4,5-trifosfát (IP 3) a diacylglycerol
(DAG).
DAG zostáva v membráne a aktivuje proteínkinázu C (PKC), serín/treonínkinázu, ktorá aktivuje evolučne „starobylý“ transkripčný faktor NFκB.
IP 3 sa viaže na svoj receptor v endoplazmatickom retikule a uvoľňuje ióny vápnika zo zásob do cytosólu.
Voľný vápnik aktivuje proteíny viažuce vápnik – kalmodulín, ktorý reguluje aktivitu radu ďalších proteínov a kalcineurín, ktorý defosforyluje a tým aktivuje jadrový faktor aktivovaných T-lymfocytov NFAT (Nukleárny faktor aktivovaných T buniek).
. Ras a iné malé G proteíny v neaktívnom stave sú spojené s GDP, ale adaptorové proteíny nahrádzajú GTP, čím prenášajú Ras do aktívneho stavu.
Ras má svoju vlastnú aktivitu GTPázy a rýchlo odštiepuje tretí fosfát, čím sa vracia do neaktívneho stavu (samo-inaktivácia).
V stave krátkodobej aktivácie sa Ras podarí aktivovať ďalšiu kaskádu kináz nazývanú MAPK (Mitogénom aktivovaná proteínkináza), ktoré v konečnom dôsledku aktivujú transkripčný faktor AP-1 v bunkovom jadre. Na obr. Obrázok 6-3 poskytuje schematické znázornenie hlavných signálnych dráh TCR. Aktivačný signál sa zapne, keď sa TCR naviaže na ligand (peptidový komplex MHC) za účasti koreceptora (CD4 alebo CD8) a kostimulačnej molekuly CD28. To vedie k aktivácii kináz Fyn a Lck. Oblasti ITAM v cytoplazmatických častiach CD3 polypeptidových reťazcov sú označené červenou farbou. Odráža sa úloha Src kináz spojených s receptorom pri fosforylácii proteínov: receptorových aj signálnych. Pozoruhodný je extrémne široký rozsah účinkov Lck kinázy spojenej s koreceptorom; úloha Fyn kinázy je menej istá (odráža sa v nespojitom charaktere línií).
Ryža. 6-3. Zdroje a smer spúšťania aktivačných signálov pri stimulácii T-lymfocytov. Označenie: ZAP-70 (ζ - pridružená proteínkináza, hovoria hmotnosť 70 kDa) - proteínkináza p70 spojená so z-reťazcom; PLCy (fosfolipáza Cγ ) - fosfolipáza C, izoforma y; PI3K (fosfatidylinozitol 3-kináza)- fosfatidylinozitol 3-kináza; Lck, Fyn-tyrozínkinázy; LAT, Grb, SLP, GADD, Vav - adaptorové proteíny
Tyrozínkináza ZAP-70 hrá kľúčovú úlohu pri sprostredkovaní medzi receptorovými kinázami a adaptorovými molekulami a enzýmami. Aktivuje (prostredníctvom fosforylácie) adaptorové molekuly SLP-76 a LAT a ten prenáša aktivačný signál na ďalšie adaptorové proteíny GADD, GRB a aktivuje y-izoformu fosfolipázy C (PLCy). Pred týmto štádiom transdukcia signálu zahŕňa výlučne faktory spojené s bunkovou membránou. Dôležitým príspevkom k aktivácii signálnych dráh je kostimulačná molekula CD28, ktorá svoje pôsobenie realizuje prostredníctvom asociovanej lipidovej kinázy PI3K (fosfatidylinozitol 3-kináza). Hlavným cieľom PI3K kinázy je faktor Vav spojený s cytoskeletom.
V dôsledku tvorby signálu a jeho prenosu z T-bunkového receptora do jadra vznikajú 3 transkripčné faktory - NFAT, AP-1 a NF-kB, ktoré indukujú expresiu génov riadiacich proces T -aktivácia lymfocytov (obr. 6-4). Tvorba NFAT je spôsobená signálnou dráhou nezávislou na kostimulácii, ktorá sa aktivuje aktiváciou fosfolipázy C a realizuje sa za účasti iónov
Ryža. 6-4. Schéma signálnych dráh počas aktivácie T buniek. NFAT (nukleárny faktor aktivovaných T buniek), AP-1 (aktivačný proteín-1), NF-KB (Jadrový faktorKomu - gén B buniek)- transkripčné faktory
Ca 2+. Táto dráha spôsobuje aktiváciu kalcineurínu, ktorý má fosfatázovú aktivitu a defosforyluje cytosolický faktor NFAT-P. Vďaka tomu NFAT-P získava schopnosť migrovať do jadra a viazať sa na promótory aktivačných génov. Faktor AP-1 sa tvorí ako heterodimér proteínov c-Fos a c-Jun, ktorých tvorba je indukovaná aktiváciou zodpovedajúcich génov pod vplyvom faktorov vytvorených v dôsledku implementácie troch komponenty kaskády MAP. Tieto dráhy sú aktivované krátkymi GTP-viažucimi proteínmi Ras a Rac. Významný príspevok k implementácii MAP kaskády tvoria signály závislé od kostimulácie prostredníctvom molekuly CD28. Tretí transkripčný faktor, NF-kB, je známy ako hlavný transkripčný faktor buniek vrodenej imunity. Aktivuje sa štiepením blokujúcej IκB podjednotky kinázou IKK, ktorá je v T bunkách aktivovaná signalizáciou závislou od izoformy proteínkinázy C (PKC9). Hlavný príspevok k aktivácii tejto signálnej dráhy tvoria kostimulačné signály z CD28. Vytvorené transkripčné faktory sa viažu na promótorové oblasti génov a indukujú ich expresiu. Génová expresia je obzvlášť dôležitá pre počiatočné štádiá reakcie T buniek na stimuláciu IL2 A IL2R, ktorý určuje produkciu T-bunkového rastového faktora IL-2 a expresiu jeho vysokoafinitného receptora na T-lymfocytoch. Výsledkom je, že IL-2 pôsobí ako autokrinný rastový faktor, ktorý spôsobuje proliferatívnu expanziu klonov T-buniek zapojených do odpovede na antigén.
DIFERENCIÁCIA T-LYMFOCYTOV
Základom pre identifikáciu štádií vývoja T-lymfocytov je stav génov receptora V a expresia TCR, ako aj koreceptorov a iných membránových molekúl. Schéma diferenciácie T-lymfocytov (obr. 6-5) je podobná vyššie uvedenej schéme vývoja B-lymfocytov (pozri obr. 5-13). Prezentované sú kľúčové charakteristiky fenotypu a rastových faktorov vyvíjajúcich sa T buniek. Akceptované označenia pre štádiá vývoja T-buniek sú určené expresiou koreceptorov: DN (od Double-Negative CD4CD8) - dvojitý negatívny, DP (od Dvojité pozitívne, CD4 + CD8 +) - dvojitý pozitívny, SP (od Single-Positive, CD4 + CD8 - a CD4CD8 +) sú jednorazovo pozitívne. Rozdelenie DNtymocytov do štádií DN1, DN2, DN3 a DN4 je založené na povahe
Ryža. 6-5. Vývoj T lymfocytov
expresia molekúl CD44 a CD25. Ďalšie symboly: SCF (od faktor kmeňových buniek)- faktor kmeňových buniek, lo (nízka; indexová značka) - nízka úroveň expresie. Štádiá preskupenia: D-J - predbežné štádium, spojenie segmentov D a J (len v génoch β- a δ-reťazcov TCR, pozri obr. 6-2), V-DJ - konečné štádium, spojenie zárodočného V génu s kombinovaným DJ segmentom .
.Tymocyty sa diferencujú zo spoločnej prekurzorovej bunky, ktorá, aj keď je stále mimo týmusu, exprimuje membránové markery ako CD7, CD2, CD34 a cytoplazmatickú formu CD3.
.Prekurzorové bunky určené na diferenciáciu na T lymfocyty migrujú z kostnej drene do subkapsulárnej zóny kôry týmusu, kde sa pomaly množia počas približne jedného týždňa. Na tymocytoch sa objavujú nové membránové molekuly CD44 a CD25.
.Potom sa bunky presunú hlbšie do kôry týmusu a molekuly CD44 a CD25 z ich membrány zmiznú. V tomto štádiu začína preskupenie β génov-, γ- a TCR ô reťazce. Ak gényγ- a δ-reťazce majú čas byť produktívne, t.j. bez posunu rámca sa preusporiadajú skôr ako gény β-reťazca, potom sa lymfocyt diferencuje ďalej akoγ δT. V opačnom prípade je p-reťazec exprimovaný na membráne v komplexe s pTα (invariantný náhradný reťazec, ktorý v tomto štádiu nahrádza skutočný α reťazec) a CD3. Toto slúži
signál na zastavenie preskupovania génov γ- a δ-reťazca. Bunky začnú proliferovať a exprimovať CD4 aj CD8 - dvojaký pozitívny tymocyty. V tomto prípade sa množstvo buniek akumuluje s hotovým β-reťazcom, ale s ešte nepreskupenými génmi α-reťazca, čo prispieva k diverzite αβ-heterodimérov.
.V ďalšom štádiu sa bunky prestanú deliť a začnú preskupovať gény Vα, niekoľkokrát v priebehu 3-4 dní. Preskupenie génov a-reťazca vedie k ireverzibilnej delécii ô-lokusu umiestneného medzi segmentmi génov a-reťazca.
.K expresii TCR dochádza pri každom novom variante α-reťazca a selekcii (selekcii) tymocytov na základe sily väzby na komplex MHC-peptid na membránach epitelových buniek týmusu.
Pozitívna selekcia: tymocyty, ktoré nenaviazali žiadny z dostupných komplexov MHC-peptid, odumierajú. V dôsledku pozitívnej selekcie odumiera asi 90 % tymocytov v týmuse.
Negatívna selekcia eliminuje klony tymocytov, ktoré viažu komplexy MHC-peptid s príliš vysokou afinitou. Negatívna selekcia eliminuje 10 až 70 % buniek, ktoré prešli pozitívnou selekciou.
Tymocyty, ktoré majú naviazaný niektorý z komplexov MHC-peptid so správnym, t.j. s priemernou silou a afinitou dostávajú signál na prežitie a pokračujú v diferenciácii.
.Na krátky čas zmiznú obe molekuly koreceptora z membrány tymocytov a potom sa exprimuje jedna z nich: tymocyty, ktoré rozpoznávajú peptid v komplexe s MHC-I, exprimujú koreceptor CD8 a s MHC-II koreceptor CD4. V súlade s tým sa na perifériu dostávajú dva typy T-lymfocytov (v pomere asi 2:1): CD8+ a CD4+, ktorých funkcie v nadchádzajúcich imunitných odpovediach sú odlišné.
-CD8+ T bunky hrajú úlohu cytotoxických T-lymfocytov (CTL) - rozpoznávajú a priamo zabíjajú bunky modifikované vírusom, nádorové a iné „pozmenené“ bunky (obr. 6-6).
-CD4+ T bunky. Funkčná špecializácia CD4 + T lymfocytov je rôznorodejšia. Významná časť CD4+ T-lymfocytov sa počas vývoja imunitnej odpovede stávajú T-pomocníkmi (pomocníkmi), interagujú s B-lymfocytmi, T-lymfocytmi a inými bunkami počas
Ryža. 6-6. Mechanizmus účinku cytotoxického T-lymfocytu na cieľovú bunku. V zabíjačskej T bunke sa v reakcii na zvýšenie koncentrácie Ca 2+ granule s perforínom (fialové ovály) a granzýmy (žlté krúžky) spájajú s bunkovou membránou. Uvoľnený perforín sa zabuduje do membrány cieľovej bunky s následnou tvorbou pórov priepustných pre granzýmy, vodu a ióny. Výsledkom je, že cieľová bunka je lyzovaná
priamym kontaktom alebo prostredníctvom rozpustných faktorov (cytokínov). V určitých prípadoch sa môžu vyvinúť na CD4+ CTL: konkrétne takéto T lymfocyty sa nachádzajú vo významných množstvách v koži pacientov s Lyellovým syndrómom.
T pomocné subpopulácie
Od konca 80. rokov 20. storočia je zvykom rozlišovať 2 subpopulácie T-helperov (podľa toho, aký súbor cytokínov produkujú) - Th1 a Th2. V posledných rokoch sa spektrum podskupín CD4+ T buniek naďalej rozširovalo. Boli objavené subpopulácie ako Th17, T-regulátory, Tr1, Th3, Tfh atď.
Hlavné podskupiny CD4+ T buniek:
. Th0 - CD4+ T lymfocyty v skorých štádiách rozvoja imunitnej odpovede produkujú len IL-2 (mitogén pre všetky lymfocyty).
.Št1- diferencovaná subpopulácia CD4 + T-lymfocytov, špecializujúca sa na produkciu IFN y, TNF p a IL-2. Táto subpopulácia reguluje mnohé bunkové imunitné reakcie, vrátane hypersenzitivity oneskoreného typu (DTH) a aktivácie CTL. Okrem toho Th1 stimuluje produkciu opsonizujúcich IgG protilátok B lymfocytmi, ktoré spúšťajú kaskádu aktivácie komplementu. Vznik nadmerného zápalu s následným poškodením tkaniva priamo súvisí s aktivitou Th1 subpopulácie.
.Št2- diferencovaná subpopulácia CD4+ T lymfocytov špecializovaných na produkciu IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 a IL-13. Táto subpopulácia sa podieľa na aktivácii B lymfocytov a podporuje ich sekréciu veľkého množstva protilátok rôznych tried, najmä IgE. Okrem toho sa subpopulácia Th2 podieľa na aktivácii eozinofilov a rozvoji alergických reakcií.
.Št17- subpopulácia CD4 + T lymfocytov špecializovaných na produkciu IL-17. Tieto bunky poskytujú protiplesňovú a antimikrobiálnu ochranu epiteliálnych a slizničných bariér a tiež zohrávajú kľúčovú úlohu v patológii autoimunitných ochorení.
.T-regulátory- CD4+ T lymfocyty, ktoré potláčajú aktivitu iných buniek imunitného systému prostredníctvom sekrécie imunosupresívnych cytokínov - IL-10 (inhibítor aktivity makrofágov a Th1 buniek) a TGFβ - inhibítor proliferácie lymfocytov. Inhibičný účinok možno dosiahnuť aj priamou medzibunkovou interakciou, keďže induktory apoptózy aktivovaných a „spotrebovaných“ lymfocytov – FasL (ligand Fas) – sú exprimované na membráne niektorých T-regulátorov. Existuje niekoľko populácií CD4+ regulačných T lymfocytov: prirodzené (Treg), dozrievajúce v týmuse (CD4 + CD25 +, exprimujúce transkripčný faktor Foxp3) a indukované – lokalizované prevažne v slizniciach tráviaceho traktu a prechádzajú na tvorba TGFp (Th3) alebo IL-10 (Tr1). Normálne fungovanie T-regulátorov je nevyhnutné na udržanie homeostázy imunitného systému a prevenciu rozvoja autoimunitných ochorení.
.Ďalšie pomocné populácie. Nedávno boli popísané stále nové populácie CD4 + T lymfocytov, klas.
klasifikované podľa typu cytokínu, ktorý prevažne produkujú. Ako sa teda ukázalo, jednou z najdôležitejších populácií je Tfh (z angl. folikulárny pomocník- folikulárny pomocník). Táto populácia CD4+ T lymfocytov sa prevažne nachádza v lymfoidných folikuloch a vykonáva pomocnú funkciu pre B lymfocyty prostredníctvom produkcie IL-21, čo spôsobuje ich dozrievanie a terminálnu diferenciáciu na plazmatické bunky. Okrem IL-21 môže Tfh produkovať aj IL-6 a IL-10, ktoré sú potrebné na diferenciáciu B lymfocytov. Dysfunkcia tejto populácie vedie k rozvoju autoimunitných ochorení alebo imunodeficiencií. Ďalšou „novo vznikajúcou“ populáciou sú producenti Th9 – IL-9. Zrejme ide o Th2, ktoré prešli na sekréciu IL-9, čo môže spôsobiť proliferáciu pomocných T buniek v neprítomnosti antigénnej stimulácie, ako aj zvýšiť sekréciu IgM, IgG a IgE B lymfocytmi.
Hlavné subpopulácie T pomocných buniek sú uvedené na obr. 6-7. Obrázok sumarizuje súčasné predstavy o adaptívnych subpopuláciách CD4 + T buniek, t.j. tvoriace sa subpopulácie -
Ryža. 6-7. Adaptívne podskupiny CD4+ T buniek (cytokíny, diferenciačné faktory, chemokínové receptory)
sa vyskytuje počas imunitnej odpovede, a nie počas prirodzeného vývoja buniek. Pre všetky typy pomocných T-buniek sú uvedené induktory cytokínov (na šípkach vedúcich ku kruhom symbolizujúcim bunky), transkripčné faktory (vo vnútri kruhov), chemokínové receptory, ktoré riadia migráciu (blízko čiar siahajúcich od „bunkového povrchu“), a produkované cytokíny (v obdĺžnikoch, ku ktorým smerujú šípky vybiehajúce z kruhov).
Rozšírenie rodiny adaptívnych subpopulácií CD4+ T buniek si vyžiadalo vyriešenie otázky o povahe buniek, s ktorými tieto subpopulácie interagujú (komu poskytujú „pomoc“ v súlade s ich pomocnou funkciou). Tieto myšlienky sa odrážajú na obr. 6-8. Poskytuje tiež aktualizovaný pohľad na funkcie týchto subpopulácií (účasť na ochrane pred určitými skupinami patogénov), ako aj na patologické dôsledky nevyváženého zvýšenia aktivity týchto buniek.
Ryža. 6-8. Adaptívne podskupiny T buniek (partnerské bunky, fyziologické a patologické účinky)
γ δT lymfocyty
Prevažná väčšina (99 %) T lymfocytov podstupujúcich lymfopoézu v týmuse sú αβT bunky; menej ako 1 % tvoria yδT bunky. Tie sa väčšinou diferencujú mimo týmusu, predovšetkým v slizniciach tráviaceho traktu. V koži, pľúcach, tráviacom a reprodukčnom trakte sú dominantnou subpopuláciou intraepitelových lymfocytov. Spomedzi všetkých T lymfocytov v tele tvoria γδT bunky 10 až 50 %. V embryogenéze sa γδT bunky objavujú pred αβT bunkami.
.γδ T bunky neexprimujú CD4. Molekula CD8 je exprimovaná na niektorých yδT bunkách, ale nie ako ap-heterodimér, ako na CD8+ apT bunkách, ale ako homodimér dvoch a-reťazcov.
.Vlastnosti rozpoznávania antigénu:γδTCR pripomínajú skôr imunoglobulíny ako αβTCR, t.j. schopné viazať natívne antigény nezávisle od klasických molekúl MHC - pre γδT bunky nie je predbežné spracovanie antigénu pomocou APC potrebné alebo vôbec nie je potrebné.
.Rôznorodosťγδ TCR menej ako αβTCR alebo imunoglobulíny, hoci vo všeobecnosti sú γδT bunky schopné rozpoznať široké spektrum antigénov (hlavne fosfolipidové antigény mykobaktérií, sacharidy, proteíny tepelného šoku).
.Funkcieγδ T bunky nie sú ešte úplne prebádané, aj keď prevláda názor, že slúžia ako jedna zo spojovacích zložiek medzi vrodenou a získanou imunitou. γδT bunky sú jednou z prvých bariér pre patogény. Okrem toho tieto bunky, vylučujúce cytokíny, hrajú dôležitú imunoregulačnú úlohu a sú schopné diferencovať sa na CTL.
NKT lymfocyty
Prirodzené zabíjačské T bunky (NKT bunky) predstavujú špeciálnu subpopuláciu lymfocytov, ktoré zaberajú medzipolohu medzi bunkami vrodenej a adaptívnej imunity. Tieto bunky majú znaky NK aj T lymfocytov. NKT bunky exprimujú αβTCR a NK bunkovo špecifický receptor NK1.1, ktorý patrí do superrodiny lektínových glykoproteínov typu C. Avšak receptor TCR buniek NKT má významné rozdiely od receptora TCR bežných buniek. U myší väčšina NKT buniek exprimuje invariantnú V doménu a-reťazca, pozostávajúcu z
segmenty Vα14-Jα18, niekedy označované ako Ja281. U ľudí pozostáva V doména a reťazca zo segmentov Va24-JaQ. U myší je a reťazec invariantného TCR prevažne v komplexe s Vp8.2 a u ľudí s Vp11. Vzhľadom na štrukturálne vlastnosti reťazcov TCR sa bunky NKT nazývajú invariantné - iTCR. Vývoj NKT buniek závisí od molekuly CD1d, ktorá je podobná molekulám MHC-I. Na rozdiel od klasických molekúl MHC-I, ktoré prezentujú peptidy T bunkám, CD1d predstavuje T bunkám iba glykolipidy. Hoci sa predpokladá, že pečeň je miestom vývoja buniek NKT, existujú silné dôkazy o úlohe týmusu v ich vývoji. NKT bunky hrajú dôležitú úlohu pri regulácii imunity. U myší a ľudí s rôznymi autoimunitnými procesmi je funkčná aktivita NKT buniek vážne narušená. Neexistuje úplný obraz o význame takýchto porúch v patogenéze autoimunitných procesov. V niektorých autoimunitných procesoch môžu NKT bunky hrať supresorovú úlohu.
Okrem kontroly autoimunitných a alergických reakcií sa NKT bunky podieľajú na imunitnom dohľade, čo spôsobuje odmietnutie nádoru, keď sa zvýši ich funkčná aktivita. Ich úloha v antimikrobiálnej ochrane je veľká, najmä v počiatočných štádiách vývoja infekčného procesu. NKT bunky sa podieľajú na rôznych zápalových infekčných procesoch, najmä pri vírusových léziách pečene. Vo všeobecnosti sú NKT bunky multifunkčnou populáciou lymfocytov, ktoré stále nesú mnohé vedecké záhady.
Na obr. 6-9 sú zhrnuté údaje o diferenciácii T lymfocytov na funkčné subpopulácie. Uvádza sa niekoľko úrovní bifurkácie: γ δТ/ αβТ, potom pre αβТ bunky - NKT/ iné T lymfocyty, pre posledné - CD4 + /CD8 +, pre CD4 + T bunky - Th/Treg, pre CD8 + T lymfocyty - CD8αβ /CD8αα. Ukázané sú aj diferenciačné transkripčné faktory zodpovedné za všetky vývojové línie.
Ryža. 6-9. Prirodzené subpopulácie T-lymfocytov a ich diferenciačné faktory
Lymfocyty
Vývoj T a B lymfocytov
Diferenciácia T-lymfocytov
agamaglobulinémia(agamaglobulinémia; a- + gamaglobulíny + grécky. haima krv; synonymum: hypogamaglobulinémia, syndróm nedostatku protilátok) je všeobecný názov pre skupinu ochorení charakterizovaných absenciou alebo prudkým poklesom hladiny imunoglobulínov v krvnom sére;
autoantigény(auto-+ antigény) - telu vlastné normálne antigény, ako aj antigény, ktoré vznikajú pod vplyvom rôznych biologických a fyzikálno-chemických faktorov, v súvislosti s ktorými sa tvoria autoprotilátky;
autoimunitná reakcia- imunitná odpoveď organizmu na autoantigény;
alergie (alergie; grécky allos iné, iné + ergon pôsobenie) - stav zmenenej reaktivity tela vo forme zvýšenej citlivosti na opakované vystavenie akýmkoľvek látkam alebo zložkám vlastných tkanív; Alergia je založená na imunitnej odpovedi, ktorá spôsobuje poškodenie tkaniva;
aktívna imunita imunita vyplývajúca z imunitnej odpovede organizmu na zavedenie antigénu;
Hlavnými bunkami, ktoré vykonávajú imunitné reakcie, sú T- a B-lymfocyty (a ich deriváty - plazmocyty), makrofágy, ako aj množstvo buniek, ktoré s nimi interagujú (žírne bunky, eozinofily atď.).
Populácia lymfocytov je funkčne heterogénna. Existujú tri hlavné typy lymfocytov: T lymfocyty, B lymfocyty a tzv nula lymfocyty (0-bunky). Lymfocyty sa vyvíjajú z nediferencovaných lymfoidných prekurzorov kostnej drene a po diferenciácii dostávajú funkčné a morfologické charakteristiky (prítomnosť markerov, povrchových receptorov), identifikované imunologickými metódami. 0-lymfocyty (null) sú bez povrchových markerov a sú považované za rezervnú populáciu nediferencovaných lymfocytov.
T lymfocyty- najpočetnejšia populácia lymfocytov, tvoriaca 70 – 90 % krvných lymfocytov. Rozlišujú sa v týmuse - týmus (odtiaľ ich názov), vstupujú do krvi a lymfy a osídľujú T-zóny v periférnych orgánoch imunitného systému - lymfatické uzliny (hlboká časť kôry), slezina (periarteriálne obaly lymfatických uzlín uzlíky), v jednotlivých a viacnásobných folikuloch rôznych orgánov, v ktorých sa vplyvom antigénov tvoria T-imunocyty (efektorové) a pamäťové T-bunky. T-lymfocyty sa vyznačujú prítomnosťou špeciálnych receptorov na plazmalemme, ktoré sú schopné špecificky rozpoznávať a viazať antigény. Tieto receptory sú produktmi génov imunitnej odpovede. T lymfocyty poskytujú bunkový imunity, podieľajú sa na regulácii humorálnej imunity, produkujú cytokíny pod vplyvom antigénov.
V populácii T-lymfocytov sa rozlišuje niekoľko funkčných skupín buniek: cytotoxické lymfocyty (TC), príp. Zabíjačské T bunky(Tk), T pomocné bunky(Tx), T-supresory(Tch). Tcs sa podieľajú na reakciách bunkovej imunity, zabezpečujú deštrukciu (lýzu) cudzích buniek a ich vlastných zmenených buniek (napríklad nádorových buniek). Receptory im umožňujú rozpoznať proteíny vírusov a nádorových buniek na ich povrchu. V tomto prípade dochádza k aktivácii TC (killerov) pod vplyvom histokompatibilné antigény na povrchu cudzích buniek.
Okrem toho sa T lymfocyty podieľajú na regulácii humorálnej imunity pomocou Tx a Tc. Tx stimulujú diferenciáciu B lymfocytov, tvorbu plazmatických buniek z nich a tvorbu imunoglobulínov (Ig). Tx majú povrchové receptory, ktoré sa viažu na proteíny na plazmaléme B lymfocytov a makrofágov, stimulujú Tx a makrofágy k proliferácii, produkcii interleukínov (peptidové hormóny) a B lymfocytom k produkcii protilátok.
Hlavnou funkciou Tx je teda rozpoznávanie cudzích antigénov (prezentovaných makrofágmi), sekrécia interleukínov, ktoré stimulujú B lymfocyty a iné bunky k účasti na imunitných reakciách.
Zníženie počtu Tx v krvi vedie k oslabeniu obranných reakcií organizmu (títo jedinci sú náchylnejší na infekcie). Bol zaznamenaný prudký pokles počtu Tx u jedincov infikovaných vírusom AIDS.
Tc sú schopné inhibovať aktivitu Tx, B-lymfocytov a plazmatických buniek. Podieľajú sa na alergických reakciách a reakciách z precitlivenosti. Tc potláča diferenciáciu B lymfocytov.
Jednou z hlavných funkcií T lymfocytov je produkcia cytokíny, ktoré majú stimulačný alebo inhibičný účinok na bunky zapojené do imunitnej odpovede (chemotaktické faktory, makrofágový inhibičný faktor – MIF, nešpecifické cytotoxické látky a pod.).
Prirodzení zabijaci. Medzi lymfocytmi v krvi, okrem vyššie opísaných TC, ktoré plnia funkciu zabijakov, existujú takzvané prirodzené zabíjače (NK, N.K.), ktoré sa podieľajú aj na bunkovej imunite. Tvoria prvú obrannú líniu proti cudzím bunkám a pôsobia okamžite, bunky rýchlo ničia. NK vo vlastnom tele ničia nádorové bunky a bunky infikované vírusom. TC tvoria druhú obrannú líniu, pretože ich vývoj z neaktívnych T lymfocytov si vyžaduje čas, takže vstupujú do činnosti neskôr ako NK. NK sú veľké lymfocyty s priemerom 12-15 mikrónov, majú laločnaté jadro a azurofilné granuly (lyzozómy) v cytoplazme.
Predchodcom všetkých buniek imunitného systému je hematopoetická kmeňová bunka (HSC). HSC sú lokalizované v embryonálnom období v žĺtkovom vaku, pečeni a slezine. V neskoršom období embryogenézy sa objavujú v kostnej dreni a pokračujú v proliferácii v postnatálnom živote. Z BMSC sa v kostnej dreni vytvorí lymfopoézna progenitorová bunka (lymfoidná multipotentná progenitorová bunka), ktorá generuje dva typy buniek: pre-T bunky (prekurzorové T bunky) a pre-B bunky (prekurzorové B bunky).
Pre-T bunky migrujú z kostnej drene cez krv do centrálneho orgánu imunitného systému – týmusu. Už počas embryonálneho vývoja sa v týmuse vytvára mikroprostredie dôležité pre diferenciáciu T lymfocytov. Pri tvorbe mikroprostredia zohrávajú osobitnú úlohu retikuloepiteliálne bunky tejto žľazy, schopné produkovať množstvo biologicky aktívnych látok. Pre-T bunky migrujúce do týmusu získavajú schopnosť reagovať na mikroenvironmentálne stimuly. Pre-T bunky v týmuse proliferujú a transformujú sa na T lymfocyty nesúce charakteristické membránové antigény (CD4+, CD8+). T-lymfocyty vytvárajú a „dodávajú“ do krvného obehu a týmus-dependentných zón periférnych lymfatických orgánov 3 typy lymfocytov: Tc, Tx a Tc. „Panenské“ T-lymfocyty migrujúce z týmusu (panenské T-lymfocyty) sú krátkodobé. Špecifická interakcia s antigénom v periférnych lymfoidných orgánoch slúži ako začiatok procesov ich proliferácie a diferenciácie na zrelé a dlhoveké bunky (T-efektorové a pamäťové T-bunky), ktoré tvoria väčšinu recirkulujúcich T-lymfocytov.
Nie všetky bunky migrujú z týmusovej žľazy. Niektoré T-lymfocyty odumierajú. Existuje názor, že príčinou ich smrti je pripojenie antigénu k receptoru špecifickému pre antigén. V týmusovej žľaze nie sú žiadne cudzie antigény, takže tento mechanizmus môže slúžiť na odstránenie T-lymfocytov, ktoré môžu reagovať s vlastnými štruktúrami tela, t.j. vykonávať funkciu ochrany pred autoimunitnými reakciami. Smrť niektorých lymfocytov je geneticky naprogramovaná (apoptóza).
diferenciačné antigény T buniek. Počas procesu diferenciácie lymfocytov sa na ich povrchu objavujú špecifické membránové molekuly glykoproteínov. Takéto molekuly (antigény) možno detegovať pomocou špecifických monoklonálnych protilátok. Boli získané monoklonálne protilátky, ktoré reagujú len s jedným antigénom bunkovej membrány. Pomocou sady monoklonálnych protilátok možno identifikovať subpopulácie lymfocytov. Existujú sady protilátok proti antigénom diferenciácie ľudských lymfocytov. Protilátky tvoria relatívne málo skupín (alebo „zhlukov“), z ktorých každá rozpoznáva jeden bunkový povrchový proteín. Bola vytvorená nomenklatúra diferenciačných antigénov ľudských leukocytov detegovaných monoklonálnymi protilátkami. Táto nomenklatúra CD ( CD - zhluk diferenciácie- diferenciačný klaster) je založený na skupinách monoklonálnych protilátok, ktoré reagujú s rovnakými diferenciačnými antigénmi.
Boli získané multiklonálne protilátky proti mnohým diferenciačným antigénom ľudských T-lymfocytov. Pri stanovení celkovej populácie T buniek možno použiť monoklonálne protilátky CD špecifík (CD2, CD3, CDS, CD6, CD7).
Sú známe diferenciačné antigény T buniek, ktoré sú charakteristické buď pre určité štádiá ontogenézy, alebo pre subpopulácie líšiace sa funkčnou aktivitou. CD1 je teda markerom skorej fázy dozrievania T-buniek v týmuse. Počas procesu diferenciácie tymocytov sa na ich povrchu súčasne exprimujú markery CD4 a CD8. Následne však CD4 marker z niektorých buniek zmizne a zostane len na subpopulácii, ktorá prestala exprimovať CD8 antigén. Zrelé CD4+ bunky sú Tx. CD8 antigén je exprimovaný na približne 1/3 periférnych T buniek, ktoré dozrievajú z CD4+/CD8+ T lymfocytov. Podskupina CD8+ T buniek zahŕňa cytotoxické a supresorové T lymfocyty. Protilátky proti CD4 a CD8 glykoproteínom sa široko používajú na rozlíšenie a separáciu T buniek na Tx a Tx.
Okrem diferenciačných antigénov sú známe špecifické markery T lymfocytov.
Antigénne receptory T-buniek sú heterodiméry podobné protilátkam, ktoré pozostávajú z a- a p-reťazcov polypeptidov. Každý reťazec je dlhý 280 aminokyselín a veľká extracelulárna časť každého reťazca je zložená do dvoch domén podobných Ig: jednej variabilnej (V) a jednej konštantnej (C). Heterodimér podobný protilátke je kódovaný génmi, ktoré sa skladajú z viacerých génových segmentov počas vývoja T buniek v týmuse.
Existuje antigén-nezávislá a antigén-závislá diferenciácia a špecializácia B a T lymfocytov.
Antigénne nezávislé proliferácia a diferenciácia sú geneticky naprogramované tak, aby produkovali bunky schopné poskytnúť špecifický typ imunitnej odpovede pri stretnutí so špecifickým antigénom v dôsledku objavenia sa špeciálnych „receptorov“ na plazmaleme lymfocytov. Vyskytuje sa v centrálnych orgánoch imunitného systému (týmus, kostná dreň alebo Fabriciova burza u vtákov) pod vplyvom špecifických faktorov produkovaných bunkami, ktoré tvoria mikroprostredie (retikulárna stróma alebo retikuloepiteliálne bunky v týmusu).
Antigén-dependentný pri stretnutí s antigénmi v periférnych lymfoidných orgánoch dochádza k proliferácii a diferenciácii T- a B-lymfocytov a vznikajú efektorové bunky a pamäťové bunky (uchovávajúce informácie o aktívnom antigéne).
Výsledné T lymfocyty tvoria zásobu dlhoveký, recirkulujúce lymfocyty a B lymfocyty - krátkodobý bunky.
66. Charakteristika B-lymfocytov.
B lymfocyty sú hlavnými bunkami zapojenými do humorálnej imunity. U ľudí sa tvoria z HSC červenej kostnej drene, potom vstupujú do krvi a ďalej osídľujú B-zóny periférnych lymfoidných orgánov – sleziny, lymfatických uzlín a lymfoidných folikulov mnohých vnútorných orgánov. Ich krv obsahuje 10-30% celej populácie lymfocytov.
B lymfocyty sú charakterizované prítomnosťou povrchových imunoglobulínových receptorov (SIg alebo MIg) pre antigény na plazmaléme. Každá B bunka obsahuje 50 000...150 000 antigén-špecifických SIg molekúl. V populácii B lymfocytov sú bunky s rôznymi SIg: väčšina (⅔) obsahuje IgM, menší počet (⅓) - IgG a asi 1-5% - IgA, IgD, IgE. Plazmalema B lymfocytov obsahuje aj receptory pre komplement (C3) a Fc receptory.
Pri vystavení antigénu sa B lymfocyty v periférnych lymfoidných orgánoch aktivujú, proliferujú a diferencujú sa na plazmatické bunky, ktoré aktívne syntetizujú protilátky rôznych tried, ktoré vstupujú do krvi, lymfy a tkanivového moku.
Diferenciácia B buniek
Prekurzory B buniek (pre-B bunky) sa ďalej vyvíjajú u vtákov v Burse Fabricius (bursa), odkiaľ pochádza názov B lymfocyty, a u ľudí a cicavcov - v kostnej dreni.
Bursa Fabricius (bursa Fabricii) je centrálnym orgánom imunopoézy u vtákov, kde dochádza k vývoju B lymfocytov umiestnených v kloake. Jeho mikroskopická štruktúra je charakterizovaná prítomnosťou početných záhybov pokrytých epitelom, v ktorom sú umiestnené lymfoidné uzliny, ohraničené membránou. Uzliny obsahujú epitelové bunky a lymfocyty v rôznych štádiách diferenciácie. Počas embryogenézy sa v strede folikulu vytvorí medulárna zóna a na periférii (mimo membrány) sa vytvorí kortikálna zóna, do ktorej pravdepodobne migrujú lymfocyty z medulárnej zóny. Vzhľadom na to, že v Burse Fabricius sa u vtákov tvoria iba B-lymfocyty, je to vhodný objekt na štúdium štruktúry a imunologických charakteristík tohto typu lymfocytov. Ultramikroskopická štruktúra B lymfocytov je charakterizovaná prítomnosťou skupín ribozómov vo forme roziet v cytoplazme. Tieto bunky majú väčšie jadrá a menej hustý chromatín ako T lymfocyty v dôsledku zvýšeného obsahu euchromatínu.
B lymfocyty sa líšia od iných typov buniek svojou schopnosťou syntetizovať imunoglobulíny. Zrelé B lymfocyty exprimujú Ig na bunkovej membráne. Takéto membránové imunoglobulíny (MIg) fungujú ako antigén-špecifické receptory.
Pre-B bunky syntetizujú intracelulárny cytoplazmatický IgM, ale nemajú povrchové imunoglobulínové receptory. Panenské B lymfocyty kostnej drene majú na svojom povrchu receptory IgM. Zrelé B lymfocyty nesú na svojom povrchu imunoglobulínové receptory rôznych tried – IgM, IgG atď.
Diferencované B-lymfocyty sa dostávajú do periférnych lymfoidných orgánov, kde vplyvom antigénov dochádza k proliferácii a ďalšej špecializácii B-lymfocytov s tvorbou plazmocytov a pamäťových B-buniek (MB).
Počas svojho vývoja mnohé B bunky prechádzajú z produkcie protilátok jednej triedy na produkciu protilátok iných tried. Tento proces sa nazýva prepínanie tried. Všetky B bunky začínajú svoje aktivity syntézy protilátok produkciou molekúl IgM, ktoré sú zabudované v plazmatickej membráne a slúžia ako receptory pre antigén. Potom, ešte pred interakciou s antigénom, väčšina B buniek pokračuje k súčasnej syntéze molekúl IgM a IgD. Keď panenská B bunka prejde z produkcie samotného IgM viazaného na membránu na súčasnú produkciu IgM a IgD viazaného na membránu, k prepnutiu pravdepodobne dôjde v dôsledku zmeny v spracovaní RNA.
Po stimulácii antigénom sa niektoré z týchto buniek aktivujú a začnú vylučovať protilátky IgM, ktoré prevažujú v primárnej humorálnej odpovedi.
Iné bunky stimulované antigénom prechádzajú na produkciu protilátok IgG, IgE alebo IgA; Pamäťové B bunky nesú tieto protilátky na svojom povrchu a aktívne B bunky ich vylučujú. Molekuly IgG, IgE a IgA sa súhrnne nazývajú protilátky sekundárnej triedy, pretože sa zdá, že sa tvoria až po antigénnej stimulácii a prevažujú v sekundárnych humorálnych odpovediach.
Pomocou monoklonálnych protilátok bolo možné identifikovať určité diferenciačné antigény, ktoré ešte pred objavením sa cytoplazmatických µ-reťazcov umožňujú klasifikovať lymfocyt, ktorý ich nesie, ako B-bunkovú líniu. Antigén CD19 je teda najskorším markerom, ktorý umožňuje klasifikáciu lymfocytu ako B-bunky. Je prítomný na pre-B bunkách v kostnej dreni a na všetkých periférnych B bunkách.
Antigén detegovaný monoklonálnymi protilátkami skupiny CD20 je špecifický pre B lymfocyty a charakterizuje neskoršie štádiá diferenciácie.
Na histologických rezoch sa antigén CD20 deteguje na B bunkách zárodočných centier lymfoidných uzlín a v kôre lymfatických uzlín. B lymfocyty tiež nesú množstvo iných (napr. CD24, CD37) markerov.
67. Makrofágy hrajú dôležitú úlohu v prirodzenej aj získanej imunite organizmu. Účasť makrofágov na prirodzenej imunite sa prejavuje v ich schopnosti fagocytózy a v syntéze množstva účinných látok – tráviacich enzýmov, zložiek komplementového systému, fagocytínu, lyzozýmu, interferónu, endogénneho pyrogénu atď. faktory prirodzenej imunity. Ich úlohou v získanej imunite je pasívny prenos antigénu na imunokompetentné bunky (T a B lymfocyty) a vyvolanie špecifickej odpovede na antigény. Makrofágy sa tiež podieľajú na zabezpečovaní imunitnej homeostázy riadením proliferácie buniek charakterizovaných množstvom abnormalít (nádorové bunky).
Pre optimálny rozvoj imunitných reakcií pod vplyvom väčšiny antigénov je potrebná účasť makrofágov ako v prvej indukčnej fáze imunity, kedy stimulujú lymfocyty, tak aj v jej záverečnej fáze (produktívnej), kedy sa podieľajú na tvorbe protilátky a zničenie antigénu. Antigény fagocytované makrofágmi vyvolávajú silnejšiu imunitnú odpoveď v porovnaní s antigénmi, ktoré fagocytujú ne. Blokáda makrofágov zavedením suspenzie inertných častíc (napríklad jatočných tiel) do tela zvieraťa výrazne oslabuje imunitnú odpoveď. Makrofágy sú schopné fagocytovať solubilné (napríklad proteíny) aj korpuskulárne antigény. Korpuskulárne antigény spôsobujú silnejšiu imunitnú odpoveď.
Niektoré typy antigénov, napríklad pneumokoky, obsahujúce na povrchu sacharidovú zložku, môžu byť fagocytované len po predbežnom opsonizácia. Fagocytóza je značne uľahčená, ak sú antigénne determinanty cudzích buniek opsonizované, t.j. spojené s protilátkou alebo komplexom protilátky a komplementu. Proces opsonizácie je zabezpečený prítomnosťou receptorov na membráne makrofágov, ktoré viažu časť molekuly protilátky (Fc fragment) alebo časť komplementu (C3). Len protilátky triedy IgG sa môžu priamo viazať na membránu makrofágov u ľudí, ak sú v kombinácii so zodpovedajúcim antigénom. IgM sa môže viazať na membránu makrofágov v prítomnosti komplementu. Makrofágy sú schopné „rozpoznať“ rozpustné antigény, ako je hemoglobín.
V mechanizme rozpoznávania antigénu existujú dve fázy, ktoré spolu úzko súvisia. Prvá fáza zahŕňa fagocytózu a trávenie antigénu. V druhom štádiu sa vo fagolyzozómoch makrofágu hromadia polypeptidy, rozpustné antigény (sérové albumíny) a korpuskulárne bakteriálne antigény. V rovnakých fagolyzozómoch možno nájsť niekoľko zavedených antigénov. Štúdium imunogenicity rôznych subcelulárnych frakcií odhalilo, že najaktívnejšia tvorba protilátok je spôsobená zavedením lyzozómov do tela. Antigén sa nachádza aj v bunkových membránach. Väčšina spracovaného antigénneho materiálu uvoľneného makrofágmi má stimulačný účinok na proliferáciu a diferenciáciu klonov T- a B-lymfocytov. Malé množstvo antigénneho materiálu môže dlhodobo pretrvávať v makrofágoch vo forme chemických zlúčenín pozostávajúcich z minimálne 5 peptidov (prípadne v spojení s RNA).
V B-zónach lymfatických uzlín a sleziny sa nachádzajú špecializované makrofágy (dendritické bunky), na povrchu ich početných výbežkov je uložených veľa antigénov, ktoré sa dostávajú do tela a prenášajú sa na zodpovedajúce klony B-lymfocytov. V T-zónach lymfatických folikulov sa nachádzajú interdigitujúce bunky, ktoré ovplyvňujú diferenciáciu klonov T-lymfocytov.
Makrofágy sa teda priamo aktívne podieľajú na kooperatívnej interakcii buniek (T- a B-lymfocytov) v imunitných reakciách tela.
Prvým stupňom laboratórnej diagnostiky je kvantitatívne hodnotenie buniek periférnej krvi a ich morfologických prvkov - počítanie leukocytového vzorca. Pri tejto analýze by ste mali venovať pozornosť nielen relatívnemu, ale aj absolútnemu počtu krviniek.
Pri určovaní normálneho krvného obrazu v relatívnych hodnotách môže prevod na absolútne hodnoty odhaliť patológiu a naopak.
Počet leukocytov a iných krviniek závisí od rýchlosti uvoľňovania buniek z kostnej drene a ich prílivu do tkanív. Počet leukocytov v periférnej krvi nad 10109 buniek/l je definovaný ako leukocytóza, pod 4*109 buniek/l - ako leukopénia. Hlavnými príčinami leukocytózy sú všetky typy infekcií, zápalové stavy, zhubné novotvary, trauma, leukémia, urémia, účinky adrenalínu a steroidných hormónov. Leukopénia sa vyskytuje pri aplázii a hypoplázii červenej kostnej drene, hypersplenizme, akútnej leukémii, myelofibróze, plazmocytómoch, nádorových metastázach v kostnej dreni, ťažkých infekciách, kolagenóze (nepriaznivé znamenie), pod vplyvom liekov.
Sú známe rôzne odchýlky leukocytového vzorca, ktoré môžu v kombinácii s inými laboratórnymi údajmi naznačovať rôzne patologické stavy.
Leukocytózu s posunom doľava možno pozorovať pri bakteriálnych infekciách (nešpecifických a špecifických), intoxikáciách (otrava oxidom uhoľnatým, hubami a pod.), komatóznych stavoch (urémia, cukrovka, pečeň a pod.), po akútnej strate krvi, pri hemolytická kríza. Zisťuje sa aj v skorých štádiách pooperačného obdobia, po veľkých chirurgických zákrokoch, počas a po pôrode, pri malígnych novotvaroch, leukémii, chorobe z ožiarenia (v počiatočnej fáze masívneho poškodenia ožiarením).
Leukocytózu s posunom doprava možno pozorovať pri vírusových a chronických bakteriálnych (tuberkulóza, syfilis, brucelóza atď.) Infekciách, nedostatku kyseliny listovej, chorobe z ožiarenia, sepse.
Neutropénia sa zvyčajne kombinuje s leukopéniou pri ťažkých a vírusových infekciách, autoimunitnej a liekmi indukovanej leukopénii, anémii z nedostatku Bi2, hypoxii, hladovaní a nedostatku vitamínov.
Eozinofília sa zisťuje pri alergických ochoreniach (bronchiálna astma, alergia na lieky a pod.), helmintickom napadnutí, kožných, autoimunitných a infekčných ochoreniach počas vývoja klinického obrazu a v štádiu rekonvalescencie, pri malígnych novotvaroch, pri lymfogranulomatóze.
Eozinopénia sa vyskytuje v stresových situáciách, akútnych infekciách, intoxikácii, šoku a infarkte myokardu.
Bazofília vzniká pri liečbe heparínom, podávaní séra, cukrovke, myxedému, nefróze, v predmenštruačnom období, pri autoimunitnej trombocytopénii, chronickej myeloidnej leukémii, myelofibróze, erytrémii.
Absolútna lymfocytóza sa pozoruje u detí mladších ako 4 roky ako fyziologický stav. U dospelých sa pozoruje zvýšenie počtu lymfocytov pri infekčných ochoreniach vírusovej etiológie a chronickej leukémii.
Lymfopénia sa vyskytuje pri chorobe z ožiarenia, AIDS a chronickej aleukemickej myeloidnej leukémii.
Monocytopénia - pri ťažkých hypertoxických formách brušného týfusu a iných infekčných ochorení a je jedným zo znakov narušených regeneračných procesov.
Monocytóza - s reumatizmom, najmä počas exacerbácie, u novorodencov možno pozorovať brucelózu, syfilis, tuberkulózu, infekčnú mononukleózu.
Výskyt plazmatických buniek v periférnej krvi naznačuje intenzitu imunitného procesu, napríklad počas detských infekcií (osýpky, rubeola, mumps, infekčná mononukleóza), u dospelých - počas ARVI, chrípky, choroby z ožiarenia, leukémie, hepatitídy.
Bunkové zloženie je možné podrobnejšie posúdiť dodatočnými štúdiami a predovšetkým pomocou metód prietokovej laserovej cytometrie. Ide o technológiu na rýchle meranie rôznych charakteristík buniek alebo ich organel. Bunková suspenzia, vopred označená fluorescenčnými monoklonálnymi protilátkami alebo fluorescenčnými farbivami, sa privádza do prietokového prvku. Bunky idú jedna za druhou, kde ich v prietokovej cele pretína laserový lúč, pod vplyvom ktorého farebné bunky fluoreskujú. Potom sa cez optickú sústavu žiarenie dostáva do záznamového zariadenia, kde sa ďalej spracováva. Pomocou prietokovej cytometrie je možné určiť veľkosť buniek, pomer jadra a cytoplazmy, stupeň asymetrie a intenzitu fluorescencie. Je povolené zafarbenie až desiatich značiek na jednej bunke. Počas štúdie je možné odhadnúť vlastnosti od niekoľkých desiatok až po niekoľko miliónov buniek.
Aplikácie prietokovej cytometrie sú veľmi rôznorodé. Okrem morfologických charakteristík buniek je pomocou monoklonálnych protilátok možné spoľahlivo určiť populačné a subpopulačné zloženie lymfocytov, identifikovať štádium diferenciácie a aktivácie buniek, posúdiť úroveň funkčnej aktivity lymfocytov, určiť intracelulárne a secernované cytokíny, vykonávať štúdie fagocytózy, analyzovať bunkový cyklus, hodnotiť apoptózu a proliferáciu. Hlavné populácie lymfocytov periférnej krvi zdravých jedincov sú uvedené v tabuľke 3.2. Tieto ukazovatele možno považovať za normatívne pri vykonávaní imunologických štúdií.
Tabuľka 3.2
Intervaly distribúcie hlavných a vedľajších populácií lymfocytov v periférnej krvi prakticky zdravých jedincov ___________________ [Khaidukov S.V. a kol., 2009]__________________
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pokles absolútneho počtu T-lymfocytov poukazuje na nedostatočnosť bunkovej imunity (nedostatočnosť bunkovej efektorovej zložky imunity). Vyskytuje sa pomerne často pri rôznych infekciách, nešpecifických zápalových procesoch, malígnych
prirodzené nádory, v pooperačnom období, pri infarkte a pod. Klinicky priaznivým znakom je zvýšenie počtu T-lymfocytov v dynamike ochorenia. Úplné dokončenie ochorenia je zvyčajne sprevádzané normalizáciou počtu T-lymfocytov.
Zvýšenie absolútneho počtu CD4+ lymfocytov indikuje stimuláciu imunitného systému na niektorý antigén a slúži ako potvrdenie hyperreaktívnych syndrómov. Treba si však uvedomiť, že ich zvýšenie nie je najčastejšie nič iné ako normálna fyziologická reakcia na antigén, ktorú pozorujeme pri špecifických aj nešpecifických infekčných ochoreniach. Proliferácia CD4+T lymfocytov pokračuje 3-5 dní po aktivácii. Zabezpečuje zvýšenie počtu buniek v klonoch zapojených do imunitnej odpovede – proliferatívnej expanzie klonov. T bunky prechádzajú 6-8 deleniami, čo zabezpečuje zvýšenie ich počtu približne 100-200 krát. Ak teda počiatočný počet T-buniek v klone možno u ľudí odhadnúť na približne 2^10 (na základe odhadu celkového počtu T pomocníkov - 7x10 resp.
možný počet klonov je 3x10), potom po proliferácii môže ich počet presiahnuť 106. Tým je zabezpečená správna účinnosť imunitnej odpovede, keďže tvorba aktívnych T-pomocníkov je nevyhnutná pre úspešnú realizáciu takmer všetkých jej vetiev. Zníženie počtu T-helper buniek naznačuje hyporeaktívny syndróm s porušením regulačnej zložky imunity. To je zrejmé najmä v prípade infekcie HIV.
Zvýšenie počtu cytotoxických T-lymfocytov je určené takmer pri všetkých vírusových, bakteriálnych a protozoálnych infekciách. Relatívny nárast počtu CD8+ buniek je zvyčajne spôsobený znížením počtu pomocných T buniek, hoci tento vzor nie je vždy pozorovaný. Je to spôsobené tým, že cytotoxické T-lymfocyty syntetizujú IFN-γ, ktorý inhibuje proliferáciu T-buniek, a pretože CD8+ lymfocyty boli predtým považované za T-supresory. Pokles počtu cytotoxických T-lymfocytov potvrdzuje nedostatočnosť bunkovej efektorovej zložky imunity, ktorá je dôležitá najmä pri liečbe chronických vírusových infekcií (vírusové hepatitídy, herpesy a pod.).
Počet B-lymfocytov v periférnej krvi sa stanovuje pomocou CD^-markera, ktorý je prítomný na všetkých B-bunkách periférnej krvi, ale chýba na plazmatických bunkách.
Z diagnostického hľadiska majú NK lymfocyty dva dôležité CD markery - 16 a 56. Ich celkový počet v krvi je: CD16+ bunky - 6-26%, CD56+ bunky - 7-31% (0,09-0,6x10 %). Zníženie počtu týchto buniek je patognomickým znakom imunodeficiencie bunkových efektorov spôsobenej závažnosťou rakoviny a vírusových infekcií a pozoruje sa aj pri užívaní imunosupresív. Zvýšenie počtu NK buniek je spojené s aktiváciou protitransplantačnej imunity, v niektorých prípadoch pozorovanej pri bronchiálnej astme, t.j. je patognomickým znakom bunkami sprostredkovanej cytotoxicity.
Dnes už takzvaný regulačný (diferenciačný) index, pomer CD4+ a CD8+ lymfocytov, stráca klinický význam. Predpokladá sa, že hodnota tohto indexu pod 1,0 zodpovedá imunodeficiencii, viac ako 2,5 - hyperaktivite. Z moderného pohľadu by bolo v súčasnosti nesprávne interpretovať tento ukazovateľ týmto spôsobom. Viac informatívne pre takéto závery je absolútny počet subpopulácií T-lymfocytov a aktivačných markerov.
Prejavom aktivácie je expresia rôznych aktivačných markerov na bunkách. Na T-lymfocytoch po stimulácii sa teda do 2-3 hodín objaví na povrchu CD69 – najskorší aktivačný antigén, čiastočne mobilizovaný z intracelulárnych zásob a čiastočne exprimovaný de novo. Jeho prejav trvá o niečo viac ako jeden deň. Krátko po CD69 sa na bunkovom povrchu objavuje ďalší marker včasnej aktivácie, CD25. Nasledujúce prejavy aktivácie sa pozorujú jeden deň po pôsobení stimulantu, keď sa exprimuje molekula transferínového receptora (CD71). V nasledujúcich dňoch (3-6 dní) sa exprimujú molekuly MHC-II, označované ako neskoré markery aktivácie T-buniek, a potom integríny, označené ako antigény veľmi neskorej aktivácie VLA (veľmi neskoré aktivačné antigény) a chemokíny sú vylučované. Tieto neskoré prejavy aktivácie buniek sú kombinované s proliferatívnym procesom.
Funkčný stav T-lymfocytov je indikovaný počtom buniek exprimujúcich receptory pre IL-2 (CD25+ lymfocyty). Normálne je ich relatívny počet v krvi 13-24%. Pri hyperreaktívnych syndrómoch sa počet týchto buniek zvyšuje pri imunodeficienciách, počet klesá. Indikátorom imunitnej hyperreaktivity je aj počet lymfocytov nesúcich dva receptory – CD3 a HLA-DR. Normálne by ich nemalo byť viac ako 12 %.
V súčasnosti sa typujú ďalšie markery, v súčasnosti existuje asi 263 odrôd. To je dôležité najmä v onkohematológii na objasnenie diagnózy.
Okrem stanovenia kvantitatívneho zloženia buniek imunitného systému je veľmi dôležité poskytnúť aj kvalitatívny popis ich funkčnej aktivity. Vďaka nedávno používanej viacfarebnej prietokovej cytometrii možno funkčnú aktivitu buniek posúdiť prítomnosťou určitých receptorov. Z klinického hľadiska sú najdôležitejšie receptory:
CD5 je adhézna molekula, ktorá reguluje aktiváciu buniek. Stanovené na T-lymfocytoch, tymocytoch, B1 klone B-buniek;
CD11b je jedným z najdôležitejších integrínov pre migráciu buniek, ktoré určujú aktivitu fagocytózy, bunkovú cytotoxicitu, chemotaxiu a bunkovú aktiváciu T-efektorov, NK buniek, makrofágov a granulocytov;
CD16 je receptor pre Fc fragment IgG, sprostredkováva fagocytózu a bunkovú cytotoxicitu závislú od protilátok, pri aktivácii sa zvyšuje cytotoxicita NK buniek, stimuluje sa sekrécia interferónu a faktora nekrózy nádorov;
CD23 - exprimovaný na aktivovaných B bunkách, makrofágoch, epitelových bunkách týmusu, eozinofiloch, krvných doštičkách. Indikátor aktivity B buniek.
CD25 je a-reťazec IL2 receptora. Vyjadrené na rôznych typoch buniek periférnej krvi: CD4+-, CD8+-, NK-lymfocyty, NKT-bunky, B-lymfocyty, monocyty. Marker včasnej aktivácie T lymfocytov. Zvýšenie ich počtu, ako aj vo všeobecnej populácii CD25-pozitívnych lymfocytov, môže naznačovať zápalový proces akejkoľvek povahy (infekčný, autoimunitný);
CD27 je ďalší marker B2 lymfocytov. Označuje prechod B lymfocytov z naivných buniek do pamäťových buniek;
CD28 je exprimovaný na väčšine aktivovaných T lymfocytov, NK bunkách a plazmatických bunkách. Vyžaduje sa ako kostimulačný faktor na vyvolanie imunitnej odpovede (proliferácia a aktivácia buniek);
CD38 je cyklická ADP-ribozylhydroláza, nachádzajúca sa na povrchu lymfocytov, zabezpečuje adhéziu, prenos signálu a je tiež markerom bunkovej aktivácie (metabolický marker). Znížený výskyt infekcie HIV, leukémie, myelómu, solídnych nádorov, cukrovky typu II;
CD50, intercelulárna adhézna molekula (ICAM-3), je tiež silnou signálnou molekulou. Prítomný na všetkých leukocytoch, endoteliálnych a dendritických bunkách. Poskytuje kostimulačné signály pre T bunky a reguluje bunkovú adhéziu interakciou s integrínmi. Preukázal sa pokles počtu CD50+ buniek pri nádorových ochoreniach;
CD57 je exprimovaný na subpopuláciách 15-20 % mononukleárnych buniek periférnej krvi, 60 % NK a T buniek. Zvýšenie ukazovateľov sa určuje u pacientov s rakovinou, pacientov po transplantácii, u pacientov s HIV, ako aj s reumatoidnou artritídou a Feltyho syndrómom. Pokles je patognomický s chronickou lymskou boreliózou;
Pre poruchu aktivácie T lymfocyty charakterizované prítomnosťou normálneho alebo zvýšeného počtu T buniek v krvi. Tieto bunky si zachovávajú normálny fenotyp, ale prenos signálu z receptorov do bunky je narušený. Preto neproliferujú ani neprodukujú cytokíny, keď sú stimulované mitogénmi, antigénmi alebo inými signálmi z TCR.
Podľa klinických prejavov sú takéto defekty podobné iným typom deficitu a v niektorých prípadoch sa nedajú odlíšiť od ťažkej kombinovanej imunodeficiencie.
CD8 lymfopénia v dôsledku mutácie génu zeta-asociovaného proteínu 70
U pacientov s poruchou Aktivácia T buniekŤažké, opakujúce sa a často smrteľné infekcie sa vyvinú v dojčenskom veku. Najviac prípadov bolo identifikovaných medzi mennonitmi. Počet B lymfocytov v krvi je normálny alebo zvýšený; koncentrácia imunoglobulínov v sére je premenlivá. Expresia povrchových antigénov CD3 a CD4 na T lymfocytoch je zachovaná, ale bunky CD8 takmer úplne chýbajú.
Nereagujú na mitogény alebo alogénne bunky in vitro a neprodukujú cytotoxické T lymfocyty. Aktivita NK buniek je zachovaná. Týmus jedného z pacientov mal normálnu štruktúru a boli tam bunky s oboma povrchovými markermi – CD4 a CD8. Avšak bunky CD8 chýbali. Tento stav je spôsobený mutáciami v géne kódujúcom zeta-asociovaný proteín 70 (ZAP-70), tyrozínkinázu, ktorá nepatrí do rodiny Src a hrá dôležitú úlohu pri prenose signálov do T lymfocytov.
gén ZAP-70 nachádza sa na dlhom ramene chromozómu 2 (sekcia ql2). Normálny počet T lymfocytov s oboma markermi (CD4 a CD8) sa vysvetľuje možnosťou použitia inej tyrozínkinázy, Syk, na pozitívnu selekciu. Hladina Syk v tymocytoch je 4-krát vyššia ako jeho obsah v periférnych T-lymfocytoch, čo zrejme určuje absenciu normálnej reakcie krvných CD4 buniek.
Nedostatok p56-Isk. U 2-mesačného chlapčeka trpiaceho bakteriálnymi, vírusovými a plesňovými infekciami bola zistená lymfopénia a hypogamaglobulinémia. V krvi boli prítomné B a NK bunky, ale počet CD4 T lymfocytov bol nízky. Reakcie na mitogény boli nekonzistentné. Stimulácia TCR neviedla k expresii CD69. Keď sa však stimuloval forbolmyristátacetátom a kalciovým ionofórom CD69 (čo je aktivačný marker), objavil sa na T lymfocytoch, čo naznačuje defekt v proximálnych úsekoch signálnej dráhy do buniek.
Molekulárna výskumu odhalili alternatívne zostrihy transkriptu, čo viedlo k absencii kinázovej domény v p56-lck.
