Трансформация
Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: S– и R–формы.
S–форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R–форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S–клетки и живые R–клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма.
В 1944 г. О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти доказали, что изменение наследственных свойств клеток связано с переносом ДНК.
Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены – факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой).
В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот.
Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация.
Процесс трансформации включает следующие стадии:
1. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки–реципиента.
2. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую.
3. Проникновение однонитевой ДНК в клетку.
4. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала.
Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки.
Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента.
Процесс трансформации изображен на схеме. Каждый отрезок прямой соответствует одной цепи ДНК. Трансформирующая ДНК обозначена черным цветом, а ДНК клетки–реципиента – серым цветом.
На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки–реципиента.
На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами.
На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи.
При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки–реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») – участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом.
После окончания репликации ДНК клетка–реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК.
Таким образом, при трансформации происходит не добавление новых генов, а замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности.
Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки–реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток.
Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений – путем микроинъекции в пыльцевую трубку.
Трансдукцией называется перенос генетического материала с помощью вирусов из клетки-донора в клетку-реципиент.
Явление трансдукции открыл в 1951 г. Н. Зиндер (ученик Дж. Ледерберга).
При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. В результате 50% клеток оказываются трансформированными.
Различают общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую) и абортивную трансдукцию.
Общая трансдукция
При общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора случайно включаются в созревающую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или вместо фаговой ДНК. Фрагменты бактериальной ДНК образуются при ее разрезании ферментом, контролируемым фагом. В состав фаговой частицы может включаться до 100 бактериальных генов.
Ограниченная трансдукция
При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация – бактериальная ДНК замещает часть фаговой ДНК. В состав рекомбинантной ДНК входит небольшое количество бактериальных генов, прилежащих к фаговой ДНК, интегрированной в бактериальную хромосому.
При общей и ограниченной трансдукции донорская ДНК замещает гомологичные участки ДНК реципиента. Этот процесс сходен с трансформацией.
Абортивная трансдукция может быть и неспецифической, и специфической. Ее сущность заключается в том, что трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК не включается в хромосому реципиента, а существует как цитоплазматический репликон. Рано или поздно этот репликон утрачивается.
Явление трансдукции вирусами широко используется при переносе генов у эукариот. Если применяется вирус, неспособный формировать капсид (то есть существующий только в форме ДНК), то трансдукция принципиально не отличается от трансформации или от конъюгативного переноса генетического материала с помощью плазмид–векторов. Созданы системы векторов на основе модифицированных вирусов SV40 (они образуют в клетке до 100 тысяч копий), герпеса, осповакцины, вирус мозаики цветной капусты.
Следует еще раз подчеркнуть, что все описанные типы рекомбинации связаны не с добавлением новых участков ДНК, а с замещением уже имеющихся нуклеотидных последовательностей. Чем выше степень гомологии трансформирующей и исходной ДНК, тем выше вероятность успешной рекомбинации. Легче всего удается рекомбинация ферментов, имеющихся у всех организмов. Труднее ввести в геном новые регуляторы, отличающиеся высокой специфичностью. Поэтому для внедрения в геном новых генов используются более сложные методы, связанные с биохимическими модификациями ДНК.
Трансдукция была открыта Дж. Ледербергом и Н.Циндером в 1952 г. у Salmonella typhimurium и фага Р22.
Трансдукция – перенос генетической информации (хромосомных генов или плазмид) от клетки-донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при участии бактериофагов. При трансдукции фрагменты хромосомы или плазмиды должны упаковаться в головку бактериофага; выйти в составе этой фаговой частицы из клетки-донора в результате ее лизиса и попасть в другую клетку (клетку-реципиент) при новом акте заражения. Белковый капсид фаговой головки предохраняет находящуюся в ней ДНК от разрушения внеклеточными нуклеазами. В этом отношении трансдуцирующая ДНК более «сохранна», чем «голая» ДНК при трансформации. Поскольку адсорбция хвостового отростка фага на рецепторах поверхности клетки видоспецифична, то и перенос генетического материала при трансдукции может происходить, в основном, между близкородственными бактериями.
При трансдукции размеры переносимого фрагмента ДНК определяются размерами головки бактериофага. Различные фаги могут переносить фрагменты ДНК от 20 до 40 т. п. н. Таким образом, при трансдукции передаются как единичные гены, как и сцепленные маркеры. Рекомбинанты, получаемые при данном способе обмена генетической информацией, называются трансдуктантами .
Изучение трансдукции показало, что одни фаги могут переносить разные бактериальные гены, а другие – только определенные. В соответствии с этим принято выделять два типа трансдукции: 1) генерализованная (неспецифическая, или общая); 2) специфическая, или ограниченная.
При генерализованной трансдукции может переноситься любой бактериальный признак с частотой 10 –5 –10 –6 . Количество бактериальной ДНК, которое может переноситься фагом, обычно составляет 1–2 % всей ДНК, содержащейся в клетке. Исключение составляет бактериофаг РBS1 B. subtilis , который может трансдуцировать до 8 % генома хозяина. В осуществлении генерализованной трансдукции бактериальный вирус является только «пассивным» переносчиком генетического материала бактерий. Трансдуцирующие дефектные фаги содержат только фрагменты бактериальной ДНК. А генетическая рекомбинация у трансдуцируемых бактерий происходит по общим закономерностям рекомбинационного процесса.
Характерными особенностями специфической трансдукции являются: 1) каждый трансдуцирующий фаг передает только строго определенную, весьма ограниченную область бактериальной хромосомы; 2) фаг не только переносит генетический материал, но и обеспечивает его включение в бактериальную хромосому; 3) вирус включает ДНК бактерий в свой геном и передает ее, лизогенизируя бактерии-реципиенты.
Наиболее известным примером специфической трансдукции является трансдукция, осуществляемая фагом λ, который способен заражать клетки бактерий E. coli с последующей интеграцией его ДНК в геном бактерий.
Трансдукция имеет практическое использование:
Позволяет трансдуцировать плазмиды и короткие фрагменты хромосомы донора;
Для конструирования штаммов заданного генотипа, в частности изогенных штаммов. Изогенные штаммы, сконструированные при помощи генерализованной трансдукции, различаются только по участку хромосомы, переносимому трансдуцирующим фагом;
Для точного картирования бактериальных генов, установления порядка и их расположения в оперонах.
Вопросы для самоконтроля
1 Какие процессы могут происходить в клетке-реципиенте, после попадания вовнутрь нее донорной ДНК и перехода в состояние мерозиготы?
2 Что такое процесс трансформации? Какие стадии он включает?
3 Перечислите основные стадии процесса конъюгации.
4 Охарактеризуйте процесс трансдукции. Чем отличается специфическая трансдукция от генерализованной?
Практическое занятие 8
Цель: изучение основных способов генетического обмена у бактерий; выявление общих и отличительных особенностей процессов трансформации, конъюгации и трансдукции.
Материалы и оборудование : демонстрационные схемы (рисунки): а) мерозиготы; б) процесса трансформации; в) механизма бактериальной конъюгации; г) F-плазмиды бактерий E. сoli ; д) генерализованной трансдукции; ж) специфической трансдукции; электронная микрофотография конъюгирующих клеток E. сoli ; цветные карандаши.
Ход работы
В протоколе занятия:
1 Дать общую характеристику способам обмена генетической информацией у бактерий: указать три основных способа обмена генетической информацией, их общие особенности.
2 Нарисовать схему мерозиготы и показать два пути ее развития.
3 Охарактеризовать процесс трансформации согласно схеме описания: понятие трансформации, история открытия, этапы процесса трансформации, компетентность, практическое использование трансформации.
4 Составить графологическую схему «Стадии процесса трансформации», отразив в этой схеме по отдельности процесс трансформации: а) плазмидной ДНК; б) бактериальной ДНК.
5 Охарактеризовать процесс конъюгации согласно схеме описания: понятие конъюгации, история открытия, этапы процесса конъюгации, количество переносимой ДНК при конъюгации, практическое использование конъюгации.
6 Составить графологическую схему «Передача генетического материала при конъюгации», отразив в этой схеме по отдельности участие в качестве клеток-доноров: а) F + -доноров; б) доноров Hfr-типа.
7 Охарактеризовать процесс трансдукции согласно схеме описания: понятие трансдукции, история открытия, этапы процесса трансдукции, количество переносимой ДНК при трансдукции, типы трансдукции, практическое использование трансдукции.
8 Составить графологические схемы «Генерализованная трансдукция», «Специфическая трансдукция». Обратить внимание на существенные отличия между этими двумя типами трансдукции.
Трансдукция - перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при помощи бактериофага. Впервые это явление установили в 1952 г. Н. Зиндер и Дж. Ледерберг. Они проводили исследования на патогенных для мышей бактериях Salmonella typhimurium. Были отобраны два штамма этих бактерий: штамм 22А ауксотрофный, не способный синтезировать триптофан (Т~), и штамм 2А, способный синтезировать триптофан (Т 1 "). Эти штаммы засевали в U-образную трубку, разделенную внизу бактериальным фильтром (рис. 24). В одно колено трубки засевали штамм 22А (Т~), в другое - штамм 2А (Т 1 "). После определенного периода инкубации бактерии штамма 22А при посеве на минимальную питательную среду дали небольшое количество колоний (частота появления трансдуцированных клеток была равна Ы0~ 5). Это свидетельствовало о том, что некоторые клетки приобрели способность синтезировать триптофан. Каким же образом бактерии могли приобрести это свойство? Исследования
Рис. 24. Схема опыта по трансдукцин
показали, что штамм 22А был лизогенен по фагу Р-22. Этот
фаг освобождался из лизогенной культуры, проходил через
фильтр и лизировал штамм 2А. Присоединив часть генетичес-
кого материала штамма 2А, фаг Бактериальные возвращался обратно и переда вал этот генетический материал штамму 22А. Штамм 22А при
обретал специфические наследственные свойства штамма 2А,
в данном случае свойство синтезировать триптофан. Аналогичным образом могут бытьтрансдуцированы и другие признаки, в том числе способность
к сбраживанию, устойчивость кантибиотикам и т. д.
Явление трансдукции установлено также у кишечной па-лочки и актиномицетов. Как правило, трансдуцируется один ген, реже два и очень редко три сцепленных гена. При переносе генетического материала заменяется участок молекулы ДНК фага. Фаг при этом теряет свой собственный фрагмент и становится дефектным. Включение генетического материала в хромосому бактерии реципиента осуществляется механизмом типа кроссинговера. Происходит обмен наследственным материалом между гомологичными участками хромосомы реципиента и материала, привнесенного фагом.
Различают три вида трансдукции: общую, или неспецифическую, специфическую и абортивную. При неспецифической трансдукции в период сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может включиться любой из фрагментов ДНК пораженной бактерии. В результате в реципиентные клетки могут переноситься различные гены бактерии донора. Неспецифическую трансдукцию могут осуществлять фаги Р-1 и Р-22 у эшерихий, шигелл и сальмонелл. При специфической трансдукции профаг включается в определенное место хромосомы бактерии и трансдуцирует определенные гены, расположенные в хромосоме клетки донора рядом с профагом. Например, фаг "к (лямбда) в состоянии профага всегда включается в одно и то же место в хромосоме кишечной палочки и трансдуцирует локус, обусловливающий способность к сбраживанию галактозы. При отделении профагов от ДНК хозяина прилегающие к профагу бактериальные гены вместе с ним выщепляются из состава хромосомы, а часть генов профага остается в ее составе. Частота общей трансдукции составляет от 1 на 1 млн до 1 на 100 млн. Специфическая трансдукция происходит чаще.
Установлено, что фрагмент хромосомы донора, перенесенный в % клетку реципиента, не всегда включается в хромосому реципиента, а может сохраняться в цитоплазме клетки. При делении бактерий он попадает только в одну из дочерних клеток. Такое состояние получило название абортивной трансдукции.
В другую бактериофагом . Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома . К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные , последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.
Трансдукция была описана Нортоном Зиндером и Джошуа Ледербергом в 1952 году у Salmonella . Они наблюдали восстановление нормальных фенотипов у ауксотрофных штаммов , и доказали, что перенос генетического материала мог осуществлять только вирус .
Механизм
Общая схема трансдукции
Трансдукция - это опосредованная фагами передача ДНК между бактериальными клетками. Ключевой этап этого процесса - упаковка переносимой ДНК в головку фага во время литической фазы его жизненного цикла , то есть когда клетка погибает, высвобождая наружу вирусные частицы . Как правило, при сборке вирусных частиц в головку фага попадает его собственная ДНК, но изредка случаются ошибки, когда в головку фага попадают фрагменты бактериальной ДНК, которые могли образоваться, например, при вызванном фагом разрушении бактериальной хромосомы . Фаговые частицы, содержащие фрагменты бактериальной ДНК, называют трансдуцирующими частицами. Они могут заражать клетки как нормальные фаги, так как имеют все необходимые для этого гены . Когда после прикрепления к клетке фаг впрыскивает в неё свою геномную ДНК, он впрыскивает и бактериальную ДНК, содержащуюся в его головке. Любопытно, что трансдукция возможна и во время литического цикла.
К трансдукции способны не все фаги. К ней способны лишь те фаги, которые вызывают фрагментацию бактериальной геномной ДНК на фрагменты нужного размера, чтобы они поместились в капсид . Иногда в вирион попадает не геномная ДНК бактерии, а плазмида , которая после попадания в следующую заражённую клетку продолжит удваиваться. Фрагменты генома, переносимые фагами, напротив, к репликации неспособны ; их удвоение возможно лишь в том случае, если они смогут интегрироваться в хромосому бактерии-реципиента . Если фрагмент бактериального генома так и останется свободным, он в течение нескольких поколений будет попадать в одну из дочерних клеток при делении ; такую трансдукцию называют абортивной .
Видео по теме
Трансдукционное картирование
Трансдукцию применяли для картирования генов бактериальных хромосом. Метод основан на том, что фрагменты бактериальной ДНК, переносимые при трансдукции, достаточно велики и могут содержать целый ряд генов, поэтому близко расположенные гены могут при трансдукции переноситься одновременно (котрансдукция). Чем меньше гены
