Aminosyror kan detekteras med hjälp av färgreaktioner: ninhydrin, xantoprotein, Foly, Milone, biurettest, etc. Dessa reaktioner är ospecifika, eftersom baseras på detektering av enskilda fragment i strukturen av aminosyror, som även kan hittas i andra föreningar.
Ninhydrinreaktion, en färgreaktion som används för kvalitativ och kvantitativ bestämning av aminosyror, iminosyror och aminer. Vid uppvärmning alkalisk miljö ninhydrin (tricetohydrindihydrat, C 9 H b O 4) med ämnen med primära aminogrupper (-NH 2), bildas en produkt som har en stabil intensiv blåviolett färg med en maximal absorption på ca 570 nm. Eftersom absorption vid denna våglängd beror linjärt på antalet fria aminogrupper, tjänade ninhydrinreaktionen som bas för deras kvantitativa bestämning genom kolorimetri eller spektrofotometri. Denna reaktion används också för att bestämma sekundära aminogrupper (>NH) i iminosyror - prolin och hydroxiprolin; i detta fall bildas en ljusgul produkt. Känslighet - upp till 0,01%. Modern automatisk aminosyraanalys utförs genom att kombinera jonbytesseparation av aminosyror och deras kvantitativa bestämning med hjälp av ninhydrinreaktionen. Vid separering av blandningar av aminosyror gör papperskromatografi att du kan bestämma varje aminosyra i en mängd av minst 2-5 μg.
Färgens intensitet kan användas för att bedöma mängden aminosyror.
Denna reaktion är positiv inte bara med fria aminosyror utan också med peptider, proteiner etc.
Xantoproteinreaktion låter dig upptäcka aromatiska aminosyror(fenylalanin, tyrosin, histidin, tryptofan), baserat på reaktionen av elektrofil substitution i den aromatiska ringen (nitrering).
När koncentrerad salpetersyra verkar på till exempel tyrosin, bildas en gulfärgad produkt.
Följ reaktion. Detta är en reaktion på cystein och cystin. Under alkalisk hydrolys spjälkas det "svagt bundna svavlet" i cystein och cystin ganska lätt, vilket resulterar i bildningen av vätesulfid, som, som reagerar med alkali, producerar natrium- eller kaliumsulfider. När bly(II)acetat tillsätts bildas en gråsvart fällning av bly(II)sulfid.
Beskrivning av upplevelsen. 1 ml cystinlösning hälls i ett provrör, 0,5 ml 20% natriumhydroxidlösning tillsätts. Blandningen upphettas till kokning och sedan tillsätts 0,5 ml bly(II)acetatlösning. En gråsvart fällning av bly(II)sulfid observeras:
Zimmerman reaktion. Detta är en reaktion på aminosyran glycin.
Beskrivning av upplevelsen. Till 2 ml av en 0,1 % glycinlösning, justerad genom att tillsätta en 10 % alkalilösning till pH = 8, tillsätt 0,5 ml vattenlösning o-ftalsyra dialdehyd. Reaktionsblandningen börjar långsamt bli ljusgrön. Efter några minuter visas en grön fällning.
Reaktion på tryptofan. Tryptofan, som reagerar i en sur miljö med aldehyder, bildar färgade kondensationsprodukter. Till exempel, med glyoxylsyra (som är en blandning av koncentrerad ättiksyra), fortskrider reaktionen enligt ekvationen:
Reaktionen av tryptofan med formaldehyd fortskrider enligt ett liknande schema.
Sakaguchis reaktion. Denna reaktion på aminosyran arginin är baserad på interaktionen mellan arginin och a-naftol i närvaro av ett oxidationsmedel. Dess mekanism har ännu inte helt klarlagts. Uppenbarligen utförs reaktionen enligt följande ekvation:
Eftersom kinoneiminderivat (in I detta fall naftokinon), där vätet i iminogruppen -NH- är ersatt med en alkyl- eller arylradikal, alltid färgas gul-röd, sedan förklaras tydligen den orange-röda färgen på lösningen under Sakaguchi-reaktionen av uppkomsten av naftokinoniminderivatet. Möjligheten för bildandet av en ännu mer komplex förening på grund av ytterligare oxidation av de återstående NH-grupperna i argininresten och bensenringen av α-naftol kan dock inte uteslutas:
Beskrivning av upplevelsen. 2 ml av en 0,01 % argininlösning hälls i ett provrör, därefter tillsätts 2 ml av en 10 % natriumhydroxidlösning och några droppar 0,2 %. alkohollösning a-naftol. Innehållet i provröret blandas väl, 0,5 ml hypobromitlösning tillsätts och blandas igen. Tillsätt omedelbart 1 ml 40 % urealösning för att stabilisera den snabbt utvecklande orange-röda färgen.
Biuret reaktion– används som en färgreaktion på proteiner. I en alkalisk miljö i närvaro av koppar(II)salter ger de en violett färg. Färgen beror på bildandet av en koppar(II)-komplexförening på grund av peptidgruppen -CO-NH-, vilket är karakteristiskt för proteiner. Denna reaktion fick sitt namn från ett ureaderivat - biuret, som bildas när urea värms upp med eliminering av ammoniak:
Förutom proteiner och biuret ges samma färgning av andra föreningar som innehåller denna grupp: amider, imider av karboxylsyror, samt föreningar som innehåller grupperna -CS-NH- eller =CH-NH- i molekylen. Proteiner, vissa aminosyror, peptider, biuret och medium peptoner reagerar också.
Färgen på komplexet som erhålls genom biuretreaktionen med olika peptider är något annorlunda och beror på peptidkedjans längd. Peptider med en kedjelängd på fyra aminosyrarester och högre bildar ett rött komplex, tripeptider - lila och dipeptider - blå.
ketonformen av polypeptiden
enolform av polypeptiden
När en polypeptid interagerar med Cu (OH) 2 bildas ett komplex, vars struktur kan visas enligt följande.
Utrustning och reagens: kromatografipapper; kromatografikammare; fotoelektrisk kolorimeter; sax; glasplattor (3´32 cm) - 3 st.; kromatogramhållare; torkskåp; mikropipetter; provrör med slipade proppar; byrett 25 ml; standardblandning av aminosyror; testblandning av aminosyror; butanol, ättiksyra, vatten i ett förhållande av 15:3:7; 1% lösning av ninhydrin i 95% aceton; etylalkohol (75%), mättad med kopparsulfat.
Slutförande av arbetet
Ta ett ark kromatografiskt papper som mäter 18 x 28 cm och rita en horisontell linje med en enkel penna på ett avstånd av 3 cm från dess korta kant. Sedan är det uppdelat i ojämna segment i enlighet med det bifogade diagrammet och gränserna för tillämpningen av standarden och testblandningar är markerade med pilar och motsvarande inskriptioner görs med en enkel penna.
Papperet förstärks ovanför bordsytan och standardblandningen appliceras först på startlinjen, begränsad av pilarna, med hjälp av en speciell mikropipett i en tunn linje tills hela lösningen från mikropipetten överförs till startlinjen (mikropipetten är fylld till 2-3 cm). Massan av den applicerade lösningen mäts genom att väga pipetten fylld med standardblandningen (innan lösningen appliceras) och tömma (efter applicering av lösningen). 0,02-0,03 g standardlösning appliceras vanligtvis på papperet. Fyll sedan en ren pipett med testblandningen av aminosyror (utfärdad av läraren för studien), väg den och applicera blandningen på startlinjen med lämplig markering.
Det framställda kromatogrammet placeras i en kromatografisk kammare med ett lösningsmedelssystem som tidigare hällts i det för att separera en blandning av aminosyror, till exempel en blandning av butanol, ättiksyra och vatten i förhållandet 15:3:7. Separation utförs genom stigande kromatografi tills frontlinjen når 2-3 cm till överkanten av kromatografipapperet (slutlinjen). Efter detta avlägsnas kromatogrammet från kammaren och den övre änden av papperet förs omedelbart in i en hållare gjord av tre glasstavar fästa med en gummiring och placeras i ett dragskåp i 20 minuter för att avlägsna lösningsmedel från papperet.
Ris. 8. Layout av aminosyror på kromatogrammet:
A - appliceringspunkt för aminosyrablandningen; I - cystin och cystein;
2 - lysin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - asparaginsyra,
serie och glycin; 6 - glutaminsyra och treonin; 7 - alanin;
8 - prolin; 9 - tyrosin; 10 - valin och metionin; II - tryptofan;
12 - fenylalanin; 13 – leucin och isoleucin
Det torkade kromatogrammet doppas i en 1% lösning av ninhydrin i aceton för att detektera positionen av aminosyrafläckar på den. Kromatogrammet placeras sedan i ett dragskåp i 10 minuter för att avlägsna aceton och överförs till ett torkskåp, där det lämnas i 15 minuter vid 70°C. Aminosyror i standarden och testblandningar detekteras i form av blåvioletta fläckar placerade i en kedja i lösningsmedelssystemets rörelseriktning från startlinjen till den övre kanten av kromatogrammet.
Identifieringen av aminosyror som ingår i testblandningen utförs genom sammanträffande i kromatogrammet av positionerna som upptas av aminosyrorna i standarden och testblandningarna (fig. 8).
För att bestämma det kvantitativa innehållet av aminosyror i testblandningarna ritas kromatogrammet med en enkel penna så att de färgade zonerna som ligger på samma nivå, motsvarande samma aminosyra, finns inom ungefär identiska rektanglar (fig. 9). .
I II III IV
Ris. 9. Schema för arrangemang av aminosyror på kromatogrammet:
I - blandning nr. I; II - blandning nr 2; 1U - blandning nr 3; Ш - standard
aminosyrablandning
De skisserade områdena av papper skärs ut och placeras i provrör, vars nummer måste motsvara antalet fläckar på kromatogrammen. 10 ml av en 75 % lösning hälls i varje provrör från en byrett. etanol mättad med honungssulfat (tillsätt 0,2 ml mättad kopparsulfatlösning till 500 ml etylalkohol). Provröret försluts och under omrörning då och då överförs den tegelröda färgen (Ruheman blåviolett kopparsalt) helt från papperet till lösningen. Detta tar 15-20 minuter. Absorptionen (optisk densitet) av standard- och testlösningarna mäts på en fotoelektrisk kalorimeter med ett grönt ljusfilter (540 nm). En kyvett med en 75% lösning av etylalkohol med kopparsulfat installeras i referensflödet.
Det kvantitativa innehållet av aminosyror i testlösningen beräknas utifrån förhållandet mellan extinktioner av test- och standardproverna.
Räkneexempel. Låt oss anta att standardblandningen innehåller 1,8 mg glycin i 1 ml, och 0,02 g av denna standardlösning appliceras på startremsan. Därför fick kromatogrammet (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glycin. Låt oss vidare komma överens om att absorptionen av de färgade lösningarna var 0,288 för standarden och 0,336 för den okända blandningen. Då blir glycinhalten i blandningen som studeras, avsatt på kromatogrammet, (36´0,336): 0,288=42 μg. Om vi vidare antar att testblandningen appliceras på kromatogrammet i en mängd av till exempel 0,0250 g, så blir glycinhalten i 1 ml av testlösningen (42:0,0250) = 1680 μg, eller 1,68 mg/ ml.
Presentera resultaten av ditt eget experiment och dra slutsatser av dem.
Laboratoriearbete nr 15
JonseparationFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+
Den här artikeln kommer att diskutera metoder för att bestämma aminosyror, som används inte bara i analys av produkter, utan i biokemi och farmaceutisk analys.
Den totala mängden aminosyror kan bestämmas med en fotometrisk metod baserad på bestämning av ammoniak erhållen från aminosyror med användning av Kjeldahl-metoden.
Reaktion med 1-naftol. För att bestämma arginin, histidin och tyrosin föreslogs en reaktion med 1-naftol. I närvaro av natriumhypoklorit (NaOCl) blir lösningen röd. En provlösning i 50 % etanol innehållande en aminosyra kyls med is och en 10 % NaOCl-lösning och en naftollösning tillsätts. Reaktionsprodukten färgas röd (1 max = 550 nm). Innehållet av aminosyror bestäms av färgintensiteten hos den resulterande lösningen.
Biuret reaktion. En av viktigaste reaktionerna används för att bestämma aminosyror är biuretreaktionen. Reaktionen utförs genom att tillsätta en utspädd vattenlösning av koppar(II)salt till en alkalisk lösning av biuret. I det här fallet blir lösningen intensiv lila på grund av bildandet av en komplex förening.
Biuretreaktionen involverar föreningar som innehåller minst 2 amidgrupper eller en aminohydroxietylengrupp, såväl som amider och imider av aminosyror. Denna reaktion utförs av proteiner och koncentrerade lösningar av aminosyror och amider. Utspädda lösningar av aminosyror ger ingen biuretreaktion och därför kan reaktionen användas för att bestämma slutet av proteinhydrolys. Reaktionen används också för kvalitativ och kvantitativ bestämning av protein. Biuretreaktionen är grunden för de metoder som används i kliniska diagnostiska laboratorier för att bestämma protein i blodet och andra biologiska vätskor.
Ninhydrinreaktion. Den näst viktigaste reaktionen som används för att bestämma aminosyror är ninhydrinreaktionen - en färgreaktion på a-aminosyror, som utförs genom att värma den senare i en alkalisk lösning av överskott av ninhydrin.
Ninhydrin utför oxidativ dekarboxylering av a-aminosyror med bildning av ammoniak, koldioxid och en aldehyd innehållande en mindre kolatom än moderaminosyran. Det reducerade ninhydrinet reagerar vidare med den frigjorda ammoniaken och en andra ninhydrinmolekyl och bildar en färgad kondensationsprodukt med ammoniak.
Den resulterande föreningen (pigment) har en violettblå färg (l max = 570 nm). Bildandet av denna färgade förening används i det kvantitativa a-aminosyratestet, som kan detektera aminosyror även i mängder så små som 1 µg.
Prolin och hydroxiprolin, som inte har en a-aminogrupp, reagerar med ninhydrin och bildar derivat gul färg(l max = 440 nm). Reaktionen är inte specifik, eftersom ammoniak och föreningar som innehåller en aminogrupp (aminer, proteiner, peptider) ger också en färgad produkt med ninhydrin. Ingen CO 2 frigörs dock med dessa föreningar. Frisättningen av koldioxid är karakteristisk endast för a-aminosyror. Reaktionen används för kolorimetrisk kvantitativ bestämning av a-aminosyror, inklusive i automatiska aminosyraanalysatorer (mätning av CO 2 -volym).
Ninhydrinreaktionen används för att bestämma glycin, isoleucin, leucin; serin, fenylalanin, cystein, tyrosin, tryptofan, etc. ger mindre intensiv färgning.
De resulterande produkterna kännetecknas av en ganska intensiv färg (e = 1,8–3,3·10 4), men de färgade produkterna är instabila. Färgintensiteten minskar snabbt. CdCl2 tillsätts för stabilisering. Det bildar stabila komplex med de resulterande föreningarna. Kadmiumklorid påskyndar också reaktionen.
Aminosyror och några andra föreningar som innehåller en aminogrupp kondenserar i ett alkaliskt medium med 1,2-naftokinon - 4-sulfoxylat för att bilda röda, gula, orangea derivat av 1,2-naftokinonmonoimin.
Reaktionen används för att bestämma a-aminooxylater (valin, isoleucin, leucin, etc.).
För att bestämma tryptofan kan reaktionen med 4-dimetylaminobensaldehyd användas. Reaktionsprodukten färgas lila och tryptofanhalten i den analyserade lösningen bestäms av färgens intensitet.
Det bör dock noteras att denna reaktion sällan används i livsmedelsanalys.
För kvantitativ bestämning av aminosyror som innehåller svavel används en bromatometrisk metod, baserad på följande reaktion:
En lösning av cystein i 1% NaOH-lösning hälls i en kolv med en mald propp, 0,1 N tillsätts. kaliumbromatlösning, torr kaliumbromid och surgjordes med 10 % HCl.
BrO3 – + 5Br – + 6H + → 3Br2 + 3H2O
Det brom som bildas som ett resultat av reaktionen, vars mängd är ekvivalent med mängden kaliumbromat, reagerar med aminosyran. Efter 10 minuter tillsätts kaliumjodid, som reagerar med oreagerat brom, och den frigjorda joden titreras med 0,1 N. natriumtiosulfatlösning med stärkelse som indikator.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Mängden tiosulfat som används för titrering är ekvivalent med mängden brom som inte reagerade med aminosyran. Baserat på skillnaden mellan mängden tillsatt kaliumbromat och tiosulfat, hittas mängden brom som gick in i reaktionen med aminosyran, och därmed mängden aminosyra.
Metionin bestäms på liknande sätt. Metionin oxideras till en sulfon:
Denna reaktion gör det under vissa förhållanden möjligt att mycket noggrant bestämma metioninhalten.
Metoder för att bestämma aminosyror
Aminosyror är biologiskt aktiva substanser, de spelar en viktig roll i människokroppens liv, de används ofta som läkemedel. Vissa av dem är viktiga och kommer in i kroppen med mat. För närvarande finns det ett antal metoder för kvantitativ bestämning av aminosyror i medicinalväxtmaterial, bl.a. mediciner och biologiska vätskor, i livsmedelsprodukter.
Av mångfalden av metoder för kvantitativ bestämning av aminosyror i olika objekt kan fyra huvudgrupper urskiljas: kromatografiska, spektrofotometriska, titrimetriska och elektrokemiska analysmetoder.
Kromatografiska metoder
Bakom senaste decennierna Betydande framsteg har gjorts inom området gas-vätskekromatografi av aminosyror. En metod som använder mikropackade kolonner har föreslagits, vilket möjliggör relativt en kort tid separerar nästan helt 17 biologiskt viktiga a-aminosyror.
En metod har utvecklats för bestämning av aminosyror med hjälp av gas-vätskekromatografi i prover av serum, plasma, urin och cerebrospinalvätska baserad på framställning av 2,3,4,5,6-pentafluorbensoylisobutyletrar följt av separation på en polydimetylsiloxankolonn i temperaturprogrammeringsläge från 140°C till 250°C med en flamjoniseringsdetektor. Den kromatografiska separationstiden är 28 minuter. Som ett resultat av forskningen separerades 27 aminosyror.
Trots mångfalden av högpresterande vätskekromatografimetoder för analys av aminosyror är den snabbaste och mest tillgängliga versionen med omvänd fas med spektrofotometrisk detektion. För framgångsrik separation och detektion omvandlas aminosyror till hydrofoba och ljusabsorberande derivat, det vill säga pre-kolonnderivatisering utförs. Ortoftalaldehyd, naftalen-2,3-dikarboxialdehyd och 9-fluorenylmetylklorformiat används som derivatiseringsreagens.
En metod har utvecklats för kvantitativ bestämning av L-cystin, L-glutaminsyra och glycin i läkemedlet "Eltacin", som har antioxidantaktivitet i kombination med en antianginal effekt. Glutaminsyra och glycin bestämdes genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi efter pre-kolonnderivatisering med ortoftalaldehyd/N-acetyl-L-cysteinreagens. Derivatisering av cystein, enligt författarna, är svår på grund av instabiliteten hos själva aminosyran och de resulterande derivaten. Därför utfördes cysteinanalys genom bromatometrisk titrering. Det visade sig att närvaron av betydande mängder cystein i provet inte stör bestämningen av derivatiseringsprodukterna av glycin och glutaminsyra med ortoftalaldehyd/N-acetyl-L-cysteinreagenset. Metoden kännetecknas av hög reproducerbarhet och noggrannhet vid bestämning.
Möjligheten att använda 4,7-fenantrolin-5,6-dion (fankinon) som ett fluorogent märkningsreagens för pre-kolumnbildning av dess derivat i syfte att separera och kvantitativ analys av aminosyror genom högpresterande vätskekromatografi var undersökt. Utan någon inneboende fluorescens reagerar fankinon med aminogrupperna i aminosyrorna (vid 68 ° C i 160 minuter), och bildar iminokinoler, vars fluorescens mäts vid en våglängd av 460 nm. De isolerade derivaten identifierades med Tm-, IR-, massa- och PMR-spektra. Högpresterande vätskekromatografi utfördes på en kromatograf med en fluorescerande detektor och en kolonn med gradienteluering med blandningar: trietylaminlösning - Fosfatbuffert(pH 3) - metanol. Kinidin användes som en intern standard. Den här metodenär ganska lovande i stora laboratorier och kan föreslås för analys av aminosyror i färdiga doseringsformer.
En högpresterande vätskekromatografiteknik med en potentiometrisk biosensor för kvantitativ bestämning av lysin har utvecklats. Biosensorn är konstruerad genom att fästa ett lysinoxidas-innehållande membran till en jonselektiv NH4+-elektrod. Ammoniumjoner som genereras under enzymatisk nedbrytning av lysin detekteras potentiometriskt. En kromatodensitometrisk expressmetod för analys av tryptofan i odlingsvätskor har utvecklats. Tunnskiktskromatografi utfördes på Sorbfil-plattor. Kromatografi utfördes i systemet propanol-2 - 25% ammoniumhydroxidlösning (7:3) under 25 minuter. Kromatogram torkades kl rumstemperatur och hölls i 15 minuter vid 120°C. För att detektera fläckar på kromatogram användes ett specifikt reagens - 4-dimetylaminobensaldehyd, selektiv för indolringen av tryptofan, i form av en 0,5% etanollösning med tillsats av 5% koncentrerad svavelsyra. Efter att ha utvecklat kromatogrammen genom nedsänkning i en teflonkyvett med en nyberedd lösning av 4-dimetylaminobensaldehyd, hölls de i 5-7 minuter vid en temperatur av 110 C. Avsökning av tryptofanfläckar utfördes vid en våglängd av 625 nm på en datorvideodensitometer. Den utvecklade metoden, trots sin höga noggrannhet i bestämning och produktivitet, är specifik för tryptofan.
För analys av β-aminosyror i biologiska vätskor, mediciner och livsmedel används kapillärelektroforesmetoder i stor utsträckning, baserade på separation av komponenterna i en komplex blandning i en kvartskapillär under verkan av en applicerad elektriskt fält. Eftersom aminosyror är zwitterjoniska till sin natur kan de separeras med hjälp av elektrolytbuffertlösningar med ett lämpligt pH-värde, oftast används neutrala och basiska separationsbuffertar.
För att öka specificiteten och känsligheten hos kapillärelektroforesmetoden för analys av individuella β-aminosyror, används deras preliminära derivatisering, följt av separation i en kvartskapillär och spektrofotometrisk bestämning av reaktionsprodukterna. Således används 9-fluorenylmetylformiat, 9-(2-karbazol)-etylklorformiat och cyaninfärgämne som derivatiseringsmedel. Utsikterna med metoden beror på sådana fördelar som snabb analys, enkel provberedning, låg förbrukning av reagens och enkel instrumentering.
Och proteiner
Det är känt att alla 20 varianter av kanoniska α-aminosyror har samma struktur, med tre varianter av funktionella grupper (Fig. 3.3). Tyvärr är reaktioner på amino- och karboxigrupper inte särskilt specifika, eftersom följaktligen är de karakteristiska för alla aminer, ett antal amider och karboxylsyror. Detsamma gäller för de flesta av deras radikaler = R, varav 10 är opolära, det vill säga representerade av alifatiska = kolvätegrupper, varav de flesta är kemiskt inerta. Specificiteten för de flesta R-polära aminosyror, som innehåller alkohol (Ser, Tre, Tyr), amid (Asn, Gln) och karboxigrupper (Asp, Glu), är också relativt låg. Aminogruppen (Lys), imidazol His och guanidinogruppen Arg är mer aktiva, och aktiviteten hos tiogruppen Cys är maximal. Därför den största praktisk betydelse i kvalitet och kvantitativ analysα-aminosyror, inklusive i aminosyraanalysatorer, fick en universell ninhydrinreaktion, specifik för den samtidiga närvaron av både amino- och karboxigrupper vid α-C-atomen.
Ris. 3.3. Allmänna formler strukturer av a-aminosyror och deras polymerisationsprodukter. Förklaringar i texten.
Polymerisering av α-aminosyror till strukturen av peptider och proteiner (Fig. 3.3) behåller alla sina R-typer, men:
1. Ninhydrinreaktionen blir negativ, eftersom med undantag för de N- och C-terminala, används a-amino- och a-karboxigrupperna på bildningen av peptidbindningar. En positiv ninhydrinreaktion med protein indikerar troligen närvaron av aminosyraföroreningar i beredningen eller behållaren.
2. För alla peptider och proteiner är en biuretreaktion specifik för en peptidgrupp som saknas i monomera aminosyror.
3. Från mer specifika reaktioner för R-aminosyror är följande användbara: xantoproteinreaktion med koncentrerad salpetersyra, för aromatisk R Fen, Tyr, Tri; reaktion med isatin på den femledade Pro-ringen, såväl som reaktioner på imidazolen R His, tiogruppen Cys och guanidinogruppen Arg. Det är viktigt att ta hänsyn till att en del av dessa R är gömda inuti proteinkulor och därför försvagas kvalitativa reaktioner på dem. Därför, innan de utförs, denatureras proteiner vanligtvis på ett eller annat sätt.
4. Till skillnad från äkta aminosyralösningar, kolloidala lösningar proteiner är karakteristiska sedimentära reaktioner , förknippad med förstörelsen av deras hydratiseringsskal och, som ett resultat, en minskning av deras löslighet under inverkan av vattenavlägsnande medel: neutrala salter = utsaltning, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aceton, urea och andra medel.
När du utför kvalitativa reaktioner bör du:
1. Följ brandsäkerhetsreglerna noggrant och arbeta med koncentrerade syror och alkalier = EZh.
2. Markera 2 rader provrör med en glasgraf eller tuschpenna och placera högst 0,5 ml (2-5 droppar) av en 1 % aminosyralösning i ett av dem och ungefär samma volym av en 1 % proteinlösning i den andra.
3. I ett par provrör med aminosyra- och proteinlösningar, tillsätt 3-5 droppar av motsvarande reagens parallellt och utför de återstående procedurerna som anges för motsvarande reaktion.
4. Om det är nödvändigt att värma provrören, ta bort degellocket och tänd det torra bränslet med en tändsticka. Kläm sedan fast provröret i en hållare, vars primitiva design är mycket opålitlig. Därför är det bättre att slå in ett par provrör med en bit papper vikt till en remsa och hålla dem tumme, passera de nedre halvorna av provrören jämnt genom lågan, undvika att peka med nacken mot grannar och få lösningen att koka våldsamt. Efter att ha avslutat operationen, släck omedelbart lågan med degellocket.
5. Resultaten av försöken, i enlighet med mallen, upprättas om laboratorieanteckningsbokens spridning i tabellform:
6. Efter att ha beaktat de erhållna resultaten och, efter att ha slutfört protokollet, tillsammans med ett ställ med provrör, presentera dem för läraren för skydd.
1. Ninhydrinreaktion. Baserat på deaminering och dekarboxylering av α-aminosyror med en alkohollösning av ninhydrin:
Den resulterande ammoniaken, som reagerar med två ninhydrinmolekyler, bildar ett färgat derivat med ett absorptionsmaximum vid 540 nm (för Pro - 440 nm).
Framsteg: Tillsätt 3-5 droppar av en 0,5 % alkohollösning av ninhydrin till testproverna. Värm försiktigt provrören med blandningarna på en låga och registrera efter 2-3 minuter hur färgen ser ut.
2. Xantoproteinreaktion. Som nämnts ovan är det baserat på bildningen av nitroderivat av aminosyror med aromatisk R: Fen, Tyr, Tri.
Framsteg: Slå på dragskåpet och tillsätt försiktigt några droppar koncentrerad salpetersyra (HNO 3) till ett par provrör med testlösningarna. Värm försiktigt provrören på en låga, undvik att peka med halsen mot grannar och registrera färgutvecklingen.
3. Nitroprussidreaktion. Den är baserad på alkalisk hydrolys av den svavelhaltiga aminosyran cystein, med frisättning av natriumsulfid (Na 2 S), vilket ger ett rött komplex med en nyberedd lösning av natriumnitroprussid.
Framsteg: Tillsätt en lika stor volym 20 % natriumhydroxid till båda provrören med 5-10 droppar av testlösningarna och låt koka i minst 3-5 minuter. Tillsätt 3-5 droppar natriumnitroprussidlösning till provrören och registrera färgutvecklingen.
4. Biuretreaktion. Den är baserad på bildandet av ett färgat komplex av en peptidbindning med en Cu 2+-jon i en alkalisk miljö. Fungerar som ett universellt test för att identifiera peptider och proteiner i lösningar. Eftersom med ökande antal peptidbindningar ökar färgintensiteten hos lösningen linjärt, används den i stor utsträckning för fotometrisk bestämning av proteinkoncentrationer.
Framsteg. Tillsätt samma mängd 10 % natriumhydroxidlösning till provrören med 5-10 droppar av testlösningarna. Blanda väl och tillsätt 2 droppar 1% kopparsulfatlösning (CuSO 4). Blanda proverna och registrera färgutvecklingen efter några minuter.
5. Kokprov. Baserat på termisk denaturering av proteiner.
Framsteg. Surgör båda provrören med testlösningarna med högst en droppe 1% ättiksyralösning (AcOH) och värm till kokning. Efter att ha kokat lösningarna i 2-3 minuter, registrera resultaten och förklara mekanismen för fenomenet.
6. Utfällning av salter av tungmetaller(Mäh) . Deras denaturerande egenskaper är baserade på förmågan hos tunga Me-katjoner att reagera med de R-funktionella grupperna i proteinmolekylen: tio-, amino-, karboxi-, aromatiska. Deras starka anjoner orsakar också omladdning av jongrupper i proteinmolekyler, och förstör därigenom jonbindningar i dem.
Framsteg. Tillsätt några droppar av en 5 % kopparsulfatlösning (CuSO 4) till båda provrören med testlösningarna. Anteckna och förklara erhållna resultat.
7. Utfällning med organiska syror. Baserat på syradenaturering av proteiner och bildning av kovalenta derivat av tio-, amino- och aromatiska grupper av R-aminosyror med organoklorer.
Framsteg. Tillsätt några droppar av en 10 % lösning av triklorättiksyra (TCA) till provrören med testlösningarna och registrera resultatet efter några minuter
