A szomatotropin és más emberi hormonok bioszintézise. Interferonok beszerzése. Interferonok előállításának és használatának jellemzői Példa a rekombináns interferon előállítására

№ 7 Interferonok, természet. Elkészítési és felhasználási módok.
Interferon az immunrendszer fontos védőfehérjéire utal. A vírusinterferencia tanulmányozása során fedezték fel, vagyis azt a jelenséget, amikor az egyik vírussal fertőzött állatok vagy sejttenyészetek érzéketlenné váltak egy másik vírus fertőzésére. Kiderült, hogy az interferencia a keletkező fehérjének köszönhető, amely vírusellenes védő tulajdonságokkal rendelkezik. Ezt a fehérjét interferonnak nevezték.
Az interferon a glikoprotein fehérjék családja, amelyet az immunrendszer sejtjei és a kötőszövet szintetizálnak. Attól függően, hogy mely sejtek szintetizálják az interferont, három típus létezik: α, β és γ-interferonok.
Alfa interferonleukociták termelik, és ezt leukocitáknak nevezik; béta interferon fibroblasztnak nevezik, mert fibroblasztok – kötőszöveti sejtek – szintetizálják, ill gamma interferon- immun, mivel aktivált T-limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek, azaz immunsejtek termelik.
Az interferon folyamatosan szintetizálódik a szervezetben, és koncentrációja a vérben körülbelül 2 NE/ml (1 nemzetközi egység - NEKEM. - ez az interferon mennyisége, amely megvédi a sejttenyészetet 1 CPD 50 vírustól). Az interferon termelése meredeken növekszik vírusfertőzés során, valamint interferoninduktorok, például RNS, DNS és komplex polimerek hatásának kitéve. Az ilyen interferon induktorokat nevezzük interferonogének.
A vírusellenes hatás mellett az interferon daganatellenes védelemmel is rendelkezik, mivel késlelteti a daganatos sejtek szaporodását (reprodukcióját), valamint immunmoduláló hatást fejt ki, serkenti a fagocitózist, természetes ölősejteket, szabályozza a B-sejtek antitest képződését, aktiválja a fő sejtek expresszióját. hisztokompatibilitási komplexum.
A cselekvés mechanizmusaAz interferon összetett. Az interferon közvetlenül nem befolyásolja a vírust a sejten kívül, hanem speciális sejtreceptorokhoz kötődik, és befolyásolja a vírus szaporodási folyamatát a sejten belül a fehérjeszintézis szakaszában.
Interferon használata. Az interferon hatása annál hatékonyabb, minél hamarabb kezd szintetizálódni vagy kívülről bejutni a szervezetbe. Ezért használják profilaktikus célokra számos vírusfertőzés, például influenza esetén, valamint terápiás célokra krónikus vírusfertőzéseknél, mint például parenterális hepatitis (B, C, D ), herpesz, sclerosis multiplex stb. Az interferon pozitív eredményeket ad a rosszindulatú daganatok és az immunhiányos betegségek kezelésében.
Az interferonok fajspecifikusak, azaz az emberi interferon kevésbé hatékony az állatok számára és fordítva. Ez a fajspecifikusság azonban relatív.
Interferon fogadása. Az interferont kétféleképpen lehet előállítani: a) humán leukociták vagy limfociták biztonságos vírussal való megfertőzésével, melynek eredményeként a fertőzött sejtek interferont szintetizálnak, amelyet azután izolálnak és interferonkészítményeket állítanak elő belőle; b) génmanipulált - olyan rekombináns baktériumtörzsek termesztésével, amelyek képesek interferon termelésére termelési körülmények között. Jellemzően olyan rekombináns pseudomonas és Escherichia coli törzseket használnak, amelyek DNS-ébe interferon géneket építenek be. A géntechnológiával előállított interferont rekombinánsnak nevezik. Hazánkban a rekombináns interferon a „Reaferon” hivatalos nevet kapta. Ennek a gyógyszernek az előállítása sok szempontból hatékonyabb és olcsóbb, mint a leukocita gyógyszer.
A rekombináns interferon széles körben elterjedt a gyógyászatban, mint vírusfertőzések, daganatok és immunhiányos betegségek megelőző és terápiás szere.

Küldje el a jó munkát a tudásbázis egyszerű. Használja az alábbi űrlapot

Diákok, végzős hallgatók, fiatal tudósok, akik a tudásbázist tanulmányaikban és munkájukban használják, nagyon hálásak lesznek Önnek.

Közzétéve: http://www.allbest.ru/

Bevezetés

1 Az interferonok osztályozása

2. Módszerek interferonok előállítására

2.1 Humán leukociták fertőzéssel történő termelése

2.2 Interferonok kinyerése géntechnológiával

3. Az interferonok hatásmechanizmusai

4. A humán interferon terápiás felhasználása

Következtetés

Felhasznált irodalom jegyzéke

Bevezetés

1957-ben a londoni National Institute for Medical Research megállapította, hogy a vírusnak kitett emberi és állati sejtek olyan anyagokat választanak ki, amelyek a nem érintett sejteket ellenállóvá teszik a vírusfertőzéssel szemben. Úgy tűnik, hogy megakadályozzák (zavarják) a vírusok szaporodását a sejtben, ezért interferonoknak nevezték őket. Az interferonok segítik szervezetünket számos vírusos betegség leküzdésében.

A különböző típusú interferonokon alapuló készítményeket immunmodulátorként használják az immunrendszer normalizálására és erősítésére, beleértve a különféle súlyos betegségek - akut vírusos hepatitis, sclerosis multiplex, osteosarcoma, mielóma és bizonyos típusú limfómák - kezelésére.

Az interferonok 15 000-21 000 dalton molekulatömegű fehérjemolekulák, amelyeket a sejtek termelnek és választanak ki vírusfertőzésre vagy más kórokozókra válaszul.

Az interferonok (IFN-ek) az autogén glikoproteinek egy csoportja, amelyek hatásmechanizmusa egyidejű vírusellenes hatással jár - a sejtgének aktiválásával, amelynek eredményeként olyan fehérjék szintetizálódnak, amelyek gátolják a vírus DNS (RNS) szintézisét és immunmoduláló hatás - az a képesség, hogy fokozza az antigének expresszióját a sejtmembránokon és növelje a citotoxikus T-sejtek és a természetes gyilkos sejtek aktivitását.

1. NAK NEKAz interferonok osztályozása

A termelő sejtek típusától függően az összes interferon a következőkre osztható:

* b-interferonok.

* β-interferonok.

* g-interferonok.

Az előállítás módja szerint az interferonokat a következőkre osztják:

1. Természetes, vírusok által stimulált humán leukocita sejttenyészetből nyert:

b-interferon, b-interferon, interferon-b Nl;

2. Rekombináns, amelyet a genomjukba integrált interferongént tartalmazó baktériumok termelnek:

Interferon-b2A, interferon-b2B, interferon-blb.

Az interferon-b-t a leukociták termelik, és ezt leukocitáknak nevezik; A β-interferont fibroblasztnak nevezik, mivel fibroblasztok - kötőszöveti sejtek szintetizálják, a g-interferont pedig immunrendszernek, mivel aktivált T-limfociták, makrofágok, természetes gyilkos sejtek, azaz immunsejtek termelik.

Az interferon-g hatására megnő a citokinek, például az interleukin-1, interleukin-2, interleukin-12, IFNb és a tumor nekrózis faktor-b termelése.

2. Az interferonok előállításának módszerei

Az interferonokat kétféleképpen lehet előállítani:

a) a humán leukociták vagy limfociták biztonságos vírussal való megfertőzésével, amelynek eredményeként a fertőzött sejtek interferont szintetizálnak, amelyet ezután izolálnak és interferonkészítményeket állítanak elő belőle;

b) génsebészettel - interferon termelésére képes rekombináns baktériumtörzsek termesztésével termelési körülmények között.

2 . 1 Páltal megszerzésehumán leukociták fertőzése

Ismertek eljárások humán leukocita interferon előállítására humán donorvér leukocitáiból, amelyeket vírusok és más induktorok indukálnak.

Az emberi vér leukocitái a természetes interferon-alfa fő termelői, amelynek termelési célú mennyiségét a donor nyersanyagok korlátozzák. E tekintetben a leukociták tenyésztésének módszereinek optimalizálása a céltermék hozamának növelése érdekében, valamint a természetes IFN előállítására szolgáló egységes hatékony módszer kidolgozása új gyógyszerformák létrehozásához nagyon fontosnak és relevánsnak tűnik a mai gyakorlati egészségügyben.

Ismeretes a humán leukocita interferon előállításának technológiája, amely a következő műveletsort tartalmazza: leukociták izolálása donorvérből, leukocita vagy eritrocita tömegből, szuszpendálása tápközegben (37±0,5) o C hőmérsékleten, hozzáadásával allantois vírust indukálunk a leukocitákhoz és inkubáljuk (30±0,5) o C-on 3 órán keresztül. Ezt követően az indukáló vírust elválasztjuk, táptalajt adunk a leukocita üledékhez és a szuszpenziót (37±) hőmérsékleten tartjuk. 0,5) o C-on 18-20 órán keresztül Ebben a szakaszban az interferon bioszintézise a leukocitákban megy végbe, és az ezzel a technológiával nyert tápközegben felhalmozódása 800-1000 NE vírusellenes hatású 1 ml gyógyszerre vonatkoztatva.

A bioszintézis szakaszban a leukociták interferontermelésének fokozása érdekében a humán leukocita interferon N 302-82 termelésére vonatkozó másik szabályozás szerint a leukocita szuszpenziót 2-10 órán keresztül 37,5 o C-on tartjuk 2-10 órán keresztül, tápközegben, amely tartalmaz 100-200 egység/ml humán leukocita interferont és 0,0015 egység/ml inzulint adunk hozzá 1-2 órán keresztül; Ezután az induktor vírust eltávolítjuk, a leukocita üledékhez táptalajt adunk, és a szuszpenziót 37,5 o C-on tartjuk 18-20 órán keresztül az interferon bioszintézis szakaszában, és az interferont tartalmazó felülúszót inaktiváljuk.

A priming szakasz bevezetése jelentősen növeli a leukociták interferon termelését, és az ezzel a módszerrel kapott interferon antivirális aktivitása 4000-5000 NE/ml. Megjegyzendő, hogy az összes fenti előállítási technológiában és a humán leukocita interferon előállítására szolgáló egyéb ismert módszerekben a leukocitákat a vérből izolálják, amelyet 4-6 o C-on tárolnak, és maga az izolálási folyamat is ugyanazon a hőmérsékleten megy végbe, ezt követi 37,5 o C-os tápközegbe való bejuttatásuk, majd a priming szakasz, az indukciós szakasz és az interferon bioszintézis végrehajtása.

Prototípusként az alábbi interferon-előállítási módszert választották, mivel ez műszakilag a legközelebb áll. A módszer célja a céltermék hozamának növelése. Ebből a célból interferon előállítására javasoltak egy eljárást, amely magában foglalja a leukociták izolálását, tápközegben való szuszpendálását és a szuszpenzió hőmérsékletének 20 o C-ról (36,6 ± 0,1) o C-ra, 4-6 °C-ra történő fokozatos emelésével történő előkészítést. óra, indukció allantois vírussal, Newcastle-betegség, interferon bioszintézis és az induktor vírus inaktiválása. A módszerek lényeges jellemzőinek összehasonlító elemzése azt mutatja, hogy a javasolt módszer megkülönböztető jellemzője a leukociták feltöltése a szuszpenzió hőmérsékletének lassú, 20 o C-ról (36,6 ± 0,1) o C-ra történő emelésével 4-6 órán keresztül. A leukociták feltöltésére javasolt hőmérsékleti rendszer biztosítja az INF intenzív bioszintézisének feltételeit. A módszert a következőképpen hajtjuk végre. A donor véréből, leukocita vagy eritrocita tömegéből izolált leukocitákat 5 liter tápközegben (199-es táptalaj) szuszpendáljuk, amely 0,0015 egység/ml inzulint és 1500-3000 NE/ml humán leukocita interferont, 5-10% emberi vérplazmát vagy 1,5-2%-ot tartalmaz. humán albumin és antibiotikumok. 1 ml táptalaj 10020 millió leukocitát tartalmaz. A fenti kiindulási komponenseket tartalmazó tápközeg kezdeti hőmérséklete 20 o C. Automatizált üzemmódban a program szerint a szuszpenzió hőmérsékletét 20 o C-ról (36,6 ± 0,1) o C-ra emeljük 4-6 órára. Ezután a szuszpenzió hőmérsékletét (36,9±0,1) o C-ra tesszük, és az induktor vírust 2 milliárd leukocita 2000-4000 GAE dózisban adjuk a szuszpenzióhoz, majd a szuszpenziót (36,9±0,1) o C-on inkubáljuk. 18-20 órán keresztül, folyamatos keverés mellett. A leukocitákat centrifugálással eltávolítjuk, és a 4,5 liter interferont tartalmazó felülúszót 10%-os sósavval pH 2,2-2,4-re savanyítjuk. A savanyított félkész interferon terméket 10 napig tároljuk az induktor vírus inaktiválására. Az így kapott interferon vírusellenes aktivitása 10-12 ezer NE/ml.

Így a humán leukocita interferon előállítására javasolt módszer biztosítja vírusellenes aktivitásának kétszeres vagy többszörös növekedését az előző módszerhez képest. A javasolt módszer alkalmazása a termelésben segít megtakarítani az anyagköltségeket, mert célja a leukociták hatékonyabb felhasználása, nem pedig számuk növelése.

Az interferonok előállítására szolgáló ezen módszerek fő hátránya a végtermék humán vírusokkal való szennyeződésének valószínűsége, például hepatitis B és C vírus, immunhiányos vírus stb.

2.2 Interferonok beszerzésegenetikailag módosított

interferon leukocita gén vírus

Jelenleg ígéretesebbnek bizonyult az interferon mikrobiológiai szintézissel történő előállításának módszere, amely lehetővé teszi a céltermék lényegesen nagyobb hozamú előállítását viszonylag olcsó kiindulási anyagokból. Az itt alkalmazott megközelítések lehetővé teszik a strukturális gén olyan változatainak létrehozását, amelyek optimálisak a bakteriális expresszióhoz, valamint olyan szabályozó elemeket, amelyek szabályozzák az expresszióját.

A Pichia pastoris, a Pseudomonas putida és az Escherichia coli különböző törzseit használják forrás mikroorganizmusokként.

A P. pastoris interferontermelőként való alkalmazásának hátránya az ilyen élesztőfajták rendkívül nehéz fermentációs körülményei, valamint az indukálószer, különösen a metanol koncentrációjának szigorú fenntartása a bioszintézis folyamata során.

A Ps használatának hátránya. putida a fermentációs folyamat összetettsége alacsony expressziós szinten (10 mg interferon 1 liter tápközegben). Termékenyebb az Escherichia coli törzsek használata.

Számos interferont expresszáló plazmid és ezek alapján létrehozott E. coli törzs ismert: az E. coli ATCC 31633 és 31644 törzsek a Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 vagy Z-pBR 322(Pstl)/ plazmidokkal. HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), E. coli pINF-AP2 törzs (SU 1312961), E. coli pINF-F-Pa törzs (AU 1312962), E. coli SG 20050 törzs p280/21FN plazmiddal, E. Coli SG 20050 törzs a pINF14 plazmiddal (SU 1703691), E. coli SG 20050 törzs pINF16 plazmiddal (RU 2054041) stb. Az ezen törzsek felhasználásán alapuló technológiák hátránya az instabilitásuk, valamint az elégtelenségük interferon expresszió.

A felhasznált törzsek jellemzői mellett az eljárás hatékonysága nagyban függ az interferon izolálására és tisztítására alkalmazott technológiától.

Ismert eljárás interferon előállítására, amely magában foglalja a Ps-sejtek tenyésztését. putida, biomassza megsemmisítése, kezelés polietiléniminnel, frakcionálás ammónium-szulfáttal, hidrofób kromatográfia fenil-szilochrom C-80-on, a lizátum pH-frakcionálása, koncentrálása és diaszűrése, ioncserélő kromatográfia DE-52 cellulózon, elúció pH gradiensben, a kapott eluens cserekromatográfiája SM-52 cellulózon, betöményítés szűrőkazettán való átvezetéssel és gélszűrés Sephadex G-100-on (SU 1640996). Ennek a módszernek a hátránya a bonyolult többlépcsős fermentáció mellett a végtermék előállításának többlépcsős folyamata.

Az interferon előállítására is ismert eljárás, amely magában foglalja az E. coli SG 20050/pIF16 törzs LB tápközegben, termosztált rázógépben, lombikokban történő tenyésztését, a biomassza centrifugálását, pufferoldattal történő mosását és ultrahangos kezelését a sejtek elpusztítására. A kapott lizátumot centrifugáljuk, 3 M pufferes karbamidoldattal mossuk, guanidin-klorid pufferoldatában feloldjuk, ultrahanggal kezeljük, centrifugáljuk, oxidatív szulfitolízissel, 8 M karbamiddal szembeni dialízissel, renaturálással és végső kétlépcsős kromatográfiával CM-en. 52 cellulóz és Sephadex G-50 (RU 2054041).

Ennek a módszernek a hátránya az izolálási és tisztítási folyamat fő szakaszainak viszonylag alacsony termelékenysége. Ez különösen vonatkozik a termék ultrahangos kezelésére, a dialízisre és az oxidatív szulfitolízisre, amelyek az interferon kitermelésének instabilitásához vezetnek, valamint arra, hogy az interferon ipari előállítására ezt a módszert nem lehet alkalmazni.

Legközelebbi analógként (prototípusként) a humán leukocita interferon előállítására szolgáló eljárás jelezhető, amely abból áll, hogy egy rekombináns E. coli törzset tenyésztenek, a kapott biomasszát -70°C-ot meg nem haladó hőmérsékleten lefagyasztják, felolvasztják, elpusztítják a mikroorganizmus sejteket. lizozimmal, DNS és RNS eltávolítása a DNS-lizátumba való bejuttatással és az interferon izolált oldhatatlan formájának tisztítása detergens pufferoldattal történő mosással, az interferon csapadék feloldása guanidin-hidroklorid oldatban, renaturálás és egylépéses ionos tisztítás cserekromatográfia. A három promotert: Plac, Pt7 és Ptrp, valamint a bevitt nukleotid szubsztitúciókkal rendelkező alfa-interferon gént tartalmazó rekombináns pSS5 plazmid felhasználásával kapott E. coli SS5 törzset használjuk termelőként.

Az interferonnak az ezt a plazmidot tartalmazó E. coli SS5 törzs általi expresszióját három promoter szabályozza: Plac, Pt7 és Ptrp. Az interferon expressziója körülbelül 800 mg 1 liter sejtszuszpenzióban.

Ennek a módszernek a hátránya a sejtek, a mikroorganizmus DNS-ének és RNS-ének enzimatikus megsemmisítésének, valamint az interferon egylépéses kromatográfiás tisztításának alacsony technológiai hatékonysága. Ez instabilitást okoz az interferon felszabadulásának folyamatában, minőségének romlásához vezet, és korlátozza a fenti séma alkalmazásának lehetőségét az interferon ipari előállítására.

Ennek a plazmidnak és az arra épülő törzsnek az a hátránya, hogy a plazmidban az E. coli BL21 (DE3) törzs T7 fágjának erős szabályozatlan promoterét alkalmazzák, amelyben a T7 RNS polimeráz gén a BL21 (DE3) törzs promótere alatt helyezkedik el. a lac operon és amely mindig „folyik”. Következésképpen a sejtben folyamatosan megy végbe az interferon szintézise, ami a plazmid disszociációjához és a törzs sejtjeinek életképességének csökkenéséhez, ennek következtében az interferon hozamának csökkenéséhez vezet.

Példa a rekombináns interferon előállítására:

A p VG-3 rekombináns plazmidot tartalmazó Pseudomonas putida 84 sejtek 600 g biomasszája tenyésztés után 130 mg alfa-2 interferont tartalmazott. A sejteket egy 5,0 literes ballisztikus dezintegrátorba töltöttük mechanikus keverővel és 3,0 liter lízispufferrel, amely 1,2% nátrium-kloridot, 1,2% trisz-(hidroxi-metil)-amino-metánt, 10% szacharózt, 0,15% etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmazott. 0,02% fenil-metil-szulfonil-fluorid és 0,01% ditiotreitol, pH 7,7. A biomasszát 30 percig homogén szuszpenzió eléréséig kevertük, majd ballisztikus dezintegrátorban a kezelési utasításnak megfelelően keringető üzemmódban szétestük. A szétesési idő 1,5 óra volt. A szétesési folyamat akkor fejeződött be, amikor a készítményt a mikroszkóp több látómezőjében mikroszkóppal vizsgálva gyakorlatilag nem volt megfigyelhető teljes mikroorganizmus sejt. A lizált biomassza szuszpenzió térfogata 3,5 liter volt.

Az ebben a szakaszban kapott lizátum ezután a nukleinsav-kicsapási szakaszba került. Ehhez a lizátumot tartalmazó edénybe 180 ml 5%-os polietilén-imin oldatot adtunk keverés közben 1-1,2 l/h sebességgel. A szuszpenziót 1 órán át kevertük, majd centrifugáltuk a nukleinsav üledék elválasztására 1 órán át (9500±500) fordulat/perc mellett (5±2) C hőmérsékleten. Centrifugálás után a felülúszót elválasztottuk, amelynek térfogata 3,0 liter volt.

Keverővel lassú keverés közben a felülúszóba kis részletekben 182 g száraz ammónium-szulfátot öntöttünk (minden következő adagot az előző teljes feloldódása után adtunk hozzá). Az ammónium-szulfát hozzáadása után a keverést addig folytattuk, amíg a só teljesen fel nem oldódott, és a fehérje üledék szuszpenzióját 16 órán át (5 ± 2) C hőmérsékleten tartottuk, majd 1 órán át (13500 ± 2) centrifugáltuk. 500) ford./perc (5 ± 2) hőmérsékleten WITH.

A kapott csapadékot desztillált vízben oldjuk, így a teljes térfogatot 4 literre állítjuk be. A kísérő fehérjék kicsapása céljából a kapott alfa-2 interferont tartalmazó oldatot savas frakcionálással végeztük. Ehhez 5,0 ml 50%-os ecetsavat adtunk az oldathoz pH 4,75-ig. A kapott elegyet hűtőszekrénybe helyezzük és (5±2)C hőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk, majd a fehérjeszuszpenziót (13500±500 fordulat/perc) centrifugáljuk 30 percig (5±2)C-on.

4 liter felülúszóhoz 50,0 ml 1 M Tris-oldatot adtunk pH-értékre (6,9 ± 0,1). Az összfehérje Lowry-módszerrel meghatározott koncentrációja 9,0 mg/ml, az alfa-2 interferon (6,80,5) biológiai aktivitása 106 IU/ml. Fajlagos aktivitás 8,5105 NE/mg. Az alfa-2 interferon teljes tartalma ebben a szakaszban 2,91010 NE.

A Soloz KG szorbenst 0,6 liter mennyiségben vizes szuszpenzió formájában kromatográfiás oszlopba helyeztük. Ezután perisztaltikus pumpával 2,0 l 0,2 M nátrium-hidroxid-oldat, 6,0 l desztillált víz és 4,5 l 0,05 M trisz-acetát pufferoldat pH-n (7,1±0,1), amelyet pH-mérővel mértünk az oszlop kimenete.

Az alfa-2 interferont tartalmazó fehérjeoldatot szobahőmérsékleten desztillált vízzel (6,0+2,0) mS/cm vezetőképességre hígítottuk. Az oldat térfogata 19,2 liter volt.

Az oldatot 1,5 l/óra sebességgel vittük fel az oszlopra, majd a szorbenst 2,0 l 0,05 M trisz-acetát pufferrel mostuk (pH 7,0). Az eluálást 1,2 l 0,05 M Tris-oldattal (pH-val) végeztük (10,2 ± 0,1).

Az összfehérje Lowry-módszerrel meghatározott koncentrációja (2,2 ± 0,2) mg/ml, az alfa-2 interferon biológiai aktivitása (2,1 ± 0,5) 107 NE/ml, a gyógyszer fajlagos aktivitása (9,7 ± 0,5). )106 NE/mg. Az alfa-2 interferon teljes tartalma ebben a szakaszban (1,5±0,5) 1010 NE.

Vizes szuszpenzió formájában 0,15 l Spherocell qae szorbenst töltöttünk az oszlopba, és 0,15 l/óra sebességgel egymás után 0,5 liter 2 M nátrium-klorid oldattal, 1,5 liter desztillált vízzel és 1,0 literrel mostuk. 1 0,05 M trisz-acetát pufferoldat, pH 8,0, pH-mérővel figyelve a pufferoldat pH-ját az oszlop kimeneténél.

Alfa-2 interferont tartalmazó 0,7 literes fehérjeoldatot vittünk fel 0,15 literes Spherocell-QAE szorbens oszlopra 0,2 l/óra sebességgel. Az oszlopot 0,1 liter trisz-acetát 0,05 M pufferoldattal (pH 8,0) mostuk, majd a szennyező fehérjéket 1,0 liter azonos pufferoldattal mostuk 0,05 M NaCl hozzáadásával. Az interferont 0,8 liter 0,1 M nátrium-acetát pufferoldattal eluáltuk 5,0 pH-n. A kollektorral gyűjtött frakciók alfa-2 interferon tartalmát enzim immunoassay módszerrel határoztuk meg. A fehérje koncentrációja (0,35±0,05) mg/ml, az alfa-2 interferon biológiai aktivitása (1,7±0,2)107 IU/ml volt. A gyógyszer fajlagos aktivitása 5,5107 NE/mg fehérje. Az eluátum 1,20 x 1010 ME-t tartalmazott. A biológiai aktivitás hozama ebben a szakaszban 82,5%.

A kapott oldat pH-ját 50%-os ecetsavval 5,0±0,1 értékre állítjuk, és 0,05 M nátrium-acetát pufferoldattal hígítjuk. A fajlagos elektromos vezetőképesség (0,29±0,02) mS/cm volt (5±2)C hőmérsékleten. Az így elkészített fehérjeoldatot Spherocell LP-M szorbenssel 0,1 l/óra sebességgel oszlopra vittük, 0,3 liter fenti pufferoldattal mostuk, majd az interferont lineáris nátrium-klorid koncentráció gradienssel eluáltuk. Ultragrad gradiens keverővel készült. Az eluátumot frakciógyűjtővel frakcionáltuk, és megmértük az összfehérje és az alfa-2 interferon koncentrációját. Fehérjekoncentráció egyesített frakciókban (0,45±0,02) mg/ml. Az oldat térfogata 0,1 l. Az alfa-2 interferon össztartalma (8,6±0,2)109 NE. Fajlagos aktivitás - e (7,5±0,2)107 NE/mg. A hozam ebben a szakaszban 73%.

A kapott 0,1 literes 3. oldatot ultraszűrő cellával Amicon YM-3 membránt használva (5,0±0,2) ml-re betöményítettük. Az így elkészített mintát Sephadex G-100 szorbenssel ellátott, foszfáttal pufferolt sóoldattal ekvilibrált oszlopra vittük fel 0,025 l/h sebességgel. A frakciók térfogata 10,0 ml. A kromatográfiás eljárással kapott frakciók alfa-2 interferon tartalmát enzim immunoassay módszerrel és az alfa-2 interferon fő csúcsát tartalmazó frakciók kombinálásával vizsgáltuk. A kapott oldat térfogata 30,2 ml. Az összfehérje Lowry-módszerrel meghatározott koncentrációja (0,90 ± 0,02) mg/ml. Az oldat teljes alfa-2 interferon tartalma 5,5109 ME. A kapott alfa-2 interferon készítmény fajlagos aktivitása 2,3108 NE/mg. Az alfa-2 interferon kitermelése ebben a szakaszban 90,2%. A kapott terméket sterilizáltuk és csomagoltuk. A gyógyszer összhozama 35,8%, ebből a tisztítási szakaszban 51%.

Nagy mennyiségű IFN előállításához egy bizonyos típusú vírussal fertőzött csirkeembriósejtek vagy tenyésztett emberi vérleukociták hatnapos egyrétegű tenyészeteit használják. Más szavakkal, az IFN megszerzéséhez egy specifikus vírus-sejt rendszer jön létre.

Az IFN bioszintéziséért felelős gént emberi sejtből izolálták. Az exogén humán IFN-t rekombináns DNS-technológiával állítják elő. Az IFN-cDNS izolálási eljárás a következő:

1) Az mRNS-t humán leukocitákból izoláljuk, méret szerint frakcionáljuk, reverz átírjuk, és egy módosított plazmid helyére inszertáljuk.

2) A kapott terméket E. coli transzformálására használjuk; a kapott klónokat csoportokra osztjuk, amelyeket azonosítunk.

3) A klónok mindegyik csoportját IFN-mRNS-sel hibridizáljuk.

4) A kapott cDNS-t és chRNS-t tartalmazó hibridekből mRNS-t izolálunk és transzlálunk a fehérjeszintézis rendszerben.

5) Határozza meg a transzláció eredményeként kapott egyes keverékek interferon vírusellenes aktivitását. Azok a csoportok, amelyek interferon aktivitást mutattak, egy klónt tartalmaznak IFN-mRNS-sel hibridizált cDNS-sel; a teljes hosszúságú humán IFN cDNS-t tartalmazó klónt újra azonosítják.

3 . Az interferonok hatásmechanizmusai

Az interferonok bizonyos aktivitást mutatnak limfokinként és immunmodulátorként. Az I-es típusú IFN-ek, amelyek elsősorban a sejtben a vírusreplikáció gátlójaként működnek, úgy fejtik ki hatásukat, hogy a gazdasejtek riboszómáiban stimulálják a sejtenzimek termelését, amelyek gátolják a vírusok termelődését, megzavarják a vírus mRNS transzlációját és a vírusok szintézisét. vírusfehérjék.

Az interferonokat a legtöbb állatfaj termeli, de aktivitásuk megnyilvánulása fajspecifikus, pl. csak abban az állatfajban hatnak, amelyben előállították őket.

Interferonokhárom enzim indukcióját okozza:

Protein-kináz, amely megzavarja a peptidlánc felépítésének kezdeti szakaszát;

Oligoizoadenilát szintetáz, amely aktiválja az RNázt, amely elpusztítja a vírus RNS-t;

Foszfodiészteráz, amely elpusztítja a tRNS végső nukleotidjait, ami a peptid megnyúlásának megzavarásához vezet.

Figyelembe véve az interferon vírusellenes és immunmoduláló hatását, az NPO "Biomed" IFNan1-et és probiotikumokat tartalmazó kúpokat javasolt és sikeresen tesztelt vírusos és bakteriális etiológiájú dysbiosis, candidiasis kezelésére; a nőgyógyászati gyakorlatban endometritis, colpitis, vaginitis és nőgyógyászati herpesz kezelésére.

4. Az interferon terápiás alkalmazásaszemély

Az interferonok (INF-ek) univerzálisan széles vírusellenes hatásspektrummal rendelkeznek, mivel nem hatnak a virionokra vagy azok NK-jaira, hanem vírusellenes állapotot indukálnak a sejtben, serkentve a vírus mRNS transzkripcióját blokkoló fehérjék komplex kialakulását. Az INF-ek nem hatolnak be a sejtekbe, hanem kölcsönhatásba lépnek a membránreceptorokkal, indukálva a cAMP képződését, amely jelet továbbít a megfelelő DNS-operonhoz. Ezenkívül az INF-ek aktiválják a közvetlen vírusellenes hatású termékeket kódoló géneket - a protein kinázokat, amelyek megzavarják a fehérje molekula összeállítását, és adenilát szintetázokat, amelyek terméke aktiválja a vírus mRNS-eit elpusztító endonukleázt. A gamma-INF aktiválja a citotoxikus limfocitákat, természetes ölősejteket, monocitákat, makrofágokat, granulocitákat, amelyek hozzájárulnak a fertőzött sejtek pusztulásához.

Az interferon gyógyszereknek két generációja létezik. Az első generációra jellemző a természetes eredetű, amelyben a donorok véréből nyerik. Száraz humán leukocita interferont nyernek belőle, amelyet inhalálásra és az orrjáratokba való becsepegtetésre használnak. Interferont is termelnek kúpokban, tisztított koncentrált interferont száraz formában és Leukinferont.

Az interferon alapú gyógyszerek előállításának ez a módszere meglehetősen drága és hozzáférhetetlen, ezért a 20. század végén géntechnológiával létrehozták a második generációs interferon gyógyszereket.

Így lehetőség nyílt a Viferon, Interal és mások rekombináns humán interferon-b-t tartalmazó gyógyszerek kifejlesztésére.

Egyedülálló tulajdonságaik miatt az interferon készítményeket használják kezelés valamint az összes légúti betegség, a legtöbb rák megelőzése számos vírusos betegség és influenza kezelésére. Az interferon készítményeket széles körben alkalmazzák a kezelésben hepatitisz A hepatitis B és C: az interferon korlátozza a vírus fejlődését, megakadályozza annak előfordulását cirrózisés kizárja a halált.

Egyes interferon gyógyszereknek mellékhatásai vannak, például bőrkiütések, allergiákés a vérképző rendszer betegségei.

Az interferon hosszan tartó alkalmazása esetén a szervezet interferon elleni antitesteket termel, ami miatt nem tud harcolni. vírusok. E jelenségek oka az albumin jelenléte az interferon alapú készítményekben.

Az albumint a vérből nyerik, így fennáll a fertőzés veszélye (bár minimális). májgyulladásés más vér útján terjedő betegségek.

Asztal 1

Interferon aktivitási spektruma

A gyógyszer neve	INF altípus	Megszerzésének módja	farmakológiai hatás	Használati javallatok
Interferon		Bioszintézis donorvér tenyésztett leukocitáiban vírusok hatására	Vírusellenes, immunmoduláló, antiproliferatív	Vírusos betegségek, leukémia, rosszindulatú melanoma, veserák, karcinoid szindróma
Interlock		Bioszintézis donorvér tenyésztett leukocitáiban paramikovírusok hatására	Elnyomja számos vírus aktivitását	Vírusos szembetegségek, hepatitis
Interferon alfa-2		Rekombináns	Vírusellenes, immunmoduláló, a tumorsejtek széles körének proliferációját gátolja	Akut és visszatérő vírusos szemfertőzés epiteliális formája; onkológiai betegségek
Interferon alfa-2a		Rekombináns. 165 aminosavat tartalmazó fehérje	Vírusellenes, daganatellenes aktivitás	Leukémiás retikuloendotheliózis, Kaposi-szarkóma, veserák, hólyagrák, melanoma, herpes zoster
Reaferon		Pseudomonas baktériumtörzs által termelt rekombináns INF, amelynek genetikai apparátusa tartalmazza a humán leukocita INF b2 génjét. Azonos a humán leukocita INF b2-vel.		Vírusos, daganatos betegségek
Interferon alfa - n1		Nagy tisztaságú humán INF	Vírusellenes	Krónikus aktív fertőző hepatitis B
Inreferon béta		Humán fibroblasztok szupertermelése stimulátorral metabolikus inhibitorok jelenlétében	Vírusellenes, immunmoduláló, daganatellenes hatás	Krónikus vírusfertőzések a szemészetben, nőgyógyászatban és urológiában, bőrgyógyászatban, hepatológiában, onkológiában
gamma-interferon		Rekombináns	Vírusellenes, immunmoduláló, daganatellenes hatás	Krónikus granulomatosus betegségek

INF-bÉsINF-V jobban hasonlítanak egymásra. Génjeik a 9-es kromoszómán találhatók. Mindkettő termeléséhez a vírusok indukáló jelek. Kifejezett vírus- és daganatellenes hatásuk van, és sokkal kisebb mértékben mutatnak immunmoduláló tulajdonságokat.

INF-G kifejezett immunmoduláló hatással rendelkezik, az interleukin-2-vel (IL-2) és a tumornekrózis faktorral (TNF vagy TNF) együtt az egyik fő gyulladáskeltő citokin, és a sejtes immunitás indukálója. Vírus- és daganatellenes tulajdonságai kevésbé hangsúlyosak, mint az INF-b-é és az INF-c-é. Az INF-g gén a 12. kromoszómán található, a fő termelő sejtek a T-limfociták, a természetes gyilkos sejtek (NK sejtek). A termelést indukáló szignál bármilyen antigén vagy más citokin lehet.

Az interferonok vírusellenes hatása a vírus RNS szintézisének elnyomásából, a vírusburok fehérjék szintézisének elnyomásából áll. Ennek a hatásnak a mechanizmusa az intracelluláris enzimek, például a protein-kináz vagy az adenilát-szintetáz aktiválása. A protein-kináz elpusztítja a fehérjeszintézis iniciációs faktorát a hírvivő RNS-ből, ami elnyomja a fehérjeszintézist. Adenilát szintetáz - olyan anyagok szintézisét okozza, amelyek elpusztítják a vírus RNS-t.

Az interferonok immunmoduláló hatása - az immunválaszban részt vevő sejtek kölcsönhatásának szabályozására való képesség. Az interferonok úgy látják el ezt a funkciót, hogy szabályozzák a sejtek citokinekkel szembeni érzékenységét és az I. típusú fő hisztokompatibilitási komplexum (MHC1) molekuláinak sejtmembránokon történő expresszióját. Az MHC1 fokozott expressziója a vírussal fertőzött sejteken jelentősen megnöveli annak valószínűségét, hogy az immunkompetens sejtek felismerik és kiürülnek a szervezetből. Az INF-g a legkifejezettebb immunmoduláló tulajdonságokkal rendelkezik, mivel az I-es típusú T-limfocita helper terméke, más gyulladást elősegítő citokinekkel együtt aktiválja a makrofágokat, a T-citotoxikus limfocitákat, a természetes gyilkos sejteket (NK-sejteket), elnyomja az aktivitást. A B-limfociták, aktiválja a prosztaglandin és a kortikoszteroid rendszert. Mindezek a tényezők fokozzák a fagocitikus és citotoxikus reakciókat a gyulladásos fókusz területén, és hozzájárulnak a fertőző ágens hatékony eltávolításához.

Az interferonok daganatellenes hatása összefügg azzal a képességükkel, hogy lassítják vagy elnyomják a sejttenyészetek növekedését, és aktiválják az immunrendszer daganatellenes mechanizmusait. Az interferonok ezen tulajdonságát már régen felfedezték, és széles körben használják terápiás célokra. Az interferonok összes daganatellenes hatása közvetlen és közvetett. Közvetlenül kapcsolódik a tumorsejtekre, azok növekedésére és differenciálódására gyakorolt közvetlen hatás képességére. A közvetettek az immunkompetens sejtek azon képességének fokozásával járnak, hogy észleljék és elpusztítsák a test atipikus sejtjeit.

Az interferon közvetlen daganatellenes hatásai:

· Az RNS szintézis elnyomása.

· A fehérjeszintézis elnyomása.

· A differenciálatlan sejtek érésének serkentése.

· A daganatsejtek és a hormonreceptorok membránantigénjeinek fokozott expressziója.

· Az érképződési folyamatok megzavarása.

· Onkovírusok semlegesítése.

· A tumornövekedési faktorok hatásának elnyomása.

Az interferon közvetett daganatellenes hatásai:

· Az immunrendszer sejtjeinek (makrofágok, NK-sejtek, T-citotoxikus limfociták) aktivitásának serkentése.

· Az I. osztályú hisztokompatibilitási molekulák fokozott expressziója a sejteken.

Az interferonok antiproliferatív hatása az interferonok azon képességében rejlik, hogy kifejtik a citosztatikumok tulajdonságait - elnyomják a sejtnövekedést az RNS és a fehérjék szintézisének elnyomásával, valamint a sejtproliferációt serkentő növekedési faktorok gátlásával.

Induktorok INF a természetes és szintetikus vegyületek nagyon változatos csoportja, amelyek hatására a szervezet saját (endogén) INF-ét képezheti. Az INF-hez hasonlóan univerzálisan széles spektrumú vírusellenes hatásuk, valamint immunmoduláló hatásuk van, ami meghatározza hatékonyságukat számos nem vírusos betegségben.

2. táblázat

Az INF-induktorok antivirális aktivitásának spektruma

Drog	Használati javallatok
Akridanonok (cikloferon, neovir)	Influenza, agyvelőgyulladás, veszettség, HIV fertőzés, AIDS
Fluorenonok (amixin)	Influenza, ARVI, herpesz, hepatitis A, encephalitis, veszettség, sclerosis multiplex
Poli (I): poli(U) - ampligén	HIV fertőzés, AIDS
Poli(G): poli(C)-poliguacil	Influenza, hepatitis B, agyvelőgyulladás, veszettség
Kétszálú RNS (larifan, ridostin)	Influenza, ARVI, herpesz, encephalitis, veszettség
Poli(A): poli(U)-poludán	Herpetikus szem elváltozások
Polifenolok (megazin, kagocel, savrac, ratosin, gozalidon)	Influenza. ARVI, herpesz, encephalitis, veszettség, hepatitis, enterovírus fertőzések

Következtetés

Az interferon a glikoprotein fehérjék családja, amelyet az immunrendszer sejtjei és a kötőszövet szintetizálnak. Attól függően, hogy mely sejtek szintetizálják az interferont, három típus létezik: b, c és g interferon.

Az interferont kétféleképpen lehet előállítani: a) humán leukociták vagy limfociták biztonságos vírussal való megfertőzésével; b) génmanipulált.

Hazánkban a rekombináns interferon a "Reaferon" hivatalos nevet kapta. Ennek a gyógyszernek az előállítása sok szempontból hatékonyabb és olcsóbb, mint a leukociták.

Az interferon hatása annál hatékonyabb, minél hamarabb kezd szintetizálódni vagy kívülről bejutni a szervezetbe. Ezért profilaktikus célokra használják számos vírusfertőzés, például influenza esetén, valamint terápiás célokra krónikus vírusfertőzések esetén, mint például parenterális hepatitis (B, C, D), herpesz, sclerosis multiplex stb. rosszindulatú daganatok és immunhiányos betegségek kezelését eredményezi.

Az interferonok fajspecifikusak, azaz az emberi interferon kevésbé hatékony az állatok számára és fordítva. Ez a fajspecifikusság azonban relatív.

Bibliográfia

1. Ideiglenes gyógyszerkönyvi cikk 42U-23/60-439-97. Interferon humán rekombináns alfa-kettő.

2. Gavrikov A.V. Rekombináns humán interferon anyagok biotechnológiai termelésének optimalizálása - M., 2003,

3. Galynkin V.A., Zaikina N.A., Kocherovets V.I., Potekhina T.S. A gyógyszerészeti mikrobiológia alapjai. Szentpétervár: Prospekt Nauki, 2008. -304 p.

4. Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás. M.: Mir, 2002. -589 p.

5. A Szovjetunió Állami Gyógyszerkönyve. XI kiad., 1. szám-- 175. o.

6. Állami gyógyszernyilvántartás / Szerk. A.V. Katlinsky és mások - M., 2002.

7. Elinov N.P. A biotechnológia alapjai. Szentpétervár: Nauka.-1995.-600 p.

8. Elinov N.P., Zaikina I.A., Sokolova I.P. Útmutató a mikrobiológiai laboratóriumi órákhoz - M.: Orvostudomány, 1998.

9. Karabelsky A.V. Rekombináns interferonok.- M.: Book on Demand, 2010.- 132 p.

10. Mashkina O.S., Butorina A.K. Géntechnológia és biológiai biztonság. Voronyezs: VSU, 2005. 71 p.

11. Naroditsky B.S. Interferonok molekuláris biotechnológiája. // "Interferon - 50 éves" tudományos és gyakorlati konferencia gyűjteménye. - M., 2007, 17-23

12. A gyógyszerészeti biotechnológia alapjai: Tankönyv / T.V. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L, K. Mikhaleva, L.S. Belova - Rostov n/a: Főnix; Tomszk: NTL Kiadó, 2006.- 256 p.

13. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. és mások A rekombináns alfa-két-interferon hatékonysága vírusos hepatitis B-ben // Medical Affairs.- Kijev, 1990.- No. 9.-- P. 105-108.

14. http://interferon.su/php/content.php?id=577

15. http://ru-patent.info/20/95-99/2098124.html

16. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

17. www.pharmvestnik.ru

Közzétéve az Allbest.ru oldalon

...

Hasonló dokumentumok

Interferonok osztályai: természetesen előforduló és mesterségesen szintetizált. Módszerek humán leukocita interferon előállítására donorvér leukocitáiból és mikrobiológiai szintézis. Interferonok hatásmechanizmusai, terápiás felhasználása.

absztrakt, hozzáadva: 2010.01.27

Az interferonok felfedezésének története, jellemzőik, osztályozásuk, hatásmechanizmusuk és a termelés sajátosságai; használatuk klinikai jellemzői. Technológiai séma leukocita és rekombináns interferon előállítására preparatív mennyiségben.

tanfolyami munka, hozzáadva 2012.12.23

Veleszületett vírusellenes immunitás. Az interferonok típusai és az interferonok vírusellenes hatásának mechanizmusai. Az antitestek és komplementerek azon képessége, hogy korlátozzák a vírus terjedését és megakadályozzák az újbóli fertőzést. Az immunológiai kontroll megkerülése vírusok által.

absztrakt, hozzáadva: 2009.09.27

Az interferon tulajdonságainak tanulmányozása. Egy antivirális, antiproliferatív és immunmoduláló hatású fehérje főbb hatásainak tanulmányozása. Az interferon alkalmazása rosszindulatú daganatok és immunhiányos betegségek kezelésében.

bemutató, hozzáadva 2015.11.17

A vérátömlesztés folyamata és célja, biztonsági értékelés az orvostudomány jelenlegi fejlődési szakaszában. A donor vér kóros hatása, okai és a beteg rehabilitációjának módszerei. A vér reinfúziója és autohemotranszfúzió alkalmazása és előnyei.

absztrakt, hozzáadva: 2009.07.13

Az immunmoduláció típusai. Az immunotróp gyógyszerek fogalma. Interferonok és induktoraik. A bakteriális vakcinák immunmoduláló hatásának mechanizmusa. Az a-IF gyógyszerek felírásának indikációi. Az interferon gyógyszerekkel történő kezelés ellenjavallatai.

bemutató, hozzáadva: 2014.04.03

Vérsejtek elemzése: vörösvérsejtek, leukociták, vérlemezkék. A hemoglobin és funkciói a szervezetben. Granulociták, monociták és limfociták, mint a leukociták összetevői. Patológiák a vér összetételében, hatásuk az emberi test funkcióira.

absztrakt, hozzáadva: 2008.10.06

A gyógyiszap terápiás és profilaktikus hatásmechanizmusa, osztályozása és felhasználása a szervezetre gyakorolt termikus hatások céljára. A hőterápia javallatai és ellenjavallatai. Technikák általános és helyi iszapfelhordáshoz és fürdőkhöz.

absztrakt, hozzáadva: 2014.12.21

A gerincesek szív- és érrendszerének folyékony szövetének funkciói. Összetétele és formált elemei. A vörösvértestek képződése, a patológiák típusai. A leukociták fő működési területe. A limfociták az immunrendszer fő sejtjei. Az életkorral összefüggő változások a vérben.

bemutató, hozzáadva 2015.10.14

Egy személy életkori periodizálása. Hematopoiesis az embriogenezisben. Az eritrociták, leukociták, limfociták és vérlemezkék koncentrációjának változása az életkorral. A vér fajsúlya és viszkozitása újszülötteknél és időseknél. A leukociták osztályozása és fejlődésének időzítése.

Az interferonok 15 000-21 000 dalton molekulatömegű fehérjemolekulák, amelyeket a sejtek termelnek és választanak ki vírusfertőzésre vagy más kórokozókra válaszul.

Az interferonok (IFN-ek) az autogén glikoproteinek egy csoportja, amelyek hatásmechanizmusa egyidejű vírusellenes hatással jár - a sejtgének aktiválásával, amelynek eredményeként olyan fehérjék szintetizálódnak, amelyek gátolják a vírus DNS (RNS) szintézisét és immunmoduláló hatás - az a képesség, hogy fokozza az antigének expresszióját a sejtmembránokon és fokozza a citotoxikus T-sejtek és a természetes gyilkos sejtek aktivitását.

Az IFN-ek két típusra oszthatók. Az első típus, amely a vírusreplikáció inhibitoraként működik, és túlnyomórészt vírusellenes hatással rendelkezik, az IFN-α 22 különböző altípusát és az IFN-β egy altípusát tartalmazza. A második típus, amely immunmoduláló aktivitást mutat, az IFN-y-t foglalja magában.

Az IFN-nek három immunológiailag különböző osztálya van: IFN-α, IFN-β, IFN-γ.

A természetben előforduló IFN-ek közé tartozik a limfoblasztoid és leukocita IFN (IFN-α), amelyet megfelelően stimulált humán monociták és B-limfociták szintetizálnak, amelyeket azután extrahálnak és tisztítanak; humán fibroblaszt tenyészetből nyert fibroblaszt IFN (IFN-β) és T-limfocita IFN (IFN-γ).

A mesterségesen szintetizált IFN-ek közé tartozik a rekombináns IFN-α, amely az IFN-α egy nagy tisztaságú egyetlen altípusa, amelyet rekombináns molekuláris technológiával állítanak elő.

Ismertek eljárások humán leukocita interferon előállítására humán donorvér leukocitáiból, amelyeket vírusok és más induktorok indukálnak.

A Pichia pastoris, a Pseudomonas putida és az Escherichia coli különböző törzseit használják forrás mikroorganizmusokként.

Számos interferont expresszáló plazmid és ezek alapján létrehozott E. coli törzs ismert: az E. coli ATCC 31633 és 31644 törzsek a Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 vagy Z-pBR 322(Pstl)/ plazmidokkal. HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli pINF-AP2 törzs (SU 1312961), E. coli pINF-F-Pa törzs (AU 1312962), E. coli SG 20050 törzs p280/21FN plazmiddal (VKVravchenko és mások, Bioorganic chemistry, 1987, 13. sz., 1186-1193. oldal, E. coli SG 20050 törzs pINF14 plazmiddal (SU 1703691), E. coli SG 20050 törzs pINF140150150104050 plazmiddal. és stb. Az ezen törzsek felhasználásán alapuló technológiák hátránya az instabilitásuk, valamint az interferon expresszió elégtelen szintje.

A felhasznált törzsek jellemzői mellett az eljárás hatékonysága nagyban függ az interferon izolálására és tisztítására alkalmazott technológiától.

Az IFN bioszintéziséért felelős gént emberi sejtből izolálták. Az exogén humán IFN-t rekombináns DNS-technológiával állítják elő. Az IFN-cDNS izolálási eljárás a következő:

1) Az mRNS-t humán leukocitákból izoláljuk, méret szerint frakcionáljuk, reverz átírjuk, és egy módosított plazmid helyére inszertáljuk.

2) A kapott terméket E. coli transzformálására használjuk; a kapott klónokat csoportokra osztjuk, amelyeket azonosítunk.

3) A klónok mindegyik csoportját IFN-mRNS-sel hibridizáljuk.

4) A kapott cDNS-t és chRNS-t tartalmazó hibridekből mRNS-t izolálunk és transzlálunk a fehérjeszintézis rendszerben.

5) Határozza meg a transzláció eredményeként kapott egyes keverékek interferon vírusellenes aktivitását. Azok a csoportok, amelyek interferon aktivitást mutattak, egy klónt tartalmaznak IFN-mRNS-sel hibridizált cDNS-sel; egy teljes hosszúságú humán IFN cDNS-t tartalmazó klónt újra azonosítják.

2. Az interferonok hatásmechanizmusai

Az IFN-ek bizonyos aktivitást mutatnak limfokinként és immunmodulátorként. Az I-es típusú IFN-ek, amelyek elsősorban a sejtben a vírusreplikáció gátlójaként működnek, úgy fejtik ki hatásukat, hogy a gazdasejtek riboszómáiban stimulálják a sejtenzimek termelését, amelyek gátolják a vírusok termelődését, megzavarják a vírus mRNS transzlációját és a vírusok szintézisét. vírusfehérjék.

Az IFN-eket a legtöbb állatfaj termeli, de aktivitásuk megnyilvánulása fajspecifikus, pl. csak abban az állatfajban hatnak, amelyben előállították őket.

Az IFN-ek három enzimet indukálnak:

protein kináz, amely megzavarja a peptidlánc felépítésének kezdeti szakaszát;

oligoizoadenilát szintetáz, amely aktiválja az RNázt, amely elpusztítja a vírus RNS-t;

foszfodiészteráz, amely elpusztítja a tRNS végső nukleotidjait, ami a peptid megnyúlásának megszakításához vezet.

Figyelembe véve az IFN vírusellenes és immunmoduláló hatását, az NPO Biomed IFNan1-et és probiotikumokat tartalmazó kúpokat javasolt és sikeresen tesztelt vírusos és bakteriális etiológiájú dysbacteriosis, candidiasis kezelésére; a nőgyógyászati gyakorlatban endometritis, colpitis, vaginitis és nőgyógyászati herpesz kezelésére.

3. A humán INF terápiás alkalmazása

Így lehetőség nyílt rekombináns humán interferon alfa-t tartalmazó Viferon, Interal és más gyógyszerek kifejlesztésére

Egyedülálló tulajdonságaik miatt az interferonkészítményeket minden légúti betegség, a legtöbb daganatos megbetegedés kezelésére és megelőzésére, valamint számos vírusos betegség és influenza kezelésére használják. Az interferon készítményeket széles körben alkalmazzák a hepatitis B és C kezelésében: az interferon korlátozza a vírus kifejlődését, megakadályozza a cirrhosis előfordulását és kiküszöböli a halált.

Egyes interferon gyógyszereknek mellékhatásai vannak, például bőrkiütések, allergiák és a vérképző rendszer betegségei.

Az interferon hosszú távú alkalmazása esetén a szervezet interferon elleni antitesteket termel, ami miatt nem képes a vírusok elleni küzdelemre. E jelenségek oka az albumin jelenléte az interferon alapú készítményekben.

Az albumint a vérből nyerik, így fennáll a kockázata (bár minimális) a hepatitis és más, vér útján terjedő betegségek megbetegedésének.

A gyógyszer neve	INF altípus	Megszerzésének módja	farmakológiai hatás	Használati javallatok
Interferon		Bioszintézis donorvér tenyésztett leukocitáiban vírusok hatására	Vírusellenes, immunmoduláló, antiproliferatív	Vírusos betegségek, leukémia, rosszindulatú melanoma, veserák, karcinoid szindróma
Interlock		Bioszintézis donorvér tenyésztett leukocitáiban paramikovírusok hatására	Elnyomja számos vírus aktivitását	Vírusos szembetegségek, hepatitis	Rekombináns	Vírusellenes, immunmoduláló, a tumorsejtek széles körének proliferációját gátolja	Akut és visszatérő vírusos szemfertőzés epiteliális formája; onkológiai betegségek
Interferon alfa-2a		Rekombináns. 165 aminosavat tartalmazó fehérje	Vírusellenes, daganatellenes aktivitás	Leukémiás retikuloendotheliózis, Kaposi-szarkóma, veserák, hólyagrák, melanoma, herpes zoster
Reaferon		Pseudomonas baktériumtörzs által termelt rekombináns INF, amelynek genetikai apparátusa tartalmazza a humán leukocita IFN α2 gént. Azonos a humán leukocita IFN α2-vel.		Vírusos, daganatos betegségek
Interferon alfa – n1		Nagy tisztaságú humán INF	Vírusellenes	Krónikus aktív fertőző hepatitis B
Inreferon béta		Humán fibroblasztok szupertermelése stimulátorral metabolikus inhibitorok jelenlétében	Vírusellenes, immunmoduláló, daganatellenes hatás	Krónikus vírusfertőzések a szemészetben, nőgyógyászatban és urológiában, bőrgyógyászatban, hepatológiában, onkológiában
gamma-interferon		Rekombináns	Vírusellenes, immunmoduláló, daganatellenes hatás	Krónikus granulomatosus betegségek

1. www.antibiotic.ru/ab/brviri.shtml

2. www.interferon.su/php/content.php?id=71

3. www.pharmvestnik.ru

4. Ideiglenes gyógyszerkönyvi cikk 42U-23/60-439-97. Interferon humán rekombináns alfa-kettő.

5. Gavrikov A.V. Rekombináns humán interferon anyagok biotechnológiai termelésének optimalizálása - M., 2003,

6. Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology / B. Glick, J. Pasternak. – M., Mir, 2002.

7. A Szovjetunió Állami Gyógyszerkönyve. XI kiad., 1. szám- 175. o.

8. Állami gyógyszernyilvántartás / Szerk. A.V. Katlinsky és mások - M., 2002.

9. Naroditsky B.S. Interferonok molekuláris biotechnológiája. // „Interferon – 50 éves” tudományos és gyakorlati konferencia gyűjteménye. – M., 2007, 17-23

10. A gyógyszerészeti biotechnológia alapjai: Tankönyv / T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhaleva. – Rostov-on-Don: Főnix; Tomszk: NTL Kiadó, 2006.

11. Frolov A.F., Vovk A.D., Dyadyun S.T. és mások A rekombináns alfa-két interferon hatékonysága vírusos hepatitis B-ben // Orvosi ügyek, 1990. - 9. sz. - 105–108.

Interferon az immunrendszer fontos védőfehérjéire utal. A vírusinterferencia tanulmányozása során fedezték fel, vagyis azt a jelenséget, amikor az egyik vírussal fertőzött állatok vagy sejttenyészetek érzéketlenné váltak egy másik vírus fertőzésére. Kiderült, hogy az interferencia a keletkező fehérjének köszönhető, amely vírusellenes védő tulajdonságokkal rendelkezik. Ezt a fehérjét interferonnak nevezték.

Alfa interferon leukociták termelik, és ezt leukocitáknak nevezik; béta interferon fibroblasztnak nevezik, mert fibroblasztok – kötőszöveti sejtek – szintetizálják, ill gamma interferon - immunis, mivel aktivált T-limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek, azaz immunsejtek termelik.

Az interferon folyamatosan szintetizálódik a szervezetben, és koncentrációját a vérben körülbelül 2 NE/ml értéken tartják (1 nemzetközi egység - NE - az interferon mennyisége, amely megvédi a sejttenyészetet a vírus 1 CPD 50-étől). Az interferon termelése meredeken növekszik vírusfertőzés során, valamint interferoninduktorok, például RNS, DNS és komplex polimerek hatásának kitéve. Az ilyen interferon induktorokat nevezzük interferonogének.

A vírusellenes hatás mellett az interferon daganatellenes védelemmel is rendelkezik, mivel késlelteti a daganatos sejtek szaporodását (reprodukcióját), valamint immunmoduláló hatást fejt ki, serkenti a fagocitózist, természetes ölősejteket, szabályozza a B-sejtek antitest képződését, aktiválja a fő sejtek expresszióját. hisztokompatibilitási komplexum.

A cselekvés mechanizmusa Az interferon összetett. Az interferon közvetlenül nem befolyásolja a vírust a sejten kívül, hanem speciális sejtreceptorokhoz kötődik, és befolyásolja a vírus szaporodási folyamatát a sejten belül a fehérjeszintézis szakaszában.

Interferon használata. Az interferon hatása annál hatékonyabb, minél hamarabb kezd szintetizálódni vagy kívülről bejutni a szervezetbe. Ezért profilaktikus célokra használják számos vírusfertőzés, például influenza esetén, valamint terápiás célokra krónikus vírusfertőzések esetén, mint például parenterális hepatitis (B, C, D), herpesz, sclerosis multiplex stb. rosszindulatú daganatok és immunhiányos betegségek kezelését eredményezi.

Az interferonok fajspecifikusak, azaz az emberi interferon kevésbé hatékony az állatok számára és fordítva. Ez a fajspecifikusság azonban relatív.

Interferon fogadása. Az interferont kétféleképpen lehet előállítani: a) humán leukociták vagy limfociták biztonságos vírussal való megfertőzésével, melynek eredményeként a fertőzött sejtek interferont szintetizálnak, amelyet azután izolálnak és interferonkészítményeket állítanak elő belőle; b) génmanipulált - olyan rekombináns baktériumtörzsek termesztésével, amelyek képesek interferon termelésére termelési körülmények között. Jellemzően olyan rekombináns pseudomonas és Escherichia coli törzseket használnak, amelyek DNS-ébe interferon géneket építenek be. A géntechnológiával előállított interferont rekombinánsnak nevezik. Hazánkban a rekombináns interferon a „Reaferon” hivatalos nevet kapta. Ennek a gyógyszernek az előállítása sok szempontból hatékonyabb és olcsóbb, mint a leukocita gyógyszer.

A rekombináns interferont széles körben alkalmazzák az orvostudományban vírusfertőzések, neoplazmák és immunhiányos betegségek megelőző és terápiás szereként.

Antigének. Meghatározás. A teljes és hibás antigének fogalma. Az antigénekre vonatkozó követelmények. Fogalmak a mikroorganizmusok antigén tulajdonságairól. A baktériumok antigén szerkezete.

Antigének(a latin anti - ellen, genos - nemzetség) - genetikailag idegen anyagok, amelyek a szervezet belső környezetébe kerülve képesek immunválaszt kiváltani antitestek vagy immun T-limfociták képződése formájában, és kölcsönhatásba lépnek őket. Az antigén fő tulajdonságai az immunogenitás és a specificitás. Az antigének a sejtek szerkezeti és kémiai elemei és anyagcseréjük termékei.

Az antigének a szervezet számára idegen kolloid szerkezetű anyagok, amelyek belső környezetébe kerülve képesek specifikus immunológiai választ kiváltani, amely különösen specifikus antitestek képződésében, szenzitizált limfociták megjelenésében, ill. az anyaggal szembeni tolerancia állapotának kialakulása.

Az antigéneknek minősülő anyagoknak a szervezet számára idegennek, makromolekulárisnak, kolloid állapotban kell lenniük, és parenterálisan, azaz parenterálisan kell bejutniuk a szervezetbe. a gasztrointesztinális traktus megkerülése, amelyben az anyag rendszerint lebomlik, és elveszik idegensége. Az antigének idegenségét az antigén és a szervezet makromolekulái közötti bizonyos fokú kémiai különbségként kell érteni, amelynek belső környezetébe bekerül.

Az antigén tulajdonságok a makromolekula molekulatömegéhez kapcsolódnak. Minél nagyobb egy anyag molekulatömege, annál nagyobb az antigenitása. Helytelen azonban azt feltételezni, hogy a nagy molekulatömeg egy antigén kötelező tulajdonsága. Így a glukagon, vazopresszin - angiotenzin is antigén tulajdonságokkal rendelkezik.

Szokás megkülönböztetni a teljes antigéneket, az alsóbbrendű antigéneket (hapténeket) és a félhapténeket.

Teljes értékű antigének azok, amelyek ellenanyagok képződését vagy a limfociták szenzibilizációját okozzák, és képesek reagálni velük mind a szervezetben, mind a laboratóriumi reakciókban. A fehérjék, poliszacharidok, nagy molekulatömegű nukleinsavak és ezen anyagok komplex vegyületei teljes értékű antigének tulajdonságaival rendelkeznek.

A hibás antigének vagy haptének önmagukban nem képesek antitestek képződését vagy a limfociták szenzibilizációját okozni. Ez a tulajdonság csak akkor jelenik meg, ha teljes értékű antigéneket ("vezetőket") adnak hozzájuk, és a keletkező antitestek vagy szenzitizált limfociták közül néhány a "vezetőre", néhány pedig a hapténre specifikus.

A hemihaptének viszonylag egyszerű anyagok, amelyek a szervezet belső környezetébe belépve kémiailag egyesülhetnek ennek a szervezetnek a fehérjéivel, és antigének tulajdonságait adják nekik. Ezek az anyagok bizonyos gyógyszereket is tartalmazhatnak (jód, bróm, antipirin stb.).

Az antigén molekula két egyenlőtlen részből áll. Az aktív (kis rész) c az antigéndetermináns (epitóp), és meghatározza az antigénspecifitást. Az antigéndeterminánsok az antigénmolekula azon helyein találhatók, amelyek a legnagyobb kapcsolatban állnak a mikrokörnyezettel. Egy fehérjemolekulában például nemcsak a polipeptidlánc végein, hanem annak más részein is elhelyezkedhetnek. Az antigéndeterminánsok legalább három merev szerkezetű aminosavat tartalmaznak (tirozin, triptofán, fenilalanin). Az antigén specifitása összefügg a polipeptid lánc aminosavainak váltakozási sorrendjével és egymáshoz viszonyított helyzetük kombinációjával is. Az antigén-determinánsok száma egy antigénmolekulában határozza meg annak vegyértékét. Minél nagyobb az antigén molekula relatív molekulatömege, annál nagyobb.

Az antigénmolekula fennmaradó (inaktív) része feltehetően a determináns hordozójaként játszik szerepet, és elősegíti az antigén behatolását a test belső környezetébe, pinocitózisát vagy fagocitózisát, a sejtes reakciót a test belső környezetébe. antigén, az intercelluláris interakció mediátorainak kialakulása az immunválaszban (a T-limfocitáknak receptorai vannak a hordozóhoz, B- az antigéndeterminánshoz).

A baktériumsejt anatómiai felépítése szerint vannak H-antigének (flagellar, ha a baktérium rendelkezik ilyenekkel), K-antigének (a sejtfal felszínén találhatók), O-antigének (a baktérium sejtfalához kapcsolódnak) , a baktériumok által környezetükbe ürített antigének (fehérjék- exotoxinok, kapszula poliszacharidok).

A mikrobiális sejt számos antigénje között vannak olyanok, amelyek csak egy adott típusú mikrobára jellemzőek (típusantigének), egy adott fajra (fajantigének), valamint olyanok, amelyek a mikroorganizmusok egy csoportjában (családjában) (csoport) jellemzőek. antigének).

Így a baktériumsejt (valamint más mikrobiális birodalmak mikroorganizmusai - vírusok, protozoonok, gombák) számos antigén komplex komplexét képviselik. Amikor belép a makroorganizmus belső környezetébe, sok ilyen antigén saját specifikus antitesteket hoz létre. Egyes antigének alig észrevehető mennyiségű antitest (titer) képződését indukálják, míg mások gyors és jelentős antitestképződést indukálnak. Ennek megfelelően megkülönböztetünk „gyenge” és „erős” antigéneket.

A baktériumsejt nem minden antigénje egyformán részt vesz az immunitás (immunitás) kiváltásában az azonos fajba tartozó patogén mikrobák makroorganizmusba való visszajutása ellen. Egy antigén immunitást kiváltó képességét immunogenitásnak, az ilyen antigént pedig immunogénnek nevezzük. Azt is megállapították, hogy bizonyos mikroorganizmusok bizonyos antigénjei különféle típusú túlérzékenység (allergia) kialakulását okozhatják. Az ilyen antigéneket allergéneknek nevezzük.

A vírusrészecske szerkezete alapján az antigének több csoportját különböztetjük meg: nukleáris, kapszid és szuperkapszid. A virion antigén összetétele magának a vírusrészecske szerkezetétől függ. Az egyszerűen szerveződő vírusok antigénspecifitása a ribo- és dezoxinukleoproteinekhez kapcsolódik. A komplex vírusokban az antigén egy része a nukleokapszidhoz kapcsolódik, a másik pedig a külső héjban található - a szuperkapszidban.

Immunogenitás- immunválasz kiváltásának képessége.

Specificitás- az antigén azon képessége, hogy kölcsönhatásba léphessen rá specifikus antitestekkel vagy aktivált (primed) limfocitákkal, ami ennek az antigénnek a semlegesítéséhez vezet.

Az immunogenitás meghatározása:

Idegenség, azok. az anyagot az immunrendszernek „nem-én”-ként kell felismernie. Sőt, minél kevésbé kifejezett a genetikai kapcsolat a szervezet és a beadott anyag között, annál jobb az immunogén;

Molekuláris tömeg, amelynek legalább 5-10 kDa-nak kell lennie. Minél nagyobb az antigén molekulatömege, annál erősebb lesz az immunválasz;

Kémiai természet. Az antigének lehetnek fehérjék, poliszacharidok, polipeptidek, foszfolipidek, nukleinsavak stb.

A kémiai természettől és a molekulatömegtől függően az antigének lehetnek teljes És befejezetlen

(haptének).

Teljes antigének(immunogének) specifikus immunválaszt indukálnak, és kölcsönhatásba lépnek az antitestekkel és az aktivált T-limfocitákkal. Ezek nagy molekulatömegű anyagok - fehérjék, poliszacharidok, glikoproteinek, lipopoliszacharidok, lipoproteinek, nukleoproteinek és korpuszkuláris formák (mikroorganizmusok, idegen sejtek stb.). Az antigének lehetnek exogének vagy endogének. Az endogén ag-ok a szervezet saját sejtjei, amelyeknek megváltozott genomjuk van, és az általuk képződött termékek ( autoantigének).

Haptens- ezek egyszerű, alacsony molekulatömegű kémiai vegyületek: diszacharidok, lipidek, peptidek, nukleinsavak stb. Nem immunogének, de magas szintű specifitásuk van, amikor az immunválasz termékeivel (antitestekkel és T-limfocitákkal) kölcsönhatásba lépnek. Ha egy haptént fehérjével kombinálunk, akkor az immunogenitás tulajdonságot nyer (azaz teljessé válik). Ennek a komplexnek a specifitását a haptén határozza meg

Félig haptens

Proantigének

Félig haptens szervetlen anyagok (jód, bróm, nitrogén stb.) fehérjével kombinálva keletkeznek. Az ilyen komplexek indukálhatják a szervetlen vegyületekre specifikus antitestek képződését.

Proantigének allergének-haptének vagy nem antigén anyagok (szulfonamidok, antibiotikumok, fenolftalein stb.). A makroorganizmus fehérjéivel kombinálva szenzibilizációt és allergiás reakciókat okozhatnak.