(odkaz na 3. článek v tomto souboru), který umožňuje posoudit schopnost těla odolávat infekčním onemocněním a ukázat fázi onemocnění, hraje důležitou roli enzymový imunosorbentní test (ELISA). Provedení této studie vám umožní komplexně posoudit aktivitu ochranné funkce krve a identifikovat stav imunodeficience u infekčních patologií, stejně jako krevních onemocnění, autoimunitních procesů a hormonálních problémů.
Jak je možné pokrýt tolik cílů v jedné analýze a jaké indikace existují pro její realizaci? Zkusme na to přijít.
Co je krevní test prováděný metodou ELISA?
Jedná se o laboratorní vyšetření, které umožňuje stanovit přítomnost specifických protilátek (ochranných krevních faktorů proteinové povahy) proti určitým antigenům (patogenním agens). Z protilátek mají primární význam imunoglobuliny, které mohou existovat ve formě imunokomplexů.
Imunoglobuliny jsou produkovány jako výsledek komplexních lidských neurohumorálních reakcí, ke kterým dochází jako reakce na zavedení cizích antigenů. Každý typ patogenního agens produkuje své vlastní specifické protilátky. Působí tak, že se „navážou“ antigen nebo patologický mikroorganismus, vytvoří se komplexní sloučenina „antigen-protilátka“, následuje neutralizace, enzymatická lýza, fagocytózní reakce a odstranění z těla.
Poznámka:Právě přítomností určitých komplexů určuje metoda ELISA typ patogenu nebo škodlivé látky přítomné u pacienta.
Základní principy fungování lidské imunity se můžete naučit sledováním této videorecenze:
Co jsou imunoglobuliny?
Bylo objeveno a studováno 5 hlavních tříd imunoglobulinů – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. role zbytku nebyla dosud plně objasněna a je předmětem vědeckého výzkumu.
Poznámka:V praktické medicíně mají největší význam imunoglobuliny tříd A, M a G. Informativnost definice je založena na různých časových intervalech jejich výskytu, maxima a mizení.
Zvažme tento problém podrobněji.
Hlavním úkolem imunoglobulin A (IgA) spočívá v ochranných funkcích sliznic dýchacích cest, gastrointestinálního traktu a močového systému. Při akutním nástupu onemocnění je nemožné je identifikovat. Tyto ochranné komplexy se objevují až od 2. týdne počátku onemocnění, někdy i později. Většina imunoglobulinu A je koncentrována ve slizničních tkáních. Přibližně asi 80 %. Zbývající protilátky cirkulují v krvi. Hlavní funkcí je neutralizace a ničení mikroorganismů. Po odeznění akutních projevů onemocnění se množství těchto imunoglobulinů začne snižovat a zcela vymizí až 8 týdnů po propuknutí onemocnění. Pokud je IgA detekován později, znamená to chronický proces.
Hlavními a prvními markery akutní fáze rozvíjející se patologie jsou imunoglobuliny třídy M (IgM). Jsou zjištěny do 5. dne nástupu onemocnění. Jejich přítomnost v krvi lze zjistit zhruba do 6 týdnů. Pak začnou rychle mizet.
Reziduální imunitní odpověď je charakterizována přítomností v krvi imunoglobuliny třídy G (IgG). Vzhled těchto faktorů v krvi je detekován přibližně měsíc po nástupu onemocnění. V budoucnu mohou být detekovány po mnoho měsíců, let a dokonce i celý život, přičemž plní ochrannou funkci proti návratu (relapsu) onemocnění a v některých případech znemožňují sekundární vývoj patologie. Pokud se množství imunoglobulinu G začne znovu zvyšovat, pak lze mít podezření na opětovnou infekci. Podobný závěr lze učinit provedením dvou nebo tří vzorků odebraných v intervalu 2 týdnů.
Imunoglobulin D (IgD) nachází se na B-lymfocytech, nachází se v nízkých koncentracích u zdravých lidí. Po 10 letech života dosahuje svých maximálních hodnot. Množství imunoglobulinu D se zvyšuje během těhotenství, u pacientek se systémovými onemocněními pojivové tkáně a onemocněními způsobenými stavem imunodeficience.
Indikace pro použití krevních testů enzymové imunoanalýzy
Stanovení protilátek proti přítomnosti patogenních mikrobů v těle, které způsobují:
- trichomoniáza;
- ureaplasmóza a
Dochází ke zvýšení množství imunoglobulinů a s.
Diagnostika se provádí za účelem zjištění:
- herpetická onemocnění;
- skupiny virové hepatitidy;
- virus Epstein-Barrové;
- cytomegoalovirus.
Pomocí ELISA můžete určit přítomnost protilátek proti 600 typům alergenů, zjistit stav imunodeficience, provést komplexní vyšetření před transplantační operací a provést komplexní analýzu účinnosti léčby.
ELISA je další metoda pro detekci rakovinných buněk.
Jak se provádí krevní ELISA?
Pro enzymovou imunoanalýzu se ve většině případů používá krev pacienta, někdy se odebírá sklivec, mok z míšního kanálu a plodová voda.
Krev se odebírá injekční jehlou do injekční stříkačky z kubitální žíly. Studie se provádí na prázdný žaludek. Je třeba si uvědomit, že užívání některých léků může ovlivnit výsledek testu. Před darováním krve se musíte zdržet kouření a pití alkoholu. Užívání drog může zkreslit výsledky.
V případě negativních hodnot imunoglobulinů IgM, IgG, IgA lze hovořit o absenci onemocnění nebo jeho počáteční fázi je také možný negativní výsledek s úplným zotavením po značné době.
Pokud nejsou detekovány IgA a IgM a IgG je pozitivní, pak se vší pravděpodobností mluvíme o vytvořené imunitě po infekčním onemocnění nebo po očkování.
V případě vysokého titru IgM s negativními hodnotami IgG a IgA lze usoudit, že jde o akutní infekční onemocnění.
Simultánní pozitivní hodnoty výsledků imunoglobulinů - IgA, IgM, IgG jsou charakteristické pro akutní fázi relapsu stávajícího chronického onemocnění.
U chronické infekce, která je v doznívající fázi procesu (remise), ELISA ukazuje negativní hodnoty imunoglobulinu M (IgM), zatímco výsledek imunoglobulinů G (IgG) a A (IgA) bude pozitivní.
Výhody metody enzymového imunotestu krve
Hlavní výhody metody ELISA jsou:
- nízké náklady na analýzu;
- diagnostická specifičnost, přesnost;
- dynamická kontrola (opakování analýzy ke stanovení účinnosti léčby a stádií onemocnění);
- možnost provádění hromadných vyšetření v oblastech infekce;
- rychlost získávání výsledků;
- relativní jednoduchost analýzy;
- možnost využití informačních technologií při zpracování;
- bezpečí a bezbolestnost pro pacienta.
Má krevní ELISA nějaké nevýhody?
Hlavním negativním aspektem studie je možnost získání falešně negativních a falešně pozitivních dat. Příčinou nedorozumění mohou být technické nedostatky nebo užívání léků, které mohou obraz zkreslit.
ELISA se používá k detekci:
- (ascaris, pinworms);
- akutní a chronické formy opisthorchiázy;
- trichinelóza;
- přítomnost Giardia (jako další analýza);
- formy leishmaniózy;
- amébóza;
- obsah toxoplazmy;
Závěrem je třeba poznamenat, že moderní imunologie je neustále ve stádiu vývoje a hledá nové metody pro diagnostiku a léčbu nemocí.
Stepanenko Vladimir, chirurg
Enzymová imunoanalýza krevní test je běžnou metodou pro identifikaci různých patologií. Výsledek krevního testu, jehož interpretaci ELISA interpretoval lékař laboratorní diagnostiky, je ve většině případů spolehlivý.
Co je ELISA
ELISA je moderní diagnostická metoda, která se používá k diagnostice infekcí, hormonálních a imunitních poruch a rakoviny v laboratorních podmínkách. Metoda umožňuje detekovat protilátky proti infekci v raných stádiích onemocnění. Tato metoda patří k nepřímým diagnostickým metodám, neboť odhaluje imunitní odpověď organismu. Mezi výhody ELISA ve srovnání s jinými diagnostickými metodami patří vysoká úroveň vyrobitelnosti, která snižuje pravděpodobnost chyb. Metoda je vysoce citlivá a používá se k diagnostice onemocnění u dětí i dospělých. Existuje široká škála různých modifikací ELISA.
Metoda ELISA je založena na specifičnosti imunochemických reakcí a také na fyzikálně-chemických vzorcích reakcí komplexů antigen-protilátka. Reakce probíhají za účasti specifických enzymů, které jsou markery pro průkaz protilátek. V důsledku imunochemické reakce se přísně definované protilátky vážou na odpovídající antigeny. Testování krve pomocí enzymové imunoanalýzy téměř vylučuje možnost získání falešně pozitivního výsledku. Specialisté na laboratorní diagnostiku posuzují pozitivní nebo negativní výsledek podle toho, zda je roztok při enzymatické indikaci komplexu antigen-protilátka zbarven. Pokud se roztok zbarví, pak antigen interaguje s protilátkou, výsledek ELISA je pozitivní.
Jaká onemocnění lze pomocí ELISA zjistit?
Výzkum pomocí enzymové imunoanalýzy umožňuje:
- identifikovat řadu infekčních onemocnění;
- diagnostikovat autoimunitní onemocnění;
- detekovat přítomnost onkologie;
- identifikovat hormonální poruchy;
- provést další výzkum.
Krevní test metodou ELISA umožňuje určit přítomnost následujících infekcí:
Metoda se používá k identifikaci antigenů patogenů řady infekcí, stejně jako k identifikaci protilátek různých tříd. Metoda ELISA se stala velmi populární pro detekci syfilis, HIV a virové hepatitidy. Stanovení přítomnosti a hladiny protilátek v krevním séru pro účely primární diagnózy STI se nedoporučuje. V tomto případě může být přítomnost protilátek v krvi pouze známkou toho, že tělo pacienta bylo v minulosti v kontaktu s infekčním agens.
Diagnostika různých autoimunitních onemocnění pomocí ELISA se provádí vyšetřením:
- antinukleární tělesa;
- protilátky proti dvouvláknové DNA;
- protilátky proti rozpustným jaderným antigenům (ENA screening);
- antikardiolipinové protilátky;
- IgG na citrulinovaný peptid;
- revmatoidní faktor;
- C-reaktivní protein;
- autoprotilátky proti cytoplazmatickým antigenům neutrofilů (ANCA screen).
Specifické imunitní komplexy jsou charakteristické pro určitá autoimunitní onemocnění. Například protilátky s dvouvláknovou DNA jsou charakteristické pro onemocnění, jako je systémový lupus erythematodes.
Rakovina je stanovena enzymovým imunotestem krevního séra na specifické nádorové markery, jako je PSA, CA-125.
PSA indikuje přítomnost adenomu prostaty a rakoviny prostaty. CA-125 je nádorový marker pro rakovinu vaječníků. Hodnota se zvyšuje také u rakovinných nádorů dělohy, mléčných žláz a endometria.
Příprava na analýzu
Chcete-li zajistit maximální přesnost výsledků, musíte dodržovat určitá pravidla pro přípravu na studii. Rozbor pro laboratorní diagnostiku metodou ELISA se provádí většinou ráno z předloktní žíly. Krev je nutné darovat striktně na lačný žaludek. Kromě tohoto jednoduchého návodu je třeba dodržovat následující doporučení pro přípravu:
- 24 hodin před testem je nutné se vyvarovat pití alkoholu a kouření;
- vyhnout se těžké fyzické aktivitě;
- zůstat v klidném stavu;
- vyhnout se nervovému napětí;
- darovat krev pro ELISA nejdříve 10 dní po ukončení léčby;
- informujte svého lékaře o užívání nezbytných léků.
Kromě toho se několik dní před testem doporučuje dodržovat dietu. Zároveň z jídelníčku vyřaďte tučná jídla a smažená jídla. Před testováním na virovou hepatitidu vylučte ze stravy nejen tučná a smažená jídla, ale také citrusové plody, stejně jako oranžovou zeleninu.
Je třeba poznamenat, že výsledky určitého rozsahu hormonálních studií jsou ovlivněny takovými faktory, jako je fáze menstruačního cyklu. Potřebu provést test v jedné nebo jiné fázi menstruačního cyklu je třeba předem projednat se svým lékařem. V opačném případě můžete získat neočekávané výsledky. Například normální hladina luteinizačního pohlavního hormonu u žen se liší v závislosti na dni cyklu:
- 1-12 dní - 2-14 medu/l;
- 12-14 dní - 24-150 mU/l;
- od 15. dne před začátkem nového cyklu - 2-17 mU/l.
Dekódování výsledků ELISA
Analýza nám umožňuje určit přítomnost protilátek různých tříd v těle. Existují 3 třídy protilátek:
K produkci těchto protilátek dochází v různých stádiích onemocnění. IgM protilátky jsou první, které se v těle vytvoří po infekci. Jejich přítomnost je v každém případě indikátorem onemocnění. Tato třída protilátek v těle zdravého člověka chybí.
Tyto imunoglobuliny jsou přítomny v krevním séru asi 5-6 týdnů.
Imunoglobuliny třídy G přítomné v krvi naznačují, že osoba buď již prodělala onemocnění, nebo je přenašečem infekce. Tyto protilátky se začínají produkovat po protilátkách třídy M, u většiny onemocnění 3-4 týdny po infekci. Jejich přítomnost v těle je možná několik let. A u některých onemocnění (například syfilis) je IgG přítomen v krvi po celý život.
Pokud je IgA v těle přítomno, je nutné s infekcí bojovat co nejintenzivněji. Protilátky této třídy se objevují pouze v případě chronického infekčního onemocnění. Vymizení IgA ukazuje na zničení infekce.
Pokud se test ELISA provádí u dětí mladších 1,5 roku, je třeba vzít v úvahu následující vlastnost: krev dítěte obsahuje IgG matky na různé infekce. To neznamená, že je dítě nemocné. V tomto případě je to spíše norma. Přítomnost IgM je důkazem intrauterinní infekce nebo infekce získané po narození. Matčin IgM nemůže vstoupit do těla dítěte přes placentu.
Tabulka ukazuje možné kombinace přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek 3 tříd v těle a jejich interpretaci.
Při dekódovacích testech (+) značí pozitivní výsledek a (-) značí opak, tedy negativní. Výsledek ukazující přítomnost nebo nepřítomnost látky v těle se nazývá kvalitativní. Lze jej kvantitativně doplňovat. Kvantitativní výsledek odráží kvantitativní obsah různých látek v těle.
Stojí za zmínku, že testovací systémy mají své vlastní referenční hodnoty definované výrobcem, které charakterizují indikátory. Překročení referenčních hodnot zpravidla znamená přítomnost určitých patologií v těle testovaného subjektu.
Po obdržení výsledků ELISA by měl získané hodnoty dešifrovat ošetřující lékař. Pouze on bude schopen správně posoudit získané výsledky a určit fázi onemocnění.
V kontaktu s
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) vstoupila do života praktické medicíny někde v 60. letech minulého století. Jejím prvotním úkolem byl histologický výzkum pro vědecké účely, který se scvrkl do hledání a identifikace antigenní struktury buněk živého organismu.
Metoda ELISA je založena na interakci specifických (AT) a příbuzných antigenů (AG) za vzniku komplexu „antigen-protilátka“, který je detekován pomocí enzymu. Tato skutečnost přiměla vědce k myšlence, že metodu lze použít pro diagnostické účely k identifikaci specifických imunoglobulinů různých tříd zapojených do imunitní odpovědi na konkrétní infekci. A byl to průlom v klinické laboratorní diagnostice!
Metoda se začala aktivně využívat až počátkem 80. let a poté především ve specializovaných institucích. První imunoenzymové analyzátory byly vybaveny krevními transfuzními centry a stanicemi, infekčními nemocnicemi a venerologickými nemocnicemi, protože hrozivý AIDS, zrozený na africkém kontinentu, se objevil na našem obzoru a okamžitě se přidal ke „starým“ infekcím, vyžadoval okamžitá diagnostická opatření a pátrání. pro terapeutické léky, které ho ovlivňují.
Rozsah aplikace metody ELISA
Možnosti enzymové imunoanalýzy jsou skutečně rozsáhlé. Nyní je těžké si představit, jak se lze obejít bez takového výzkumu, který se používá doslova ve všech odvětvích medicíny. Zdá se, co dokáže ELISA v onkologii? Ukazuje se, že může. A hodně. Schopnost analýzy najít markery charakteristické pro určité typy zhoubných novotvarů je základem včasného záchytu nádoru, kdy ještě není pro svou malou velikost detekován jiným způsobem.
Moderní klinická laboratorní diagnostika (CDL) má kromě nádorových markerů významný arzenál panelů ELISA a využívá je k diagnostice různých patologických stavů (infekční procesy, hormonální poruchy) a sledování farmaceutických léků za účelem identifikace jejich vlivu na organismus pacienta. a mimochodem nejen lidské. V současné době je enzymová imunoanalýza široce používána ve veterinárních službách, protože „naši bratříčci“ jsou také náchylní k mnoha nemocem, kterými někdy velmi trpí.
Tím pádem, ELISA může díky své citlivosti a specifičnosti určit ze vzorku krve odebrané ze žíly:
- Hormonální stav (hormony štítné žlázy a nadledvin, pohlavní hormony);
- Přítomnost virových a bakteriálních infekcí (HIV, B a C, chlamydie, syfilis a, a, stejně jako mnoho dalších onemocnění způsobených patogenními mikroorganismy);
- Stopy vitální aktivity mikroorganismů, které iniciovaly infekční proces, který úspěšně skončil a přešel do fáze tvorby imunitní odpovědi na tento patogen. Takové stopy, tedy protilátky, zůstávají v mnoha případech po celý život kolovat v krvi, a tím člověka chrání před opětovnou infekcí.
Co je podstatou ELISA?
Metoda enzymové imunoanalýzy umožňuje stanovit nejen přítomnost samotného patogenu (kvalitativní analýza), ale také jeho kvantitativní obsah v krevním séru pacienta.
Virová nebo bakteriální dávka významně ovlivňuje průběh infekčního procesu a jeho výsledek, proto kvantitativní analýza hraje důležitou roli v diagnostice a léčbě onemocnění v různých formách a stádiích.
Když však známe enzymové imunotesty jako metodu ELISA, ani nás nenapadne, jak dokáže pokrýt tak širokou škálu mikroorganismů obývajících naši planetu, z nichž mnohé přímo ohrožují zdraví a životy lidí a zvířat. Faktem ale je, že ELISA má mnoho možností (nesoutěžních i konkurenčních – přímých i nepřímých), z nichž každá řeší svůj vlastní problém a umožňuje tak cílené vyhledávání.
K identifikaci imunoglobulinů té či oné třídy se používá tradiční 96jamkový polystyrenový panel (deska), v jehož jamkách jsou koncentrovány sorbované rekombinantní proteiny v pevné fázi. Protilátky nebo antigeny, které se dostanou do jamky s krevním sérem, najdou „známý“ předmět a vytvoří s ním komplex (AG - AT), který se fixovaný enzymovým konjugátem projeví změnou barvy jamky při čtení výsledků.
Enzymová imunoanalýza se provádí pomocí testovacích systémů určité specifičnosti, vyrobených ve speciálních laboratořích a vybavených všemi potřebnými reagujícími složkami. Výzkum lze provádět pomocí praček („praček“) a čtecích spektrofotometrů, které většinou zahrnují ruční práci. Na plně automatických strojích, které zbavují laboranta monotónního kapání, mytí a dalších rutinních úkonů, je samozřejmě práce rychlejší a pohodlnější, ale ne všechny laboratoře si mohou dovolit takový luxus a nadále pracovat postaru - na poloautomatické stroje.
Interpretace výsledků ELISA je v kompetenci lékaře laboratorní diagnostiky a je třeba vzít v úvahu i vlastní vlastnost téměř všech imunochemických reakcí dávat falešně pozitivní nebo falešně negativní odpovědi.
Video: moderní enzymová imunoanalýza
Výsledky ELISA na příkladu syfilis
Enzymová imunoanalýza je vhodná pro detekci všech forem a navíc se používá ve screeningových studiích. K provedení analýzy se používá pacientova žilní krev odebraná nalačno. V práci jsou použity tablety s určitou specificitou (AB třídy A, M, G) nebo celkové protilátky.
Vzhledem k tomu, že protilátky u syfilis jsou produkovány ve specifické sekvenci, může ELISA snadno odpovědět na otázku, kdy k infekci došlo a v jaké fázi je proces, a interpretaci získaných výsledků lze prezentovat v následující podobě:
- IgM udává dobu trvání infekčního procesu (může se objevit během exacerbace chronických zánětlivých onemocnění);
- IgA uvádí, že k infekci došlo před více než měsícem;
- IgG naznačuje, že infekce je v plném proudu nebo že léčba byla nedávno provedena, což lze snadno určit na základě anamnézy.
Při testování na syfilis zůstanou negativní jamky (a negativní kontrola) bezbarvé, zatímco pozitivní jamky (a pozitivní kontrola) budou vykazovat jasně žlutou barvu v důsledku změny barvy chromogenu přidaného během testu. Intenzita barvy se však nemusí vždy shodovat s kontrolou, to znamená, že může být mírně bledší nebo mírně nažloutlá. Jedná se o pochybné výsledky, které zpravidla podléhají opětovnému zkoumání s povinným zohledněním kvantitativních ukazatelů získaných na spektrofotometru, ale obecně je barva přímo úměrná počtu imunitních komplexů (sdružených Ag a AT) .
Nejzajímavější z enzymových imunoanalýz je HIV ELISA
Analýza na je možná zajímavější než jiné pro široké spektrum populace, protože stále nelze s jistotou říci, že mnoho sociálních problémů zmizelo (prostituce, drogová závislost atd.). HIV bohužel neovlivňuje pouze tyto vrstvy lidské společnosti; můžete se nakazit za různých okolností, které nesouvisejí se sexuální nemorálností nebo užíváním drog. Pokud je ale potřeba provést HIV test, neměli byste se bát, že o vaší návštěvě takové laboratoře budou vědět všichni kolem vás. Nyní jsou lidé infikovaní HIV chráněni zákonem a ti, kdo mají pochybnosti, se mohou obrátit na anonymní úřady, kde mohou problém vyřešit bez obav z publicity a odsouzení.
Enzymová imunoanalytická metoda používaná k diagnostice HIV infekce je jednou z nejdůležitějších standardních studií, která však vyžaduje speciální podmínky, protože téma je velmi delikátní.
Má smysl provádět HIV ELISA po sexuálním kontaktu, krevní transfuzi, jiných lékařských zákrocích naznačujících infekci a na konci inkubační doby („séronegativní okno“), ale je třeba mít na paměti, že tato doba není konstantní. Může skončit za 14–30 dní, nebo může trvat až šest měsíců, za průměrnou hodnotu se tedy považuje interval od 45 do 90 dnů. Krev se na HIV daruje stejně jako na jiné infekce – ze žíly nalačno. Výsledky budou připraveny v závislosti na akumulaci materiálu v laboratoři a jejím vytížení (od 2 do 10 dnů), i když nejčastěji laboratoře poskytnou odpověď ve stejný nebo následující den.
Co můžete očekávat od svých výsledků HIV?
ELISA pro infekci HIV detekuje protilátky proti dvěma typům viru: HIV-1 (běžnější v Rusku a dalších zemích Evropy a Asie) a HIV-2 (častější v západní Africe).
Úkolem HIV ELISA je vyhledávat protilátky třídy G, které jsou detekovány na všech testovacích systémech, ale v pozdějším období, a protilátky třídy A a M detekované na rekombinantních testovacích soupravách nové generace, které umožňují najít protilátky. v nejranějších fázích (inkubační doba – „séronegativní okno“). Od ELISA můžete očekávat následující odpovědi:
- Primárně pozitivní výsledek: krev musí být znovu vyšetřena testovacím systémem stejného typu, ale pokud možno jiné série a jinou osobou (laborantem);
- Opakované (+) zahrnuje nový odběr krve od pacienta s jejím vyšetřením podobným primární analýze;
- Další pozitivní výsledek je předmětem referenční analýzy, která využívá vysoce specifické testovací soupravy (2-3 ks);
- Pozitivní výsledek v obou (nebo třech) systémech je odeslán na imunoblotování (stejný test ELISA, ale prováděný individuálně pomocí testovacích souprav s obzvláště vysokou specificitou).
Závěr o infekci HIV se dělá pouze na základě imunoblotu. Rozhovor s infikovanou osobou je veden zcela důvěrně. Prozrazení lékařského tajemství v Rusku, stejně jako v jiných zemích, podléhá trestnímu postihu.
Zvláštní oblibu si získaly také testy na chlamydie a cytomegalovirus metodou enzymové imunoanalýzy, protože umožňují určit dobu infekce, stadium onemocnění a účinnost léčebných opatření.
Během implementace lze také pozorovat výskyt protilátek různých tříd. v různých fázích patologického stavu způsobeného infekčním agens:
- IgM lze detekovat již sedm dní po infekci;
- IgA ukazuje, že infekce žije v těle déle než měsíc;
- IgG potvrzuje diagnózu chlamydií a pomáhá sledovat léčbu a určovat její účinnost. Je třeba poznamenat, že protilátky třídy G zůstávají a cirkulují v těle bez ohledu na dobu trvání onemocnění, proto pro správnou interpretaci analýzy musíte vzít v úvahu referenční hodnoty (normy), které mimochodem , jsou různé pro každý CDL: s ohledem na značku testovacího systému a specifičnost činidel obsažených v sadě. Normální hodnoty se zadávají do formuláře vedle výsledku ELISA.
Co se týče , tady je to trochu jinak: Protilátky třídy M se objevují asi po měsíci až měsíci a půl, to znamená, že pozitivní výsledek (IgM+) se dostane do fáze primární infekce nebo při reaktivaci latentní infekce a zůstane tak od 4 měsíců do šesti měsíců.
Přítomnost protilátek třídy G je charakteristická pro nástup primární akutní infekce nebo reinfekce. Analýza uvádí, že virus je přítomen, ale neposkytuje informaci o tom, v jaké fázi je infekční proces. Mezitím stanovení normálního titru IgG také způsobuje potíže, protože zcela závisí na imunitním stavu konkrétní osoby, který je však stanoven identifikací imunoglobulinů třídy G vzhledem k tomuto chování protilátek při diagnostice CMV k posouzení schopnosti protilátek třídy G interagovat s CMV, aby je později „neutralizovaly“ (avidita AT). V počáteční fázi onemocnění se IgG velmi špatně váže na virové antigeny (nízká avidita) a teprve poté začíná vykazovat aktivitu, proto lze hovořit o zvýšení avidity protilátek.
O výhodách enzymové imunoanalýzy můžeme mluvit hodně, protože tato metoda dokázala vyřešit mnoho diagnostických problémů pouze s použitím žilní krve. Odpadá dlouhé čekání, starosti a problémy se sběrem materiálu pro výzkum. Kromě toho se testovací systémy pro ELISA stále zdokonalují a není daleko den, kdy test poskytne 100% spolehlivý výsledek.
Video: vzdělávací film Moskevské státní lékařské univerzity pojmenovaný po. Sechenov o základech ELISA
Díky rozvoji moderní medicíny se již lékař při stanovení diagnózy nemusí zaměřovat na nepřímé projevy nemocí nebo provádět vícestupňová laboratorní vyšetření. Stačí provést jednu analýzu, která potvrdí nebo vyvrátí údajnou prvotní diagnózu.
Tato metoda je enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) - tato studie umožňuje detekovat specifické protilátky a antigeny charakteristické pro různé patologie, což výrazně urychluje diagnostiku.
Analýza ELISA je laboratorní test (metoda), který pomáhá určit přítomnost nebo nepřítomnost určitých protilátek v těle pro boj s virem a jejich množství.
Základem studia je přirozený reakční antigen (tělu škodlivý předmět) - protilátka (protein ničící škodlivé předměty), který umožňuje detekovat přítomnost různých virů a bakterií.
ELISA je přirozená imunitní reakce těla – interakce protilátky s odpovídajícím antigenem. Takže během ELISA jsou antigeny nebo protilátky přidávány jeden po druhém do zkumavky s materiálem, načež je stanovena koncentrace výsledných komplexů antigen-protilátka.
Pokud se vytvoří zápalky, pak vznikají imunitní komplexy, pak dochází k enzymatické reakci barviva s kombinovanou molekulou. Právě díky změně barvy při enzymatické indikaci je onemocnění identifikováno po vyšetření hladiny stanovované sloučeniny.
Typy imunoglobulinů
Lidské imunoglobuliny se dělí do několika tříd, které se od sebe liší vlastnostmi, strukturou a antigenními charakteristikami těžkých řetězců (H řetězec). Všichni savci, včetně lidí, mají pět H-řetězců, které určují příslušnost imunoglobulinů do odpovídající třídy: G, M, A, D, E.
Každá třída se od sebe liší biologickými vlastnostmi a schopností vázat antigeny a rychlostí a silou spojení s molekulou.
Funkce každého imunoglobulinu (Ig) jsou různé:
| Množství v těle | Funkce | Poločas rozpadu (dny) | Význam | |||||||||||||||||||||||||||
| G | 70% | Vytvořte pasivní imunitu u novorozence; nezbytné pro imunitní odpověď zlepšit fagocytózu, | 21-24 | poskytují dlouhodobou humorální imunitu proti infekčním chorobám | ||||||||||||||||||||||||||
| M | 5-10% | potřebné k aktivaci fagocytózy, schopný vázat 5 molekul antigenu, | 5 | Poskytuje primární imunitní odpověď | ||||||||||||||||||||||||||
| A | 10-15 | Neutralizuje toxiny a viry potřebné pro vytvoření rané imunity Vznik imunoglobulinů se vyskytuje podél zvláštního „řetězce“ - lgM lgG, takto tělo reaguje na výskyt antigenu v těle. Při laboratorní diagnostice se posuzuje koncentrace tří hlavních imunoglobulinů - G, M, A. Indikace pro testování imunoglobulinůAnalýza ELISA je každým rokem stále populárnější. Taková studie urychluje diagnostiku, a to je velmi důležité pro léčbu patologií, jako jsou:
ELISA je jedinečný marker autoimunitních patologií a maligních novotvarů. Příprava na zkouškuPři přípravě na studium byste měli dodržovat následující pravidla: Lékaři také doporučují dodržovat speciální dietu - vyloučit tučná a smažená jídla, a pokud se test provádí na hepatitidu, pak je nutné nejíst žádnou oranžovou zeleninu a zejména citrusy. Krev byste měli darovat ráno nalačno. K falešně pozitivnímu rozboru dochází v důsledku nesplněných doporučení, zejména konzumace tučných jídel, což vede k příliš vysoké koncentraci triglyceridů v plazmě, a proto klesá vodivost testu ELISA. Postup odběru vzorkůJako testovací materiál lze použít plnou krev, sérum nebo plazmu z venózní krve. Materiál se odebírá, obvykle z ulnární žíly, pomocí jednorázové jehly a je zapotřebí 5-10 ml krve. Pro zajištění přesnosti výsledku je důležité dodržet správnou techniku odběru - punkci samotné cévy i okolních tkání je nutné provést jednou manipulací, proto se používá krátká jehla s velkým průměrem, aby protilehlá stěna žíly není zraněna a červené krvinky nejsou poškozeny.
Při skladování materiálu je třeba se vyvarovat případné ionizace, materiál by navíc neměl přijít do styku se zbytkovými dezinfekčními prostředky, proto se používá pouze jednorázová plastová tuba označená jménem pacienta, datem a časem dodání materiálu. Je-li nutné krátkodobé skladování zkušebního materiálu, pak se používá chladicí komora o teplotě 2-4 o C, je-li nutné delší skladování, pak se materiál zmrazuje při teplotě -20 o C. Jak se provádí analýzaPo přípravě studovaného materiálu začne laboratorní asistent potřebné manipulace. K tomuto účelu se používá řada speciálních sad antigenů, které mají schopnost vyvolat reakci těla na dráždivou látku, jsou to různé infekce, hormony a alergeny. Očekávaná reakce antigen-protilátka vypadá asi takto:
V současné době bylo vyvinuto mnoho různých možností ELISA, ale neexistuje jejich jasná klasifikace. Typicky jsou metody zvažovány na základě jejich rozdělení na hetero- a homogenní - všechny fáze analýzy probíhají s použitím pevné fáze nebo pouze s použitím roztoku. Moderní klinické diagnostické laboratoře obvykle používají heterogenní (solid-phase) ELISA, kdy pevnou fází rozumíme absorpci antigenů nebo protilátek na pevném povrchu speciálních jamek umístěných na polystyrenové mikrodestce metoda se dělí na přímou a nepřímou ELISA; Při přímé ELISA je zavedený antigen fixován během inkubačního procesu na povrchu prázdných jamek, k tomu je testovaný materiál umístěn do čistých jamek na 20-25 minut, což je nezbytné, aby se antigen přichytil k jejich povrchu. Poté se přidá požadovaná protilátka. Dále materiál zůstává po určitou dobu, aby vytvořil vazby. Protilátky jsou vždy přidávány v přebytku, takže i když jsou přítomny, zůstávají ve vzorku nenavázané antigeny, a pokud tam žádné antigeny nejsou, pak nebudou žádná spojení. K odstranění „extra“ protilátek se provádí dekantace, po které zůstávají pouze ty protilátky, které vytvořily vazbu s antigenem.
V nepřímé metodě ELISA se používají protilátky, které jsou předem kombinovány se substrátem enzymatické reakce; v tomto případě dochází ke spojení protilátek s antigenem během inkubačního procesu, po kterém dochází k mobilizaci vazeb na povrchu jamek a následně přidaný konjugát a substrát-chromogenní činidlo zabarví reakci. Hlavním rozdílem mezi nepřímou a přímou metodou tedy není adheze materiálu k povrchu čistých jamek, ale vazba na antigen imobilizovaný na destičce. Reakce se zastaví pomocí specializovaných zařízení, poté se každá jamka podrobí fotometrickému procesu, po kterém následuje srovnávací popis výsledku získaného s dříve provedenými kontrolními vzorky. Pokud je ve vzorku zjištěn nárůst optické hustoty, pak je ve výsledku testu nadhodnocena i koncentrace specifických protilátek. Kdy bude analýza hotová?Studie netrvá dlouho od odběru krve po obdržení výsledku, trvá od 1 do 10 dnů v závislosti na diagnostických opatřeních. Výsledky testů a jejich interpretaceFormulář diagnostického výsledku, který pacient obdrží, ukazuje negativní nebo pozitivní výsledek pro určité třídy imunoglobulinů a je také uveden kvantitativní indikátor různých tříd protilátek. Jsou možné různé interpretace výsledků:
Takže pokud byly například detekovány IgG a IgM, pak pacient může mít jednu z následujících chorob:
Pro hormonální studie je často předepsána enzymová imunoanalýza, normy jsou uvedeny v tabulce:
Analýza ELISA je diagnostický test, který umožňuje posoudit pravděpodobnost vzniku onkologických patologií. Interpretaci výsledků však provádí pouze ošetřující lékař. Význam výsledků testůELISA je vhodná pro detekci různých forem sexuálně přenosných infekcí, včetně syfilis, a často se používá pro screening těhotných žen. Díky této studii můžete zjistit, jak dlouho k infekci došlo a v jakém stádiu onemocnění v době studie:
Během studie zůstávají jamky na destičce s negativním indikátorem bezbarvé a pozitivní se zbarví jasně žlutě. Pokud barva pozitivních jamek neodpovídá barvě kontroly, pak je výsledek považován za sporný a je nutné test opakovat. Enzymová imunoanalýza je prvním krokem v diagnostice HIV. Rozbor nelze provést ihned po podezření na infekci, je nutné počkat do konce inkubační doby (od 14 dnů do 6 měsíců). Při rozboru se zjišťují protilátky proti HIV-1 a HIV-2, hledají se protilátky třídy G, které se obvykle objevují v pozdější fázi, a protilátky třídy A a M se detekují v časných stádiích (během inkubační doby).
ELISA se také používá jako diagnostický test na tuberkulózu, ale i když má pacient protilátky proti této patologii, nemusí to vždy potvrdit přítomnost tuberkulózy, takže ELISA se často používá jako objasňující technika nebo k diagnostice latentní extrapulmonální formy. IgG - chronické stadium invaze |
||||||||||||||||||||||||||||
| IgA – k infekci došlo před více než 30 dny | ||||||||||||||||||||||||||||||
| IgG – invaze je v akutní fázi | ||||||||||||||||||||||||||||||
| IgG – potvrzuje diagnózu a ukazuje účinnost terapie |
Výhody a nevýhody analýzy
ELISA má mnoho výhod, což vysvětluje jeho popularitu mezi lékaři a pacienty, jsou to:
- vysoká přesnost výsledku,
- dostupná cena,
- rychlý výsledek,
- identifikace stádia onemocnění,
- kontrola onemocnění v průběhu času.
Spolu s výhodami však existuje i nevýhoda - ve vzácných případech může být analýza falešně pozitivní nebo falešně negativní.
Proč může být výsledek nespolehlivý
V důsledku toho může dojít k chybám v důsledku technických porušení; analýza může být také nespolehlivá u lidí s určitými chronickými onemocněními (revmatoidní faktor), které se vyznačují tvorbou specifických protilátek.
Konečný výsledek je také ovlivněn užíváním léků a metabolickými poruchami. Z těchto důvodů vyžaduje pozitivní výsledek na HIV a onkopatologii opakované odběry.
Náklady na studium
Cena ELISA se liší v závislosti na směru diagnózy (RUB):
- hepatitida 250-900;
- viry – 250 -1000;
- HIV – 250-350;
- helmintické napadení – 280 – 900;
- syfilis -150-250;
- plísňové infekce 400-500.
Formát článku: Ložinský Oleg
Video o analýze ELISA
Jak se provádí analýza ELISA:
Infekce virem lidské imunodeficience je vážná diagnóza. Chyby v diagnostice mohou mít katastrofální následky. Test ELISA na HIV je nejdostupnější metodou výzkumu, ale není ve všech případech informativní.
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay. Účelem metody ELISA je průkaz protilátek proti viru imunodeficience v biologickém materiálu. Pomocí této metody můžete sledovat přítomnost v kapalině nikoli samotných virů, ale pouze protilátek produkovaných v reakci na jejich přítomnost. Enzymová imunoanalýza je široce používána v diagnostice STD. Pomáhá identifikovat pohlavně přenosné choroby.
Existuje několik typů ELISA: přímá verze, nepřímá verze, sendvičová metoda. V každém případě je technika založena na stanovení přítomnosti protilátek, které slouží jako indikátor průniku cizího agens. K identifikaci těchto „značek“ je biologická složka ošetřena enzymy.
Enzymová imunoanalýza stanovuje protilátky s přesností 96–98 %, chyba je nevýznamná. Je to 2 – 4 %.
ELISA – metoda diagnostiky HIV
ELISA test na HIV je první fází diagnózy. Antigeny viru imunodeficience jsou proteiny p24, p15, p17, p31 a glykoproteiny gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.
K detekci virového proteinu se odebere vzorek krve ze žíly. Vzorek odeslaný na krevní test ELISA je ošetřen enzymatickými imunoanalytickými reagenciemi. Sérum se izoluje z krve. Pokud jsou během studie nalezeny, znamená to, že virus je již přítomen v krvi.
Krev se daruje striktně na lačný žaludek. 2 dny před testem se nedoporučuje jíst tučná jídla ani pít alkohol. Na 14 dní byste měli přestat užívat antivirotika.
Výhody metody:
- relativně nízké náklady;
- vysoká stabilita činidel;
- vysoká citlivost;
- krátké trvání;
- minimální vliv lidského faktoru.
Moderní testovací systémy ELISA jsou vyráběny podle mezinárodních standardů. To zvyšuje přesnost metody.
Enzymová imunoanalýza ne vždy poskytuje spolehlivé výsledky. Poté, co virus vstoupí do krve, začíná latentní (skrytá) fáze vývoje. Období, kdy se viry začnou množit a protilátky se ještě nevytvoří, se nazývá „čas séronegativního okna“. V této fázi nemá smysl provádět ELISA. Pokud dojde k infekci, výsledkem bude . Jak rychle se virus odhalí, závisí na tom, kolik nebezpečných buněk vstoupilo do těla. V případě nechráněného pohlavního styku nebo transfuze kontaminované krve bude tato doba minimální.
Pro vysokou spolehlivost testu HIV ELISA se test provádí třikrát. Termíny pro odběr ELISA na virus lidské imunodeficience:
- 6 týdnů po pravděpodobném kontaktu,
- za 3 měsíce,
- o šest měsíců později.
ELISA 4. generace na HIV je metoda, která je nejvíce informativní v časných stádiích infekce. Lze ji provést již 1 měsíc po podezření na infekci. Test je drahý ve srovnání s analogem 3. generace. Proto se ve veřejných zdravotnických zařízeních používá jako doplňková diagnostická metoda. Test 3 se provádí zdarma Pokud na základě jeho výsledků nelze dát jasnou odpověď, je pacient odeslán na ELISA 4. generace.
Důležité! Bezprostředně po infekci se člověk stává infekčním. Pro ostatní je nebezpečný, i když o své diagnóze ještě neví!
Pokud ELISA odhalí protilátky proti antigenům HIV, musí být provedeny další studie. To zahrnuje . Spolehlivost této metody je 80 %. PCR testuje krev, sperma a vaginální výtok. Biologická tekutina je rozložena v lékařském reaktoru a poté ošetřena enzymy. V důsledku toho se získají údaje o koncentraci buněk HIV v kapalném médiu. Vzhledem k velké chybě (20 %) se při pozitivním výsledku navíc provádí imunoblotting.
Další fází diagnostiky je Combo test (neboli immunoblotting). Jedná se o vysoce citlivý test (98% spolehlivost), který se provádí, pokud jsou výsledky ELISA po 6 měsících nejednoznačné.
Dekódování výsledků ELISA
Doba dešifrování se pohybuje od 24 do 48 hodin. Pokud je nutné získat informace naléhavě (je nutný chirurgický zákrok), dekódování se provádí do 2 hodin. Provinční lékařská střediska nemají vždy potřebná činidla. Vzorek je odebrán v místě aplikace, poté je převezen do krajského centra. Za takových okolností lze výsledek zjistit za 1-2 týdny.
Výsledek enzymového imunotestu může být buď pozitivní, nebo negativní; nejsou žádné jiné možnosti.
I když byl výsledek počáteční a opakované ELISA pozitivní, pacient nemůže být rozpoznán jako infikovaný HIV. S výhradou chyby. Důvody falešně pozitivního výsledku:
- chronická onemocnění;
- dlouhodobé infekční nemoci;
- těhotenství.
Výsledek analýzy by proto měl být objasněn dalšími studiemi.
Pokud je imunoblotting HIV pozitivní (reaktivní), osoba je považována za infikovanou HIV, což znamená, že je zdravá.
V průběhu času se buňky viru přizpůsobí předepsaným lékům. Pro kontrolu se test ELISA periodicky opakuje.
Někdy imunoblotting ukazuje falešně negativní výsledek. Je extrémně vzácné mít virus imunodeficience po dobu 6 měsíců (nebo déle). To je možné, pokud se do krve dostane malé množství virových buněk. U 0,5 % z celkového počtu případů lze infekci diagnostikovat až po roce. V 99,5 % do šesti měsíců po infekci poskytne ELISA spolehlivý výsledek.
I při vysoce přesných studiích zůstává 2% pravděpodobnost chyby. Neměli bychom zapomínat na lidský faktor. Pro eliminaci možnosti chyby lze test provést ve 2 různých institucích.
