Интерпретация на кръвен тест за имуноензимен анализ. Анализ за сифилис ELISA - интерпретация на анализа. Норма и отклонения. Плюсове и минуси на анализа

ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ, ELISA) навлиза в живота на практическата медицина някъде през 60-те години на миналия век. Първоначалната му задача беше хистологично изследване за научни цели, което се свеждаше до търсене и идентифициране на антигенната структура на клетките на живия организъм.

Методът ELISA се основава на взаимодействието на специфични (AT) и свързани антигени (AG) с образуването на комплекс "антиген-антитяло", който се открива с помощта на ензим. Този факт накара учените да мислят, че методът може да се използва за диагностични цели за идентифициране на специфични имуноглобулини от различни класове, участващи в имунния отговор към определена инфекция. И това беше пробив в клиничната лабораторна диагностика!

Методът започва да се използва активно едва в началото на 80-те години, и то предимно в специализирани институции. Първите имуноензимни анализатори бяха оборудвани с центрове и станции за кръвопреливане, инфекциозни и венерологични болници, тъй като страховитият СПИН, роден на африканския континент, се появи на нашия хоризонт и веднага се присъедини към „старите“ инфекции, изискваше незабавни диагностични мерки и търсене за терапевтични лекарства, които му въздействат.

Обхват на приложение на метода ELISA

Възможностите на ензимния имуноанализ са наистина обширни.Сега е трудно да си представим как може да се направи без такова изследване, което се използва буквално във всички отрасли на медицината. Изглежда, какво може да направи ELISA в онкологията? Оказва се, че може. И то много. Способността на анализа да открие маркери, характерни за определени видове злокачествени новообразувания, е в основата на ранното откриване на тумор, когато той все още не е открит по друг начин поради малкия си размер.

Съвременната клинична лабораторна диагностика (КЛД), в допълнение към туморните маркери, разполага със значителен арсенал от ELISA панели и ги използва за диагностициране на различни патологични състояния (инфекциозни процеси, хормонални нарушения) и наблюдение на фармацевтичните лекарства, за да идентифицира ефекта им върху тялото на пациента. и между другото не само човешки. В момента ензимният имуноанализ се използва широко във ветеринарните услуги, тъй като „нашите малки братя“ също са податливи на много заболявания, от които понякога страдат много.

По този начин, ELISA, поради своята чувствителност и специфичност, може да определи от кръвна проба, взета от вена:

Хормонален статус (хормони на щитовидната жлеза и надбъбречните жлези, полови хормони);
Наличието на вирусни и бактериални инфекции (HIV, B и C, хламидия, сифилис и, и, както и много други заболявания, причинени от патогенни микроорганизми);
Следи от жизнената активност на микроорганизмите, които инициираха инфекциозния процес, който завърши успешно и премина в етапа на формиране на имунен отговор към този патоген. Такива следи, тоест антитела, в много случаи остават циркулиращи в кръвта за цял живот, като по този начин предпазват човек от повторно заразяване.

Каква е същността на ELISA?

Методът на ензимен имуноанализ позволява да се определи не само наличието на самия патоген (качествен анализ), но и неговото количествено съдържание в кръвния серум на пациента.

Вирусната или бактериалната доза значително влияе върху хода на инфекциозния процес и неговия резултат, поради което количественият анализ играе важна роля в диагностиката и лечението на заболявания в различни форми и стадии.

Въпреки това, знаейки изследванията на ензимния имуноанализ като метода ELISA, ние дори не се замисляме как той успява да обхване толкова широк спектър от микроорганизми, обитаващи нашата планета, много от които представляват пряка заплаха за здравето и живота на хората и животните. Но факт е, че ELISA има много опции (неконкурентни и конкурентни - директни и индиректни), всяка от които решава свой собствен проблем и по този начин позволява целенасочено търсене.

За идентифициране на имуноглобулини от един или друг клас се използва традиционен 96-ямков панел от полистирол (плака), в чиито ямки са концентрирани сорбирани рекомбинантни протеини в твърдата фаза. Антитела или антигени, които попадат в ямката с кръвен серум, намират „познат“ обект и образуват комплекс с него (AG - AT), който, фиксиран от ензимен конюгат, ще се прояви чрез промяна в цвета на ямката, когато четене на резултатите.

Ензимният имуноанализ се извършва с помощта на тест системи с определена специфичност, произведени в специални лаборатории и оборудвани с всички необходими реагиращи компоненти. Изследванията могат да се извършват с помощта на перални машини ("шайби") и спектрофотометри за отчитане, които включват предимно ръчен труд. На напълно автоматични машини, които освобождават лаборанта от монотонно вливане, миене и други рутинни задачи, разбира се, се работи по-бързо и удобно, но не всички лаборатории могат да си позволят такъв лукс и да продължат да работят по стария начин - на полуавтоматични машини.

Интерпретацията на резултатите от ELISA е от компетенцията на лекаря по лабораторна диагностика, като трябва да се вземе предвид и присъщото свойство на почти всички имунохимични реакции да дават фалшиво положителни или фалшиво отрицателни отговори.

Видео: модерен ензимен имуноанализ

Резултатите от ELISA, използвайки примера за сифилис

Ензимният имуноанализ е подходящ за откриване на всички форми, и в допълнение се използва в скринингови изследвания. За извършване на анализа се използва венозна кръв на пациента, взета на празен стомах. Работата използва таблетки с определена специфичност (AB класове A, M, G) или тотални антитела.

Като се има предвид, че антителата при сифилис се произвеждат в определена последователност, ELISA може лесно да отговори на въпроса кога е възникнала инфекцията и на какъв етап е процесът, а интерпретацията на получените резултати може да бъде представена в следната форма:

IgM показва продължителността на инфекциозния процес (може да се появи по време на обостряне на хронични възпалителни заболявания);
IgA показва, че инфекцията е настъпила преди повече от месец;
IgG показва, че инфекцията е в разгара си или наскоро е проведено лечение, което лесно се определя чрез снемане на анамнеза.

При тестване за сифилис отрицателните ямки (и отрицателната контрола) ще останат безцветни, докато положителните ямки (и положителната контрола) ще покажат ярко жълт цвят поради промяната на цвета на хромогена, добавен по време на теста. Въпреки това, интензитетът на цвета не винаги съвпада с контролния, тоест може да бъде малко по-блед или леко жълтеникав. Това са съмнителни резултати, които по правило подлежат на повторно изследване със задължително отчитане на количествените показатели, получени на спектрофотометъра, но като цяло цветът е пряко пропорционален на броя на имунните комплекси (свързани Ags и ATs) .

Най-вълнуващият от ензимните имунотестове е HIV ELISA

Анализът е може би по-интересен от други за широк кръг от населението, тъй като все още е невъзможно да се каже с увереност, че много социални проблеми са изчезнали (проституция, наркомания и др.). За съжаление, ХИВ засяга не само тези слоеве на човешкото общество; можете да се заразите при различни обстоятелства, които не са свързани със сексуална неморалност или употреба на наркотици. Но ако има нужда от тест за ХИВ, не трябва да се страхувате, че всички около вас ще знаят за вашето посещение в такава лаборатория. Сега ХИВ-инфектираните са защитени от закона и тези, които имат съмнения, могат да се обърнат към анонимни офиси, където могат да разрешат проблема без страх от публичност и осъждане.

Имуноензимният метод за диагностициране на HIV инфекцията е едно от най-важните стандартни изследвания, което обаче изисква специални условия, тъй като темата е много деликатна.

Има смисъл да се извършва HIV ELISA след сексуален контакт, кръвопреливане, други медицински процедури, предполагащи инфекция, и в края на инкубационния период („серонегативен прозорец“), но трябва да се има предвид, че този период от време не е постоянен. Може да приключи след 14-30 дни или да продължи до шест месеца, така че средната стойност се счита за интервал от 45 до 90 дни. Кръвта се дарява за ХИВ по същия начин, както при други инфекции - от вена на празен стомах. Резултатите ще бъдат готови в зависимост от натрупването на материал в лабораторията и нейната натовареност (от 2 до 10 дни), но най-често лабораториите дават отговор на същия ден или на следващия.

Какво можете да очаквате от вашите ХИВ резултати?

ELISA за HIV инфекция открива антитела срещу два вида вирус: HIV-1 (по-често срещан в Русия и други страни от Европа и Азия) и HIV-2 (по-често срещан в Западна Африка).

Задачата на HIV ELISA е да търси антитела от клас G, които се откриват на всички тестови системи, но в по-късен период, и антитела от клас А и М, откривани в рекомбинантни тестови комплекти от ново поколение, които позволяват откриването на антитела в най-ранните етапи (инкубационен период - "серонегативен прозорец"). Можете да очаквате следните отговори от ELISA:

Първичен положителен резултат: кръвта трябва да се изследва повторно с тест система от същия тип, но по възможност от друга серия и от друго лице (лаборант);
Повторното (+) включва ново вземане на кръв от пациента с изследване, подобно на първичния анализ;
Друг положителен резултат подлежи на референтен анализ, при който се използват високоспецифични тестови комплекти (2-3 бр.);
Положителен резултат в двете (или три) системи се изпраща за имуноблотинг (същият ELISA, но извършен индивидуално с помощта на тестови комплекти с особено висока специфичност).

Заключението за HIV инфекция се прави само въз основа на имуноблотинг. Със заразения се провежда разговор при пълна конфиденциалност. Разкриването на медицинска тайна в Русия, както и в други страни, подлежи на наказателно наказание.

Тестовете за хламидия и цитомегаловирус, използващи метода на ензимен имуноанализ, също придобиха особена популярност, поради факта, че те позволяват да се определи времето на инфекция, стадия на заболяването и ефективността на мерките за лечение.

По време на прилагането може да се наблюдава и появата на антитела от различни класове.в различни фази на патологичното състояние, причинено от инфекциозен агент:

IgM може да се открие още седем дни след заразяването;
IgA показва, че инфекцията живее в тялото повече от месец;
IgG потвърждава диагнозата хламидия и помага за проследяване на лечението и определяне на неговата ефективност. Трябва да се отбележи, че антителата от клас G остават и циркулират в тялото независимо от продължителността на заболяването, следователно, за да интерпретирате правилно анализа, трябва да вземете предвид референтните стойности (норми), които между другото , са различни за всеки CDL: като се вземат предвид марката на тест системата и спецификата на включените в комплекта реагенти. Нормалните стойности се въвеждат във формуляра до резултата от ELISA.

Що се отнася до , тук е малко по-различно:антителата от клас М се появяват след около месец до месец и половина, тоест положителният резултат (IgM+) става във фазата на първична инфекция или по време на реактивиране на латентна инфекция и остава такъв от 4 месеца до шест месеца.

Наличието на антитела от клас G е характерно за началото на първична остра инфекция или повторна инфекция. Анализът посочва, че вирусът е наличен, но не дава информация на какъв етап е инфекциозният процес. Междувременно определянето на нормалния титър на IgG също създава затруднения, тъй като той изцяло зависи от имунния статус на конкретен човек, който обаче се установява чрез идентифициране на имуноглобулини от клас G, когато се диагностицира CMV за оценка на способността на антителата от клас G да взаимодействат с CMV, за да го „неутрализират“ по-късно (AT авидитет). В началния стадий на заболяването IgG се свързва много слабо с вирусните антигени (нисък авидитет) и едва след това започва да проявява активност, следователно можем да говорим за повишаване на авидитета на антителата.

Можем да говорим много за предимствата на ензимния имуноанализ, тъй като този метод успя да реши много диагностични проблеми, използвайки само венозна кръв. Няма нужда от дълго чакане, притеснения и проблеми със събирането на материал за изследване. В допълнение, тестовите системи за ELISA продължават да се подобряват и не е далеч денят, когато тестът ще даде 100% надежден резултат.

Видео: образователен филм на Московския държавен медицински университет на името на. Сеченов за основите на ELISA

– съвременен лабораторен тест, който търси специфични антитела в кръвта или антигени към определени заболявания, за да се установи не само етиологията, но и стадия на заболяването. Резултатите от ELISA могат да бъдат дадени качествено и количествено.

В момента ELISA се използва в следните ситуации:

1) Търсене на специфични антитела към всяко инфекциозно заболяване;
2) търсене на антигени на всякакви заболявания (инфекциозни, венерологични);
3) изследване на хормоналния статус на пациента;
4) изследване за туморни маркери;
5) изследване за наличие на автоимунни заболявания.

Предимства на метода ELISA:

1) Висока специфичност и чувствителност на метода ELISA (повече от 90%).
2) Възможността за определяне на заболяването и проследяване на динамиката на процеса, т.е. сравняване на броя на антителата в различни периоди от време.
3) Наличие на ELISA диагностика във всяка медицинска институция.

Относителен недостатък:

1) Откриване на имунния отговор (антитела), но не и на самия патоген.

Основни понятия

Преди да изясним същността на метода ELISA, нека накратко разберем някои понятия.
Антитела (или имуноглобулини - Ig) – специфични протеини, произведени от B -
лимфоцити (имунни клетки) в отговор на всеки инфекциозен патоген (вируси, бактерии, гъбички и др.), навлизащ в тялото. Има имуноглобулини А (IgA), имуноглобулини Е (IgE), имуноглобулини М (IgM), имуноглобулини G (IgG), имуноглобулини D (IgD). Те се различават помежду си по молекулна форма и тегло, полуживот, участие/неучастие в инфекциозни процеси и време на откриване от момента на заразяване. Ако вземем предвид молекулното тегло, тогава IgM има най-голямо тегло - това е пентамер (950 000 далтона) за разлика от други Ig (от 150 до 200 000 Da), поради което IgM просто не може да премине през плацентарната бариера. Следователно откриването на IgM при дете на 1 година винаги е признак за наличие на инфекция в плода. В кръвния серум по-голямата част от имуноглобулините е представена от IgG (75-85%), а най-ниската е IgE (0,003%). Само IgA, M, G участват пряко в инфекциозния процес е признак на алергични реакции и заболявания, а IgD може да се намери само в тъканта на лимфните възли и сливиците и играе роля в образуването на локален имунитет.

Антигени – високомолекулни вещества от органичен произход, по-специално патогени на инфекциозни и други заболявания, както и вещества от различни променени клетки, образувани по време на определено заболяване (автоимунни заболявания, онкология).

Имунен комплекс – комплекс антиген-антитяло, участващ в имунния процес.

На какво се основава методът ELISA?

Има няколко вида ELISA (директен, индиректен, блокиращ метод, конкурентен), но в практиката най-често се използва хетерогенният твърдофазов имуноанализ или ELISA (enzyme linked imunosorbent assay).

Основата на ензимния имуноанализ е имунната реакция на антиген и антитяло с образуването на имунен комплекс: антиген-антитяло, което води до промяна в ензимната активност на специфични белези на повърхността на антителата.

С прости думи този процес може да бъде разделен на няколко етапа:

1) На повърхността на ямките на таблетката на лекаря, провеждащ изследването, има пречистен антиген на определен патоген. Когато се добави биологичен материал (кръвен серум) от пациента, възниква специфична реакция между този антиген и желаното антитяло (имуноглобулин). Това съединение ще действа като „специален антиген“ в следващия етап.

2) На този етап възниква образуването на IC (имунни комплекси) - реакция между „специален антиген“ и конюгат (това е имуноглобулин, маркиран с ензима пероксидаза). Добавя се специален хромоген. Резултатът от тази ензимна реакция е образуването на оцветено вещество в гнездото на таблетката, чийто интензитет на цвета зависи от количеството имуноглобулини (антитела), съдържащи се в материала на пациента.

3) След това се оценява резултатът: фотометрия с помощта на многоканален спектрофотометър, сравнение на оптичната плътност на изследвания материал с оптичната плътност на контролните проби, математическа обработка на резултатите. Количеството антитела в пациента зависи пряко от височината на оптичната плътност на дадено гнездо.

Обикновено в практиката се използват 96-ямкови плаки.

При измерване на оптичната плътност (ОП) на тестваната течност се изчислява количеството (или концентрацията) на антителата в определена единица обем. След това резултатът се сравнява с контролна проба.

Трябва да запомните:За всяка тестова система са разработени индивидуални индикатори за записване на резултатите, показатели за нормалност и патология (т.е. „референтни стойности“). Това трябва да се има предвид при оценката на резултатите от всяко конкретно изследване. Неправилно е резултатите от една лаборатория да се интерпретират въз основа на „референтните стойности“ на друга лаборатория. Също така е неправилно да се сравняват резултатите от различни лаборатории помежду си.

При извършване на ELISA реакции концепцията за авидитет на антитела също е важна.
Авидност на антитела - това е силата на връзката между антитялото и антигена и количеството антиген, което е във връзка с имуноглобулини (антитела). Авидността е от голямо значение при оценката на очакваната продължителност на инфекцията, което е изключително важно при диагностицирането на първична инфекция при бременни жени.

Основата на теста за авидност на антитялото се състои от третиране на имунния комплекс (антиген-антитяло) с разтвор на урея за унищожаване на протеина. Връзките с висока авидност остават непокътнати, докато връзките с ниска авидност се разрушават. Резултатът е даден като индекс на авидитет, изразен като процент (%).

Какви заболявания се откриват чрез ELISA диагностика?

2. Маркери на автоимунни заболявания и показатели на човешкия имунитет(общ IgE, общ IgG, общ IgA, общ IgM, общ IgD, секреторен IgA, IgG 2, IgG4, CEC-циркулиращи имунни комплекси, IgA и IgG към глиадин и други)

3. Онкологични маркери(TNF - тумор некрозис фактор, CEA - карциноембрионален антиген, PSA - простатен специфичен антиген, hCG - човешки хорионгонадотропин, СА 125, алвеомуцин и много други)

4. Репродуктивни нарушения I (естрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, AFP-алфафетопротеин, FSH - фоликулостимулиращ хормон и други)

5. Заболявания на щитовидната жлеза(свободен и свързан Т3, Т4, тиреоглобулин, тиреоидна пероксидаза - TPO, тиреостимулиращ хормон - TSH).

Този списък не представя всички заболявания, които се диагностицират с помощта на ензимен имуноанализ.

Материал за ELISA анализ и правила за събирането му

Най-честият материал за реакцията ELISA е кръвният серум на пациента, взет на празен стомах. Материалът може да бъде също цереброспинална течност, амниотична течност, съдържание на стъкловидното тяло, слуз от цервикалния канал и уретрата, цитонамазки.

Подготовка на пациентите за предаване на материал за ELISA

Време за производство на ELISA

Ензимният имуноанализ на материала се извършва бързо, в рамките на 24 часа. Възможно е забавяне в различни лаборатории поради натрупване на определено количество серум.

Възможни резултати от ELISA диагностика

При оценката на резултатите за специфични инфекции класът на откритите антитела и тяхното количество са важни. Не само въпросът за етиологията на инфекцията (дали съществува или не), но и очакваният стадий на заболяването (остър, хроничен), както и наличието на активна инфекция (остра или екзацербация на хронична) при времето за преглед зависи от това.

Какъв е приблизителният срок за появата на антитела (имуноглобулини - Ig)?

Най-ранните антитела са IgM. Те могат да бъдат открити 1-3 седмици след евентуална инфекция, което характеризира острата фаза на инфекциозния процес. Втората ситуация за появата на IgM антитела е активирането (или обострянето) на хроничен процес. IgM антителата циркулират средно около 3 месеца, след което броят им постепенно изчезва. Въпреки това, при някои пациенти следи от IgM могат да бъдат открити в рамките на 1-2 години след инфекцията.

Съвременните тест системи са силно чувствителни, което води до неспецифични фалшиво положителни резултати (често при бременни жени). Ето защо при тази група пациенти трябва да се провери повторно положителните IgM!

IgA антителата се появяват 2-4 седмици след инфекцията, но в количества, достатъчни за откриване в рамките на един месец. Серумният IgA се синтезира от плазмените клетки на далака, лимфните възли и лигавиците. Секреторният IgA се концентрира върху лигавиците, за да изпълнява своята защитна функция - те участват в локалния имунитет.

От 4-та седмица след инфекцията започват да се появяват IgG антитела. При повечето инфекции техният титър постепенно се увеличава с максимум в различно време (средно след 1,5-2 месеца), след което титърът остава на ниско ниво и показва имунитет. При някои заболявания (микоплазмоза, хламидия, трихомониаза) нивото на IgG не е високо и намалява значително поради липсата на имунитет при тези инфекции.

Опции за откриване на антитела от различни класове:

Изолираното откриване на IgM антитела предполага наличието на първичен
инфекция.
- Едновременното откриване на IgM и IgG в кръвта е характерно за първичната инфекция
в предходните 2-3 месеца, както и при обостряне на хронично заболяване. Следователно по време на бременност наличието на IgM не винаги е признак на първична инфекция.
- Откриването на изолиран IgG може да показва имунитет към това заболяване,
както и при хронична инфекция. Във втората ситуация е важно както количеството антитела (титър), така и промяната в този титър във времето. Обикновено изследванията се провеждат на интервали от 2-4-6 седмици.
- Откриването на IgA изолиран или с IgM показва първична инфекция. При
Появата на IgA заедно с IgG предполага активиране на хронична инфекция (средно 2 седмици от момента на обостряне).

Определение Авидност на IgG антителае отличен допълнителен етап в диагностиката на първична инфекция от дългогодишна инфекция, която има своето клинично значение, на първо място, при оценка на риска от вътрематочна инфекция на плода. Откриването на нискоавиден IgG показва първична инфекция и се открива средно 4-6 месеца след заразяването, рядко по-дълго. IgG с нисък авидит изисква друго лабораторно потвърждение на първична инфекция (IgM). Антителата с висока авидност са признак или на хронично заболяване и неговото обостряне, или на формиран имунитет.

Характеристики при кърмачета:при деца до една година, а понякога дори на 1,5 години, майчиният IgG към различни инфекции циркулира в кръвта (т.е. те са проникнали през плацентата от майката на плода по време на вътрематочно развитие). Те сами по себе си не са признак за наличие на инфекция в настоящето. Ако IgM се открие на тази възраст (не забравяйте, че майчиният IgM не може да проникне през плацентата), това е признак на вътрематочна инфекция или инфекция, придобита след раждането.

Количествен ELISA метод

Резултатът от ELISA диагностика (използвайки ензимен имуноанализатор) се дава в определени мерни единици:
- Оптична плътност (ОП) на проба – концентрацията на специфични антитела в единица обем. Колкото по-висока е OD на пробата, толкова по-висока е концентрацията на антитела. Някои резултати се отнасят до коефициента на положителност (CP), който също е оптичната плътност на пробата.
- Единици за концентрация на антитела (нанограм/милилитър или ng/ml).
- Под формата на серумни титри: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и т.н. Диагностичните титри (при които се поставя диагнозата на заболяването, а не фактът на инфекцията) са различни за различните заболявания.
- Под формата на символи – “+”, “-”, “?” (+, ++, +++, ++++).
- Под формата на качествена оценка по зададен критерий (положителен или отрицателен).

Само лекарят може правилно да прецени броя на антителата, възможността за класово откриване на имуноглобулини и следователно да определи стадия на заболяването и необходимостта от лечение.

Не трябва да забравяме, че за всяка тестова система се разработват собствени „референтни стойности“ (варианти на нормата), при превишаване на които се диагностицира определено заболяване (варианти на патология). За различните тестови системи „референтните стойности“ са различни.

Правилното сравнение на резултатите от ELISA, направени във времето, е възможно само ако са произведени в една и съща лаборатория.

Лекар по инфекциозни заболявания Н.И

Представлявайки модерен тип лабораторно изследване, ELISA или ензимно-свързан имуносорбентен анализ ви позволява да намерите специфични антитела или антигени към определени заболявания в кръвта. Това дава възможност да се открие както етиологията на заболяването, така и да се определи неговият стадий. Освен това резултатите от този тип изследвания могат да бъдат представени както количествено, така и качествено. Така че, нека разгледаме подробно принципа на метода на ензимен имуноанализ, неговата методология и същност.

Какво е ензимен имуноанализ

Предписан за най-пълна цялостна оценка на здравето, ензимният имуноанализ ви позволява да оцените общото здравословно състояние и да оцените неговите защитни функции. Този лабораторен тест ви позволява да диагностицирате инфекциозни, автоимунни, хематологични патологии с помощта на кръвен тест.

Същността на ензимния имуноанализ е разгледана във видеото по-долу:

На кого се предписва?

Това изследване може да бъде предписано на тези пациенти, които са диагностицирани със следните заболявания:

заболявания с вирусен произход, които включват хепатит;
полово предавани болести - хламидия, трихомонада, сифилис, уреаплазма, микоплазма;
имунна недостатъчност;
провеждане на цялостен предоперативен преглед.

Също така се предписва кръвен тест ELISA, за да се определят нивата на хормоните и да се оцени качеството на вида на провежданата терапия.

Лекарят може да предпише този анализ, за да определи стадия на съществуващото заболяване, което позволява навременни корекции на използваното лечение. А високата точност на получените данни ви позволява да имате най-изчерпателната картина на здравето. В същото време данните се получават след изследването в много кратък период от време, което дава възможност да се следи динамиката на развитието на патологичния процес.

Защо да правите такива тестове?

Тъй като благодарение на кръвния анализ ELISA е възможно да се получи значително количество информация за здравословното състояние и патологичните процеси, протичащи в тялото, това дава възможност най-пълно да се вземат предвид първоначалните данни (общо здравословно състояние, етап на заболяване, динамика на развитието на патологичния процес, показател за ефективността на използваната терапия) при съставяне на схеми на лечение.

Поради тази причина, за да се получи най-изразен резултат от лечението и най-бързото спиране на патологичния процес в тялото, се предписва кръвен тест ELISA. Въз основа на получените данни сериозните заболявания на имунната система, наличието на антигени в кръвта и причините за алергии могат да бъдат излекувани по-бързо, като се използват най-ефективните методи.

Назначаването на ELISA анализ се извършва за различни патологии и трябва да се извършва само според предписанието на лекар. Честотата на анализа също се определя от лекаря, а когато се дарява кръв за анализ ELISA, картината на заболяването е най-пълна. Тъй като получаването на динамиката на хода на заболяването е възможно чрез вземане на този тест повече от веднъж, най-често кръводаряването може да се предписва три до пет пъти. Това дава възможност да се сравнява количеството антитела в кръвта в различни периоди от време.

Видове такава процедура

Има няколко вида ензимни имуноанализа. Те се различават по вида на течността, взета от човешкото тяло, въз основа на която се изследва нейният състав и наличието на определени антигени.

В този случай не само кръвта на човек, но и другите му течности могат да бъдат взети за анализ:

амниотична течност,
гръбначно-мозъчна течност,
стъкловидно съдържание,
инсулти,
слуз от уретрата и цервикалния канал.

Самата операция за приемане на определен вид течност е стандартна и се извършва в дневен стационар.

Показания за изследване

Обикновено ELISA тестът се предписва от лекар, ако е необходимо да се получи подробна картина на текущото заболяване, което се проявява под всякаква форма: хронична, мудна или остра. И следните състояния и цели на лечението могат да се считат за индикации за този вид анализ:

търсене на антигени на определени заболявания;
определяне на хормоналния статус;
откриване на вирусен хепатит в тялото;
изследване на ;
търсене на антитела срещу всякакъв вид инфекциозни заболявания;
изследване за наличие на автоимунни лезии на тялото.

За информация относно ензимния имуноанализ вижте видеоклипа по-долу:

Противопоказания за

Към днешна дата не са установени противопоказания за ензимен имуноанализ.

По време на бременност, когато има постоянна промяна в нивата на хормоните в кръвта, е необходимо този анализ да се извършва многократно, за да се потвърди полученият резултат. Новородените и кърмачетата също могат да имат неправилни данни от теста: по време на развитието на плода някои видове антитела могат да навлязат в кръвта на плода през плацентата на майката. Следователно тяхното присъствие в анализа не трябва да се счита за признак на съществуваща инфекция.

Тествайте безопасността

Провеждането на процедурата за вземане на всякакъв вид течност от човешкото тяло не носи никакви отрицателни ефекти върху тялото. Пълната стерилност по време на манипулациите избягва риска от заразяване с всякакъв вид заболявания.

Подготовка за събитието

За да получите най-надеждните резултати от изследването, трябва да се въздържате от пиене на алкохолни напитки и наркотици, преди да вземете кръв (или друга течност) за анализ.

Как протича процедурата и какво чувствате по време на нея

За провеждане на тест ELISA кръвта на пациента се взема строго на празен стомах: не трябва да ядете никаква форма на храна поне часове преди процедурата. Анализът се взема от лакътната вена.

Наличието на някакви заболявания и взетите лекарства се съобщават на лекаря най-често, лекарствата се преустановяват по време на кръводаряването. Усещанията по време на процедурата са подобни на вземането на кръв за биохимичен анализ.

Декодиране на резултатите

ELISA диагностиката ви позволява да определите наличието на инфекция в тялото, активността на патологичния процес и етиологията на съществуващата инфекция. Бързото получаване на резултатите от анализа (в рамките на 24 часа) е едно от предимствата на този вид изследване.

Процесът на дешифриране на получената информация се извършва от лекаря. Трябва да се има предвид, че правилността на получените резултати за динамиката на всякакви процеси е гарантирана, когато тестовете се извършват в една лаборатория.

Средна цена на процедурата

Средната цена на ELISA тест зависи от фокуса на анализа и определянето на конкретни стойности. По този начин определянето на серологични маркери на инфекциозни заболявания от различни видове (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) ще струва от 200 до 320 рубли и се извършва в рамките на 2 работни дни. Цената на тази процедура също се счита за нейното предимство: достъпността на цените за всякакъв вид изследване ви позволява да провеждате изследвания при всякакъв размер на бюджета.

Цената на ELISA тест зависи от политиката на лечебното заведение, но трябва да се счита за общодостъпна процедура, която ви позволява да получите подробна картина на съществуващото заболяване и да осигурите най-пълното лечение.

За нормите и характеристиките на изследването ELISA вижте видеоклипа по-долу:

Как се провежда изследването ELISA?

Механизъм на реакцията

Ензимно-свързаният имуносорбентен анализ се основава на имунната реакция на антиген с антитяло и прикрепването на ензимен маркер към антителата позволява резултатът от реакцията антиген-антитяло да бъде взет предвид чрез появата на ензимна активност или чрез промяна в нейното ниво В опростен вид механизмът на реакцията може да бъде представен по следния начин:

	Първата реакция възниква между открития Ig (Ab) и пречистения патогенен антиген (Ag), фиксиран към повърхността на ямките на имунологичната таблетка
	За идентифициране на образуваните имунни комплекси се провежда втора имунологична реакция, при която свързаният специфичен Ig действа като антиген, а конюгат, представляващ Ig (Ab), към съответния човешки Ig, белязан с ензима -пероксидаза (К) , се използва като антитела срещу него.
	След това протича ензимна реакция, катализирана от ензимната част на конюгатната молекула. Субстратът за тази реакция е безцветно вещество - хромоген, който по време на реакцията образува оцветено вещество. Интензитетът на цвета в ямката зависи по определен начин от количеството имуноглобулини, съдържащи се в пробата.

Изчисляване на резултатите

Провеждане на имуноензимен анализ

За серодиагностика се използват 96-ямкови полистиренови плаки, върху стените на клетките на които антигенът е предварително адсорбиран. Тестовият серум се добавя към клетката на таблетката. В този случай към него се прикрепват антитела, хомоложни на антигена. Неприкрепените антитела се отстраняват чрез промиване. След това към клетките се добавят антитела срещу човешки имуноглобулини (антитела), белязани с ензим. Ако в тестовия серум присъстват откриваеми антитела, тогава на този етап те ще действат като антигени, с които белязаните антитела ще реагират. Добавянето на хромогенно вещество (багрило) след измиване ще ни позволи да вземем предвид реакцията на развиващия се цвят в клетките. Интензитетът на цвета е пропорционален на количеството на ензима и следователно на количеството на антителата. При измерване на оптичната плътност (ОП) на течност в клетка и сравняването й с контролна проба, концентрацията на антитела се изчислява в единици. Най-често се използва за изчисляване на резултатите в единици за оптична плътност. Трябва да се има предвид, че всяка тестова система има свои собствени показатели за запис на резултатите и показатели за нормалност и патология, от които трябва да се ръководи при тълкуването на. резултати.

Какви инфекции могат да бъдат открити чрез ELISA?

Основно в съвременната венерология се използва за диагностика на сифилис (в комбинация с други реакции), ХИВ инфекция, има ограничено значение за диагностика на хламидиална инфекция, цитомегаловирусна инфекция и други херпесни инфекции за определяне на антитела при различни инфекциозни заболявания, нива на хормони, автоантитела и различни маркери за рак.

Как да тълкуваме резултатите от ELISA

Изследването на наличието и нивото на антитела от различни класове в някои случаи помага да се определят етапите на инфекциозния процес

Стадий на заболяването	IgM	IgA	IgG
Първична фаза (2 седмици от заразяването)
Първична фаза (2,5 - 3 седмици от инфекцията)
Първична фаза (3-4 седмици от заразяването)
Обостряне на хроничната фаза (2 седмици от началото на обострянето)
Хронична фаза
Минала (излекувана инфекция)
Възстановяване		титърът намалява 2-4 пъти след успешно лечение	титърът намалява с 4-8 пъти 1-1,5 месеца след успешно лечение
Отрицателен резултат

За съжаление такова важно предимство на ELISA като количественото определяне на антитела не е от голямо значение в практическата работа - т.е. не позволява точна диагноза и не влияе на дозировката и времето на приема на лекарствата.

Каква е ролята на метода ELISA в диагностиката на сифилис?

Методът ELISA при диагностицирането на сифилис е използван за първи път през 1975 г. В момента той се използва широко за серологична диагностика на сифилис в Русия и се използва като потвърждаващ тест за сифилис. Обикновено се провежда изследване, което идентифицира т.нар общите антитела срещу антигените на Treponema pallidum (IgM и IgG), въпреки че в някои случаи е възможно да се определят само „ранни“ антитела от клас М за сифилис, стават положителни след 3 седмици от момента на инфекцията и остават положителни за доста дълго време дори след лечение (понякога за цял живот), като тест, потвърждаващ излекуването на сифилис, не се използва ELISA. В повечето случаи се извършва само качествено определяне на ELISA - т.е. само положителен или отрицателен резултат, въпреки че е възможно и количествено определяне.

Самойликов Павел Владимирович стажант в катедрата по клинична лабораторна диагностика

Руски държавен медицински университет

Методите за имуноанализ се използват широко в медицинската практика. Във всички области на съвременната медицина имуноанализите се използват предимно за диагностични и аналитични цели. Особено важно е, че те дават възможност за идентифициране на биологични компоненти (хормони, ензими, невропептиди, продукти на имунната система, антигени и др.) в ниски и много ниски концентрации. Всички продукти, срещу които могат да се получат антитела, се откриват с тези методи.

Имуноанализът се основава на взаимодействието на антиген (AG) и антитяло (AT), като се използват различни възможности за маркиране на един от компонентите (ензим, радионуклид, флуоресцентно багрило и др.). Реакцията се оценява автоматично с помощта на специално оборудване, което прави възможно стандартизирането на тези методи.

В зависимост от вида на използвания етикет и условията на изследване, имуноанализът се обозначава като ензимен имуноанализ (ELISA), радиоимуноанализ (RIA), имунофлуоресцентен и др. Когато реакциите се организират в един или повече етапи, те се означават като директни или косвени. Средата, в която протича реакцията, има значение. Ако реакцията се провежда с реагенти, фиксирани на повърхността, тогава тестът се обозначава като твърдофазен, например ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ).

В тази работа ще бъде разгледан само ензимен имуноанализ - метод, широко използван в биологията и медицината, както практически, така и фундаментален.

ELISA се появява в средата на 60-те години и първоначално е разработен като метод за идентифициране на антиген в хистологична проба, както и за визуализиране на преципитационни линии при тестове за имунодифузия и имуноелектрофореза, а след това започва да се използва за количествено определяне на антигени и антитела в биологични течности. В разработването на метода участват E. Engvall и R. Pählman, както и независимо W. Van Weeman и R. Schurs.

Фигура 1. Основен принцип на ELISA.

1) За идентифициране на антигени. 2) За откриване на антитела.

Методът се основава на специфичното свързване на антитяло с антиген, като един от компонентите се конюгира с ензим, в резултат на реакцията със съответния хромогенен субстрат се образува оцветен продукт, чието количество може да се определи; спектрофотометрично (фиг. 1).

Откриването на възможността за имобилизиране на антиген и антитяло върху различни носители при запазване на тяхната свързваща активност направи възможно разширяването на използването на ELISA в различни области на биологията и медицината.

Появата на моноклонални антитела допринесе за по-нататъшното развитие на ELISA, което направи възможно повишаването на неговата чувствителност, специфичност и възпроизводимост на резултатите.

Теоретично ELISA се основава на данни от съвременната имунохимия и химична ензимология, познаване на физикохимичните закономерности на реакцията антиген-антитяло, както и на основните принципи на аналитичната химия. Чувствителността на ELISA и времето, което отнема, се определят от няколко основни фактора: кинетичните и термодинамичните характеристики на реакцията антиген-антитяло, съотношението на реагентите, активността на ензима и разделителната способност на методите му за откриване. Като цяло реакцията антиген-антитяло може да се опише с проста схема:

+[AG]↔[ATAG]

Разнообразието от обекти на изследване от нискомолекулни съединения до вируси и бактерии, както и необичайно широк спектър от задачи, свързани с разнообразието от условия за използване на ELISA, определят развитието на изключително голям брой варианти на този метод.

Всяка версия на ELISA съдържа 3 задължителни етапа:

1. етапът на разпознаване на тестваното съединение от антитяло, специфично за него, което води до образуването на имунен комплекс;

2. етапът на образуване на връзката на конюгата с имунния комплекс или със свободни места на свързване;

3. етап на преобразуване на ензимния етикет в записан сигнал.

Класификацията на методите ELISA се основава на няколко подхода:

1. Въз основа на вида на реагентите, налични в първия етап на ELISA, се разграничават конкурентни и неконкурентни методи.

А) При конкурентен ELISA на първия етап системата съдържа както анализираното съединение, така и неговия аналог, белязан с ензим и конкуриращ се за специфични места на свързване с него.

Б) Неконкурентните методи се характеризират с наличието в системата на първия етап само на анализираното съединение и специфични за него центрове за свързване.

2. Всички ELISA методи са разделени на хомогенни и хетерогенни.

Ако и трите етапа на ELISA протичат в разтвор и между основните етапи няма допълнителни стъпки за разделяне на образуваните имунни комплекси от нереагиралите компоненти, методът принадлежи към хомогенната група.

Основата на хомогенния ELISA, използван като правило за определяне на нискомолекулни вещества, е инхибирането на активността на ензима, когато се комбинира с антиген или антитяло. Ензимната активност се възстановява в резултат на реакцията антиген-антитяло.

Когато едно антитяло се свърже с антиген, съдържащ ензимен маркер, ензимната активност се инхибира с 95% по отношение на субстрата с високо молекулно тегло, което се дължи на пространственото изключване на субстрата от активния център на ензима. Тъй като концентрацията на антигена се увеличава, повече антитела се свързват и остават повече свободни антиген-ензимни конюгати, способни да хидролизират субстрата с високо молекулно тегло. Анализът се извършва много бързо, едно определяне изисква 1 минута. Чувствителността на метода е доста висока. Може да се използва за определяне на вещество на ниво пикомол.

Хетерогенните методи се характеризират с анализ в двуфазна система с участието на твърда носеща фаза и задължителен етап на отделяне на имунните комплекси от нереагиралите компоненти (промиване), които са в различни фази (формираните имунни комплекси са на твърда фаза, а нереагиралите комплекси са в разтвор) . Хетерогенните методи, при които образуването на имунни комплекси на първия етап се извършва в твърдата фаза, се наричат твърдофазни методи.

Методите се класифицират като хомогенни-хетерогенни, ако етап 1 - образуването на специфични комплекси става в разтвор и след това се използва твърда фаза с имобилизиран реагент за разделяне на компонентите.

3. Според принципа на определяне на тестваното вещество:

А) Директно определяне на концентрацията на вещество (антиген или антитяло) чрез броя на свързващите места, взаимодействащи с него. В този случай ензимният етикет ще се намира в образувания специфичен AG-AT комплекс. Концентрацията на аналита ще бъде право пропорционална на записания сигнал.

B) Определяне на концентрацията на вещество чрез разликата в общия брой на свързващите места и останалите свободни свързващи места. В този случай концентрацията на аналита ще се увеличи, а записаният сигнал ще намалее; следователно в този случай има обратна връзка с величината на записания сигнал.

Ензими.

Ензимните маркери имат изключително мощен каталитичен ефект; една ензимна молекула може да реагира с голям брой субстратни молекули. По този начин ензимът, присъстващ в малки количества, може да бъде идентифициран и количествено определен чрез образуването на продукти и реакцията, която катализира. Друго предимство на използването на ензими като етикети се дължи на наличието в молекулата на множество функционални групи (сулфхидрилни, карбоксилни, тиразинови остатъци и др.), Чрез които молекулите на лигандите могат да бъдат ковалентно свързани.

Ензимните маркери, използвани в ELISA, трябва да имат следните свойства:

– висока активност и стабилност на ензима при аналитични условия, когато е модифициран и в конюгат с антитела или други протеини;

– наличието на чувствителни субстрати и простотата на метода за определяне на продуктите или субстратите на ензимната реакция;

– способността за адаптиране на субстратните системи към по-нататъшно укрепване;

– липса на ензима и неговите инхибитори в изследваната биологична течност.

Най-малко 15 различни ензима могат да се използват в ELISA. Най-широко използваните, в съответствие с горните изисквания, са пероксидазата от хрян (HRP), алкалната фосфатаза (ALP) и β-D-галактозидазата (Таблица 1). И трите са стабилни и катализират силно чувствителни реакции. В допълнение, продуктите, получени в резултат на реакциите, катализирани от тези ензими, в зависимост от използвания субстрат, могат да бъдат открити не само чрез колориметрични методи, но и чрез флуоресцентни методи. Други ензими се използват много по-рядко. Това се обяснява с по-ниската им специфична активност в сравнение с ПК и АП.

Субстрати.

Изборът на субстрат се определя основно от ензима, използван като етикет, тъй като реакцията ензим-субстрат е силно специфична.

Основни изисквания към основата:

– осигуряване на висока чувствителност на метода при откриване на ензима в конюгата;

– образуване на добре разпознаваеми (например оцветени) продукти на реакцията ензим-субстрат;

– субстратът трябва да е безопасен, евтин, достъпен и удобен за използване.

Маса 1.

Ензимите и техните субстрати са най-широко използвани в ELISA.

По-често се използват хромогенни субстрати, които, когато се разрушат, образуват цветно вещество. Обещаващо е използването на високоенергийни субстрати - флуоресцентни, хемилуминесцентни. Използването на такива субстрати позволява теоретично да се увеличи чувствителността на ELISA с два порядъка.

Антигени и антитела.

AG и AT, използвани в ELISA, трябва да бъдат високо пречистени и силно активни. Освен това антигените трябва да имат висока антигенност, оптимална плътност и брой антигенни детерминанти, чуждост и хомогенност. Много синтетични и рекомбинантни антигени на вируси и бактерии са се доказали добре, когато се използват в ELISA. Това значително повишава специфичността и възпроизводимостта на метода чрез минимизиране на кръстосаните реакции.

Едни от най-важните реагенти в ELISA са антителата. Чувствителността на ELISA зависи от концентрацията, активността и специфичността на използваните антитела. Използваните антитела могат да бъдат поли- или моноклонални, от различни класове (IgG или IgM) и подкласове (IgGl, IgG2), антиалотипни или антиидиотипни. При нисък афинитет към АТ, разрушаването на комплекса AG-AT води до отстраняване на свързания AG от системата. Чувствителността и специфичността на метода се увеличава при използване на моноклонални антитела. В този случай става възможно да се открият ниски концентрации на AG (AT) в тестовите проби.

Образуване на конюгат

Конюгатът е антиген или антитяло, белязано с ензимен маркер. Образуването на конюгат е един от важните етапи на ELISA.

При образуването на конюгат се избира оптималният метод за въвеждане на ензимен етикет, така че и двата компонента на конюгата да запазят своята биологична активност: ензимът - способността да взаимодейства със субстрата и антигенът или антитялото - антигенност и антиген-свързваща активност , съответно. Наличието на белязан, високо пречистен антиген позволява използването на конкурентни методи. В този случай на последния етап е възможно да се измери активността на конюгата, който не е свързан с имобилизирани антитела, което избягва процедурата на измиване и прави анализа по-удобен. Въпреки това, антигените са различни по своите физикохимични свойства и структура, което означава, че е невъзможно да се разработят универсални методи за получаване на конюгат с антиген. В този случай получаването на конюгат антиген-ензим е отделна сложна задача. Приготвянето на белязани антитела за ELISA е методично по-достъпно.

Конюгацията на ензима с имунохимично активни протеини се осъществява чрез различни методи: химическо кръстосано свързване, ковалентно свързване на ензимната молекула с Ag или AT и образуване на съединения чрез нековалентни връзки, например, когато връзката между ензима и Ag или AT се осъществява имунологично чрез взаимодействие антиген-антитяло.

Най-широко използвани са ковалентните методи за получаване на конюгати. Изборът на реакция на свързване се определя от вида на наличните функционални групи в дадените протеинови молекули. Глутаралдехид, натриев периодат и др. се използват като реагенти, използвани за въвеждане на ензима в молекулите на антигена и антитялото.

Съществуват едноетапни и двуетапни методи за получаване на конюгати с помощта на глутаралдехид. Могат да се образуват конюгати с различни размери с намалена ензимна активност (15 - 60% от свободния ензим). Полученият конюгат с голям размер може пространствено да попречи на определянето на тестваното вещество. Конюгатите с относително ниско молекулно тегло се състоят от Fab фрагмент и една ензимна молекула.

В резултат на двуетапен синтез, който се състои от поетапно производство на ензим, първо модифициран с омрежващ агент, неговото изолиране и след това последващото му взаимодействие с антиген (антитяло), молекулите на се образува хомогенен състав, съдържащ 1-2 ензимни молекули на имуноглобулинова молекула и поддържащ висока ензимна и имунологична активност. Въпреки това, броят на образуваните такива конюгати е малък (за пероксидазата от хрян е 5–10%).

Най-голямо практическо приложение е намерено в метода за получаване на имунопероксидазни конюгати, базиран на окисляването на въглехидратния компонент на ензима с натриев периодат (свързването на пероксидазата в конюгата достига 70-90% от първоначалното количество ензим).

Надеждният конюгат трябва да има следните свойства:

Висока сила на антитялото и висок афинитет към антигена, така че да може да се използва във високо разреждане и по този начин да се намали неспецифичното свързване;

Достатъчна специфичност при работното разреждане;

Преобладаването на мономерните форми над полимерните, т.к полимерните форми са склонни да се придържат неспецифично към пластмасата, което води до високо фоново ниво на реакция;

Оптималното моларно съотношение между ензим и антитела (оптималното съотношение е около 1:1);

Достатъчна ензимна активност на конюгата. Това свойство се определя главно от условията на конюгация и съотношението на ензимните молекули и антителата в конюгата.

Твърда фаза

Като твърда фаза за ELISA могат да се използват различни материали: полистирен, поливинилхлорид, полипропилен и други вещества. Твърдата фаза може да бъде стените на епруветка, 96-ямкови и други плаки, топки, перли, както и нитроцелулоза и други мембрани, които активно абсорбират протеини.

Имобилизирането на антиген или антитела върху твърдата фаза е възможно по три начина:

– пасивна адсорбция, основана на силни хидрофобни взаимодействия между протеините и синтетичната повърхност;

– ковалентно свързване към твърдата фаза;

– имунохимични и др. (нековалентно и неадсорбционно присъединяване).

Пасивната протеинова адсорбция се използва широко при извършване на ELISA върху титрационни плаки и нитроцелулозни мембрани. Пасивната адсорбция следва принципа на насищане и корелира с молекулното тегло на адсорбираното вещество. Адсорбционната повърхност на мембраните от различни видове (нитроцелулоза, найлон и др.) е 100-1000 пъти по-висока от тази на пластмасата.

Полизахаридите и силно гликозилираните протеини често имат нисък афинитет към полистирола. Необходими са други методи за обездвижването им, като ковалентно прикрепване с помощта на глутаралдехид. Ковалентното прикрепване е ефективно, когато като твърда фаза се използват хидрофилни зърна (агароза) и полистиролови зърна.

Имунохимичните методи се основават на използването на предварително адсорбирани антитела „капан“ за обездвижване на антигена или антителата. Имунохимично имобилизиран антиген е 10 пъти по-активен от пасивно адсорбиран антиген. Могат да се използват лектини или имуноглобулин-свързващи протеини от бактерии, които лесно се адсорбират върху пластмасови или други хидрофобни повърхности, като конканавалин A (Con A) или стафилококов протеин A. Con A е в състояние да имобилизира gp 120, протеин на HIV вируса.

Свободните места на повърхността на твърдата фаза, които не са свързани със сорбирания агент, могат да фиксират други молекули, включително конюгати, по време на теста, което води до увеличаване на фоновия сигнал. За да се предотврати неспецифичното свързване, след обездвижване твърдата фаза на основния материал се третира с вещества, които са неутрални за теста. Най-популярните блокиращи агенти са говежди серумен албумин (BSA), казеин и др. Изборът на блокиращ агент и условията за този етап зависят от вида на твърдата фаза и чувствителността на системата.

В момента се използват огромен брой различни разновидности и модификации на ELISA. Широко разпространени са различни варианти на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Твърдофазовият ELISA е предложен през 1971 г. Основните принципи на твърдофазния ELISA, независимо от модификацията, са следните:

1. В етап 1 на реакцията антигените или антителата се адсорбират върху твърдата фаза. В този случай реагентите, които не са свързани с твърдата фаза, лесно се отстраняват чрез измиване.

2. Тестовата проба се инкубира в сенсибилизираните ямки. Ямките на положителната контрола съдържат стандартни реагенти. В този случай на повърхността на твърдата фаза се образуват имунни комплекси. Несвързаните компоненти се отстраняват чрез измиване.

3. Когато се добави конюгат антитяло-ензим или антиген-ензим и се свърже с имобилизирания имунен комплекс, активното място на ензима остава достъпно за последващо взаимодействие със субстрата. Инкубирането на субстрата в ямки с имобилизирания конюгат води до развитие на цветна реакция. Тази реакция може да бъде спряна на желания етап, тежестта на оцветяването може да се оцени визуално или чрез оптична плътност.

Важен етап от всеки вариант на твърдофазов анализ е процедурата за измиване от несвързани реагенти. Важно е не само да се изплакнат компонентите, фиксирани в твърдата фаза, но и да се отстранят реагентите от цялата дълбочина на слоя. Това са най-отнемащите време и трудоемки етапи на анализ. Пробите могат да се измиват автоматично с помощта на специално устройство - шайба или ръчно с помощта на многоканална пипета. За да извършите ELISA, трябва:

– полистиролова таблетка или други използвани варианти на твърда фаза;

– измиващ разтвор;

– конюгат (ензимно маркирани антигени или антитела);

– смес от използвани субстрати;

– спиращ разтвор (Стоп реагент – разтвор за спиране на реакцията);

– проби, използвани за положителна и/или отрицателна контрола;

– стандартен антиген (за построяване на калибровъчна крива);

– едноканални и многоканални пипети;

– шайба (шайба);

– оптично устройство за определяне на оптичната плътност на тестовия разтвор (ELISA четец, четец, който последователно фотометрира всички ямки);

– 5-100 µl от изследвания биологичен материал.

Директен ELISA

1. Антигени или антитела (тестов материал) се адсорбират в ямките на панелите. Беше отбелязано по-горе, че антигените се различават значително по способността си да се адсорбират върху различни видове пластмаса, в зависимост от това към кой клас вещества (протеини, въглехидрати или липопротеини) принадлежат. Често при директен ELISA антигенът, имобилизиран върху твърдата фаза, е клетки и други корпускулни антигени.

контрол. Като контрола се използват ямки с адсорбирана положителна контролна проба, която задължително съдържа желания антиген, и отрицателна контролна проба, която очевидно не съдържа изследвания антиген. Ако е наличен пречистен стандартен антиген, реакцията се провежда в няколко разреждания, така че да може да се построи калибровъчна крива.

2. „Блокирайте свободните места на свързване, оставащи върху твърдата фаза, като използвате BSA казеин и други (за предотвратяване на неспецифична сорбция на конюгата върху твърдата фаза).

3. Ензимно белязани антитела или антигени (конюгат) се добавят към ямките и се инкубират. Свързването на конюгата към твърдата фаза ще се случи само ако и двата компонента на системата са комплементарни. След инкубиране с конюгата, ямките се промиват, като по този начин се отстранява несвързаната част от конюгата.

4. След това към ямките се добавя субстрат, специфичен за използвания ензим, и се инкубира. След като се постигне оптималното ниво на оцветяване в ямките на положителната контрола, ензимната реакция се спира.

5. Отчитане на реакцията. Първо, резултатите от реакцията се вземат предвид визуално. За по-точно записване на резултатите, интензитетът на оцветяване се оценява с помощта на ELISA четец с подходящ светлинен филтър. Въз основа на резултатите от анализа се построява графика на зависимостта на оптичната плътност от концентрацията (фиг. 2).

Фигура 2. Директен ELISA.

а) за идентифициране на антиген; б) за откриване на антитела.

Тази версия на ELISA обикновено се използва за откриване на специфични антитела. Стандартен антиген се адсорбира в ямките на панелите и се инкубира с проби от серум или друг биологичен материал, получен от пациента (цереброспинална течност, слюнка и др.). Специфични антитела, свързани с антигена в твърдата фаза, се откриват с помощта на антиглобулинов конюгат. В зависимост от целта на анализа се използват различни антиглобулинови реагенти, откриващи антитела от всички изотипове или специфични за отделните класове и подкласове имуноглобулини. Основното предимство на метода е универсалността на конюгата. Същият конюгат може да се използва за откриване на човешки антитела срещу голямо разнообразие от антигени във всяка проба. Реакцията е методологически проста.

Основните етапи на индиректния ELISA за определяне на антитела:

1. Антигенът се адсорбира върху твърдата фаза, след което се промива, за да се отстранят несвързаните компоненти.

2. Блокирайте сайтове за безплатно обвързване. Измит.

3. Тестовият материал се добавя към ямките, инкубира се и след това се извършва процедурата по промиване. Успоредно с това се поставят проби с положителни и отрицателни контроли.

4. Добавете антиглобулинов конюгат в работно разреждане, инкубирайте и отмийте несвързаните компоненти.

5. Добавя се субстрат и се инкубира. След като се постигне оптималното ниво на оцветяване в ямките на положителната контрола, реакцията се спира чрез добавяне на стоп разтвор.

6. Измерете количеството на реакционния продукт с помощта на ELISA четец (фиг. 3).

При оптимални условия за анализ, методът е много специфичен и чувствителен. Това прави възможно откриването на нанограмови количества антитела в серума на изследваните пациенти. За получаване на задоволителни резултати е необходима стандартизация на реактивите и методологичните техники. Тази версия на ELISA може да се използва и за тестване на моноклонални антитела.

Антигените, открити с помощта на този вариант на ELISA, трябва да имат множество епитопи, способни да свързват антитела, или да имат повтарящи се, пространствено разделени епитопи с една и съща специфичност.

При извършване на тази версия на ELISA, високо специфични поли- или моноклонални антитела, адсорбирани върху твърдата фаза, се инкубират с тестовата проба. След процедурата на промиване към ямките се добавят маркирани с ензим антитела (конюгат) към същия антиген и след това се провеждат всички останали етапи на реакцията. Ефективността на образуване на специфичен комплекс на всеки етап от анализа зависи от константата на свързване на реакцията антиген-антитяло.

Основни етапи на анализа:

1. Моноклонални антитела или афинитетно пречистени поликлонални антитела се имобилизират върху твърдата фаза.

2. Тестовата проба се добавя към ямките на панелите и паралелно се поставят положителна контролна проба и отрицателна контролна проба в различни разреждания. Инкубирайте и измийте.

3. Към ямките се добавят белязани с ензим моноклонални или поликлонални антитела – конюгат. След инкубацията се извършва промиване.

4. Добавя се субстрат и се инкубира. Реакцията се спира, когато се постигне оптимално оцветяване в ямките на положителната контрола.

5. Записване на резултатите на ELISA четец.

Основното предимство на метода е неговата висока чувствителност, която надхвърля възможностите на другите ELISA схеми (фиг. 4).

Фигура 3. Индиректен ELISA за откриване на антитела.

Този анализ се основава на конкуренцията на белязани (конюгирани) и небелязани (тест) антитела за свързване с антиген, адсорбиран върху твърдата фаза. Количеството ензим, прикрепен към твърдата фаза, ще намалее пропорционално на съдържанието на свободни антитела в сместа. За определяне на антиген се използва същата опция, но в този случай желаният антиген се конкурира с белязан стандартен антиген за свързване с антитела, имобилизирани на повърхността на твърдата фаза.

Състезателният метод изисква минимален брой операции, ниска консумация на реагенти и може лесно да се автоматизира. Когато се извършва конкурентен ELISA за откриване на антитела, по-добре е да се използват белязани моноклонални антитела, тогава конюгатът се конкурира с тестовата проба за единичен епитоп на антигена, адсорбиран върху твърдата фаза. Тази версия на ELISA се използва за определяне на различни съединения, като човешки имуноглобулини, карциноембрионален антиген, инсулин и др. Тя позволява откриването на антитела към диагностично значими епитопи на инфекциозни агенти.

Основните етапи на анализа за идентифициране на антигена (фиг. 5):

1. Моноклоналните антитела, специфични за откривания антиген, се имобилизират върху твърдата фаза.

2. Антиген, белязан с ензим, и тестовата проба се добавят към ямките на панелите в известна концентрация. Провеждат се инкубация и промиване. Успоредно с това положителните и отрицателните контроли се поставят в съседни ямки. За конструиране на калибриране се използва стандартен небелязан антиген в различни разреждания.

3. Добавете субстрат, инкубирайте, спрете реакцията, когато се развие оптимално оцветяване в ямките на положителната контрола.

4. Отчитане на реакцията на ELISA четеца.

В този случай количеството антиген в тестовата проба е обратно пропорционално на ензимната активност върху твърдата фаза.

В тази версия на ELISA, антигенът, присъстващ в тестовата проба, се свързва с маркирани с ензим моноклонални антитела и инхибира тяхното взаимодействие със стандартния антиген, имобилизиран върху твърдата фаза. Наличието дори на следи от конюгат-специфичен антиген в проба ще инхибира свързването на белязани антитела към имобилизирания антиген. Степента на инхибиране е право пропорционална на съдържанието на антиген в разтвора. За количествен анализ се конструира калибровъчна крива, като се използват серийни разреждания на стандартния антиген. Основните етапи на инхибиторния ELISA за откриване на антиген (фиг. 6).

1. Стандартният антиген се адсорбира в ямките на панелите. Работното разреждане на белязаните антитела се избира чрез титруване.

Фигура 4. „Сандвич“ версия на ELISA.

2. Предварителната инкубация на конюгата се извършва в разреждане, предхождащо работното, с разреждания на тестовата проба, стандартен антиген и положителни контролни проби.

3. Сместа се прехвърля в ямките на панелите. За да се контролира 100% свързване, само белязани антитела се добавят към няколко ямки, без инхибиторния антиген. Панелите се инкубират и след това се измиват.

4. Добавете субстрат.

5. Запишете резултатите.

Концентрацията на антигена, който се определя в тестовата проба, е обратно пропорционална на ензимната активност върху твърдата фаза.

ELISA може да се използва не само за определяне на разтворим антиген или антитяло, но и на клетки, които произвеждат различни протеини.

През 1983 г. технологията ELISA беше адаптирана за откриване на лимфоидни клетки, секретиращи антитела или антигени (напр. цитокини) in vitro. Методът се нарича ELISPOT (enzyme-linked immunospot spot method). Основният принцип на метода:

1. На повърхността на полистиролова ямка (използват се панели с 24 ямки за клетъчна култура) се сорбират антигени или антитела, които служат като реагенти „капан“.

2. Изследваните лимфоидни клетки се добавят и култивират няколко часа при 37°C, като им се дава възможност да заемат определено място и да изпълняват секреторна функция. Антитела или антигени, секретирани от такива клетки, се улавят от реагенти, адсорбирани върху твърдата фаза.

3. Клетките се отстраняват с помощта на измиващ разтвор с детергент, който лизира клетките.

4. Зоните на натрупване на секреторни продукти се разкриват чрез добавяне на ензимно свързани антитела (антиглобулинов реагент).

5. Добавя се смес от субстрат и агароза (използваните субстрати трябва да се разтворят в агароза и да образуват неразтворими реакционни продукти), на повърхността на твърдата фаза се образуват кафяви или сини петна (в зависимост от използваните ензими и субстрати), разкриващи области, където клетките бяха разположени.

Получените петна се преброяват под микроскоп, това ще бъде броят на секретиращите клетки.

Нитроцелулозната мембрана може да се използва като твърда фаза. В този случай има редица предимства: поради високия адсорбционен капацитет на NCM, е необходимо значително по-малко количество антиген, използван като „капан“ реагент , не е необходимо да се включва агароза в субстрата.

Чрез едновременно определяне на броя на секретиращите клетки и общото количество секретиран антиген или антитяло в ямката, което е възможно при използване на различен субстрат, е възможно да се определи количеството секретирано вещество от една клетка.

Този метод се използва широко за оценка на броя на клетките, секретиращи антиген, уловен от адсорбирани антитела; използва се за определяне на броя на клетките, секретиращи цитокини (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a).

При използване на антитела с висок афинитет чувствителността на отделните варианти на ELISA е много висока и теоретично позволява откриването на единични антигенни молекули, но на практика чувствителността е ограничена от редица фактори: ензимна активност, интензитет на сигнала и методи за запис на сигнала. Системите за усилване на сигнала правят възможно повишаването на чувствителността на различни опции за ELISA. Нека да разгледаме някои от тези системи:

Въз основа на взаимодействието на авидин-биотин.

Молекулите на биотин коензим (mw 244 Da) се конюгират с антитела с помощта на биотинил-N-хидроксисукцимид. Малка молекула биотин е по-лесна за прикрепване към имуноглобулин или друг протеин, без да се нарушават неговите имунни или ензимни свойства. В този случай ензимът е свързан с гликопротеина авидин на яйчен белтък. Афинитетът на свързване на авидин към биотин е много висок (константата на дисоциация на комплекса е 10-15 mol), конюгатът авидин-ензим е здраво фиксиран към комплекса антиген-антитяло-биотин. След добавяне на подходящия субстрат реакционният продукт се определя спектрофотометрично или чрез интензитета на луминесценция.

Една молекула авидин се състои от четири идентични субединици и е способна да взаимодейства с четири молекули биотин, което позволява да се използва като свързваща молекула между две биотин-съдържащи съединения. В този случай ензимът също е биотинилиран и авидинът действа като мост, свързващ две молекули, съдържащи биотинови остатъци. Свободен авидин и след това биотинилиран ензим се добавят към получения комплекс антиген-антитяло-биотин. Реакцията се взема предвид.

Протеинът авидин може да бъде неспецифично адсорбиран върху други молекули, така че друг биотин-свързващ протеин, стрептавидин, открит в бактериите Streptomyces avidinii, все повече се използва. Стрептавидин също образува силен комплекс с биотин и се състои от четири идентични субединици.

Използването на авидин-биотинов комплекс може значително да повиши чувствителността на ELISA, тъй като при синтезиране на конюгат с една AT молекула могат да бъдат свързани десетки биотинови молекули. Получаването на конюгати (антитела и ензими с биотин) е доста лесно и е съпроводено с минимални промени в тяхната имунологична и ензимна активност. Ензимните конюгати с биотин могат да се използват като универсални реагенти.

Използване на хемилуминесцентни реакции.

За получаване на сигнал в ELISA могат да се използват хемилуминесцентни реакции, което повишава чувствителността на метода и намалява времето за анализ. Пероксидазата от хрян се използва широко като маркер в ELISA; различни хемилуминесцентни реакции могат да се използват за откриването й. Хемилуминесцентните реакции се основават на способността на луминола да свети, когато се окислява с водороден пероксид. При директен анализ ензимната реакция произвежда водороден пероксид и окислява луминол; тази реакция се катализира от пероксидаза от хрян. За подобряване на сигнала се използват различни съединения, например луциферин, феноли, в този случай интензитетът на луминесценция се увеличава 10-100 пъти, в някои случаи 500 пъти (усилен хемилуминесцентен анализ). Луминесцентният сигнал е много стабилен, нивото му достига максимум за 30 s (за сравнение: цветната реакция с OFD като индикатор се развива напълно само за 30 min).

При индиректния анализ антитялото се маркира с луминол или негови производни. Такъв етикет в свободно състояние може да се окисли от водороден пероксид, освобождавайки светлина. Ако е образувал комплекс, той губи способността си да се окислява.

Базиран на каскадни системи.

Ензимните каскадни системи могат да се използват за повишаване на чувствителността на ELISA. В този случай първият свързан с антитяло ензим произвежда редуцируем субстрат за втората ензимна система. Втората ензимна система може да бъде субстратно-циклична или редоксициклична. В този случай фосфо-глюкоизомераза, алдолаза и алкална фосфатаза могат да служат като ензимни маркери. Крайният реакционен продукт се определя визуално или спектрофотометрично.

Системите за усилване ELISA могат да постигнат висока чувствителност. Такива системи ELISA се използват за определяне на нивото на хормоните (тироид-стимулиращи, прогестерон и др.).

ELISA намери широко приложение в различни области на медицината и биологията поради относителната простота и висока чувствителност на метода. ELISA се използва успешно за:

Масова диагностика на инфекциозни заболявания (откриване на различни специфични антигени или антитела към тях);

Откриване и определяне нивото на хормони и лекарства в биологични проби;

Определяне на изотипове (IgG, IgM и други) на антитела срещу специфичен антиген;

Идентифициране на имунни комплекси;

Идентифициране на туморни маркери;

Определяне на серумни протеини (феритин, фибронектин и др.);

Определяне на общи IgE и специфични IgE антитела;

Скрининг за миоклонални антитела;

Определяне на цитокини в биологични течности.

Чувствителност на метода

ELISA замени методите на аглутинация, преципитация и RIA, които преди това бяха широко използвани в клиничната практика. В сравнение с горните методи, ELISA е по-малко трудоемък и отнема по-малко време и е удобен за извършване на голям брой подобни тестове.

ELISA съчетава уникалната специфичност на имунохимичния анализ с високата чувствителност на определяне на ензимния етикет. Чувствителността на метода (под чувствителност се разбира минималното откриваемо количество антитела или антиген) се определя от следните фактори: афинитетът на антителата, за предпочитане е използването на моноклонални антитела; специфична ензимна активност; интензитет на сигнала; чувствителност на измерване на сигнала. Различните опции за ELISA се различават по своята чувствителност. Някои варианти на ELISA в твърда фаза позволяват откриването на единични молекули в проба. Средната чувствителност на ELISA е 10-9 – 10-12 mol.

Галактионов В.Г. Имунология. Издателство на Московския университет, 1998 г

Кишкун А.А. Имунологични изследвания и методи за диагностика на инфекциозни заболявания в клиничната практика. Медицинска информационна агенция, 2009г

Кондратьева И.А. Семинар по имунология. Учебник за ВУЗ. Академия, 2004г

Лефковиц И., Пернис Б. Имунологични методи за изследване. Свят, 1988 г

Ройт А., Бростоф Д., Мейл Д. Свят, 2000 г

Соколов E.I. Клинична имунология. Медицина, 1998г

Frimel G. Имунологични методи. Медицина, 1987г

Khaitov R. M. Имунология. Медицина, 2000

Шигина Ю.В. Имунология: Учебник. Издателство РИОР, 2007 г

Ярилин А.А. Основи на имунологията. Медицина, 1999г