Genetinė rekombinacija transformacijos metu. Transdukcija bakterijose. Bendroji ir specifinė transdukcija. Transformacijos ir transdukcijos panaudojimas genų kartografavimui. Fagų transdukcija Nespecifinė transdukcija

Transformacija

Transformacija – tai grynos DNR perkėlimas iš vienos ląstelės į kitą. Transformaciją atrado bakteriologas F. Griffithsas 1928 m., atlikdamas eksperimentus su pneumokokais. Pneumokokai turi dviejų tipų padermes: S ir R formas.

S formai būdinga polisacharidinė kapsulė, dėl kurios dirbtinai auginant susidaro lygios blizgios kolonijos; ši forma yra patogeniška pelėms. Dirbtinai auginama R forma neturi kapsulės, formuoja šiurkščias kolonijas; ši forma nėra patogeniška pelėms. Tačiau jei pelėms vienu metu suleidžiamos nužudytos S ląstelės ir gyvos R ląstelės, pelės miršta. Todėl vienos padermės genetinės savybės turi įtakos kitos padermės genetinėms savybėms.

1944 metais O. Avery, K. McLeod ir M. McCarthy įrodė, kad paveldimų ląstelių savybių pokyčiai yra susiję su DNR perkėlimu.

Ląstelės gebėjimas transformuotis įmanomas esant ypatingai jos sąlygai, kuri vadinama kompetencija. Kompetentingose ląstelėse keičiasi ląstelės sienelės ir plazmolemos sudėtis: sienelė tampa porėta, plazmalema suformuoja daugybę invaginacijų, o išoriniame paviršiuje atsiranda specialūs antigenai – kompetencijos faktoriai (ypač specifiniai mažos molekulinės masės baltymai).

Natūraliomis sąlygomis tarpląstelinė gryna DNR susidaro prokariotų mirties (lizės) metu.

Paprastai transformacija vyksta vienoje prokariotų rūšyje, tačiau, esant homologiniams genams, stebima ir tarprūšinė transformacija.

Transformacijos procesas apima šiuos etapus:

1. Transformuojančios dvigrandės DNR prijungimas prie receptorių ląstelės recipiento paviršiuje.

2. Dvigrandės DNR pavertimas viengrande.

3. Viengrandės DNR įsiskverbimas į ląstelę.

4. Transformuojančios DNR integravimas į recipiento chromosomą ir genetinės medžiagos rekombinacija.

Transformuojančios DNR ilgis turėtų būti nuo 500 iki 200 tūkstančių bp. Energija, išsiskirianti skaidant vieną iš DNR grandinių, naudojama aktyviam likusios grandinės transportavimui į ląstelę.

Pirmieji trys transformacijos etapai nepriklauso nuo DNR nukleotidų sudėties. Tačiau transformuojančios DNR integracijos į recipiento chromosomą procesas yra labiau tikėtinas, jei ši DNR yra labai homologiška recipiento DNR.

Transformacijos procesas pavaizduotas diagramoje. Kiekvienas tiesios linijos segmentas atitinka vieną DNR grandinę. Transformuojanti DNR pažymėta juoda spalva, o recipiento ląstelės DNR pažymėta pilka spalva.

Pirmajame etape transformuojanti DNR prisijungia prie receptorių vietų recipiento ląstelės paviršiuje.

Antrame etape dvigrandė DNR ląstelės paviršiuje paverčiama viengrande DNR dėl vienos iš grandinių suskaidymo bakterijų nukleazėmis.

Trečiajame etape likusi DNR grandinė pernešama per membraną į citoplazmą. Tam naudojama energija, išsiskirianti papildomos grandinės irimo metu.

Bakterijos chromosomos replikacijos metu transformuojanti DNR grandinė yra prijungta prie homologinės (iš dalies komplementarios) ląstelės recipiento DNR srities. Šiuo atveju dėl visiško komplementarumo stokos susidaro heterodupleksas („molekulinis heterozigotas“) - dvigrandės DNR sekcija, kurioje ne visose nukleotidų porose yra azoto bazių, sujungtų vandenilio ryšiais. Likusi DNR dalis replikuojasi normaliai.

Pasibaigus DNR replikacijai, ląstelė recipientas dalijasi ir susidaro dvi ląstelės: iš dalies transformuota ląstelė su chromosoma, apimančia heterodupleksinę DNR sritį, ir netransformuota ląstelė. DNR replikacijos metu iš dalies transformuotoje ląstelėje abiejose DNR grandinėse užbaigiamos papildomos grandinės. Viena grandinė išlaiko pradines nukleotidų sekas, o kita visiškai transformuojama. Pasidalijus iš dalies transformuotai ląstelei, susidaro viena netransformuota ir viena visiškai transformuota ląstelė, kurioje pradinė nukleotidų seka pakeičiama transformuojančios DNR nukleotidų seka.

Taigi transformacijos metu įvyksta ne naujų genų pridėjimas, o recipiento genų pakeitimas homologinėmis nukleotidų sekomis.

Transformacijos dažnis prokariotuose priklauso nuo transformuojančios DNR savybių, jos koncentracijos, ląstelės recipientės būklės ir bakterijų tipo. Didžiausias transformuotų ląstelių dažnis neviršija 1 iš 100 ląstelių.

Transformacija taip pat žinoma eukariotams. Tačiau eukariotinių ląstelių paviršiuje nėra receptorių vietų, o transformuojanti DNR dirbtinai įvedama į ląsteles. Pavyzdžiui, DNR į gyvūnų kiaušinėlius įvedama tiesiogine mikroinjekcija, o į augalų kiaušinėlius – mikroinjekcija į žiedadulkių vamzdelį.

Transdukcija yra genetinės medžiagos perkėlimas naudojant virusus iš donoro ląstelės į recipiento ląstelę.

Transdukcijos fenomeną 1951 metais atrado N. Zinder (J. Lederbergo mokinys).

Transdukcijos metu DNR iš šeimininko ląstelės patenka į virionus. Virionai užkrečia kitas ląsteles, o pirminės bakterinės ląstelės DNR patenka į kitą bakterijos ląstelę. Virusinė DNR integruojasi į bakterijų chromosomą, o įvesta bakterinė DNR rekombinuoja su bakterijų chromosomos DNR. Dėl to 50% ląstelių transformuojasi.

Yra bendra (nespecifinė), ribota (specifinė) ir abortinė transdukcija.

Bendroji transdukcija

Bendrosios transdukcijos metu donoro bakterijų DNR fragmentai atsitiktinai įtraukiami į bręstančio fago dalelę kartu su fago DNR arba vietoj fago DNR. Bakterijos DNR fragmentai susidaro, kai ją supjausto fagas kontroliuojamas fermentas. Fago dalelėje gali būti iki 100 bakterijų genų.

Ribotas perdavimas

Esant ribotai transdukcijai, vyksta rekombinacija – bakterijų DNR pakeičia dalį fago DNR. Rekombinantinėje DNR yra nedidelis skaičius bakterijų genų, esančių šalia fago DNR, integruotos į bakterijų chromosomą.

Bendroje ir ribotoje transdukcijoje donoro DNR pakeičia homologines recipiento DNR sritis. Šis procesas yra panašus į transformaciją.

Abortyvi transdukcija gali būti ir nespecifinė, ir specifinė. Jo esmė slypi tame, kad fago perduotas DNR fragmentas nėra įtrauktas į recipiento chromosomą, bet egzistuoja kaip citoplazminis replikonas. Anksčiau ar vėliau šis replikonas prarandamas.

Virusų transdukcijos reiškinys plačiai naudojamas genų perkėlimui eukariotuose. Jei naudojamas virusas, kuris negali sudaryti kapsidės (tai yra, egzistuoja tik DNR pavidalu), tada transdukcija iš esmės nesiskiria nuo transformacijos arba nuo konjugatyvaus genetinės medžiagos perkėlimo naudojant plazmidinius vektorius. Sukurtos vektorinės sistemos pagal modifikuotus SV40 virusus (ląstelėje jie sudaro iki 100 tūkst. kopijų), pūslelinės, vakcinijos, žiedinių kopūstų mozaikos virusų.

Dar kartą reikia pabrėžti, kad visi aprašyti rekombinacijos tipai yra susiję ne su naujų DNR sekcijų pridėjimu, o su esamų nukleotidų sekų pakeitimu. Kuo didesnis homologijos laipsnis tarp transformuojančios ir pradinės DNR, tuo didesnė sėkmingos rekombinacijos tikimybė. Lengviausias būdas pasiekti rekombinaciją yra fermentai, esantys visuose organizmuose. Sunkiau įvesti naujus reguliatorius, kurie yra labai specifiniai į genomą. Todėl naujų genų įvedimui į genomą naudojami sudėtingesni metodai, susiję su biocheminėmis DNR modifikacijomis.

Bendrosios transdukcijos metu fago dalelės, turinčios ląstelės šeimininkės DNR segmentus, perneša santykinai ilgus genominės DNR ruožus iš vienos bakterinės ląstelės į kitą. Transdukuojančios fago dalelės susidaro tam tikrų infekcinių procesų metu, kai ląstelės DNR yra efektyviai suardoma ir fragmentai

ląstelės DNR, maždaug fago genomo dydžio, netyčia supakuota į subrendusias bakteriofagų daleles. Dėl vėlesnio bakterijų ląstelių užkrėtimo fagų dalelių populiacija, įskaitant transdukuojančius fagus, pastarųjų pagalba donorų ląstelių DNR perkeliama į šias užkrėstas ląsteles. Rekombinacija tarp įvestų donoro DNR fragmentų ir ląstelės recipiento DNR lemia pastarosios genotipo pasikeitimą.

Kiekvienoje transdukuojančioje fago dalelėje paprastai yra tik vienas atsitiktinis pradinės donoro chromosomos fragmentas. Tikimybė įtraukti į tokią dalelę bet kurią donoro genomo dalį yra maždaug tokia pati. Tačiau dėl gana didelio transdukuotų DNR segmentų dydžio (tam tikriems bakteriofagams tai yra apie 100 kb, arba 2,5 proc. visos E. coli chromosomos) ląstelė recipientė per vieną transdukcijos veiksmą dažniausiai įgyja visą genų grupę. . Dėl to genai, glaudžiai susiję vienas su kitu donoro chromosomoje, kotransdukuojami dideliu dažniu, o vienas nuo kito nutolę genai transdukuojami nepriklausomai. Genų kotransdukcijos dažnio nustatymas padeda patobulinti genetinius žemėlapius, nes leidžia įvertinti santykinius atstumus tarp glaudžiai susijusių genų. 3 Specifinė (ribota) transdukcija

Antrojo tipo, specifinio, transdukcija būdinga vidutinio klimato bakteriofagams, kurių infekcinis ciklas nutrūksta dėl viruso genomo įtraukimo į specifinį užkrėstos ląstelės DNR chromosomų lokusą. Bakterijos, turinčios tokius integruotus fagų genomus, vadinamos lizogeninis. Jie turi virusų genomus kaip paveldimus savo chromosomų elementus. Lizogeninėje ląstelėje viruso ir ląstelių genomai replikuojasi kaip vienas vienetas ir yra tarpusavyje suderinami. Fago genomo integracija su ląstelės-šeimininkės genomu atima fago gebėjimą sukelti ląstelių mirtį ir gaminti infekcinius palikuonis. Dėl šios priežasties bakteriofagas

galintis lizogenezei, skirtingai nei virulentiškas fagas, pavadintas saikingai.

Tam tikromis sąlygomis - indukcija- lizogeninė būsena nutraukiama ir viruso genomas išpjaunamas iš šeimininko chromosomos. Jis replikuojasi, sudarydamas daugybę virusinių dalelių ir naikina ląstelę. Paprastai viruso genomo pašalinimas vyksta labai tiksliai ir gautame fage yra viruso genomas, kuris visiškai atitinka pradinį.

Kartais fago genomas nupjaunamas neteisingai ir chromosomų genai patenka į dukterines fago daleles, gretimasį integruotą viruso genomą. Šie genai yra įjungti vietoj kai kurių virusų genų. Kito infekcijos ciklo metu donoro ląstelės genai kartu su fago genais perkeliami į recipiento ląsteles. Po to, kai transdukuojančio fago DNR yra įtraukta į recipiento genomą, ląstelė kartu su fago genomu įgyja ir ankstesnio fago šeimininko genetinę informaciją.

Taigi, specifinės transdukcijos metu fagas tarnauja kaip vektorius, pernešantis genus iš vienos ląstelės į kitą. Naudojant šį mechanizmą, transdukuojami tik tie šeimininko ląstelės chromosominiai genai, kurie yra glaudžiai susiję su viruso genomo integracijos vieta.

Kadangi skirtingi vidutinio klimato fagai įsiterpia į skirtingas chromosomų vietas, juos neteisingai išpjaunant, susidaro fagai, kurie transdukuoja skirtingus chromosomų genus. Taigi fagai lambda transdukuoja genus, atsakingus už galaktozės apykaitą arba genus, kontroliuojančius biotino sintezę, o f80 fagai transdukuoja skirtingą skaičių genų, koduojančių triptofano biosintezės fermentus.

Fago genomas gali atlikti specifinę transdukciją, jei:

1 Jis turi įgyti kovalentiškai susietą nevirusinės DNR segmentą, kuris bus transdukuotas. Šis DNR segmentas dažniausiai yra ląstelinės kilmės, tačiau iš esmės jis gali būti bet kokio šaltinio. Jei yra, jis gali būti įterptas bet kurioje viruso genomo vietoje

neturi įtakos viruso DNR replikacijai užkrėstoje šeimininko ląstelėje arba jos gebėjimui supakuoti į subrendusias fago daleles.

2 Fago genomas turi turėti galimybę replikuotis po to, kai užsikrėtė ląstelė recipientas, t.y. Viruso DNR turi išlaikyti replikacijos pradinę sritį (OP) ir replikacijai reikalingus genus.

3 Fagų genai, koduojantys struktūrinius fagų baltymus, turi būti funkciškai aktyvūs.

Specifinė transdukcija plačiai naudojama molekulinėje genetikoje. Panagrinėkime vieną tokio šio reiškinio taikymo pavyzdį. E. coli geno, koduojančio fermento beta-galaktozidazės sintezę, yra 3600 bp. ir sudaro vieną tūkstantąją tam tikro mikroorganizmo genomo dalį. Jei bakterijos ląstelės DNR fragmentas, koduojantis beta-galaktozidazės sintezę, įterpiamas į transdukuojančio bakteriofago lambda genomą, jis ten užima penkioliktąją dalį, tai yra, lambda fago DNR yra praturtinta beta-galaktozidazės genu. 100 kartų daugiau nei E. coli DNR.

Bendroji transdukcija

Jo mechanizmas yra tas, kad tarpląstelinio fago dauginimosi metu bakterijos DNR fragmentas, lygus fago DNR ilgiui, gali atsitiktinai patekti į jo galvą, o ne į fago DNR. Tai visiškai įmanoma, nes užkrėstoje ląstelėje jos DNR biosintezė yra blokuojama, o pati DNR yra suyra. Taigi fagų dauginimosi proceso metu atsiranda brokuotų virionų, kurių galvutėse vietoj jų pačių genominės DNR yra bakterijos DNR fragmentas. Tokie fagai išlaiko infekcines savybes. Jie adsorbuojami ant bakterinės ląstelės, į ją įvedant galvoje esančią DNR, tačiau fagas nesidaugina. Donoro DNR (donoro chromosomos fragmentas), įvesta į recipiento ląstelę, jei joje yra genų, kurių recipiente nėra, suteikia jai naują požymį. Šis bruožas priklausys nuo to, kuris (-i) genas (-ai) yra transdukuojančio fago galvoje. Fago įvesto donoro DNR fragmento rekombinacijos su ląstelės recipiento chromosoma atveju šis požymis yra paveldimas.

Specifinė transdukcija

Jis skiriasi nuo nespecifinio tuo, kad šiuo atveju transdukuojantys fagai visada perkelia tik tam tikrus genus, būtent tuos, kurie yra lizogeninės ląstelės chromosomoje į kairę nuo attL arba į dešinę nuo attR. Specifinė transdukcija visada yra susijusi su vidutinio klimato fago integracija į šeimininko ląstelės chromosomą. Išeidamas (išskirdamas) iš chromosomos, profagas gali užfiksuoti geną iš kairiojo arba dešiniojo šono, pavyzdžiui, gal arba bio. Tačiau šiuo atveju jis turi prarasti tą patį DNR kiekį iš priešingo galo, kad jo bendras ilgis liktų nepakitęs (kitaip jis negali būti supakuotas į fago galvutę). Todėl su šia išskyrimo forma susidaro defektiniai fagai: A - dgal arba Xdbio.

Specifinė transdukcija į E. coli atlieka ne tik lambda fagas, bet ir giminingas lambdoidas bei kiti fagai. Priklausomai nuo attB vietų vietos chromosomoje, kai jos neįtraukiamos, jos gali įjungti įvairius bakterijų genus, susietus su profagu, ir perkelti juos į kitas ląsteles. Į genomą integruota medžiaga gali pakeisti iki 1/3 fago genetinės medžiagos.

Kai ląstelė recipientas yra užkrėstas, transdukuojantis fagas integruojasi į jos chromosomą ir įveda į ją naują geną (naują požymį), tarpininkaujant ne tik lizogenizacijai, bet ir lizogeninei konversijai.

Taigi, jei nespecifinės transdukcijos metu fagas yra tik pasyvus genetinės medžiagos nešėjas, tai specifinės transdukcijos metu fagas šią medžiagą įtraukia į savo genomą ir perduoda ją, lizogenizuodamas bakterijas, recipientui. Tačiau lizogeninė konversija taip pat gali įvykti, jei vidutinio klimato fago genome yra savų genų, kurių ląstelė neturi, bet yra atsakingi už esminių baltymų sintezę. Pavyzdžiui, tik tie difterijos sukėlėjai, kurių profagas yra vidutinio sunkumo, turintis tokso operoną, yra integruoti į savo chromosomas, kad susidarytų egzotoksinas. Jis yra atsakingas už difterijos toksino sintezę. Kitaip tariant, vidutinio klimato fagų toksas sukelia lizogeninį netoksigeninės difterijos bacilos pavertimą toksine.

Ryžiai. 4.

1 - taškinis testas; 2 - titravimas pagal Grazia.

Agaro sluoksnio metodas yra toks. Pirmiausia į puodelį pilamas maistinio agaro sluoksnis. Po sukietėjimo į šį sluoksnį įpilama 2 ml 0,7% agaro, ištirpinto ir atšaldyto iki 45 °C, į kurį pirmiausia įlašinamas lašelis koncentruotos bakterijų suspensijos ir tam tikras tūris fago suspensijos. Kai viršutinis sluoksnis sukietėja, puodelis dedamas į termostatą. Minkštame agaro sluoksnyje bakterijos dauginasi, sudarydamos vientisą nepermatomą foną, kuriame sterilių dėmių pavidalu aiškiai matomos fagų kolonijos (4.2 pav.). Kiekviena kolonija susidaro padauginus vieną pradinį fago virioną. Šio metodo naudojimas leidžia:

a) skaičiuodami kolonijas, tiksliai nustatykite gyvybingų fagų virionų skaičių tam tikroje medžiagoje;

b) remdamiesi būdingais požymiais (dydžiu, skaidrumu ir kt.), ištirkite paveldimą V fagų kintamumą.

Pagal veikimo spektrą bakterijoms fagai skirstomi į daugiavalentis(su lize susijusios bakterijos, pavyzdžiui, polivalentinis Salmonella fagas lizuoja beveik visas salmoneles), monofagas(jos lizuoja tik vieno tipo bakterijas, pvz., fagas Vi-I lizuoja tik vidurių šiltinės patogenus) ir būdingas tipui fagai, kurie selektyviai lizuoja tam tikrus rūšies bakterijų variantus. Tokių fagų pagalba atliekama subtiliausia bakterijų diferenciacija rūšies viduje, suskirstant jas į fagų variantus. Pavyzdžiui, naudojant fagų rinkinį Vi-II, vidurių šiltinės sukėlėjas suskirstomas į daugiau nei 100 fagų variantų. Kadangi bakterijų jautrumas fagams yra gana stabilus požymis, susijęs su atitinkamų receptorių buvimu, fagų tipavimas turi svarbią diagnostinę ir epidemiologinę reikšmę.

Vadovėlis susideda iš septynių dalių. Pirmoje dalyje – „Bendroji mikrobiologija“ – pateikiama informacija apie bakterijų morfologiją ir fiziologiją. Antroji dalis skirta bakterijų genetikai. Trečioje dalyje – „Biosferos mikroflora“ – nagrinėjama aplinkos mikroflora, jos vaidmuo medžiagų cikle gamtoje, taip pat žmogaus mikroflora ir jos reikšmė. Ketvirta dalis – „Infekcijos tyrimas“ – skirta mikroorganizmų patogeninėms savybėms, jų vaidmeniui infekciniame procese, taip pat pateikiama informacija apie antibiotikus ir jų veikimo mechanizmus. Penktoje dalyje – „Imuniteto doktrina“ – pateikiamos šiuolaikinės idėjos apie imunitetą. Šeštoje dalyje – „Virusai ir jų sukeliamos ligos“ – pateikiama informacija apie pagrindines virusų biologines savybes ir jų sukeliamas ligas. Septintoje dalyje – „Privati medicinos mikrobiologija“ – pateikiama informacija apie daugelio infekcinių ligų sukėlėjų morfologiją, fiziologiją, patogenines savybes, šiuolaikinius jų diagnostikos, specifinės profilaktikos ir terapijos metodus.

Vadovėlis skirtas aukštųjų medicinos mokyklų, universitetų studentams, magistrantams ir dėstytojams, visų specialybių mikrobiologams ir praktikuojantiems gydytojams.

5-asis leidimas, pataisytas ir išplėstas

Knyga:

<<< Назад

Pirmyn >>>

Jis skiriasi nuo nespecifinio tuo, kad šiuo atveju transdukuojantys fagai visada perkelia tik tam tikrus genus, būtent tuos, kurie yra lizogeninės ląstelės chromosomoje į kairę nuo attL arba į dešinę nuo attR. Specifinė transdukcija visada yra susijusi su vidutinio klimato fago integracija į šeimininko ląstelės chromosomą. Išeidamas (išskirdamas) iš chromosomos, profagas gali užfiksuoti geną iš kairiojo arba dešiniojo šono, pavyzdžiui, gal arba bio. Tačiau šiuo atveju jis turi prarasti tą patį DNR kiekį iš priešingo galo, kad jo bendras ilgis liktų nepakitęs (kitaip jis negali būti supakuotas į fago galvutę). Todėl, esant tokiai išskyrimo formai, susidaro defektiniai fagai: ?dgal arba ?dbio.

Specifinė transdukcija į E. coli atlieka ne tik lambda fagas, bet ir giminingi lambdoidiniai bei kiti fagai. Priklausomai nuo attB vietų vietos chromosomoje, kai jos neįtraukiamos, jos gali įjungti įvairius bakterijų genus, susietus su profagu, ir perkelti juos į kitas ląsteles. Į genomą integruota medžiaga gali pakeisti iki 1/3 fago genetinės medžiagos.

Taigi, jei nespecifinės transdukcijos metu fagas yra tik pasyvus genetinės medžiagos nešėjas, tai specifinės transdukcijos metu fagas šią medžiagą įtraukia į savo genomą ir perduoda ją, lizogenizuodamas bakterijas, recipientui. Tačiau lizogeninė konversija taip pat gali įvykti, jei vidutinio klimato fago genome yra savų genų, kurių ląstelė neturi, bet yra atsakingi už esminių baltymų sintezę. Pavyzdžiui, tik tie difterijos sukėlėjai, kurių profagas yra vidutinio sunkumo, turintis tokso operoną, yra integruoti į savo chromosomas, kad susidarytų egzotoksinas. Jis yra atsakingas už difterijos toksino sintezę. Kitaip tariant, vidutinio klimato fagų toksas sukelia netoksigeninės difterijos bacilos lizogeninį pavertimą toksine.

Agaro sluoksnio metodas yra toks. Pirmiausia į puodelį pilamas maistinio agaro sluoksnis. Po sukietėjimo į šį sluoksnį įpilama 2 ml 0,7% agaro, ištirpinto ir atšaldyto iki 45 °C, į kurį pirmiausia įlašinamas lašelis koncentruotos bakterijų suspensijos ir tam tikras tūris fago suspensijos. Kai viršutinis sluoksnis sukietėja, puodelis dedamas į termostatą. Minkštame agaro sluoksnyje bakterijos dauginasi, sudarydamos vientisą nepermatomą foną, kuriame sterilių dėmių pavidalu aiškiai matomos fagų kolonijos (84 pav., 2). Kiekviena kolonija susidaro padauginus vieną pradinį fago virioną. Šio metodo naudojimas leidžia: a) skaičiuojant kolonijas, tiksliai nustatyti gyvybingų fagų virionų skaičių tam tikroje medžiagoje;

b) tirti paveldimą fagų kintamumą pagal būdingus požymius (dydžiu, skaidrumu ir kt.).

Pagal veikimo spektrą bakterijoms fagai skirstomi į daugiavalentis(su lize susijusios bakterijos, pavyzdžiui, polivalentinis Salmonella fagas lizuoja beveik visas salmoneles), monofagas(jos lizuoja tik vieno tipo bakterijas, pvz., fagas Vi-I lizuoja tik vidurių šiltinės sukėlėjus) ir būdingas tipui fagai, kurie selektyviai lizuoja tam tikrus rūšies bakterijų variantus. Tokių fagų pagalba atliekama subtiliausia bakterijų diferenciacija rūšies viduje, suskirstant jas į fagų variantus. Pavyzdžiui, naudojant Vi-II fagų rinkinį, vidurių šiltinės sukėlėjas skirstomas į daugiau nei 100 fagų variantų. Kadangi bakterijų jautrumas fagams yra gana stabilus požymis, susijęs su atitinkamų receptorių buvimu, fagų tipavimas turi svarbią diagnostinę ir epidemiologinę reikšmę.

Ryžiai. 84. Bakteriofagų aptikimas tiriamojoje medžiagoje:

1 – taškinis testas; 2 – titravimas pagal Grazia

<<< Назад

Pirmyn >>>

FEDERALINĖ ŠVIETIMO AGENTŪRA
VALSTYBINĖ AUKŠTOJO MOKYMO ĮSTAIGA
PROFESINIS IŠSIlavinimas
IRKUTSK VALSTYBINIS UNIVERSITETAS
(GOU VPO ISU)
Biologijos ir dirvožemio mokslų fakultetas
Mikrobiologijos katedra

Esė
mikroorganizmų citologija
Transdukcija ir transformacija bakterijose

Atlikta:
studentas gr.04331-DS
Kuznecova E.A.
Patikrinta: k.b. n
Makarova A.P.

Irkutskas 2012 m
Turinys

2.1 Tyrimo istorija………………………………………………………………..9
2.2 Transformacija prokariotuose……………………………………….9
2.3 Bakterijų transformacijos stadijos……………………………………………

Transdukcija bakterijose
Transdukcija (iš lot. transduct io – judėjimas) – tai ląstelės, kurioje iš pradžių buvo bakteriofagas, genetinės medžiagos fragmentų perkėlimas į užkrėstą ląstelę bakteriofagu. Transdukuojantis bakteriofagas paprastai perkelia tik nedidelį šeimininko DNR fragmentą iš vienos ląstelės (donoro) į kitą (recipientą).
Transdukuoti gali ir vidutinio klimato fagai, ir virulentiniai, tačiau pastarieji sunaikina bakterijų populiaciją, todėl transdukcija jų pagalba neturi didelės reikšmės nei gamtoje, nei tyrimuose.

Tyrimo istorija
Esther Lederberg buvo pirmoji mokslininkė, 1950 metais iš Escherichia coli K-12 išskyrusi bakteriofagą lambda, DNR virusą.
Tikrasis transdukcijos atradimas siejamas su amerikiečių mokslininko Joshua Lederbergo vardu. 1952 m. jis ir Nortonas Zinderis atrado bendrą transdukciją. 1953 m. Lederberg ir kt. įrodė, kad egzistuoja abortinė transdukcija, o 1956 m. – specifinė transdukcija.
Fagų elgesys bakterijų ląstelėje
Fagai gali įgyvendinti du vystymosi kelius bakterijų ląstelėje:

DNR fragmentų perkėlimas per bakterijas
Nespecifinė transdukcija.
Bakterijų chromosomų sričių pernešimą fagais 1951 m. atrado Lederbergas ir Zinderis Salmonella typhimurium. Esminio eksperimento metu B+ donoro padermė buvo užkrėsta vidutinio klimato bakteriofagu P22. Po šeimininko ląstelių lizės laisvieji fagai buvo išskirti ir inkubuojami su recipientu B- paderme, kuri genetiškai skyrėsi nuo B+ padermės bent vienu požymiu. Autoriai nustatė, kad pasėjus inkubuotas ląsteles tinkamoje terpėje, atsirado rekombinantai, turintys B+ donoro padermės savybių.
Tokio nespecifinio DNR perdavimo metu vykstantys procesai yra labai sudėtingi. Fago P22 dauginimosi metu B + donoro padermės ląstelėse bakterijos chromosomos fragmentai gali būti įtraukti į kapsidus, o ne į fago DNR. Taigi fagolizate yra normalių ir defektuotų fagų mišinys. Recipiento štamo B užkrėtimas normaliu fagu, kaip taisyklė, sukelia ląstelių lizę atsiranda, o tai gali lemti sugedusio recipiento geno pakeitimą nepažeistu geno donoru.
Kadangi transdukuojami tik nedideli DNR fragmentai, tikimybė, kad rekombinacija paveiks tam tikrą požymį, yra labai maža: ji svyruoja nuo 10-b iki 10-8. Pasidaro aišku, kad naudojant vieną Salmonella fago P22 dalelę arba nespecifiškai transdukuojantį Escherichia coli fago PI, kiekvienu atveju galima transdukuoti tik vieną geną (arba kelis labai arti esančius genus). Bakterinės DNR kiekis, panašus į fago genomą, yra tik 1-2% viso bakterijos ląstelėje esančios DNR. Išimtis yra Bacillus subtilis bakteriofagas PBS 1, kuris gali transdukuoti iki 8% šeimininko genomo.

Specifinė transdukcija.
Geriausiai žinomas pavyzdys yra transdukcija, kurią atlieka fagas X. Kaip jau minėta, šis fagas, perėjęs į profago būseną, yra įtrauktas į tam tikrą bakterijos šeimininkės chromosomos sritį. Fago DNR atsiskyrimas nuo bakterijų chromosomos (pavyzdžiui, dėl UV spinduliavimo) gali vykti netiksliai, t.y. tam tikras jo fragmentas liks chromosomoje, o arti esančios ląstelės šeimininkės genai bus užfiksuoti fago DNR. Matyt, to priežastis gali būti neteisinga rekombinacija.
Ląstelių, turinčių tam tikro geno, pvz., gal, užkrėtimo transdukuojančiu fagu, gali įvykti rekombinacija, kai pačios bakterijos defektinis genas pakeičiamas nepažeistu transdukuotu genu; tokiu atveju susidaro rekombinantai (transduktantai) gal +.
Panašiu būdu genus perneša bakteriofagas Phi 80. Jo DNR yra įtraukta į chromosomą šalia genų, koduojančių fermentus, atsakingus už triptofano biosintezę. Dėl šios priežasties Phi 80 ypač tinka trp genų perkėlimui.
Būtina sąlyga sėkmingam genų perkėlimui specifinės transdukcijos metu (priešingai nei nespecifinės) yra fago integracija į ląstelės šeimininkės genomą.
Kai kuriais atvejais buvo įrodyta, kad transdukuotas DNR fragmentas nerekombinuoja su recipiento chromosoma, bet lieka už chromosomos ribų. Tokiu atveju ląstelė tampa heterozigotine perduotų genų atžvilgiu. Perduota DNR yra transkribuojama (tai rodo atitinkamo geno produkto sintezė), bet nėra replikuojama. Tai lemia tai, kad ląstelių dalijimosi metu donoro fragmentas patenka tik į vieną iš dukterinių ląstelių (abortyvi transdukcija). Jei recipientas auksotrofinis, o perkeltas fragmentas ištaiso atitinkamą defektą, tada gali augti tik tos ląstelės, kurios paveldėjo šį fragmentą; pasėti ant agaro jie sudaro mažytes kolonijas.

Abortyvi transdukcija
Abortyvios transdukcijos metu įvestas donoro DNR fragmentas neintegruojamas į recipiento chromosomą, o lieka citoplazmoje ir ten funkcionuoja savarankiškai. Vėliau jis perduodamas vienai iš dukterinių ląstelių (t. y. paveldima vienarūšiu būdu), o vėliau netenkama palikuonių.
Transdukuojančių fagų dalelių savybės yra šios:
Dalelės neša tik dalį fago DNR, tai yra, tai ne funkciniai virusai, o talpyklos, kuriose yra bakterinės DNR fragmentai.
Kaip ir kiti sugedę virusai, dalelės negali daugintis.
Transdukuojantys fagai gali turėti bet kurią šeimininko chromosomos dalį su genais, kurie recipientei bakterijai suteikia tam tikrų pranašumų (pavyzdžiui, atsparumo antibiotikams genai arba genai, koduojantys gebėjimą sintetinti įvairias medžiagas). Toks bakterijų įgytas naujų savybių vadinamas lizogenijos reiškiniu.
Transdukcijos reiškinys gali būti naudojamas bakterijų chromosomų kartografavimui, jei laikomasi tų pačių principų, kaip ir kartografuojant naudojant transformacijos reiškinį.

Transformacija bakterijose
Transformacija yra organizmo ląstelės laisvos DNR molekulės absorbcijos iš aplinkos ir jos integravimo į genomą procesas, dėl kurio tokioje ląstelėje atsiranda naujų paveldimų savybių, būdingų DNR donoro organizmui. Kartais transformacija suprantama kaip bet koks horizontalaus genų perdavimo procesas, įskaitant transdukciją, konjugaciją ir kt.
Tyrimo istorija
Transformacija buvo atrasta 1928 m., kai britų mokslininkas F. Griffithas parodė galimybę nepatogenines Streptococcus pneumoniae padermes paversti patogeninėmis (skirtingos polisacharido kapsulės buvimu, leidžiančiomis prisitvirtinti prie aukštesniųjų organizmų audinių). dėl sąveikos su nužudytomis patogeninių padermių ląstelėmis. 1944 metais O. Avery (JAV) parodė, kad požymiui perduoti pakanka apdoroti patogeninės pneumokoko padermės DNR. Šis atradimas buvo pirmasis DNR, kaip paveldimumo nešėjos, vaidmens įrodymas.
1960-aisiais pradėta tirti gyvūnų transformacija, o aštuntojo dešimtmečio pabaigoje – augaluose.

Transformacija prokariotuose
Bet kurioje populiacijoje tik dalis bakterijų gali absorbuoti DNR molekules iš aplinkos. Ląstelių būsena, kurioje tai įmanoma, vadinama kompetencijos būsena. Paprastai maksimalus kompetentingų ląstelių skaičius stebimas logaritminio augimo fazės pabaigoje.
Kompetencijos būsenoje bakterijos gamina specialų mažos molekulinės masės baltymą (kompetencijos faktorių), kuris aktyvina autolizino, endonukleazės I ir DNR surišančio baltymo sintezę. Autolizinas iš dalies sunaikina ląstelės sienelę, kuri leidžia pro ją prasiskverbti DNR, taip pat sumažina bakterijų atsparumą osmosiniam šokui. Esant kompetencijos būsenai, sumažėja ir bendras medžiagų apykaitos greitis. Galima dirbtinai įvesti ląsteles į kompetencijos būseną. Norėdami tai padaryti, naudokite terpę, kurioje yra daug kalcio, cezio, rubidžio jonų, elektroporaciją arba pakeiskite recipiento ląsteles protoplastais be ląstelių sienelių.
Transformacijos efektyvumas nustatomas pagal kolonijų, išaugintų Petri lėkštelėje, skaičių, į ląsteles įdėjus 1 μg superspiralinės plazmidės DNR ir pasėjus ląsteles ant maistinės terpės. Šiuolaikiniai metodai leidžia pasiekti efektyvumą 10 6 -10 9 .
Absorbuota DNR turi būti dvigrandė (viengrandės DNR transformacijos efektyvumas dydžiais mažesnis, bet rūgščioje aplinkoje šiek tiek didėja), jos ilgis turi būti ne mažesnis kaip 450 bazinių porų. Optimalus pH, kad procesas vyktų, yra apie 7. Kai kurioms bakterijoms (Neisseria gonorrhoeae, Hemophilus) absorbuotoje DNR turi būti tam tikros sekos.
DNR negrįžtamai adsorbuojama ant DNR surišančio baltymo, po to viena iš grandinių endonukleazės supjaustoma į 2-4 tūkstančių bazinių porų ilgio fragmentus ir prasiskverbia į ląstelę, antroji visiškai sunaikinama. Jei šie fragmentai turi didelį homologijos laipsnį su bet kuria bakterijų chromosomos dalimis, šias dalis galima jais pakeisti. Todėl transformacijos efektyvumas priklauso nuo evoliucinio atstumo tarp donoro ir recipiento. Bendras proceso laikas neviršija kelių minučių. Vėliau dalijimosi metu DNR, sudaryta remiantis pradine DNR grandine, patenka į vieną dukterinę ląstelę, o DNR, sudaryta iš grandinės su įtrauktu svetimu fragmentu (skilimo) pagrindu, patenka į kitą dukterinę ląstelę.

Bakterijų transformacijos etapai
Transformacija vyksta trimis etapais:
1) dvigrandės DNR adsorbcija kompetentingų ląstelių ląstelės sienelės srityse;
2) fermentinis surištos DNR skilimas kai kuriose atsitiktinai išdėstytose vietose, susidarant 4-5 * 10 6 D fragmentams;
3) DNR fragmentų, kurių molekulinė masė ne mažesnė kaip 5 * 10 6 D, įsiskverbimas kartu su vienos iš DNR grandinių sunaikinimu (paskutinis etapas priklauso nuo energijos). Įsiskverbta DNR grandinė rekombinuojasi su recipiento ląstelės genetine medžiaga.

Išvada
Transdukcija yra aktyvus mechanizmas formuojant kultūras su pakeistomis savybėmis ir gali atlikti svarbų vaidmenį mikroorganizmų evoliucijoje. Gebėjimas transformuotis buvo nustatytas daugelyje bakterijų genčių, tačiau, matyt, jos vaidmuo keičiantis genetine medžiaga tarp bakterijų natūraliomis sąlygomis yra mažiau reikšmingas nei kitų mechanizmų, nes daugelis bakterijų turi specialias ribojimo ir modifikavimo sistemas. .

Literatūra