ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) vstúpila do života praktickej medicíny niekde v 60. rokoch minulého storočia. Jeho prvotnou úlohou bol histologický výskum na vedecké účely, ktorý predstavoval hľadanie a identifikáciu antigénnej štruktúry buniek živého organizmu.
Metóda ELISA je založená na interakcii špecifických (AT) a príbuzných antigénov (AG) s tvorbou komplexu „antigén-protilátka“, ktorý sa deteguje pomocou enzýmu. Táto skutočnosť podnietila vedcov k myšlienke, že metódu možno použiť na diagnostické účely na identifikáciu špecifických imunoglobulínov rôznych tried, ktoré sa podieľajú na imunitnej odpovedi na konkrétnu infekciu. A bol to prelom v klinickej laboratórnej diagnostike!
Metóda sa začala aktívne používať až začiatkom 80-tych rokov a potom najmä v špecializovaných inštitúciách. Prvé imunoenzýmové analyzátory boli vybavené krvnými transfúznymi centrami a stanicami, infekčnými chorobami a venerologickými nemocnicami, keďže sa na našom obzore objavil hrozivý AIDS, ktorý sa zrodil na africkom kontinente a okamžite sa pripojil k „starým“ infekciám, vyžadoval okamžité diagnostické opatrenia a pátranie. pre terapeutické lieky, ktoré ho ovplyvňujú.
Rozsah použitia metódy ELISA
Možnosti enzýmovej imunoanalýzy sú skutočne rozsiahle. Teraz je ťažké si predstaviť, ako sa možno zaobísť bez takéhoto výskumu, ktorý sa používa doslova vo všetkých odvetviach medicíny. Zdá sa, čo dokáže ELISA v onkológii? Ukazuje sa, že môže. A veľa. Schopnosť analýzy nájsť markery charakteristické pre určité typy malígnych novotvarov je základom včasnej detekcie nádoru, keď pre svoju malú veľkosť ešte nie je detekovaný iným spôsobom.
Moderná klinická laboratórna diagnostika (CDL) má okrem nádorových markerov aj významný arzenál panelov ELISA a využíva ich na diagnostiku rôznych patologických stavov (infekčné procesy, hormonálne poruchy) a sledovanie farmaceutických liekov s cieľom identifikovať ich vplyv na organizmus pacienta. a mimochodom nielen ľudské. V súčasnosti je enzýmová imunoanalýza široko používaná vo veterinárnych službách, pretože „naši bratia“ sú tiež náchylní na mnohé choroby, ktorými niekedy veľmi trpia.
teda ELISA vďaka svojej citlivosti a špecifickosti dokáže zo vzorky krvi odobratej zo žily určiť:
- Hormonálny stav (hormóny štítnej žľazy a nadobličiek, pohlavné hormóny);
- Prítomnosť vírusových a bakteriálnych infekcií (HIV, B a C, chlamýdie, syfilis, a, a, rovnako ako mnoho ďalších chorôb spôsobených patogénnymi mikroorganizmami);
- Stopy vitálnej aktivity mikroorganizmov, ktoré iniciovali infekčný proces, ktorý úspešne skončil a prešiel do štádia tvorby imunitnej odpovede na tento patogén. Takéto stopy, teda protilátky, zostávajú v mnohých prípadoch cirkulovať v krvi po celý život, čím chránia človeka pred opätovnou infekciou.
Čo je podstatou ELISA?
Enzýmová imunoanalýza umožňuje určiť nielen prítomnosť samotného patogénu (kvalitatívnou analýzou), ale aj jeho kvantitatívny obsah v krvnom sére pacienta.
Vírusová alebo bakteriálna dávka významne ovplyvňuje priebeh infekčného procesu a jeho výsledok, preto kvantitatívna analýza zohráva dôležitú úlohu v diagnostike a liečbe ochorení v rôznych formách a štádiách.
Keď však poznáme enzýmové imunotesty ako metódu ELISA, ani sa nezamýšľame nad tým, ako dokáže pokryť takú širokú škálu mikroorganizmov obývajúcich našu planétu, z ktorých mnohé predstavujú priamu hrozbu pre zdravie a životy ľudí a zvierat. Faktom však je, že ELISA má veľa možností (nekonkurenčných a konkurenčných - priamych a nepriamych), z ktorých každá rieši svoj vlastný problém a umožňuje tak cielené vyhľadávanie.
Na identifikáciu imunoglobulínov jednej alebo druhej triedy sa používa tradičný 96-jamkový polystyrénový panel (doštička), v jamkách ktorého sú koncentrované sorbované rekombinantné proteíny v tuhej fáze. Protilátky alebo antigény, ktoré sa dostanú do jamky s krvným sérom, nájdu „známy“ predmet a vytvoria s ním komplex (AG - AT), ktorý sa fixovaný enzýmovým konjugátom prejaví zmenou farby jamky, keď čítanie výsledkov.
Enzýmová imunoanalýza sa vykonáva pomocou testovacích systémov určitej špecifickosti, vyrobených v špeciálnych laboratóriách a vybavených všetkými potrebnými reagujúcimi zložkami. Výskum možno vykonávať pomocou práčok („práčok“) a čítacích spektrofotometrov, ktoré väčšinou zahŕňajú ručnú prácu. Na plnoautomatických strojoch, ktoré oslobodia laboranta od monotónnej instilácie, umývania a iných rutinných úkonov, je samozrejme práca rýchlejšia a pohodlnejšia, no nie všetky laboratóriá si môžu dovoliť taký luxus a pokračovať v práci po starom - ďalej poloautomatické stroje.
Interpretácia výsledkov ELISA je v kompetencii lekára laboratórnej diagnostiky a treba brať do úvahy aj inherentnú vlastnosť takmer všetkých imunochemických reakcií dávať falošne pozitívne alebo falošne negatívne odpovede.
Video: moderný enzýmový imunotest
Výsledky ELISA na príklade syfilisu
Enzýmová imunoanalýza je vhodná na detekciu všetkých foriem a okrem toho sa používa v skríningových štúdiách. Na vykonanie analýzy sa používa pacientova venózna krv odobratá na prázdny žalúdok. V práci sa používajú tablety s určitou špecifickosťou (AB triedy A, M, G) alebo celkové protilátky.
Vzhľadom na to, že protilátky v syfilise sú produkované v špecifickej sekvencii, ELISA môže ľahko odpovedať na otázku, kedy došlo k infekcii a v akom štádiu je proces, a interpretácia získaných výsledkov môže byť prezentovaná v nasledujúcej forme:
- IgM indikuje trvanie infekčného procesu (môže sa objaviť počas exacerbácie chronických zápalových ochorení);
- IgA uvádza, že infekcia sa vyskytla pred viac ako mesiacom;
- IgG naznačuje, že infekcia je v plnom prúde alebo že liečba bola nedávno vykonaná, čo sa dá ľahko určiť na základe anamnézy.
Pri testovaní na syfilis zostanú negatívne jamky (a negatívna kontrola) bezfarebné, zatiaľ čo pozitívne jamky (a pozitívna kontrola) budú vykazovať jasne žltú farbu v dôsledku zmeny farby chromogénu pridaného počas testu. Intenzita farby sa však nie vždy zhoduje s kontrolou, to znamená, že môže byť mierne bledšia alebo mierne žltkastá. Ide o pochybné výsledky, ktoré spravidla podliehajú opätovnému preskúmaniu s povinným zohľadnením kvantitatívnych ukazovateľov získaných na spektrofotometri, ale vo všeobecnosti je farba priamo úmerná počtu imunitných komplexov (súvisiacich Ag a AT) .
Najvzrušujúcejším z enzýmových imunotestov je HIV ELISA
Analýza je pre široké spektrum populácie možno zaujímavejšia ako iné, pretože stále nemožno s istotou povedať, že mnohé sociálne problémy zmizli (prostitúcia, drogová závislosť atď.). Žiaľ, HIV postihuje nielen tieto vrstvy ľudskej spoločnosti, môžete sa nakaziť za rôznych okolností, ktoré nesúvisia so sexuálnou nemorálnosťou alebo užívaním drog. Ak je však potrebný test na HIV, nemali by ste sa báť, že o vašej návšteve takéhoto laboratória budú vedieť všetci naokolo. Teraz sú ľudia infikovaní HIV chránení zákonom a tí, ktorí majú pochybnosti, sa môžu obrátiť na anonymné úrady, kde môžu problém vyriešiť bez strachu z publicity a odsúdenia.
Enzýmová imunoanalytická metóda používaná na diagnostiku HIV infekcie je jednou z najdôležitejších štandardných štúdií, ktorá si však vyžaduje špeciálne podmienky, keďže téma je veľmi chúlostivá.
Má zmysel vykonávať HIV ELISA po sexuálnom kontakte, transfúzii krvi, iných lekárskych zákrokoch, ktoré naznačujú infekciu, a na konci inkubačnej doby („séronegatívne okno“), ale treba mať na pamäti, že toto obdobie je nie konštantná. Môže skončiť za 14-30 dní, alebo môže trvať až šesť mesiacov, preto sa za priemernú hodnotu považuje interval od 45 do 90 dní. Na HIV sa krv daruje rovnako ako pri iných infekciách – zo žily nalačno. Výsledky budú pripravené v závislosti od akumulácie materiálu v laboratóriu a jeho pracovnej vyťaženosti (od 2 do 10 dní), hoci najčastejšie laboratóriá odpovedajú v ten istý alebo nasledujúci deň.
Čo môžete očakávať od svojich výsledkov HIV?
ELISA na infekciu HIV zisťuje protilátky proti dvom typom vírusu: HIV-1 (bežnejší v Rusku a iných krajinách Európy a Ázie) a HIV-2 (častejší v západnej Afrike).
Úlohou HIV ELISA je vyhľadávanie protilátok triedy G, ktoré sú detegované na všetkých testovacích systémoch, ale v neskoršom období, a protilátok triedy A a M, detegovaných na rekombinantných testovacích súpravách novej generácie, ktoré umožňujú nájsť protilátky. v najskorších štádiách (inkubačná doba – „séronegatívne okno“). Od testu ELISA možno očakávať nasledujúce odpovede:
- Primárny pozitívny výsledok: krv musí byť znovu vyšetrená testovacím systémom rovnakého typu, ale podľa možnosti inej série a inou osobou (laborantom);
- Opakované (+) zahŕňa nový odber krvi od pacienta s jej vyšetrením podobným primárnej analýze;
- Ďalší pozitívny výsledok je predmetom referenčnej analýzy, ktorá využíva vysoko špecifické testovacie súpravy (2-3 ks);
- Pozitívny výsledok v oboch (alebo troch) systémoch sa odošle na imunoblotovanie (rovnaká ELISA, ale vykonaná individuálne s použitím testovacích súprav obzvlášť vysokej špecifickosti).
Záver o infekcii HIV sa robí len na základe imunoblotingu. Konverzácia s infikovanou osobou prebieha úplne dôverne. Vyzradenie lekárskeho tajomstva v Rusku, ako aj v iných krajinách, je trestne stíhané.
Mimoriadnu obľubu si získali aj testy na chlamýdie a cytomegalovírusy pomocou metódy enzýmovej imunoanalýzy, pretože umožňujú určiť čas infekcie, štádium ochorenia a účinnosť liečebných opatrení.
Počas implementácie je možné pozorovať aj výskyt protilátok rôznych tried. v rôznych fázach patologického stavu spôsobeného infekčným agensom:
- IgM možno zistiť už sedem dní po infekcii;
- IgA naznačuje, že infekcia žije v tele viac ako mesiac;
- IgG potvrdzuje diagnózu chlamýdií a pomáha monitorovať liečbu a určiť jej účinnosť. Je potrebné poznamenať, že protilátky triedy G zostávajú a cirkulujú v tele bez ohľadu na trvanie ochorenia, preto, aby ste správne interpretovali analýzu, musíte vziať do úvahy referenčné hodnoty (normy), ktoré mimochodom , sú odlišné pre každý CDL: berúc do úvahy značku testovacieho systému a špecifickosť činidiel zahrnutých v súprave. Normálne hodnoty sa zadávajú do formulára vedľa výsledku ELISA.
Čo sa týka , tu je to trochu inak: Protilátky triedy M sa objavia asi po mesiaci až mesiaci a pol, to znamená, že pozitívny výsledok (IgM+) sa dostane do fázy primárnej infekcie alebo počas reaktivácie latentnej infekcie a zostane tak od 4 mesiacov do šiestich mesiacov.
Prítomnosť protilátok triedy G je charakteristická pre nástup primárnej akútnej infekcie alebo reinfekcie. Analýza uvádza, že vírus je prítomný, ale neposkytuje informácie o tom, v akom štádiu je infekčný proces. Stanovenie normálneho titra IgG tiež spôsobuje ťažkosti, pretože úplne závisí od imunitného stavu konkrétnej osoby, ktorý sa však stanovuje pomocou identifikácie imunoglobulínov triedy G, vzhľadom na takéto správanie protilátok pri diagnostike CMV na posúdenie schopnosti protilátok triedy G interagovať s CMV, aby ho neskôr „neutralizovali“ (AT avidita). V počiatočnom štádiu ochorenia sa IgG veľmi zle viaže na vírusové antigény (nízka avidita) a až potom začne vykazovať aktivitu, preto môžeme hovoriť o zvýšení avidity protilátok.
O výhodách enzýmovej imunoanalýzy môžeme veľa hovoriť, pretože táto metóda dokázala vyriešiť mnohé diagnostické problémy iba pomocou venóznej krvi. Odpadá tak dlhé čakanie, starosti a problémy so zbieraním materiálu na výskum. Okrem toho sa testovacie systémy pre ELISA neustále zdokonaľujú a nie je ďaleko deň, keď test poskytne 100% spoľahlivý výsledok.
Video: vzdelávací film Moskovskej štátnej lekárskej univerzity pomenovaný po. Sechenov o základoch ELISA
– moderný laboratórny test, ktorý hľadá špecifické protilátky v krvi alebo antigény na konkrétne ochorenia s cieľom identifikovať nielen etiológiu, ale aj štádium ochorenia. Výsledky ELISA možno poskytnúť kvalitatívne a kvantitatívne.
V súčasnosti sa ELISA používa v nasledujúcich situáciách:
1) Hľadanie špecifických protilátok proti akejkoľvek infekčnej chorobe;
2) hľadanie antigénov akýchkoľvek chorôb (infekčných, venerologických);
3) štúdium hormonálneho stavu pacienta;
4) vyšetrenie nádorových markerov;
5) vyšetrenie na prítomnosť autoimunitných ochorení.
Výhody metódy ELISA:
1) Vysoká špecificita a senzitivita metódy ELISA (viac ako 90 %).
2) Schopnosť určiť ochorenie a sledovať dynamiku procesu, to znamená porovnanie počtu protilátok v rôznych časových obdobiach.
3) Dostupnosť diagnostiky ELISA v akomkoľvek zdravotníckom zariadení.
Relatívna nevýhoda:
1) Detekcia imunitnej odpovede (protilátok), ale nie samotného patogénu.
Základné pojmy
Predtým, ako si objasníme podstatu metódy ELISA, stručne pochopme niektoré pojmy.
Protilátky (alebo imunoglobulíny - Ig)
– špecifické proteíny produkované B –
lymfocyty (imunitné bunky) v reakcii na akýkoľvek infekčný patogén (vírusy, baktérie, huby atď.), ktorý sa dostane do tela. Existujú imunoglobulíny A (IgA), imunoglobulíny E (IgE), imunoglobulíny M (IgM), imunoglobulíny G (IgG), imunoglobulíny D (IgD). Líšia sa od seba tvarom a hmotnosťou molekuly, polčasom rozpadu, účasťou/neúčasťou na infekčných procesoch a načasovaním detekcie od okamihu infekcie. Ak vezmeme do úvahy molekulovú hmotnosť, potom IgM má najväčšiu hmotnosť - je to pentamér (950 000 daltonov) na rozdiel od iných Ig (od 150 do 200 000 Da), kvôli ktorému IgM jednoducho nemôže prejsť cez placentárnu bariéru. Preto je detekcia IgM u dieťaťa vo veku 1 roka vždy znakom prítomnosti infekcie u plodu. V krvnom sére je väčšina imunoglobulínov zastúpená IgG (75-85%) a najnižšia je IgE (0,003%). Len IgA, M, G sa priamo podieľajú na infekčnom procese, je znakom alergických reakcií a ochorení a IgD sa nachádza len v tkanive lymfatických uzlín a mandlí a zohráva úlohu pri tvorbe lokálnej imunity.
Antigény – vysokomolekulárne látky organického pôvodu, najmä patogény infekčných a iných chorôb, ako aj látky rôznych zmenených buniek vznikajúcich pri určitom ochorení (autoimunitné ochorenia, onkológia).
Imunitný komplex – komplex antigén-protilátka zapojený do imunitného procesu.
Na čom je založená metóda ELISA?
Existuje niekoľko typov ELISA (priama, nepriama, blokujúca metóda, kompetitívna), ale v praxi sa najčastejšie používa heterogénna imunoanalýza na pevnej fáze alebo ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
Základom enzýmovej imunoanalýzy je imunitná reakcia antigénu a protilátky s tvorbou imunitného komplexu: antigén-protilátka, ktorá má za následok zmenu enzymatickej aktivity špecifických značiek na povrchu protilátok.
Zjednodušene možno tento proces rozdeliť do niekoľkých etáp:
1) Na povrchu jamiek tablety lekára vykonávajúceho vyšetrenie je purifikovaný antigén určitého patogénu. Keď sa pridá biologický materiál (krvné sérum) od pacienta, dôjde k špecifickej reakcii medzi týmto antigénom a požadovanou protilátkou (imunoglobulínom). Táto zlúčenina bude v ďalšom štádiu pôsobiť ako „špeciálny antigén“.
2) V tomto štádiu nastáva tvorba IC (imunitných komplexov) - reakcia medzi „špeciálnym antigénom“ a konjugátom (ide o imunoglobulín značený enzýmom peroxidázou). Pridáva sa špeciálny chromogén. Výsledkom tejto enzymatickej reakcie je vznik farebnej látky v jamke tablety, ktorej intenzita farby závisí od množstva imunoglobulínov (protilátok) obsiahnutých v materiáli pacienta.
3) Ďalej sa vyhodnotí výsledok: fotometria pomocou viackanálového spektrofotometra, porovnanie optickej hustoty študovaného materiálu s optickou hustotou kontrolných vzoriek, matematické spracovanie výsledkov. Množstvo protilátok u pacienta priamo závisí od výšky optickej hustoty danej jamky.
Typicky sa v praxi používajú 96-jamkové platne.
Pri meraní optickej hustoty (OD) testovacej kvapaliny sa vypočíta množstvo (alebo koncentrácia) protilátok v určitej jednotke objemu. Výsledok sa potom porovná s kontrolnou vzorkou.
Treba si zapamätať:Pre každý testovací systém sú vyvinuté individuálne indikátory na zaznamenávanie výsledkov, indikátorov normality a patológie (to znamená „referenčné hodnoty“). Toto sa musí vziať do úvahy pri hodnotení výsledkov každej konkrétnej štúdie. Je nesprávne interpretovať výsledky jedného laboratória na základe „referenčných hodnôt“ iného laboratória. Rovnako je nesprávne porovnávať výsledky rôznych laboratórií medzi sebou.
Pri vykonávaní reakcií ELISA je dôležitý aj koncept avidity protilátok.
Avidita protilátok
- toto je sila spojenia medzi protilátkou a antigénom a množstvo antigénu, ktoré je vo vzťahu s imunoglobulínmi (protilátkami). Avidita má veľký význam pri hodnotení predpokladaného trvania infekcie, čo je mimoriadne dôležité pri diagnostike primárnej infekcie u tehotných žien.
Základ testu avidity protilátok pozostáva z ošetrenia imunitného komplexu (antigén-protilátka) roztokom močoviny na zničenie proteínu. Dlhopisy s vysokou aviditou zostávajú nedotknuté, zatiaľ čo dlhopisy s nízkou aviditou sú zničené. Výsledok je daný ako index avidity vyjadrený v percentách (%).
Aké ochorenia sa zisťujú pomocou diagnostiky ELISA?
2. Markery autoimunitných ochorení a indikátory imunity človeka(celkové IgE, celkové IgG, celkové IgA, celkové IgM, celkové IgD, sekrečné IgA, IgG 2, IgG4, CEC-cirkulujúce imunitné komplexy, IgA a IgG voči gliadínu a iné)
3. Onkologické markery(TNF - tumor necrosis factor, CEA - karcinoembryonálny antigén, PSA - prostatický špecifický antigén, hCG - ľudský choriový gonadotropín, CA 125, alveomucín a mnohé ďalšie)
4. Poruchy reprodukcie I (estradiol, progesterón, prolaktín, testosterón, AFP-alfafetoproteín, FSH - folikuly stimulujúci hormón a iné)
5. Choroby štítnej žľazy(voľný a viazaný T3, T4, tyreoglobulín, peroxidáza štítnej žľazy - TPO, hormón stimulujúci štítnu žľazu - TSH).
Tento zoznam nepredstavuje všetky choroby, ktoré sú diagnostikované pomocou enzýmového imunotestu.
Materiál pre analýzu ELISA a pravidlá pre jeho zber
Najbežnejším materiálom pre reakciu ELISA je krvné sérum pacienta odobraté nalačno. Materiálom môže byť aj likvor, plodová voda, obsah sklovca, hlien krčka maternice a močovej rúry, stery.
Príprava pacientov na predloženie materiálu na ELISA
Čas výroby pre ELISA
Enzýmová imunoanalýza materiálu sa vykonáva rýchlo, do 24 hodín. V rôznych laboratóriách môže dôjsť k oneskoreniu v dôsledku nahromadenia určitého množstva séra.
Možné výsledky diagnostiky ELISA
Pri hodnotení výsledkov pre špecifické infekcie je dôležitá trieda zistených protilátok a ich množstvo. Nielen otázka etiológie infekcie (či existuje alebo nie), ale aj predpokladané štádium ochorenia (akútne, chronické), ako aj prítomnosť aktívnej infekcie (akútna alebo exacerbácia chronickej) pri Čas vyšetrenia závisí od toho.
Aký je približný časový rámec pre výskyt protilátok (imunoglobulínov - Ig)?
Najskoršie protilátky sú IgM. Môžu byť zistené 1-3 týždne po možnej infekcii, ktorá charakterizuje akútnu fázu infekčného procesu. Druhou situáciou pre výskyt protilátok IgM je aktivácia (alebo exacerbácia) chronického procesu. Protilátky IgM cirkulujú v priemere asi 3 mesiace, potom ich počet postupne mizne. U niektorých pacientov je však možné zistiť stopové množstvá IgM v priebehu 1-2 rokov po infekcii.
Moderné testovacie systémy sú vysoko citlivé, čo vedie k nešpecifickým falošne pozitívnym výsledkom (často u tehotných žien). Preto u tejto skupiny pacientov treba pozitívne IgM znova skontrolovať!
IgA protilátky sa objavia 2-4 týždne po infekcii, ale v množstve postačujúcom na detekciu do mesiaca. Sérové IgA je syntetizované plazmatickými bunkami sleziny, lymfatických uzlín a slizníc.
Od 4. týždňa po infekcii sa začínajú objavovať protilátky IgG. Pri väčšine infekcií sa ich titer postupne zvyšuje s maximom v rôznych časoch (v priemere po 1,5-2 mesiacoch), potom zostáva titer na nízkej úrovni a indikuje imunitu. Pri niektorých ochoreniach (mykoplazmóza, chlamýdie, trichomoniáza) nie je hladina IgG vysoká a výrazne klesá v dôsledku nedostatočnej imunity pri týchto infekciách.
Možnosti detekcie protilátok rôznych tried:
Izolovaná detekcia IgM protilátok naznačuje prítomnosť primárnej
infekcia.
- Súčasná detekcia IgM a IgG v krvi je charakteristická pre primárnu infekciu
v predchádzajúcich 2-3 mesiacoch, ako aj počas exacerbácie chronického ochorenia. Preto počas tehotenstva nie je prítomnosť IgM vždy znakom primárnej infekcie.
- Detekcia izolovaného IgG môže naznačovať imunitu voči tomuto ochoreniu,
ako aj pri chronickej infekcii. V druhej situácii je dôležité ako množstvo protilátok (titer), tak aj zmena tohto titra v čase. Typicky sa štúdie vykonávajú v intervaloch 2-4-6 týždňov.
- Detekcia IgA izolovaného alebo s IgM indikuje primárnu infekciu. O
Výskyt IgA spolu s IgG naznačuje aktiváciu chronickej infekcie (v priemere 2 týždne od okamihu exacerbácie).
Definícia Avidita IgG protilátok je výborným doplnkovým štádiom v diagnostike primárnej infekcie z dlhotrvajúcej infekcie, ktorá má svoj klinický význam predovšetkým pri hodnotení rizika vnútromaternicovej infekcie plodu. Detekcia IgG s nízkou aviditou indikuje primárnu infekciu a zisťuje sa v priemere 4-6 mesiacov po infekcii, zriedkavo aj dlhšie. IgG s nízkou aviditou vyžaduje ďalšie laboratórne potvrdenie primárnej infekcie (IgM). Protilátky s vysokou aviditou sú buď príznakom chronického ochorenia a jeho exacerbácie, alebo vytvorenej imunity.
Vlastnosti u dojčiat:u detí do jedného roka, niekedy aj 1,5 roka, koluje v krvi materské IgG na rôzne infekcie (teda prenikli cez placentu z matky na plod počas vnútromaternicového vývoja). Samy o sebe nie sú znakom prítomnosti infekcie v súčasnosti. Ak sa v tomto veku zistí IgM (pamätajte, že materské IgM nemôže preniknúť do placenty), potom je to príznak vnútromaternicovej infekcie alebo infekcie získanej po narodení.
Kvantitatívna metóda ELISA
Výsledok diagnostiky ELISA (pomocou analyzátora enzýmovej imunoanalýzy) je uvedený v určitých jednotkách merania:
- Optická hustota (OD) vzorky – koncentrácia špecifických protilátok na jednotku objemu. Čím vyššia je OD vzorky, tým vyššia je koncentrácia protilátok. Niektoré výsledky sa vzťahujú na koeficient pozitivity (CP), ktorý je zároveň optickou hustotou vzorky.
- Jednotky koncentrácie protilátok (nanogram/mililiter alebo ng/ml).
- Vo forme sérových titrov: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 atď. Diagnostické titre (pri ktorých sa robí diagnóza choroby a nie skutočnosť infekcie) sa líšia pre rôzne choroby.
- Vo forme symbolov – „+“, „-“, „?“ (+, ++, +++, ++++).
- Vo forme kvalitatívneho hodnotenia podľa daného kritéria (pozitívne alebo negatívne).
Len lekár dokáže správne posúdiť počet protilátok, možnosť triednej detekcie imunoglobulínov, a teda stanoviť štádium ochorenia a potrebu liečby.
Nesmieme zabúdať, že pre každý testovací systém sa vyvíjajú jeho vlastné „referenčné hodnoty“ (varianty normy), pri prekročení sa diagnostikuje konkrétna choroba (varianty patológie). Pre rôzne testovacie systémy sú „referenčné hodnoty“ rôzne.
Správne porovnanie výsledkov ELISA získaných v priebehu času je možné len vtedy, ak boli vyrobené v rovnakom laboratóriu.
Doktorka infekčnej choroby N.I
Predstavuje moderný typ laboratórneho výskumu, ELISA alebo enzýmový imunosorbentový test, ktorý vám umožňuje nájsť v krvi špecifické protilátky alebo antigény určitých chorôb. To umožňuje odhaliť tak etiológiu ochorenia, ako aj určiť jeho štádium. Navyše výsledky tohto typu výskumu možno prezentovať kvantitatívne aj kvalitatívne. Pozrime sa teda podrobne na princíp metódy enzýmovej imunoanalýzy, jej metodiku a podstatu.
Čo je to enzýmová imunoanalýza
Enzýmová imunoanalýza, ktorá je predpísaná pre čo najkomplexnejšie posúdenie zdravia, vám umožňuje posúdiť celkový zdravotný stav a posúdiť jeho ochranné funkcie. Tento laboratórny test vám umožňuje diagnostikovať infekčné, autoimunitné, hematologické patológie pomocou krvného testu.
Podstata enzýmového imunotestu je diskutovaná vo videu nižšie:
Komu je predpísaný?
Táto štúdia môže byť predpísaná tým pacientom, ktorí majú diagnostikované nasledujúce ochorenia:
- choroby vírusového pôvodu, ktoré zahŕňajú hepatitídu;
- pohlavne prenosné choroby - chlamýdie, trichomonas, syfilis, ureaplazma, mykoplazma;
- imunodeficiencie;
- vykonanie predoperačného komplexného vyšetrenia.
Na stanovenie hladín hormónov a posúdenie kvality typu vykonávanej terapie je tiež predpísaný krvný test ELISA.
Lekár môže predpísať tento test na určenie štádia existujúceho ochorenia, čo umožňuje včasné prispôsobenie použitej liečby. A vysoká presnosť získaných údajov umožňuje mať najkomplexnejší obraz o zdraví. Zároveň sa údaje získavajú po štúdii vo veľmi krátkom časovom období, čo umožňuje sledovať dynamiku vývoja patologického procesu.
Prečo robiť takéto testy?
Keďže vďaka analýze krvi ELISA je možné získať značné množstvo informácií o zdravotnom stave a patologických procesoch prebiehajúcich v organizme, umožňuje maximálne zohľadniť počiatočné údaje (celkový zdravotný stav, štádium choroba, dynamika vývoja patologického procesu, indikátor účinnosti použitej terapie) pri zostavovaní liečebných režimov.
Z tohto dôvodu, aby sa dosiahol najvýraznejší výsledok liečby a najrýchlejšie zastavenie patologického procesu v tele, je predpísaný krvný test ELISA. Na základe získaných údajov možno rýchlejšie vyliečiť závažné ochorenia imunitného systému, prítomnosť antigénov v krvi a príčiny alergií pomocou najúčinnejších metód.
Vymenovanie analýzy ELISA sa vykonáva pre rôzne patológie a malo by sa vykonávať iba podľa predpisu lekára. Frekvenciu rozborov určuje aj lekár a pri darovaní krvi na rozbor ELISA je obraz choroby najúplnejší. Keďže získať dynamiku priebehu ochorenia je možné vykonaním tohto testu viac ako raz, najčastejšie sa darovanie krvi môže predpísať trikrát až päťkrát. To umožňuje porovnávať množstvo protilátok v krvi v rôznych časových obdobiach.
Typy takéhoto postupu
Existuje niekoľko typov enzýmových imunotestov. Líšia sa typom tekutiny odobratej z ľudského tela, na základe čoho sa študuje jej zloženie a prítomnosť určitých antigénov.
V tomto prípade sa na analýzu môže odobrať nielen krv človeka, ale aj jeho ďalšie tekutiny:
- plodová voda,
- cerebrospinálny mok,
- obsah sklovca,
- ťahy,
- hlien z močovej trubice a krčka maternice.
Samotná operácia odberu určitého typu tekutiny je štandardná a vykonáva sa v dennom stacionári.
Indikácie na testovanie
Test ELISA zvyčajne predpisuje lekár, ak je potrebné získať podrobný obraz o aktuálnej chorobe, ktorá sa vyskytuje v akejkoľvek forme: chronická, pomalá alebo akútna. Za indikácie pre tento typ analýzy možno považovať nasledujúce stavy a liečebné účely:
- hľadanie antigénov určitých chorôb;
- stanovenie hormonálneho stavu;
- detekcia vírusu hepatitídy v tele;
- výskum v oblasti ;
- hľadanie protilátok proti akémukoľvek typu infekčnej choroby;
- vyšetrenie na prítomnosť autoimunitných lézií tela.
Informácie o enzýmovej imunoanalýze nájdete v nasledujúcom videu:
Kontraindikácie pre
Doteraz neboli identifikované žiadne kontraindikácie pre enzýmovú imunoanalýzu.
Počas tehotenstva, keď dochádza k neustálym zmenám hladín hormónov v krvi, je potrebné túto analýzu vykonávať opakovane, aby sa potvrdil získaný výsledok. Novorodenci a dojčatá môžu mať tiež nesprávne údaje z testov: počas vývoja plodu sa môžu určité typy protilátok dostať do krvi plodu cez placentu matky. Preto by sa ich prítomnosť v analýze nemala považovať za príznak existujúcej infekcie.
Test bezpečnosti
Uskutočnenie postupu odoberania akéhokoľvek druhu tekutiny z ľudského tela neprináša žiadne negatívne účinky na telo. Úplná sterilita počas manipulácií zabraňuje riziku infekcie akýmikoľvek typmi chorôb.
Príprava na podujatie
Ak chcete získať čo najspoľahlivejšie výsledky štúdie, pred odberom krvi (alebo inej tekutiny) na analýzu by ste sa mali zdržať pitia alkoholických nápojov a drog.
Ako procedúra prebieha a ako sa počas nej cítite
Na vykonanie testu ELISA sa krv pacienta odoberie striktne na prázdny žalúdok: najmenej hodiny pred zákrokom by ste nemali jesť žiadnu formu jedla. Analýza sa odoberá z ulnárnej žily.
Prítomnosť akýchkoľvek chorôb a užívané lieky sa hlásia lekárovi najčastejšie, lieky budú vysadené v čase darovania krvi. Pocity počas procedúry sú podobné ako pri odbere krvi na biochemickú analýzu.
Dekódovanie výsledkov
Diagnostika ELISA umožňuje určiť prítomnosť infekcie v tele, aktivitu patologického procesu a etiológiu existujúcej infekcie. Rýchly príjem výsledkov analýzy (do 24 hodín) je jednou z výhod tohto typu výskumu.
Proces dekódovania prijatých informácií vykonáva lekár. Malo by sa vziať do úvahy, že správnosť výsledkov získaných o dynamike akýchkoľvek procesov je zaručená, keď sa testy vykonávajú v jednom laboratóriu.
Priemerné náklady na postup
Priemerná cena testu ELISA závisí od zamerania rozboru a stanovenia konkrétnych hodnôt. Stanovenie sérologických markerov infekčných ochorení rôznych typov (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) teda bude stáť od 200 do 320 rubľov a uskutoční sa do 2 pracovných dní. Náklady na tento postup sa tiež považujú za jeho výhodu: cenová dostupnosť akéhokoľvek typu výskumu vám umožňuje vykonávať výskum pri akejkoľvek veľkosti rozpočtu.
Cena testu ELISA závisí od politiky lekárskej inštitúcie, ale mala by sa považovať za všeobecne dostupný postup, ktorý vám umožní získať podrobný obraz o existujúcej chorobe a poskytnúť čo najkompletnejšiu liečbu.
Informácie o normách a vlastnostiach výskumu ELISA nájdete vo videu nižšie:
Ako sa vykonáva štúdia ELISA?
Mechanizmus reakcie
Enzýmová imunoanalýza je založená na imunitnej reakcii antigénu s protilátkou a pripojenie enzýmovej značky k protilátkam umožňuje, aby sa výsledok reakcie antigén-protilátka vzal do úvahy objavením sa enzymatickej aktivity alebo zmena jeho úrovne V zjednodušenej forme možno mechanizmus reakcie znázorniť takto:
|
K prvej reakcii dochádza medzi detegovaným Ig (Ab) a purifikovaným antigénom patogénu (Ag), fixovaným na povrchu jamiek imunologickej tablety |
|
|
|
Na identifikáciu vytvorených imunitných komplexov sa uskutoční druhá imunologická reakcia, v ktorej naviazaný špecifický Ig pôsobí ako antigén a konjugát predstavujúci Ig (Ab) na zodpovedajúci ľudský Ig, značený enzýmom -peroxidázou (K). , sa používa ako protilátky proti nemu. |
|
|
Ďalej nastáva enzymatická reakcia katalyzovaná enzymatickou časťou molekuly konjugátu Substrátom pre túto reakciu je bezfarebná látka – chromogén, ktorý pri reakcii vytvára farebnú látku. Intenzita farby v jamke závisí určitým spôsobom od množstva imunoglobulínov obsiahnutých vo vzorke. |
Výpočet výsledkov
Vykonávanie enzýmového imunotestu
Na sérodiagnostiku sa používajú 96-jamkové polystyrénové platne, na stenách buniek, ktorých antigén je vopred adsorbovaný. Testované sérum sa pridá do bunky tablety. V tomto prípade sú k nemu pripojené protilátky homológne s antigénom. Nenaviazané protilátky sa odstránia premytím. Ďalej sa do buniek pridajú protilátky proti ľudským imunoglobulínom (protilátky) značené enzýmom. Ak boli v testovacom sére prítomné detegovateľné protilátky, potom v tomto štádiu budú pôsobiť ako antigény, s ktorými budú označené protilátky reagovať. Pridanie chromogénnej látky (farbiva) po umytí nám umožní zohľadniť reakciu vyvíjajúcej sa farby v bunkách. Intenzita farby je úmerná množstvu enzýmu, a teda množstvu protilátok Pri meraní optickej hustoty (OD) kvapaliny v bunke a jej porovnaní s kontrolnou vzorkou sa koncentrácia protilátok počíta v jednotkách. objemu Najčastejšie sa používa výpočet výsledkov v jednotkách optickej hustoty. Je potrebné vziať do úvahy, že každý testovací systém má svoje vlastné indikátory na zaznamenávanie výsledkov a indikátory normality a patológie, ktorými sa treba riadiť pri interpretácii. výsledky.
Aké infekcie možno zistiť testom ELISA?
Hlavne v modernej venerológii sa používa na diagnostiku syfilisu (v kombinácii s inými reakciami), HIV infekcie, vírusovej hepatitídy Má obmedzenú hodnotu pre diagnostiku chlamýdiovej infekcie, cytomegalovírusovej infekcie a iných herpetických infekcií na stanovenie protilátok pri rôznych infekčných ochoreniach, hladiny hormónov, autoprotilátok a rôznych markerov rakoviny.
Ako interpretovať výsledky ELISA
Štúdium prítomnosti a hladiny protilátok rôznych tried v niektorých prípadoch pomáha určiť štádiá infekčného procesu
|
Štádium choroby |
IgM |
IgA |
IgG |
|
Primárna fáza |
|||
|
Primárna fáza |
|||
|
Primárna fáza |
|||
|
Exacerbácia chronickej fázy |
|||
|
Chronická fáza |
|||
|
Minulosť (vyliečená infekcia) |
|||
|
zotavenie |
zníženie titra 2-4 krát po úspešnej liečbe |
zníženie titra o 4-8 krát 1-1,5 mesiaca po úspešnej liečbe |
|
|
Negatívny výsledok |
Žiaľ, taká dôležitá výhoda ELISA, akou je kvantitatívne stanovenie protilátok, nemá v praktickej práci veľký význam – t.j. neumožňuje presnú diagnózu a neovplyvňuje dávkovanie a načasovanie liekov.
Aká je úloha metódy ELISA v diagnostike syfilisu
Metóda ELISA v diagnostike syfilisu bola prvýkrát použitá v roku 1975. V súčasnosti je široko používaná na sérologickú diagnostiku syfilisu v Rusku a používa sa ako potvrdzujúci test na syfilis Zvyčajne sa vykonáva štúdia, ktorá identifikuje tzv celkové protilátky proti antigénom Treponema pallidum (IgM a IgG), aj keď v niektorých prípadoch je možné stanoviť len „skoré“ protilátky triedy M na syfilis sa stávajú pozitívnymi po 3 týždňoch od okamihu infekcie a zostávajú pozitívne pomerne dlho dlhú dobu aj po liečbe (niekedy doživotne), preto sa ako test potvrdzujúci vyliečenie syfilisu ELISA nerobí vo väčšine prípadov len kvalitatívne stanovenie ELISA - t.j. iba pozitívny alebo negatívny výsledok, hoci je možné aj kvantitatívne stanovenie.
Samoilikov Pavel Vladimirovič stážista oddelenia klinickej laboratórnej diagnostiky
Ruská štátna lekárska univerzita
Imunotestové metódy sú široko používané v lekárskej praxi. Vo všetkých oblastiach modernej medicíny sa imunotesty využívajú najmä na diagnostické a analytické účely. Dôležité je najmä to, že umožňujú identifikovať biologické zložky (hormóny, enzýmy, neuropeptidy, produkty imunitného systému, antigény atď.) v nízkych a veľmi nízkych koncentráciách. Všetky produkty, proti ktorým je možné získať protilátky, sa detegujú týmito metódami.
Imunoanalýza je založená na interakcii antigénu (AG) a protilátky (AT) s použitím rôznych možností značenia jednej zo zložiek (enzým, rádionuklid, fluorescenčné farbivo atď.). Reakcia sa vyhodnocuje automaticky pomocou špeciálneho zariadenia, ktoré umožňuje štandardizáciu týchto metód.
V závislosti od typu použitej značky a podmienok testu sa imunoanalýza označuje ako enzýmová imunoanalýza (ELISA), rádioimunoanalýza (RIA), imunofluorescenčná a iné. Ak sú reakcie usporiadané v jednom alebo viacerých stupňoch, označujú sa ako priame alebo nepriame. Dôležité je prostredie, v ktorom sa reakcia uskutočňuje. Ak sa reakcia uskutočňuje s činidlami fixovanými na povrchu, potom sa test označuje ako tuhá fáza, napríklad ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
V tejto práci sa bude brať do úvahy iba enzýmová imunoanalýza - metóda široko používaná v biológii a medicíne, praktická aj základná.
ELISA sa objavila v polovici 60. rokov a bola pôvodne vyvinutá ako metóda na identifikáciu antigénu v histologickej vzorke, ako aj na vizualizáciu precipitačných línií v imunodifúznych a imunoelektroforéznych testoch a potom sa začala používať na kvantitatívne stanovenie antigénov a protilátok v r. biologické tekutiny. Na vývoji metódy sa podieľali E. Engvall a R. Pählman, ako aj samostatne W. Van Weeman a R. Schurs.
Obrázok 1. Základný princíp ELISA.
1) Identifikovať antigény. 2) Na detekciu protilátok.
Metóda je založená na špecifickej väzbe protilátky na antigén, pričom jedna zo zložiek je konjugovaná s enzýmom ako výsledok reakcie s príslušným chromogénnym substrátom vzniká farebný produkt, ktorého množstvo je možné určiť spektrofotometricky (obr. 1).
Objav možnosti imobilizácie antigénu a protilátky na rôznych nosičoch pri zachovaní ich väzbovej aktivity umožnil rozšírenie použitia ELISA v rôznych oblastiach biológie a medicíny.
Vznik monoklonálnych protilátok prispel k ďalšiemu rozvoju ELISA, čo umožnilo zvýšiť jej senzitivitu, špecifickosť a reprodukovateľnosť výsledkov.
Teoreticky je ELISA založená na údajoch modernej imunochémie a chemickej enzymológie, znalosti fyzikálno-chemických zákonitostí reakcie antigén-protilátka, ako aj na hlavných princípoch analytickej chémie. Citlivosť ELISA a čas, ktorý je potrebný, sú určené niekoľkými hlavnými faktormi: kinetickými a termodynamickými charakteristikami reakcie antigén-protilátka, pomerom činidiel, aktivitou enzýmu a rozlíšením jeho detekčných metód. Vo všeobecnosti možno reakciu antigén-protilátka opísať jednoduchou schémou:
+[AG]↔[ATAG]
Rôznorodosť predmetov štúdia od nízkomolekulových zlúčenín po vírusy a baktérie, ako aj neobvykle široká škála úloh spojených s rôznymi podmienkami použitia ELISA, určujú vývoj extrémne veľkého počtu variantov tejto metódy.
Akákoľvek verzia testu ELISA obsahuje 3 povinné fázy:
1. štádium rozpoznania testovanej zlúčeniny protilátkou pre ňu špecifickou, čo vedie k vytvoreniu imunitného komplexu;
2. štádium vytvorenia spojenia konjugátu s imunitným komplexom alebo s voľnými väzbovými miestami;
3. štádium premeny enzýmovej značky na zaznamenaný signál.
Klasifikácia metód ELISA je založená na niekoľkých prístupoch:
1. Na základe typu reagencií prítomných v prvej fáze ELISA sa rozlišujú kompetitívne a nekompetitívne metódy.
A) V kompetitívnej ELISA v prvej fáze systém obsahuje analyzovanú zlúčeninu aj jej analóg, značené enzýmom a súperiace s ním o špecifické väzbové miesta.
B) Nekompetitívne metódy sú charakterizované prítomnosťou v systéme v prvom stupni iba analyzovanej zlúčeniny a väzbových centier pre ňu špecifických.
2. Všetky metódy ELISA sú rozdelené na homogénne a heterogénne.
Ak všetky tri stupne ELISA prebiehajú v roztoku a medzi hlavnými stupňami nie sú žiadne ďalšie kroky na oddelenie vytvorených imunokomplexov od nezreagovaných zložiek, metóda patrí do homogénnej skupiny.
Základom homogénnej ELISA, používanej spravidla na stanovenie nízkomolekulových látok, je inhibícia aktivity enzýmu pri jeho kombinácii s antigénom alebo protilátkou. Enzýmová aktivita sa obnoví ako výsledok reakcie antigén-protilátka.
Keď sa protilátka viaže na antigén obsahujúci enzýmovú značku, aktivita enzýmu je inhibovaná o 95 % vzhľadom na substrát s vysokou molekulovou hmotnosťou, čo je spôsobené stérickým vylúčením substrátu z aktívneho centra enzýmu. Keď sa koncentrácia antigénu zvýši, naviaže sa viac protilátok a zostane viac voľných konjugátov antigén-enzým, schopných hydrolyzovať substrát s vysokou molekulovou hmotnosťou. Analýza sa vykonáva veľmi rýchlo, jedno stanovenie si vyžaduje 1 minútu. Citlivosť metódy je pomerne vysoká. Môže sa použiť na stanovenie látky na úrovni pikomolov.
Heterogénne metódy sú charakterizované analýzou v dvojfázovom systéme s účasťou pevnej nosnej fázy a povinným stupňom separácie imunitných komplexov od nezreagovaných zložiek (premývanie), ktoré sú v rôznych fázach (vytvorené imunitné komplexy sú na tuhá fáza a nezreagované komplexy sú v roztoku). Heterogénne metódy, pri ktorých dochádza k tvorbe imunitných komplexov v prvom štádiu na pevnej fáze, sa nazývajú metódy na pevnej fáze.
Metódy sa klasifikujú ako homogénne-heterogénne, ak 1. stupeň - tvorba špecifických komplexov nastáva v roztoku a potom sa na oddelenie zložiek použije tuhá fáza s imobilizovaným činidlom.
3. Podľa princípu stanovenia testovanej látky:
A) Priame určenie koncentrácie látky (antigénu alebo protilátky) podľa počtu väzobných miest, ktoré s ňou interagujú. V tomto prípade bude enzýmová značka umiestnená vo vytvorenom špecifickom komplexe AG-AT. Koncentrácia analytu bude priamo úmerná zaznamenanému signálu.
B) Stanovenie koncentrácie látky rozdielom celkového počtu väzobných miest a zostávajúcich voľných väzbových miest. V tomto prípade sa koncentrácia analytu zvýši a zaznamenaný signál sa zníži, preto v tomto prípade existuje inverzný vzťah s veľkosťou zaznamenaného signálu.
Enzýmy.
Enzýmové značky majú mimoriadne silný katalytický účinok, jedna molekula enzýmu môže reagovať s veľkým počtom molekúl substrátu. Enzým prítomný v nepatrných množstvách teda možno identifikovať a kvantifikovať tvorbou produktov a reakciou, ktorú katalyzuje. Ďalšia výhoda použitia enzýmov ako značiek je spôsobená prítomnosťou mnohých funkčných skupín v molekule (sulfhydrylové, karboxylové, tyrazínové zvyšky atď.), prostredníctvom ktorých môžu byť molekuly ligandu kovalentne pripojené.
Enzýmové markery používané v ELISA musia mať nasledujúce vlastnosti:
– vysoká aktivita a stabilita enzýmu v analytických podmienkach, keď je modifikovaný a v konjugáte s protilátkami alebo inými proteínmi;
– prítomnosť citlivých substrátov a jednoduchosť metódy stanovenia produktov alebo substrátov enzymatickej reakcie;
– možnosť prispôsobenia substrátových systémov ďalšiemu spevneniu;
– neprítomnosť enzýmu a jeho inhibítorov v skúmanej biologickej tekutine.
V ELISA sa môže použiť najmenej 15 rôznych enzýmov. Najpoužívanejšie sú v súlade s vyššie uvedenými požiadavkami chrenová peroxidáza (HRP), alkalická fosfatáza (ALP) a β-D-galaktozidáza (tabuľka 1). Všetky tri sú stabilné a katalyzujú vysoko citlivé reakcie. Okrem toho produkty, ktoré sú výsledkom reakcií katalyzovaných týmito enzýmami, v závislosti od použitého substrátu, môžu byť detegované nielen kolorimetrickými metódami, ale aj fluorescenčnými metódami. Ostatné enzýmy sa používajú oveľa menej často. Vysvetľuje to ich nižšia špecifická aktivita v porovnaní s PC a AP.
Substráty.
Výber substrátu je primárne určený enzýmom použitým ako značka, pretože reakcia enzým-substrát je vysoko špecifická.
Základné požiadavky na podklad:
– zabezpečenie vysokej citlivosti metódy pri detekcii enzýmu v konjugáte;
– tvorba dobre rozpoznateľných (napríklad farebných) produktov reakcie enzým-substrát;
– substrát musí byť bezpečný, lacný, prístupný a vhodný na použitie.
Stôl 1.
V ELISA sú najpoužívanejšie enzýmy a ich substráty.
Častejšie sa používajú chromogénne substráty, ktoré po zničení vytvárajú farebnú látku. Sľubné je použitie vysokoenergetických substrátov – fluorescenčných, chemiluminiscenčných. Použitie takýchto substrátov umožňuje teoreticky zvýšiť citlivosť ELISA o dva rády.
Antigény a protilátky.
AG a AT používané v ELISA musia byť vysoko purifikované a vysoko aktívne. Okrem toho musia mať antigény vysokú antigenicitu, optimálnu hustotu a počet antigénnych determinantov, cudzosť a homogenitu. Mnohé syntetické a rekombinantné antigény vírusov a baktérií sa osvedčili pri použití v ELISA. To významne zvýšilo špecificitu a reprodukovateľnosť metódy minimalizovaním krížových reakcií.
Jedným z najdôležitejších činidiel v ELISA sú protilátky. Citlivosť testu ELISA závisí od koncentrácie, aktivity a špecifickosti použitých protilátok. Použité protilátky môžu byť poly- alebo monoklonálne, rôznych tried (IgG alebo IgM) a podtriedy (IgGl, IgG2), antialotypové alebo antiidiotypické. Pri nízkej AT afinite vedie rozpad komplexu AG-AT k odstráneniu naviazaného AG zo systému. Pri použití monoklonálnych protilátok sa zvyšuje citlivosť a špecifickosť metódy. V tomto prípade je možné detegovať nízke koncentrácie AG (AT) v testovaných vzorkách.
Tvorba konjugátu
Konjugát je antigén alebo protilátka značená enzýmovou značkou. Tvorba konjugátu je jedným z dôležitých štádií testu ELISA.
Pri tvorbe konjugátu sa zvolí optimálny spôsob zavedenia enzýmovej značky tak, aby si obe zložky konjugátu zachovali svoju biologickú aktivitu: enzým - schopnosť interagovať so substrátom a antigén alebo protilátka - antigénnosť a väzbová aktivita antigénu. , resp. Prítomnosť značeného, vysoko purifikovaného antigénu umožňuje použitie kompetitívnych metód. V tomto prípade je v konečnom štádiu možné merať aktivitu konjugátu, ktorý nie je spojený s imobilizovanými protilátkami, čím sa vyhne premývaciemu postupu a analýza je pohodlnejšia. Antigény sa však líšia svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami a štruktúrou, čo znamená, že nie je možné vyvinúť univerzálne metódy na získanie konjugátu s antigénom. V tomto prípade je získanie konjugátu antigén-enzým samostatnou komplexnou úlohou. Príprava značených protilátok pre ELISA je metodicky dostupnejšia.
Konjugácia enzýmu s imunochemicky aktívnymi proteínmi sa uskutočňuje rôznymi metódami: chemickým zosieťovaním, kovalentnou väzbou molekuly enzýmu na Ag alebo AT a tvorbou zlúčenín prostredníctvom nekovalentných väzieb, napríklad pri spojení medzi enzýmom a Ag alebo AT sa uskutočňuje imunologicky prostredníctvom interakcie antigén-protilátka.
Najpoužívanejšie sú kovalentné metódy na prípravu konjugátov. Voľba väzbovej reakcie je určená typom funkčných skupín dostupných v daných proteínových molekulách. Glutaraldehyd, jodistan sodný atď. sa používajú ako činidlá používané na zavedenie enzýmu do molekúl antigénu a protilátky.
Existujú jednostupňové a dvojstupňové metódy na získanie konjugátov pomocou glutaraldehydu. Môžu sa vytvárať konjugáty rôznych veľkostí so zníženou enzymatickou aktivitou (15 - 60 % voľného enzýmu). Výsledný konjugát veľkej veľkosti môže stéricky brániť stanoveniu testovanej látky. Konjugáty s relatívne nízkou molekulovou hmotnosťou pozostávajú z fragmentu Fab a jednej molekuly enzýmu.
Výsledkom dvojstupňovej syntézy, ktorá pozostáva z postupnej produkcie enzýmu najprv modifikovaného sieťovacím činidlom, jeho izolácie a následnej interakcie s antigénom (protilátkou), sa molekuly vytvorí sa homogénna kompozícia obsahujúca 1 až 2 molekuly enzýmu na molekulu imunoglobulínu a zachováva si vysokú enzymatickú a imunologickú aktivitu. Počet takýchto vytvorených konjugátov je však malý (pre chrenovú peroxidázu je to 5–10 %).
Najväčšie praktické uplatnenie našiel spôsob získavania imunoperoxidázových konjugátov, založený na oxidácii sacharidovej zložky enzýmu jodistanom sodným (naviazanie peroxidázy do konjugátu dosahuje 70-90 % pôvodného množstva enzýmu).
Spoľahlivý konjugát musí mať nasledujúce vlastnosti:
Vysoký tiger protilátky a vysoká afinita k antigénu, takže ho možno použiť vo vysokom riedení, a tým znížiť nešpecifickú väzbu;
Dostatočná špecifickosť v pracovnom riedení;
Prevaha monomérnych foriem nad polymérnymi, pretože polymérne formy majú tendenciu nešpecificky priľnúť k plastu, čo vedie k vysokej úrovni reakcie;
Optimálny molárny pomer medzi enzýmom a protilátkami (optimálny pomer je asi 1:1);
Dostatočná enzymatická aktivita konjugátu. Túto vlastnosť určujú najmä podmienky konjugácie a pomer molekúl enzýmu a protilátok v konjugáte.
Pevná fáza
Ako pevnú fázu pre ELISA je možné použiť rôzne materiály: polystyrén, polyvinylchlorid, polypropylén a iné látky. Pevnou fázou môžu byť steny skúmavky, 96-jamkové a iné doštičky, guľôčky, guľôčky, ale aj nitrocelulóza a iné membrány, ktoré aktívne absorbujú proteíny.
Imobilizácia antigénu alebo protilátok na pevnej fáze je možná tromi spôsobmi:
– pasívna adsorpcia, založená na silných hydrofóbnych interakciách medzi proteínmi a syntetickým povrchom;
– kovalentná väzba na pevnú fázu;
– imunochemické atď. (nekovalentná a neadsorpčná adícia).
Pasívna adsorpcia proteínov sa široko používa pri vykonávaní testu ELISA na titračných platniach a nitrocelulózových membránach. Pasívna adsorpcia sa riadi princípom nasýtenia a koreluje s molekulovou hmotnosťou adsorbovanej látky. Adsorpčný povrch membrán rôznych typov (nitrocelulóza, nylon atď.) je 100-1000-krát vyšší ako u plastov.
Polysacharidy a vysoko glykozylované proteíny majú často nízku afinitu k polystyrénu. Na ich imobilizáciu sú potrebné iné metódy, ako je kovalentné pripojenie pomocou glutaraldehydu. Kovalentné pripojenie je účinné, keď sa ako pevná fáza použijú hydrofilné guľôčky (agaróza) a polystyrénové guľôčky.
Imunochemické metódy sú založené na použití vopred adsorbovaných „lapačových“ protilátok na imobilizáciu antigénu alebo protilátok. Imunochemicky imobilizovaný antigén je 10-krát aktívnejší ako pasívne adsorbovaný antigén. Môžu sa použiť lektíny alebo imunoglobulín viažuce proteíny z baktérií, ktoré sa ľahko adsorbujú na plastové alebo iné hydrofóbne povrchy, ako je konkanavalín A (Con A) alebo stafylokokový proteín A. Con A je schopný imobilizovať gp 120, proteín vírusu HIV.
Voľné miesta na povrchu tuhej fázy, ktoré nie sú naviazané na sorbované činidlo, môžu počas testu fixovať iné molekuly, vrátane konjugátov, čo vedie k zvýšeniu signálu pozadia. Aby sa zabránilo nešpecifickej väzbe, po imobilizácii sa pevná fáza základného materiálu ošetrí látkami, ktoré sú pre test neutrálne. Najpopulárnejšími blokátormi sú hovädzí sérový albumín (BSA), kazeín atď. Výber blokujúceho činidla a podmienky pre túto fázu závisia od typu tuhej fázy a citlivosti systému.
V súčasnosti sa používa obrovské množstvo rôznych odrôd a modifikácií ELISA. Rozšírili sa rôzne varianty ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
ELISA na pevnej fáze bola navrhnutá v roku 1971. Základné princípy ELISA na pevnej fáze, bez ohľadu na modifikáciu, sú nasledovné:
1. V štádiu 1 reakcie sa antigény alebo protilátky adsorbujú na tuhej fáze. V tomto prípade sa činidlá, ktoré nie sú naviazané na pevnú fázu, ľahko odstránia premytím.
2. Testovaná vzorka sa inkubuje v senzibilizovaných jamkách. Pozitívne kontrolné jamky obsahujú štandardné činidlá. V tomto prípade sa na povrchu tuhej fázy tvoria imunitné komplexy. Nenaviazané zložky sa odstránia praním.
3. Keď sa pridá konjugát protilátka-enzým alebo antigén-enzým a naviaže sa na imobilizovaný imunitný komplex, aktívne miesto enzýmu zostane dostupné pre následnú interakciu so substrátom. Inkubácia substrátu v jamkách s imobilizovaným konjugátom vedie k rozvoju farebnej reakcie. Táto reakcia môže byť zastavená v požadovanom štádiu, závažnosť zafarbenia môže byť hodnotená vizuálne alebo pomocou optickej hustoty.
Dôležitou etapou každého variantu analýzy na pevnej fáze je postup premývania z nenaviazaných činidiel. Je dôležité nielen opláchnuť komponenty fixované v pevnej fáze, ale odstrániť reagencie z celej hĺbky vrstvy. Toto sú časovo a pracovne najnáročnejšie fázy analýzy. Vzorky je možné umývať automaticky pomocou špeciálneho zariadenia - premývačky alebo ručne pomocou viackanálovej pipety. Na vykonanie testu ELISA potrebujete:
– polystyrénové tablety alebo iné použité možnosti tuhej fázy;
- umývací roztok;
– konjugát (enzýmom značené antigény alebo protilátky);
– zmes použitých substrátov;
– zastavovací roztok (Stop reagent – roztok na zastavenie reakcie);
– vzorky použité na pozitívnu a/alebo negatívnu kontrolu;
– štandardný antigén (na zostavenie kalibračnej krivky);
– jedno- a viackanálové pipety;
– podložka (podložka);
– optické zariadenie na stanovenie optickej hustoty testovaného roztoku (čítačka ELISA, čítačka, ktorá sekvenčne fotometruje všetky jamky);
– 5 – 100 µl skúmaného biologického materiálu.
Priama ELISA
1. Antigény alebo protilátky (testovaný materiál) sú adsorbované v jamkách panelov. Vyššie bolo uvedené, že antigény sa výrazne líšia svojou schopnosťou adsorbovať sa na rôznych typoch plastov v závislosti od triedy látok (proteíny, sacharidy alebo lipoproteíny), do ktorých patria. Pri priamom teste ELISA sú antigénom imobilizovaným na pevnej fáze bunky a iné korpuskulárne antigény.
Kontrola. Ako kontrola sa používajú jamky s adsorbovanou pozitívnou kontrolnou vzorkou, ktorá nevyhnutne obsahuje požadovaný antigén, a negatívnou kontrolnou vzorkou, ktorá zjavne neobsahuje skúmaný antigén. Ak je k dispozícii purifikovaný štandardný antigén, reakcia sa uskutoční v niekoľkých riedeniach, aby bolo možné zostaviť kalibračnú krivku.
2. „Zablokujte voľné väzbové miesta zostávajúce na tuhej fáze pomocou BSA kazeínu a iných (na zabránenie nešpecifickej sorpcii konjugátu na tuhej fáze).
3. Enzýmom značené protilátky alebo antigény (konjugát) sa pridajú do jamiek a inkubujú sa. Väzba konjugátu na pevnú fázu nastane iba vtedy, ak sú obe zložky systému komplementárne. Po inkubácii s konjugátom sa jamky premyjú, čím sa odstráni nenaviazaná časť konjugátu.
4. Potom sa do jamiek pridá substrát špecifický pre použitý enzým a inkubuje sa. Po dosiahnutí optimálnej úrovne zafarbenia v jamkách s pozitívnou kontrolou sa enzymatická reakcia zastaví.
5. Účtovanie reakcie. Po prvé, výsledky reakcie sa zohľadňujú vizuálne. Pre presnejšie zaznamenanie výsledkov sa intenzita farbenia hodnotí pomocou čítačky ELISA s vhodným svetelným filtrom. Na základe výsledkov analýzy je zostrojený graf závislosti optickej hustoty od koncentrácie (obr. 2).
Obrázok 2. Priama ELISA.
a) na identifikáciu antigénu; b) na detekciu protilátok.
Táto verzia testu ELISA sa zvyčajne používa na detekciu špecifických protilátok. Štandardný antigén sa adsorbuje do jamiek panelov a inkubuje sa so vzorkami séra alebo iného biologického materiálu získaného od pacienta (cerebrospinálny mok, sliny atď.). Špecifické protilátky naviazané na antigén na pevnej fáze sa detegujú pomocou antiglobulínového konjugátu. V závislosti od účelu analýzy sa používajú rôzne antiglobulínové činidlá, ktoré detegujú protilátky všetkých izotypov alebo špecifické pre jednotlivé triedy a podtriedy imunoglobulínov. Hlavnou výhodou metódy je všestrannosť konjugátu. Rovnaký konjugát sa môže použiť na detekciu ľudských protilátok proti širokej škále antigénov v akejkoľvek vzorke. Reakcia je metodologicky jednoduchá.
Hlavné fázy nepriamej ELISA na stanovenie protilátok:
1. Antigén sa adsorbuje na tuhej fáze, potom sa premyje, aby sa odstránili nenaviazané zložky.
2. Blokujte voľné väzbové miesta. Umyté.
3. Testovaný materiál sa pridá do jamiek, inkubuje sa a potom sa uskutoční premývací postup. Paralelne sa umiestnia vzorky s pozitívnou a negatívnou kontrolou.
4. Pridajte antiglobulínový konjugát do pracovného riedenia, inkubujte a umyte nenaviazané zložky.
5. Pridá sa substrát a inkubuje sa. Po dosiahnutí optimálnej úrovne zafarbenia v jamkách s pozitívnou kontrolou sa reakcia zastaví pridaním zastavovacieho roztoku.
6. Zmerajte množstvo reakčného produktu pomocou čítačky ELISA (obr. 3).
Za optimálnych podmienok analýzy je metóda vysoko špecifická a citlivá. Umožňuje detekovať nanogramové množstvá protilátok v sére študovaných pacientov. Na získanie uspokojivých výsledkov je potrebná štandardizácia činidiel a metodických techník. Táto verzia testu ELISA sa môže použiť aj na testovanie monoklonálnych protilátok.
Antigény detegované pomocou tohto variantu ELISA musia mať viacero epitopov schopných viazať protilátky alebo musia mať opakujúce sa, priestorovo oddelené epitopy s rovnakou špecifickosťou.
Pri vykonávaní tejto verzie testu ELISA sa vysoko špecifické poly- alebo monoklonálne protilátky adsorbované na pevnej fáze inkubujú s testovanou vzorkou. Po premývacom postupe sa do jamiek pridajú enzýmom značené protilátky (konjugát) k rovnakému antigénu a potom sa uskutočnia všetky ostatné stupne reakcie. Účinnosť tvorby špecifického komplexu v každom štádiu analýzy závisí od väzbovej konštanty reakcie antigén-protilátka.
Hlavné fázy analýzy:
1. Monoklonálne protilátky alebo afinitne purifikované polyklonálne protilátky sú imobilizované na pevnej fáze.
2. Testovaná vzorka sa pridá do jamiek panelov a paralelne sa umiestni pozitívna kontrolná vzorka a negatívna kontrolná vzorka v rôznych riedeniach. Inkubujte a umyte.
3. Do jamiek sa pridajú enzýmom značené monoklonálne alebo polyklonálne protilátky – konjugát. Po inkubácii sa uskutoční premytie.
4. Pridá sa substrát a inkubuje sa. Reakcia sa zastaví, keď sa dosiahne optimálne zafarbenie v jamkách s pozitívnou kontrolou.
5. Zaznamenanie výsledkov na čítačke ELISA.
Hlavnou výhodou metódy je jej vysoká citlivosť, ktorá prevyšuje možnosti iných schém ELISA (obr. 4).
Obrázok 3. Nepriama ELISA na detekciu protilátok.
Tento test je založený na kompetícii značených (konjugátov) a neznačených (testovaných) protilátok o väzbu na antigén adsorbovaný na pevnej fáze. Množstvo enzýmu naviazaného na tuhú fázu bude klesať úmerne s obsahom voľných protilátok v zmesi. Na stanovenie antigénu sa používa rovnaká možnosť, ale v tomto prípade požadovaný antigén súťaží so značeným štandardným antigénom o väzbu na protilátky imobilizované na povrchu tuhej fázy.
Konkurenčná metóda vyžaduje minimálny počet operácií, nízku spotrebu činidiel a dá sa ľahko automatizovať. Pri vykonávaní kompetitívnej ELISA na detekciu protilátok je lepšie použiť značené monoklonálne protilátky, potom konjugát súťaží s testovanou vzorkou o jediný epitop antigénu adsorbovaného na pevnej fáze. Táto verzia ELISA sa používa na stanovenie rôznych zlúčenín, ako sú ľudské imunoglobulíny, karcinoembryonálny antigén, inzulín atď. Umožňuje detekciu protilátok proti diagnosticky významným epitopom infekčných agens.
Hlavné fázy analýzy na identifikáciu antigénu (obr. 5):
1. Monoklonálne protilátky špecifické pre detegovaný antigén sú imobilizované na pevnej fáze.
2. Antigén značený enzýmom a testovaná vzorka sa pridajú do jamiek panelov v známej koncentrácii. Uskutoční sa inkubácia a premytie. Paralelne sa do susedných jamiek umiestnia pozitívne a negatívne kontroly. Na vytvorenie kalibrácie sa používa štandardný neznačený antigén v rôznych riedeniach.
3. Pridajte substrát, inkubujte, zastavte reakciu, keď sa v jamkách s pozitívnou kontrolou rozvinie optimálne zafarbenie.
4. Započítanie reakcie na čítačke ELISA.
V tomto prípade je množstvo antigénu v testovanej vzorke nepriamo úmerné enzymatickej aktivite na pevnej fáze.
V tejto verzii testu ELISA sa antigén prítomný v testovanej vzorke viaže na enzýmom značené monoklonálne protilátky a inhibuje ich interakciu so štandardným antigénom imobilizovaným na pevnej fáze. Prítomnosť dokonca stopových množstiev antigénu špecifického pre konjugát vo vzorke bude inhibovať väzbu značených protilátok na imobilizovaný antigén. Stupeň inhibície je priamo úmerný obsahu antigénu v roztoku. Na kvantitatívnu analýzu sa zostrojí kalibračná krivka s použitím sériových riedení štandardného antigénu. Hlavné štádiá inhibičnej ELISA na detekciu antigénu (obr. 6).
1. Štandardný antigén sa adsorbuje do jamiek panelov. Pracovné riedenie značených protilátok sa vyberie titráciou.
Obrázok 4. „Sendvičová“ verzia ELISA.
2. Predinkubácia konjugátu sa vykonáva v zriedení predchádzajúcom pracovnému, s riedením testovanej vzorky, štandardného antigénu a vzoriek pozitívnej kontroly.
3. Zmes sa prenesie do jamiek panelov. Na kontrolu 100 % väzby sa do niekoľkých jamiek pridajú iba značené protilátky bez inhibičného antigénu. Panely sa inkubujú a potom sa umyjú.
4. Pridajte substrát.
5. Zaznamenajte výsledky.
Koncentrácia antigénu v testovanej vzorke je nepriamo úmerná enzymatickej aktivite na pevnej fáze.
ELISA sa môže použiť nielen na stanovenie rozpustného antigénu alebo protilátky, ale aj buniek, ktoré produkujú rôzne proteíny.
V roku 1983 bola technológia ELISA prispôsobená na detekciu lymfoidných buniek vylučujúcich protilátky alebo antigény (napr. cytokíny) in vitro. Metóda sa nazýva ELISPOT (enzyme-linked immunospot spot method). Základný princíp metódy:
1. Na povrchu polystyrénovej jamky (na kultiváciu buniek sa používajú 24-jamkové panely) sa sorbujú antigény alebo protilátky, ktoré slúžia ako „lapacie“ činidlá.
2. Lymfoidné bunky, ktoré majú byť študované, sa pridajú a kultivujú sa niekoľko hodín pri 37 °C, čo im dáva možnosť obsadiť špecifické miesto a vykonávať sekrečnú funkciu. Protilátky alebo antigény vylučované takýmito bunkami sú zachytené činidlami adsorbovanými na pevnej fáze.
3. Bunky sa odstránia pomocou premývacieho roztoku s detergentom, ktorý bunky lýzuje.
4. Oblasti akumulácie sekrečných produktov sa odhalia pridaním protilátok viazaných na enzým (antiglobulínové činidlo).
5. Pridá sa zmes substrátu a agarózy (použité substráty sa musia v agaróze rozpustiť a vytvoriť nerozpustné reakčné produkty), na povrchu tuhej fázy sa vytvoria hnedé alebo modré škvrny (v závislosti od použitých enzýmov a substrátov), ktoré odhalia oblasti, kde bunky sa nachádzali.
Výsledné škvrny sa spočítajú pod mikroskopom, bude to počet vylučujúcich buniek.
Nitrocelulózová membrána môže byť použitá ako pevná fáza. V tomto prípade existuje množstvo výhod: kvôli vysokej adsorpčnej kapacite NCM je potrebné podstatne menšie množstvo antigénu, ktorý sa navyše používa ako „lapač“. , nie je potrebné pridávať agarózu do substrátu.
Súčasným stanovením počtu secernujúcich buniek a celkového množstva secernovaného antigénu alebo protilátky v jamke, čo je možné pri použití iného substrátu, je možné určiť množstvo secernovanej látky jednou bunkou.
Táto metóda sa široko používa na odhad počtu buniek vylučujúcich antigén zachytený adsorbovanými protilátkami, používa sa na stanovenie počtu buniek vylučujúcich cytokíny (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a).
Pri použití vysokoafinitných protilátok je citlivosť jednotlivých variantov ELISA veľmi vysoká a teoreticky umožňuje detekciu jednotlivých molekúl antigénu, ale v praxi je citlivosť limitovaná množstvom faktorov: enzýmovou aktivitou, intenzitou signálu a metódami záznamu signálu. Systémy na zosilnenie signálu umožňujú zvýšiť citlivosť rôznych možností ELISA. Pozrime sa na niektoré z týchto systémov:
Na základe interakcie avidín-biotín.
Molekuly biotínového koenzýmu (mh 244 Da) sú konjugované s protilátkami pomocou biotinyl-N-hydroxysukcímidu. Malá molekula biotínu sa ľahšie pripojí k imunoglobulínu alebo inému proteínu bez narušenia jeho imunitných alebo enzymatických vlastností. Enzým je v tomto prípade spojený s glykoproteínom vaječného bielka avidín. Väzbová afinita avidínu k biotínu je veľmi vysoká (disociačná konštanta komplexu je 10-15 mol), konjugát avidín-enzým je pevne fixovaný na komplex antigén-protilátka-biotín. Po pridaní vhodného substrátu sa reakčný produkt stanoví spektrofotometricky alebo intenzitou luminiscencie.
Jedna molekula avidínu pozostáva zo štyroch identických podjednotiek a je schopná interagovať so štyrmi molekulami biotínu, čo umožňuje jej použitie ako spojovacej molekuly medzi dvoma zlúčeninami obsahujúcimi biotín. V tomto prípade je enzým tiež biotinylovaný a avidín pôsobí ako mostík spájajúci dve molekuly obsahujúce biotínové zvyšky. K výslednému komplexu antigén-protilátka-biotín sa pridá voľný avidín a potom biotinylovaný enzým. Reakcia sa berie do úvahy.
Proteín avidín sa môže nešpecificky adsorbovať na iné molekuly, takže sa čoraz viac používa ďalší proteín viažuci biotín, streptavidín, ktorý sa nachádza v baktériách Streptomyces avidinii. Streptavidín tiež tvorí silný komplex s biotínom a pozostáva zo štyroch rovnakých podjednotiek.
Použitie komplexu avidín-biotín môže výrazne zvýšiť citlivosť ELISA, pretože pri syntéze konjugátu s jednou molekulou AT sa môžu viazať desiatky molekúl biotínu. Získanie konjugátov (protilátok a enzýmov s biotínom) je pomerne jednoduché a je sprevádzané minimálnymi zmenami v ich imunologickej a enzymatickej aktivite. Enzýmové konjugáty s biotínom možno použiť ako univerzálne činidlá.
Použitie chemiluminiscenčných reakcií.
Chemiluminiscenčné reakcie možno použiť na získanie signálu v ELISA, čo zvyšuje citlivosť metódy a skracuje čas analýzy. Chrenová peroxidáza je široko používaná ako značka v ELISA, na jej detekciu sa môžu použiť aj rôzne chemiluminiscenčné reakcie. Chemiluminiscenčné reakcie sú založené na schopnosti luminolu žiariť pri oxidácii peroxidom vodíka. Pri priamej analýze enzymatická reakcia produkuje peroxid vodíka a oxiduje luminol, táto reakcia je katalyzovaná chrenovou peroxidázou. Na zosilnenie signálu sa používajú rôzne zlúčeniny, napríklad luciferín, fenoly, v tomto prípade sa intenzita luminiscencie zvýši 10-100-krát, v niektorých prípadoch 500-krát (vylepšená chemiluminiscenčná analýza). Luminiscenčný signál je veľmi stabilný, jeho úroveň dosiahne maximum za 30 s (pre porovnanie: farebná reakcia s OFD ako indikátorom sa naplno rozvinie až za 30 min).
Pri nepriamej analýze je protilátka značená luminolom alebo jeho derivátmi. Takáto značka vo voľnom stave môže byť oxidovaná peroxidom vodíka, pričom sa uvoľňuje svetlo. Ak vytvoril komplex, stráca schopnosť oxidovať.
Založené na kaskádových systémoch.
Na zvýšenie citlivosti testu ELISA možno použiť systémy enzýmovej kaskády. V tomto prípade prvý enzým naviazaný na protilátku produkuje redukovateľný substrát pre druhý enzýmový systém. Druhý enzýmový systém môže byť substrát-cyklický alebo redoxycyklický. V tomto prípade môžu ako enzýmové značky slúžiť fosfo-glukoizomeráza, aldoláza a alkalická fosfatáza. Konečný reakčný produkt sa stanoví vizuálne alebo spektrofotometricky.
Amplifikačné systémy ELISA môžu dosiahnuť vysokú citlivosť. Takéto systémy ELISA sa používajú na stanovenie hladiny hormónov (stimulujúcich štítnu žľazu, progesterónu atď.).
ELISA našla široké uplatnenie v rôznych oblastiach medicíny a biológie vďaka relatívnej jednoduchosti a vysokej citlivosti metódy. ELISA sa úspešne používa na:
Hromadná diagnostika infekčných chorôb (detekcia rôznych špecifických antigénov alebo protilátok proti nim);
Detekcia a stanovenie hladiny hormónov a liečiv v biologických vzorkách;
Stanovenie izotypov (IgG, IgM a iné) protilátok proti špecifickému antigénu;
Identifikácia imunitných komplexov;
Identifikácia nádorových markerov;
Stanovenie sérových proteínov (feritín, fibronektín atď.);
Stanovenie celkového IgE a špecifických IgE protilátok;
Skríning myoklonálnych protilátok;
Stanovenie cytokínov v biologických tekutinách.
Citlivosť metódy
ELISA nahradila aglutinačné, precipitačné a RIA metódy, ktoré boli predtým široko používané v klinickej praxi. V porovnaní s vyššie uvedenými metódami je ELISA menej prácna a časovo menej náročná a je vhodná na vykonávanie veľkého počtu podobných testov.
ELISA kombinuje jedinečnú špecifickosť imunochemického testu s vysokou citlivosťou stanovenia enzýmovej značky. Citlivosť metódy (senzitivitou sa rozumie minimálne detegovateľné množstvo protilátok alebo antigénu) je určená nasledujúcimi faktormi: afinita protilátok, výhodné je použitie monoklonálnych protilátok; špecifická enzýmová aktivita; intenzita signálu; citlivosť merania signálu. Rôzne možnosti ELISA sa líšia svojou citlivosťou. Určité varianty ELISA na pevnej fáze umožňujú detegovať jednotlivé molekuly vo vzorke. Priemerná citlivosť ELISA je 10-9 – 10-12 mol.
Galaktionov V.G. Imunológia. Vydavateľstvo Moskovskej univerzity, 1998
Kishkun A.A. Imunologické štúdie a metódy diagnostiky infekčných ochorení v klinickej praxi. Lekárska informačná agentúra, 2009
Kondratyeva I.A. Workshop o imunológii. Učebnica pre vysoké školy. Akadémia, 2004
Lefkovits I., Pernis B. Imunologické metódy výskumu. Svet, 1988
Royt A., Brostoff D., Meil D. Svet, 2000
Sokolov E.I. Klinická imunológia. Medicína, 1998
Frimel G. Imunologické metódy. Medicína, 1987
Khaitov R. M. Imunológia. Medicína, 2000
Shigina Yu.V. Imunológia: Učebnica. Vydavateľstvo RIOR, 2007
Yarilin A.A. Základy imunológie. Medicína, 1999
