átalakítás
Az átalakulás a tiszta DNS átvitele egyik sejtből a másikba. Az átalakulást F. Griffiths bakteriológus fedezte fel 1928-ban pneumococcusokkal végzett kísérletekben. A pneumococcusoknak kétféle törzsük van: S- és R-forma.
Az S-formát poliszacharid kapszula jelenléte jellemzi, aminek köszönhetően mesterségesen termesztve sima, fényes telepeket képez; ez a forma egerekre patogén. Az R-formának nincs kapszula, ha mesterségesen termesztik, durva telepeket képez; ez a forma nem patogén egerekre. De ha elölt S-sejteket és élő R-sejteket egyidejűleg injektálnak egerekbe, az egerek elpusztulnak. Ezért az egyik törzs genetikai tulajdonságai befolyásolják egy másik törzs genetikai tulajdonságait.
1944-ben O. Avery, K. McLeod és M. McCarthy bebizonyította, hogy a sejtek örökletes tulajdonságaiban bekövetkező változások összefüggenek a DNS transzferrel.
Egy sejt transzformációs képessége speciális állapotában lehetséges, amit kompetenciának nevezünk. Kompetens sejtekben megváltozik a sejtfal és a plazmalemma összetétele: a fal porózussá válik, a plazmalemma számos invaginációt képez, és a külső felületen speciális antigének jelennek meg - kompetenciafaktorok (különösen kis molekulatömegű specifikus fehérjék).
Természetes körülmények között a prokarióták halála (lízise) során extracelluláris tiszta DNS képződik.
A transzformáció általában egy prokarióta fajon belül történik, de homológ gének jelenlétében interspecifikus transzformáció is megfigyelhető.
Az átalakítási folyamat a következő szakaszokból áll:
1. Transzformáló kettős szálú DNS kötődése a befogadó sejt felszínén lévő receptorokhoz.
2. Kétszálú DNS átalakítása egyszálúvá.
3. Egyszálú DNS behatolása a sejtbe.
4. A transzformáló DNS integrálása a recipiens kromoszómába és a genetikai anyag rekombinációja.
A transzformáló DNS hosszának 500 és 200 ezer bp között kell lennie. Az egyik DNS-szál lebontása során felszabaduló energiát a fennmaradó szál sejtbe történő aktív szállítására használják fel.
A transzformáció első három szakasza nem függ a DNS nukleotid-összetételétől. A transzformáló DNS befogadó kromoszómába való integrálódási folyamata azonban valószínűbb, ha ez a DNS nagymértékben homológ a recipiens DNS-sel.
Az átalakítási folyamat a diagramon látható. Minden egyenes szakasz egy DNS-szálnak felel meg. A transzformáló DNS-t feketével, a recipiens sejt DNS-ét pedig szürkével jelöltük.
Az első szakaszban a transzformáló DNS a befogadó sejt felszínén lévő receptorhelyekhez kötődik.
A második szakaszban a sejtfelszínen lévő kettős szálú DNS egyszálú DNS-sé alakul az egyik szál bakteriális nukleázok általi hasítása miatt.
A harmadik szakaszban a megmaradt DNS-szál a membránon keresztül a citoplazmába kerül. Ez a komplementer lánc lebomlása során felszabaduló energiát használja fel.
A bakteriális kromoszóma replikációja során a transzformáló DNS-szál a befogadó sejt homológ (részben komplementer) DNS-régiójához kapcsolódik. Ebben az esetben a teljes komplementaritás hiánya miatt heteroduplex („molekuláris heterozigóta”) képződik - a kettős szálú DNS szakasza, amelyben nem minden nukleotidpár rendelkezik nitrogénbázisokkal, amelyeket hidrogénkötések kötnek össze. A DNS többi része normálisan replikálódik.
A DNS-replikáció befejezése után a befogadó sejt osztódik, és két sejt keletkezik: egy részlegesen transzformált sejt, amelynek kromoszómája heteroduplex DNS-régiót tartalmaz, és egy nem transzformált sejt. A részlegesen transzformált sejtben a DNS-replikáció során mindkét DNS-szálon komplementer láncok jönnek létre. Az egyik szál megtartja az eredeti nukleotidszekvenciákat, míg a másik teljesen átalakul. Egy részlegesen transzformált sejt osztódása után egy nem transzformált és egy teljesen transzformált sejt keletkezik, amelyben az eredeti nukleotidszekvenciát a transzformáló DNS nukleotidszekvenciája helyettesíti.
A transzformáció során tehát nem új gének hozzáadása történik, hanem a recipiens gének homológ nukleotidszekvenciákkal való helyettesítése.
A transzformáció gyakorisága prokariótákban a transzformáló DNS tulajdonságaitól, koncentrációjától, a befogadó sejt állapotától és a baktérium típusától függ. A transzformált sejtek maximális gyakorisága nem haladja meg az 1/100 sejtet.
Az átalakulás az eukariótákról is ismert. Az eukarióta sejtek felszínén azonban nincsenek receptorhelyek, a transzformáló DNS-t mesterségesen juttatják be a sejtekbe. Például a DNS-t az állati tojásokba közvetlen mikroinjekcióval, a növényi tojásokba pedig a pollencsőbe történő mikroinjekcióval juttatják be.
A transzdukció a genetikai anyag vírusok segítségével történő átvitele egy donor sejtből a recipiens sejtbe.
A transzdukció jelenségét 1951-ben N. Zinder (J. Lederberg tanítványa) fedezte fel.
A transzdukció során a gazdasejtből származó DNS bejut a virionokba. A virionok megfertőznek más sejteket, és az eredeti baktériumsejt DNS-e egy másik baktériumsejtbe kerül. A vírus DNS beépül a bakteriális kromoszómába, és a bejuttatott bakteriális DNS rekombinálódik a bakteriális kromoszóma DNS-ével. Ennek eredményeként a sejtek 50%-a átalakul.
Létezik általános (nem specifikus), korlátozott (specifikus) és abortív transzdukció.
Általános transzdukció
Az általános transzdukció során a donor bakteriális DNS fragmensei véletlenszerűen kerülnek be az érő fágrészecskébe a fág DNS-sel együtt vagy a fág DNS helyett. Bakteriális DNS-fragmensek képződnek, amikor egy fág által szabályozott enzim elvágja. Egy fágrészecske akár 100 bakteriális gént is tartalmazhat.
Korlátozott transzdukció
Korlátozott transzdukció esetén rekombináció következik be - a bakteriális DNS helyettesíti a fág DNS egy részét. A rekombináns DNS kis számú bakteriális gént tartalmaz a fág DNS mellett, a bakteriális kromoszómába integrálva.
Általános és korlátozott transzdukció esetén a donor DNS helyettesíti a recipiens DNS-ének homológ régióit. Ez a folyamat hasonló az átalakuláshoz.
Az abortív transzdukció lehet nem specifikus és specifikus is. Lényege abban rejlik, hogy a fág által transzdukált DNS-fragmens nem kerül be a recipiens kromoszómába, hanem citoplazmatikus replikonként létezik. Előbb-utóbb ez a replikon elveszik.
A vírusok általi transzdukció jelenségét széles körben alkalmazzák az eukarióták génátvitelében. Ha olyan vírust használunk, amely nem képes kapszidot képezni (vagyis csak DNS formájában létezik), akkor a transzdukció alapvetően nem különbözik a transzformációtól vagy a genetikai anyag plazmidvektorokkal történő konjugatív átvitelétől. A módosított SV40 vírusok (egy sejtben akár 100 ezer másolatot is alkotnak), herpesz, vaccinia és karfiol mozaikvírus alapján hoztak létre vektorrendszereket.
Még egyszer hangsúlyozni kell, hogy a leírt rekombinációs típusok mindegyike nem új DNS-szakaszok hozzáadásával, hanem a meglévő nukleotidszekvenciák helyettesítésével jár. Minél nagyobb a homológia foka a transzformáló és eredeti DNS között, annál nagyobb a sikeres rekombináció valószínűsége. A rekombináció legegyszerűbb módja az összes szervezetben megtalálható enzimek. Nehezebb új, erősen specifikus szabályozókat bevinni a genomba. Ezért az új gének genomba történő bejuttatására a DNS biokémiai módosításaival kapcsolatos összetettebb módszereket alkalmazzák.
Transzdukció J. Lederberg és N. Zinder fedezte fel 1952-ben Salmonella typhimuriumés a P22 fág.
Transzdukció– genetikai információ (kromoszómális gének vagy plazmidok) átvitele a donor sejtből a recipiens sejtbe, amely bakteriofágok részvételével történik. A transzdukció során a kromoszóma vagy plazmid fragmentumokat a bakteriofág fejébe kell csomagolni; ennek a fágrészecskének a részeként hagyja el a donor sejtet annak lízise következtében, és egy új fertőzés során egy másik sejtbe (recipiens sejt) lép be. A fágfej fehérjekapszidja megvédi a benne található DNS-t az extracelluláris nukleázok általi pusztulástól. Ebből a szempontból a transzdukáló DNS jobban „megőrzött”, mint a „csupasz” DNS a transzformáció során. Mivel a fág farok folyamatának sejtfelszíni receptorokon való adszorpciója fajspecifikus, a transzdukció során a genetikai anyag átvitele elsősorban közeli rokon baktériumok között történhet.
A transzdukció során az átvitt DNS-fragmens méretét a bakteriofág fejének mérete határozza meg. Különféle fágok képesek 20-40 kb méretű DNS-fragmenseket átvinni. Így a transzdukció során egyetlen gének és kapcsolt markerek is átvitelre kerülnek. A genetikai információcsere ezen módszerével nyert rekombinánsokat ún transzduktánsok.
A transzdukciós vizsgálatok kimutatták, hogy egyes fágok különböző bakteriális géneket, míg mások csak bizonyos géneket képesek átvinni. Ennek megfelelően kétféle transzdukciót szokás megkülönböztetni: 1) általánosított (nem specifikus, vagy Tábornok); 2) konkrét, vagy korlátozott.
Nál nél generalizált transzdukció Bármilyen bakteriális tünet átadható 10 –5 –10 –6 gyakorisággal. A fág által átvihető bakteriális DNS mennyisége általában a sejtben található teljes DNS 1-2%-a. A kivétel a PBS1 bakteriofág B. subtilis, amely a gazda genomjának akár 8%-át is képes transzdukálni. A generalizált transzdukció megvalósítása során a bakteriális vírus csak „passzív” hordozója a baktériumok genetikai anyagának. A transzdukáló hibás fágok csak bakteriális DNS-fragmenseket tartalmaznak. A transzdukált baktériumokban a genetikai rekombináció pedig a rekombinációs folyamat általános törvényei szerint megy végbe.
Jellemző tulajdonságok specifikus transzdukció a következők: 1) minden egyes transzdukáló fág a bakteriális kromoszóma egy szigorúan meghatározott, nagyon korlátozott régióját viszi át; 2) a fág nemcsak genetikai anyagot továbbít, hanem biztosítja a bakteriális kromoszómába való beépülését is; 3) a vírus bakteriális DNS-t épít be a genomjába, és továbbítja azt, lizogenizálva a befogadó baktériumokat.
A specifikus transzdukció legismertebb példája a λ fág, amely képes megfertőzni a baktériumsejteket. E. coli ezt követi a DNS-ének a bakteriális genomba való integrációja.
A transzdukciónak gyakorlati haszna van:
Lehetővé teszi a plazmidok és a donor kromoszóma rövid fragmenseinek transzdukcióját;
Adott genotípusú törzsek, különösen izogén törzsek létrehozása. Az általánosított transzdukcióval előállított izogén törzsek csak a transzdukáló fág által hordozott kromoszóma régióban térnek el egymástól;
Bakteriális gének pontos feltérképezéséhez, sorrendjének és elhelyezkedésének megállapításához az operonokban.
Kérdések az önkontrollhoz
1 Milyen folyamatok játszódnak le a recipiens sejtben, miután a donor DNS bejutott és merozigóta állapotba kerül?
2 Mi az átalakulási folyamat? Milyen szakaszokat tartalmaz?
3 Sorolja fel a ragozási folyamat főbb szakaszait!
4 Ismertesse a transzdukciós folyamatot! Miben különbözik a specifikus transzdukció az általánosítotttól?
Gyakorlati lecke 8
Cél: a baktériumok genetikai cseréjének fő módszereinek tanulmányozása; a transzformációs, konjugációs és transzdukciós folyamatok közös és megkülönböztető jegyeinek azonosítása.
Anyagok és felszerelések: bemutató diagramok (rajzok): a) merozigóták; b) az átalakulás folyamata; c) a bakteriális konjugáció mechanizmusa; d) Baktériumok F-plazmidjai E. coli; e) általánosított transzdukció; g) specifikus transzdukció; A konjugált sejtek elektronmikroszkópos felvétele E. coli; színes ceruzák.
Előrehalad
Az óra protokolljában:
1 Adja meg a baktériumok genetikai információcsere módszereinek általános leírását: jelölje meg a genetikai információcsere három fő módszerét és azok általános jellemzőit!
2 Rajzoljon diagramot egy merozigótáról, és mutasson be két fejlődési módot!
3 Jellemezze az átalakulási folyamatot a leírási séma szerint: az átalakulás fogalma, felfedezéstörténet, az átalakulási folyamat szakaszai, kompetencia, az átalakulás gyakorlati felhasználása.
4 Készítsen grafológiai diagramot a „transzformációs folyamat szakaszairól”, amely ezen a diagramon külön tükrözi a transzformáció folyamatát: a) plazmid DNS; b) bakteriális DNS.
5 Jellemezze a konjugációs folyamatot a leírási séma szerint: a konjugáció fogalma, a felfedezés története, a konjugációs folyamat szakaszai, a konjugáció során átvitt DNS mennyisége, a konjugáció gyakorlati alkalmazása.
6 Készítsen grafológiai diagramot „Genetikai anyag átvitele a konjugáció során”, amely ezen a diagramon külön tükrözi az alábbiak donorsejtként való részvételét: a) F + -donorok; b) Hfr típusú donorok.
7 Jellemezze a transzdukciós folyamatot a leírási séma szerint: a transzdukció fogalma, a felfedezés története, a transzdukciós folyamat szakaszai, a transzdukció során átvitt DNS mennyisége, a transzdukció típusai, a transzdukció gyakorlati felhasználása.
8 Készítsen grafológiai diagramokat „Általános transzdukció”, „Speciális transzdukció”. Vegye figyelembe a jelentős különbségeket e két típusú transzdukció között.
A transzdukció a gének átvitele egyik baktériumsejtből a másikba bakteriofág segítségével. Ezt a jelenséget először 1952-ben N. Zinder és J. Lederberg állapította meg. Kutatásokat végeztek a Salmonella typhimurium baktériummal, amely egerekre patogén. Ezeknek a baktériumoknak két törzsét választottuk ki: a 22A törzset, egy auxotróf törzset, amely nem képes a triptofán (T~) szintézisére, és a 2A törzset, amely képes triptofán (T1") szintetizálására. Ezeket a törzseket egy U alakú csőbe oltottuk be, és a következő időpontban választották el. az alját bakteriális szűrővel (24. ábra A 22A (T~) törzset a cső egyik könyökébe, a 2A törzset (T 1") a másikba oltottuk be. Egy bizonyos inkubációs időszak után a 22A törzs baktériumai minimális táptalajra vetve kis számú telepet hoztak létre (a transzdukált sejtek megjelenési gyakorisága N0~5 volt). Ez azt jelzi, hogy egyes sejtek képesek voltak triptofán szintetizálására. Hogyan szerezhetik meg a baktériumok ezt a tulajdonságot? Kutatás
Rizs. 24. A transzducin kísérlet vázlata
kimutatták, hogy a 22A törzs lizogén a P-22 fággal szemben. Ez
a fág kiszabadult a lizogén tenyészetből, átjutott rajta
szűrőt és lizált 2A törzset. A genetikai részhez való csatlakozással
Miután megkapta a 2A törzsből származó anyagot, a bakteriális fág visszatért, és átvitte ezt a genetikai anyagot a 22A törzsbe. Törzs 22A at
a 2A törzs sajátos örökletes tulajdonságait szerzett,
ebben az esetben a triptofán szintézisének képessége. Más tulajdonságok is hasonlóan transzdukálhatók, beleértve a képességet is
erjedés, cantibiotikumokkal szembeni rezisztencia stb.
A transzdukció jelenségét Escherichia coliban és actinomycetesben is megállapították. Általában egy gén transzdukálódik, ritkábban kettő és nagyon ritkán három kapcsolt gén. A genetikai anyag átvitelekor a fág DNS-molekula egy része kicserélődik. A fág ekkor elveszíti saját fragmentumát és hibás lesz. A genetikai anyag beépülése a befogadó baktérium kromoszómájába olyan mechanizmussal történik, mint például a keresztezés. A recipiens kromoszóma homológ régiói és a fág által bevitt anyag között örökletes anyagcsere megy végbe.
Háromféle transzdukció létezik: általános vagy nem specifikus, specifikus és abortív. A nem specifikus transzdukció során a fágrészecskék összeállítása során az érintett baktérium bármely DNS-fragmentuma bekerülhet a fejükbe a fág DNS-sel együtt. Ennek eredményeként a donor baktérium különböző génjei átkerülhetnek a befogadó sejtekbe. A nem specifikus transzdukciót a P-1 és P-22 fágok végezhetik Escherichia, Shigella és Salmonella esetén. A specifikus transzdukció során a prófág a bakteriális kromoszóma egy meghatározott helyére beépül, és a donor sejt kromoszómájában a prófég melletti bizonyos géneket transzdukálja. Például a profág állapotban lévő "k" fág (lambda) mindig ugyanazon a helyen szerepel az E. coli kromoszómában, és transzdukálja azt a lókuszt, amely meghatározza a galaktóz fermentációs képességét. Amikor a profágokat elválasztják a gazda DNS-étől, a bakteriális gének A profággal szomszédos kromoszómák kiürülnek a készítményből, és a profág gének egy része az összetételében marad.
Megállapítást nyert, hogy a donor kromoszómájának a recipiens sejtjébe átvitt töredéke nem mindig szerepel a recipiens kromoszómájában, de a sejt citoplazmájában megőrzhető. Amikor a baktériumok osztódnak, csak az egyik leánysejtbe kerülnek. Ezt az állapotot abortív transzdukciónak nevezik.
Egy másikban egy bakteriofág. Az általános transzdukciót a bakteriális genetikában a genomtérképezéshez használják. A mérsékelt égövi fágok és a virulensek egyaránt képesek transzdukcióra, ez utóbbiak azonban elpusztítják a baktériumpopulációt, így a transzdukciónak nincs nagy jelentősége sem a természetben, sem a kutatásban.
A transzdukciót leírták Norton Zinderés Joshua Lederberg 1952-ben Salmonella. Megfigyelték az auxotróf törzsekben a normális fenotípusok helyreállását, és bebizonyították, hogy csak vírus képes a genetikai anyag átvitelére.
Gépezet
A transzdukció általános sémája
A transzdukció a DNS fágok által közvetített átvitele a baktériumsejtek között. Ennek a folyamatnak a kulcsfontosságú lépése az átvitt DNS becsomagolása a fágfejbe annak életciklusának litikus fázisában, vagyis amikor a sejt elpusztul, és a vírusrészecskéket kifelé bocsátja. A vírusrészecskék összeépülése során általában saját DNS jut be a fágfejbe, de időnként hibák lépnek fel, amikor olyan bakteriális DNS-fragmensek kerülnek a fágfejbe, amelyek például a bakteriális kromoszóma pusztulása során keletkezhettek. a fág által. A bakteriális DNS-fragmenseket tartalmazó fágrészecskéket transzdukáló részecskéknek nevezzük. Megfertőzhetik a sejteket, mint a normál fágokat, mivel rendelkeznek az ehhez szükséges összes génnel. Amikor a fág a sejthez való kapcsolódás után a genomiális DNS-ét belefecskendezi, a fejében lévő bakteriális DNS-t is befecskendezi. Érdekes módon a transzdukció a lítikus ciklus során is lehetséges.
Nem minden fág képes transzdukcióra. Csak azok a fágok képesek rá, amelyek a bakteriális genomiális DNS-t a szükséges méretű fragmentumokká törik fel, hogy azok beleférjenek a kapszidba. Néha nem a baktérium genomiális DNS-e kerül be a virionba, hanem egy plazmid, amely a következő fertőzött sejtbe jutva tovább duplázódik. A fágok által hordozott genomfragmensek éppen ellenkezőleg, nem képesek replikációra; megkettőződésük csak akkor lehetséges, ha be tudnak épülni a befogadó baktérium kromoszómájába. Ha a bakteriális genom egy töredéke szabad marad, akkor több generáción keresztül osztódáskor az egyik leánysejtbe kerül; az ilyen transzdukciót abortívnak nevezzük.
Videó a témáról
Transzdukciós leképezés
A transzdukciót a bakteriális kromoszómák gének feltérképezésére használták. A módszer azon alapszik, hogy a transzdukció során átvitt bakteriális DNS fragmentumok meglehetősen nagyok és számos gént tartalmazhatnak, így a transzdukció (kotranszdukció) során egyidejűleg is átkerülhetnek egymáshoz közel elhelyezkedő gének. Minél kisebbek a gének
