Transformácia
Transformácia je prenos čistej DNA z jednej bunky do druhej. Premenu objavil bakteriológ F. Griffiths v roku 1928 pri pokusoch s pneumokokmi. Pneumokoky majú dva typy kmeňov: S- a R-formy.
S-forma sa vyznačuje prítomnosťou polysacharidovej kapsuly, vďaka ktorej pri umelej kultivácii vytvára hladké lesklé kolónie; táto forma je patogénna pre myši. R-forma nemá tobolku, keď sa umelo pestuje, vytvára hrubé kolónie; táto forma je pre myši nepatogénna. Ale ak sú usmrtené S-bunky a živé R-bunky súčasne injikované myšiam, myši uhynú. Preto genetické vlastnosti jedného kmeňa ovplyvňujú genetické vlastnosti iného kmeňa.
V roku 1944 O. Avery, K. McLeod a M. McCarthy dokázali, že zmeny v dedičných vlastnostiach buniek sú spojené s prenosom DNA.
Schopnosť bunky transformovať sa je možná za jej špeciálnej podmienky, ktorá sa nazýva kompetencia. V kompetentných bunkách sa mení zloženie bunkovej steny a plazmalemy: stena sa stáva poréznou, plazmalema vytvára početné invaginácie a na vonkajšom povrchu sa objavujú špeciálne antigény - kompetenčné faktory (najmä špecifické proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou).
V prirodzených podmienkach vzniká extracelulárna čistá DNA počas smrti (lýzy) prokaryotov.
Transformácia sa spravidla vyskytuje v rámci jedného druhu prokaryotov, ale v prítomnosti homológnych génov sa pozoruje aj medzidruhová transformácia.
Proces transformácie zahŕňa nasledujúce fázy:
1. Pripojenie transformujúcej sa dvojvláknovej DNA k receptorom na povrchu recipientnej bunky.
2. Konverzia dvojvláknovej DNA na jednovláknovú.
3. Prienik jednovláknovej DNA do bunky.
4. Integrácia transformujúcej sa DNA do chromozómu príjemcu a rekombinácia genetického materiálu.
Dĺžka transformujúcej sa DNA by mala byť od 500 do 200 tisíc bp. Energia uvoľnená pri degradácii jedného z reťazcov DNA sa využíva na aktívny transport zostávajúceho reťazca do bunky.
Prvé tri stupne transformácie nezávisia od nukleotidového zloženia DNA. Proces integrácie transformujúcej DNA do chromozómu príjemcu je však pravdepodobnejší, ak je táto DNA vysoko homológna s DNA príjemcu.
Proces transformácie je znázornený na diagrame. Každý priamy segment zodpovedá jednému vláknu DNA. Transformujúca sa DNA je označená čiernou farbou a DNA prijímacej bunky je označená šedou farbou.
V prvom štádiu sa transformujúca DNA naviaže na receptorové miesta na povrchu recipientnej bunky.
V druhom štádiu sa dvojvláknová DNA na bunkovom povrchu premení na jednovláknovú DNA v dôsledku štiepenia jedného z vlákien bakteriálnymi nukleázami.
V treťom štádiu je zostávajúce vlákno DNA transportované cez membránu do cytoplazmy. To využíva energiu uvoľnenú počas degradácie komplementárneho reťazca.
Počas replikácie bakteriálneho chromozómu je transformujúci reťazec DNA pripojený k homológnej (čiastočne komplementárnej) oblasti DNA recipientnej bunky. V tomto prípade sa v dôsledku nedostatočnej komplementarity vytvorí heteroduplex („molekulárny heterozygot“) - časť dvojvláknovej DNA, v ktorej nie všetky nukleotidové páry majú dusíkaté bázy spojené vodíkovými väzbami. Zvyšok DNA sa normálne replikuje.
Po ukončení replikácie DNA sa prijímajúca bunka rozdelí a vytvorí dve bunky: čiastočne transformovanú bunku s chromozómom, ktorý obsahuje oblasť heteroduplexnej DNA, a netransformovanú bunku. Počas replikácie DNA v čiastočne transformovanej bunke sú komplementárne reťazce dokončené na oboch reťazcoch DNA. Jedno vlákno si zachováva pôvodné nukleotidové sekvencie, zatiaľ čo druhé sa úplne transformuje. Po rozdelení čiastočne transformovanej bunky vznikne jedna netransformovaná bunka a jedna úplne transformovaná bunka, v ktorých je pôvodná nukleotidová sekvencia nahradená nukleotidovou sekvenciou transformujúcej sa DNA.
Počas transformácie teda nedochádza k pridávaniu nových génov, ale k nahradeniu recipientných génov homológnymi nukleotidovými sekvenciami.
Frekvencia transformácie u prokaryotov závisí od vlastností transformujúcej sa DNA, jej koncentrácie, stavu recipientnej bunky a typu baktérie. Maximálna frekvencia transformovaných buniek nepresahuje 1 na 100 buniek.
Transformácia je známa aj pre eukaryoty. Na povrchu eukaryotických buniek však nie sú žiadne receptorové miesta a transformujúca DNA sa do buniek vnáša umelo. DNA sa napríklad zavádza do vajíčok zvierat priamou mikroinjekciou a do vajíčok rastlín mikroinjekciou do peľovej trubice.
Transdukcia je prenos genetického materiálu pomocou vírusov z bunky darcu do bunky príjemcu.
Fenomén transdukcie objavil v roku 1951 N. Zinder (žiak J. Lederberga).
Počas transdukcie vstupuje DNA z hostiteľskej bunky do viriónov. Virióny infikujú iné bunky a DNA pôvodnej bakteriálnej bunky preniká do inej bakteriálnej bunky. Vírusová DNA sa integruje do bakteriálneho chromozómu a zavedená bakteriálna DNA sa rekombinuje s DNA bakteriálneho chromozómu. Výsledkom je, že 50% buniek je transformovaných.
Existuje všeobecná (nešpecifická), obmedzená (špecifická) a abortívna transdukcia.
Všeobecná transdukcia
Počas všeobecnej transdukcie sú fragmenty donorovej bakteriálnej DNA náhodne zahrnuté do zrejúcej fágovej častice spolu s fágovou DNA alebo namiesto fágovej DNA. Fragmenty bakteriálnej DNA sa tvoria, keď je štiepená enzýmom riadeným fágom. Fágová častica môže obsahovať až 100 bakteriálnych génov.
Obmedzená transdukcia
Pri obmedzenej transdukcii dochádza k rekombinácii – bakteriálna DNA nahrádza časť fágovej DNA. Rekombinantná DNA obsahuje malý počet bakteriálnych génov susediacich s fágovou DNA integrovanou do bakteriálneho chromozómu.
Vo všeobecnosti a obmedzená transdukcia, darcovská DNA nahrádza homológne oblasti DNA príjemcu. Tento proces je podobný transformácii.
Abortívna transdukcia môže byť nešpecifická aj špecifická. Jeho podstata spočíva v tom, že fragment DNA transdukovaný fágom nie je zahrnutý v chromozóme príjemcu, ale existuje ako cytoplazmatický replikón. Skôr či neskôr sa tento replikón stratí.
Fenomén transdukcie vírusmi je široko používaný pri prenose génov u eukaryotov. Ak sa použije vírus, ktorý nie je schopný vytvoriť kapsidu (to znamená, že existuje len vo forme DNA), potom sa transdukcia zásadne nelíši od transformácie alebo od konjugatívneho prenosu genetického materiálu pomocou plazmidových vektorov. Vektorové systémy boli vytvorené na základe modifikovaných vírusov SV40 (tvoria až 100 tisíc kópií v bunke), vírusu herpes, vakcínie a vírusu mozaiky karfiolu.
Je potrebné ešte raz zdôrazniť, že všetky opísané typy rekombinácií nesúvisia s pridaním nových úsekov DNA, ale s nahradením existujúcich nukleotidových sekvencií. Čím vyšší je stupeň homológie medzi transformujúcou sa a pôvodnou DNA, tým vyššia je pravdepodobnosť úspešnej rekombinácie. Najjednoduchší spôsob, ako dosiahnuť rekombináciu, sú enzýmy nachádzajúce sa vo všetkých organizmoch. Je ťažšie zaviesť nové regulátory, ktoré sú vysoko špecifické do genómu. Preto sa na zavedenie nových génov do genómu používajú zložitejšie metódy spojené s biochemickými modifikáciami DNA.
Transdukcia objavil J. Lederberg a N. Zinder v roku 1952 Salmonella typhimurium a fág P22.
Transdukcia– prenos genetickej informácie (chromozomálne gény alebo plazmidy) z bunky darcu do bunky príjemcu, ktorý sa uskutočňuje za účasti bakteriofágov. Počas transdukcie musia byť fragmenty chromozómov alebo plazmidov zabalené do hlavy bakteriofága; opustiť donorovú bunku ako súčasť tejto fágovej častice v dôsledku jej lýzy a vstúpiť do inej bunky (prijímajúcej bunky) počas nového aktu infekcie. Proteínová kapsida hlavy fága chráni v nej obsiahnutú DNA pred zničením extracelulárnymi nukleázami. V tomto ohľade je transdukcia DNA počas transformácie viac „zachovaná“ ako „nahá“ DNA. Keďže adsorpcia procesu fágového chvosta na receptoroch bunkového povrchu je druhovo špecifická, prenos genetického materiálu počas transdukcie môže nastať hlavne medzi blízko príbuznými baktériami.
Počas transdukcie je veľkosť preneseného fragmentu DNA určená veľkosťou hlavy bakteriofága. Rôzne fágy môžu prenášať fragmenty DNA od 20 do 40 kb. Počas transdukcie sa teda prenášajú jednotlivé gény aj spojené markery. Rekombinanty získané týmto spôsobom výmeny genetickej informácie sa nazývajú transduktanty.
Transdukčné štúdie ukázali, že niektoré fágy môžu prenášať rôzne bakteriálne gény, zatiaľ čo iné môžu prenášať iba niektoré. V súlade s tým je obvyklé rozlišovať dva typy transdukcie: 1) generalizované (nešpecifické, alebo všeobecné); 2) konkrétne, alebo obmedzené.
O generalizovanej transdukcie Akýkoľvek bakteriálny príznak sa môže prenášať s frekvenciou 10 –5 –10 –6. Množstvo bakteriálnej DNA, ktoré môže fág niesť, je zvyčajne 1–2 % z celkovej DNA obsiahnutej v bunke. Výnimkou je bakteriofág PBS1 B. subtilis, ktorý dokáže transdukovať až 8 % genómu hostiteľa. Pri realizácii generalizovanej transdukcie je bakteriálny vírus len „pasívnym“ nosičom genetického materiálu baktérií. Transdukčné defektné fágy obsahujú iba fragmenty bakteriálnej DNA. A genetická rekombinácia v transdukovaných baktériách prebieha podľa všeobecných zákonov procesu rekombinácie.
Charakteristické vlastnosti špecifická transdukcia sú: 1) každý transdukujúci fág prenáša iba presne definovanú, veľmi obmedzenú oblasť bakteriálneho chromozómu; 2) fág nielen prenáša genetický materiál, ale zabezpečuje aj jeho zaradenie do bakteriálneho chromozómu; 3) vírus inkorporuje bakteriálnu DNA do svojho genómu a prenáša ju, pričom lyzogenizuje recipientné baktérie.
Najznámejším príkladom špecifickej transdukcie je tá, ktorú vykonáva fág λ, ktorý je schopný infikovať bakteriálne bunky E. coli nasleduje integrácia jeho DNA do bakteriálneho genómu.
Transdukcia má praktické využitie:
Umožňuje transdukciu plazmidov a krátkych fragmentov donorového chromozómu;
Konštruovať kmene daného genotypu, najmä izogénne kmene. Izogénne kmene skonštruované pomocou generalizovanej transdukcie sa líšia len v oblasti chromozómu, ktorú nesie transdukujúci fág;
Pre presné mapovanie bakteriálnych génov, stanovenie poradia a ich umiestnenia v operónoch.
Otázky na sebaovládanie
1 Aké procesy môžu nastať v bunke príjemcu potom, čo do nej vstúpi darcovská DNA a prejde do stavu merozygota?
2 Čo je proces transformácie? Aké fázy zahŕňa?
3 Uveďte hlavné fázy procesu konjugácie.
4 Popíšte proces transdukcie. Ako sa špecifická transdukcia líši od zovšeobecnenej?
Praktická lekcia 8
Cieľ:štúdium hlavných metód genetickej výmeny v baktériách; identifikácia spoločných a charakteristických znakov procesov transformácie, konjugácie a transdukcie.
Materiály a vybavenie: demonštračné diagramy (nákresy): a) merozygoty; b) proces transformácie; c) mechanizmus bakteriálnej konjugácie; d) F-plazmidy baktérií E. coli; e) generalizovaná transdukcia; g) špecifická transdukcia; elektrónový mikrosnímok konjugujúcich sa buniek E. coli; farebné ceruzky.
Pokrok
V protokole lekcie:
1 Uveďte všeobecný opis metód výmeny genetickej informácie u baktérií: uveďte tri hlavné metódy výmeny genetickej informácie a ich všeobecné znaky.
2 Nakreslite diagram merozygota a ukážte dva spôsoby jeho vývoja.
3 Charakterizujte transformačný proces podľa popisnej schémy: pojem transformácia, história objavovania, etapy transformačného procesu, kompetencia, praktické využitie transformácie.
4 Zostavte grafologický diagram „Etapy procesu transformácie“, ktorý v tomto diagrame odzrkadľuje oddelene proces transformácie: a) plazmidová DNA; b) bakteriálna DNA.
5 Charakterizujte proces konjugácie podľa popisnej schémy: pojem konjugácia, história objavu, štádiá procesu konjugácie, množstvo prenesenej DNA pri konjugácii, praktické využitie konjugácie.
6 Zostavte grafologický diagram „Prenos genetického materiálu počas konjugácie“, ktorý v tomto diagrame osobitne zohľadní účasť ako darcovské bunky: a) F + -darcov; b) Donory typu Hfr.
7 Charakterizujte proces transdukcie podľa popisnej schémy: pojem transdukcia, história objavu, štádiá procesu transdukcie, množstvo prenesenej DNA pri transdukcii, typy transdukcie, praktické využitie transdukcie.
8 Zostavte grafologické diagramy „Zobecnená transdukcia“, „Špecifická transdukcia“. Všimnite si významné rozdiely medzi týmito dvoma typmi transdukcie.
Transdukcia je prenos génov z jednej bakteriálnej bunky do druhej pomocou bakteriofága. Prvýkrát tento fenomén založili v roku 1952 N. Zinder a J. Lederberg. Uskutočnili výskum baktérie Salmonella typhimurium, ktorá je patogénna pre myši. Vybrali sa dva kmene týchto baktérií: kmeň 22A, auxotrofný, neschopný syntetizovať tryptofán (T~) a kmeň 2A, schopný syntetizovať tryptofán (T1"). Tieto kmene sa naočkovali do skúmavky v tvare U, oddelené pri dno bakteriálnym filtrom (obr. 24 kmeň 22A (T~) bol naočkovaný do jedného kolena skúmavky a kmeň 2A (Ti") do druhého. Po určitom čase inkubácie baktérie kmeňa 22A, keď boli vysiate na minimálnom živnom médiu, produkovali malý počet kolónií (frekvencia výskytu transdukovaných buniek bola rovná NO~ 5). To naznačuje, že niektoré bunky získali schopnosť syntetizovať tryptofán. Ako mohli baktérie získať túto vlastnosť? Výskum
Ryža. 24. Schéma transducínového experimentu
ukázali, že kmeň 22A bol lyzogénny pre fág P-22. Toto
fág sa uvoľnil z lyzogénnej kultúry, prešiel cez ňu
filtrovať a lyzovať kmeň 2A. Spojením časti genetického
Po prijatí materiálu z kmeňa 2A sa bakteriálny fág vrátil a preniesol tento genetický materiál do kmeňa 22A. Kmeň 22A pri
získal špecifické dedičné vlastnosti kmeňa 2A,
v tomto prípade schopnosť syntetizovať tryptofán. Ostatné vlastnosti sa dajú preniesť podobne, vrátane schopnosti
na fermentáciu, rezistenciu na kantibiotiká a pod.
Fenomén transdukcie bol tiež preukázaný u Escherichia coli a aktinomycét. Spravidla sa transdukuje jeden gén, menej často dva a veľmi zriedka tri spojené gény. Pri prenose genetického materiálu sa nahradí časť molekuly fágovej DNA. Fág potom stratí svoj vlastný fragment a stane sa defektným. Zahrnutie genetického materiálu do chromozómu baktérie príjemcu sa uskutočňuje mechanizmom, akým je napríklad cross-over. K výmene dedičného materiálu dochádza medzi homológnymi oblasťami chromozómu príjemcu a materiálom zavedeným fágom.
Existujú tri typy transdukcie: všeobecná alebo nešpecifická, špecifická a abortívna. Počas nešpecifickej transdukcie, počas zostavovania fágových častíc, môže byť ktorýkoľvek z fragmentov DNA postihnutej baktérie zahrnutý do ich hlavy spolu s fágovou DNA. Výsledkom je, že rôzne gény z darcovskej baktérie môžu byť prenesené do buniek príjemcu. Nešpecifická transdukcia môže byť uskutočnená fágmi P-1 a P-22 v Escherichia, Shigella a Salmonella. Pri špecifickej transdukcii sa profág vloží do určitého miesta na bakteriálnom chromozóme a prenesie určité gény umiestnené v chromozóme donorovej bunky vedľa profága. Napríklad fág "k (lambda) v profágovom stave je vždy zahrnutý na rovnakom mieste v chromozóme E. coli a transdukuje lokus, ktorý určuje schopnosť fermentovať galaktózu. Keď sú profágy oddelené od hostiteľskej DNA, bakteriálne gény priľahlé k profágu sú eliminované z kompozície spolu s jeho chromozómom a časť profágových génov zostáva v jeho zložení. Frekvencia všeobecnej transdukcie sa pohybuje od 1 z 1 milióna do 1 zo 100 miliónov.
Zistilo sa, že fragment chromozómu darcu prenesený do bunky príjemcu nie je vždy zahrnutý v chromozóme príjemcu, ale môže byť zachovaný v cytoplazme bunky. Keď sa baktérie delia, skončia iba v jednej z dcérskych buniek. Tento stav sa nazýva abortívna transdukcia.
V inom bakteriofág. Všeobecná transdukcia sa používa v bakteriálnej genetike na mapovanie genómu. Mierne fágy aj virulentné sú schopné transdukcie, avšak ničia bakteriálnu populáciu, takže transdukcia s ich pomocou nemá veľký význam ani v prírode, ani vo výskume.
Transdukcia bola opísaná Norton Zinder a Joshua Lederberg v roku 1952 Salmonella. Pozorovali obnovenie normálnych fenotypov u auxotrofných kmeňov a dokázali, že prenos genetického materiálu môže uskutočniť iba vírus.
Mechanizmus
Všeobecná schéma transdukcie
Transdukcia je fágom sprostredkovaný prenos DNA medzi bakteriálnymi bunkami. Kľúčovým krokom v tomto procese je balenie prenesenej DNA do hlavy fága počas lytickej fázy jeho životného cyklu, to znamená, keď bunka zomrie, pričom sa vírusové častice uvoľnia smerom von. Pri zostavovaní vírusových častíc sa jeho vlastná DNA spravidla dostáva do hlavy fágu, ale občas sa vyskytnú chyby, keď fragmenty bakteriálnej DNA vstúpia do hlavy fágu, ktoré mohli vzniknúť napríklad pri deštrukcii bakteriálneho chromozómu spôsobenej fágom. Fágové častice obsahujúce fragmenty bakteriálnej DNA sa nazývajú transdukčné častice. Môžu infikovať bunky ako normálne fágy, pretože majú na to všetky potrebné gény. Keď fág po pripojení k bunke vstrekne do nej svoju genómovú DNA, vstrekne aj bakteriálnu DNA obsiahnutú v jej hlave. Zaujímavé je, že transdukcia je možná aj počas lytického cyklu.
Nie všetky fágy sú schopné transdukcie. Sú toho schopné len tie fágy, ktoré spôsobujú fragmentáciu bakteriálnej genómovej DNA na fragmenty požadovanej veľkosti tak, aby sa zmestili do kapsidy. Niekedy sa do viriónu nedostane genómová DNA baktérie, ale plazmid, ktorý sa po vstupe do ďalšej infikovanej bunky bude ďalej zdvojnásobovať. Fragmenty genómu prenášané fágmi, naopak, nie sú schopné replikácie; ich zdvojnásobenie je možné len vtedy, ak sa dokážu integrovať do chromozómu recipientnej baktérie. Ak fragment bakteriálneho genómu zostane voľný, počas niekoľkých generácií sa počas delenia dostane do jednej z dcérskych buniek; takáto transdukcia sa nazýva abortívna.
Video k téme
Transdukčné mapovanie
Transdukcia sa použila na mapovanie génov na bakteriálnych chromozómoch. Metóda je založená na skutočnosti, že fragmenty bakteriálnej DNA prenášané počas transdukcie sú pomerne veľké a môžu obsahovať množstvo génov, takže blízko umiestnené gény môžu byť prenášané súčasne počas transdukcie (kotransdukcie). Čím menšie sú gény
