Antonova O.P., Malyugin B.E.

Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor alkalmazása fibrines uveitis kezelésében egyidejű keratoplasztika és szürkehályog műtét után (klinikai eset)

1 Országos Orvostudományi Kutatóközpont „MNTK „Szem mikrosebészet” névadója. akad. S.N. Fedorov" az Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériumától

A fibrines uveitis a szürkehályog műtét és keratoplasztika posztoperatív időszakának egyik súlyos szövődménye. A fibrin hosszú távú jelenléte az elülső kamrában megváltoztatja és súlyosbítja a posztoperatív időszak lefolyását. Fennáll a toxikus és mechanikai hatások veszélye a környező szövetekre, különösen a graft endothel sejtjeire, és az iridolentikuláris rekeszizom és a graft között kialakuló elülső synechiák okozhatják annak (graft) leválását. Az elülső kamrában kialakuló fibrines folyadékgyülem intenzív lokális és szisztémás kortikoszteroid terápiát igényel, ami viszont késlelteti a látásrehabilitáció folyamatát, és a hosszan tartó kezelés esetleg nem vezet a kívánt végeredményhez. A fibrines pupillahártya kialakulása még a magas technikai színvonalon végzett műtét funkcionális eredményét is rontja, ismételt beavatkozást tesz szükségessé.

A fibrinos uveitis kezelésének fő gyógyszerei a fibrinolitikumok és a plazminogén aktivátorok: fibrinolizin, sztreptodekáz, urokináz stb. Ezek a gyógyszerek azonban, az urokináz kivételével, az emberi szervezet számára idegen fehérjék, és gyakran allergiás reakciókat okoznak. Ezenkívül az aktív fibrinolízishez szükséges dózisokban mérgezőek a szem belső, és bizonyos esetekben a külső membránjaira nézve.

A szemsebészetben a trombolitikumok csoportjának egyik legújabb gyógyszere a rekombináns szöveti plazminogén aktivátor (rTPA). Az rTPA egy allogén enzim. Természetes analógja az emberi test szinte minden szövetében és szervében megtalálható, beleértve a szem minden szerkezetét is. Ezért ennek az enzimnek nincs antigén tulajdonsága. Az rtPA megkülönböztető jellemzője a nagy fibrin-specifitás. A plazminogén aktiválása csak a kóros szubsztrát (vérrög vagy fibrin) felszínén történik, míg a szisztémás fibrinolízis aktiválása nem következik be rtPA alkalmazásakor.

A rekombináns szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó altepláz enzim kifejezett trombolitikus hatással rendelkezik olyan betegségekben, mint az akut miokardiális infarktus, a tüdőartéria és az agyi erek tromboembóliája. Külföldi tudósok először a 80-as években számoltak be az rtPA szemészetben történő alkalmazásának eredményeiről. múlt század. Számos külföldi munka foglalkozik az rtPA intraokuláris fibrinolízisre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatával kísérletekben, valamint adatok a klinikai egyszeri alkalmazásáról. A hazai szakirodalomban 1995-ből származnak az első publikációk ezzel a problémával kapcsolatban.

A mai napig számos munka jelent meg, főként külföldi kutatóktól, az rtPA alkalmazásáról a fibrines uveitis kezelésében. Számos tanulmány vizsgálta az rtPA hatékonyságát különböző szempatológiák esetén, beadásának módjait, a gyógyszer egyszeri és kezelési dózisait, valamint a hagyományos kezelési módszerekkel való kompatibilitását.

A modern hazai szemészetben az rtPA-t rendkívül ritkán alkalmazzák a posztoperatív szövődmények kezelésében, ami a gyógyszer magas költségével magyarázható, ezért nem mindennapi választás a fibrines uveitis elleni küzdelemben.

Cél- saját klinikai példánkon tanulmányozni a rekombináns szöveti plazminogén aktivátor alkalmazásának hatékonyságát és biztonságosságát a posztoperatív fibrinous uveitis kezelésében.

Anyag és módszerek

1 beteget vizsgáltunk, 77 éves, akinél Fuchs endothel szaruhártya-dystrophiát és szürkehályoggal kombináltak. A látásélesség felvételkor 0,05, a keratopachimetria 650 µm volt a központi ponton, az endothel sejtek denzitása nem volt meghatározható. A fenti adatok alapján egylépcsős műtét mellett döntöttek: szürkehályog fakoemulzifikációja hátsó kamrás IOL beültetésével és hátsó automata lamellás keratoplasztika. A posztoperatív időszak első napján a szaruhártya átlátszó, a Descemet membrán egyes redői, az elülső kamra közepes mélységű, az elülső kamra folyadék átlátszó, a szivárványhártya szerkezeti, az IOL a tokzsákban, a helyes pozíció, PEC - 1340 cella/mm 2 . A posztoperatív időszak első négy napjában a szem állapota stabil maradt. A posztoperatív időszakban a terápia standard volt, és magában foglalta az antibiotikumok, kortikoszteroidok, vérnyomáscsökkentő gyógyszerek, keratoprotektorok és a kötőhártya alatti kortikoszteroid injekciók becseppentését. A műtét utáni ötödik napon a biomikroszkópos vizsgálat fibrinuszos váladékot vizualizált az elülső kamrában, ami egy pupillamembrán volt a graft széleihez rögzített elülső synechiákkal (1. ábra), ezért a fenti terápiát módosítottuk: a becseppentések gyakoriságát. az antibiotikumok és a kortikoszteroidok napi adagja megemelkedett, mydriatikumok, NSAID-ok becsepegtetése és szisztémás kortikoszteroidok adagolásával egészült ki.

Ezt a terápiát 15 napig végezték, de nem volt pozitív dinamika. A fibrines folyadék elülső kamrából történő leszívása céljából ismételt sebészeti beavatkozás kérdését a graftleválás magas kockázata miatt elutasították. Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor (Actilyse, Boehringer Ingelheim Pharma, Németország) alkalmazása mellett döntöttek. A posztoperatív időszak 16. napján rtPA-t fecskendeztünk az elülső kamrába 25 μg/ml, 0,2 ml mennyiségben. A gyógyszer bemutatott dózisának kiszámítása külföldi kutatók számos munkájának eredményein alapult.

eredmények

A következő néhány órán belül pozitív dinamikát észleltünk: a gyógyszer beadása után 3 órával a pupilla membránja felére csökkent, a graft széleihez rögzített elülső synechiák teljesen hiányoztak. 8 órával az rtPA beadása után szinte teljes reszorpció volt megfigyelhető, és kis mennyiségű fibrin maradt az IOL elülső felületén. Másnap az OCT Visante adatai szerint az IOL elülső felületén megmaradt a pupillahártya, melynek méretei a sagittális síkban 0,21-0,28 mm. Az rtPA elülső kamrába történő bejuttatása után a graft endoteliális sejtjei egyrétegű állapotának felmérésére PEC-számlálást végeztünk, amely 1290 sejt/mm 2 volt, látásélesség - 0,3. Az rtPA beadását követő 7. napon a biomikroszkópia során az IOL elülső felületén az írisz pupilla szélén fibrinális membránt figyeltek meg, a maradék fibrin méretei a következők voltak: a szagittális sík - 0,09 mm, az elülső síkban - 0,54 mm. PEC - 1310 sejt/mm 2, a látásélesség stabil maradt - 0,3. 1 hónap után rtPA beadása után az elülső kamrában a fibrinális folyamat teljes megszűnése következett be, PEC - 1280 sejt/mm 2, látásélesség - 0,4. Érdemes megjegyezni, hogy a teljes posztoperatív időszakban, amelyet a fenti terápia és az rtPA elülső kamrába történő bejuttatása kísért, a graft átlátszó, szilárd maradt, és teljesen szomszédos volt a recipiens strómájának hátsó rétegeivel. 2).

következtetéseket

A fenti klinikai eset alapján megállapítható, hogy az elülső kamrában a fibrin felszívódási folyamata az rtPA egyszeri intrakamerális beadásával többszörösére gyorsul. Így saját klinikai tapasztalataink alapján kijelenthetjük, hogy a rekombináns szöveti plazminogén aktivátor alkalmazása biztonságos és hatékony alternatíva a posztoperatív fibrinos membránok eltávolításában. A nemkívánatos reakciók és a szaruhártya endotéliumára gyakorolt ​​negatív hatások hiánya, a fibrinális folyamat teljes feloldódása az rtPA hatására szükségtelenné teszi az ismételt sebészeti beavatkozásokat, ami viszont csökkenti a graft diszlokációjának kockázatát, és biztosítja a felgyorsult vizuális rehabilitációt. beteg. Sajnos ennek a gyógyszernek a magas ára a legtöbb esetben kizárja annak használatát a klinikán.

Forrás oldal: 9

Plazminogén aktivátor, urokináz Megnevezések Szimbólumok PLAU Entrez Gene ... Wikipédia

I Fibrinolitikus szerek (fibrin + oldódásra képes görög lytikos; szinonimája trombolitikus gyógyszerek) intravaszkuláris vérrögök oldódását elősegítő gyógyszerek, amelyeket artériás és vénás trombózisra, valamint ... Orvosi enciklopédia

- (Fibrin és görög lýsis szóból - bomlás, feloldódás) a vérrögök és vérrögök feloldódási folyamata, a vérzéscsillapító rendszer szerves része, mindig a véralvadási folyamatot kíséri, és az ebben részt vevő tényezők által kultiválják ... ... Wikipédia

Hatóanyag ›› Alteplase* (Alteplase*) Latin neve Actilyse ATX: ›› B01AD02 Alteplase Farmakológiai csoport: Fibrinolitikumok Nosológiai besorolás (ICD 10) ›› I21 Akut szívinfarktus … Gyógyszerszótár

A 8. emberi kromoszóma idiogramja A 8. emberi kromoszóma a 23 emberi kromoszóma egyike, amely körülbelül 145 millió bázispárt tartalmaz, ami a sejt teljes genetikai anyagának 4,5-5%-a. Rövid ideig... Wikipédia

TÜDŐINFRAKCIÓ- édesem A tüdőinfarktus (IL) a tüdő parenchyma hemorrhagiás konszolidációja a PE következtében. Etiológia és kockázati tényezők Hiperkoagulálhatósági állapotok Policitémia Sarlósejtes vérszegénység Flebitis Az alsó végtagok mélyvénás trombózisa ... Betegségek jegyzéke

MIOKARDIÁLIS INFARKTUS- édesem A szívizominfarktus (MI) a szívizom akut fokális nekrózisa a koszorúér-véráramlás abszolút vagy relatív elégtelensége miatt. Az esetek több mint 95%-ában az MI alapja a szívkoszorúér érelmeszesedése, szövődményes... ... Betegségek jegyzéke

AKUT ARTÉRIA ELFOGLALÁSOK- édesem Az akut artériás elzáródás egy akut keringési rendellenesség, amely az artériás elzáródás helyétől távolabb helyezkedik el, embólia vagy trombus következtében. A feltétel sürgősnek minősül. Az elzáródás helyétől proximálisan és disztálisan a normális véráramlás megszakad, ami... ... Betegségek jegyzéke

A szövet típusú plazminogén aktivátor (t-PA) egy szerin proteáz. Nagyon specifikus; egyetlen bizonyítottan szubsztrátja a plazminogén. Úgy tűnik, a t-PA a fibrinolízis fő fiziológiai aktivátora az ér lumenében. A t-PA szintézis fő helye az endotélium. Az endotéliumon kívül a t-PA számos más sejtben is szintetizálódik: monocitákban, megakariocitákban, mezoteliális sejtekben, vaszkuláris izomsejtekben, szívfibroblasztokban stb. A plazma t-PA nagy része fő inhibitorához, a PAI-1-hez kapcsolódik. Mind a megkötött, mind a szabad aktivátort a májsejtek gyorsan eltávolítják a véráramból.

A fibrinolízis aktiválása mellett a t-PA részt vesz a gyulladásgátló reakciókban és az endothel proliferáció stimulálásában. Bizonyíték van arra, hogy a t-PA képes aktiválni az f.VII.

A t-PA funkciója számos receptor jelenlétével függ össze. t-PA receptorok 2 nagy csoportra vannak osztva - aktiváló és eltávolító.

Az aktiváló t-PA receptorok a sejtfelszínen helyezkednek el, és fokozzák a plazminogén t-PA általi aktiválását. A legtöbbet tanulmányozott aktiváló t-PA receptor az Annexin II. Az annexin II túlzott expressziója promielocitás leukémiában szenvedő betegeknél vérzéses megnyilvánulásokkal járó hiperfibrinolízishez vezet.

Fibrinolízis rendszer

A t-PA eliminációját elősegítő receptorok csoportjában, mannóz receptor és LRP/α 2 -makroglobulin receptor. Az első található

Az urokináz plazminogén aktivátor (uro-kináz, u-PA) nagy mennyiségben található az emberi vizeletben. Az u-PA prekurzora a prourokináz vagy scu-PA. A prourokinázt különböző sejtekben szintetizálják. A Scu-PA-t különösen aktívan szintetizálják a vesevezetékek hámsejtjei, valamint szinte az összes csatorna parietális sejtjei, beleértve a verejték-, könnymirigy- és más mirigyek csatornáit. A csatornákban az urokináz szükséges a váladék fehérjekomponenseinek lebontásához. Az urokináz fő munkáját a szövetekben végzi, elősegítve az extracelluláris mátrix lebomlását, ami elősegíti a sejtmigrációs folyamatokat. Az urokináz szerepe számos élettani folyamatban jelentős

az egyik a máj endothel sejtek és a Kupfer sejtek membránján, a másik a hepatociták membránján hat.

és kóros folyamatok - sebgyógyulás, gyulladás, embriogenezis, daganatsejtek metasztázisa.

Az urokináz számos egyéb funkciója ismert a plazminogén aktiváláson kívül. Ezek közül a legfontosabbak a növekedési faktorok aktiválása, a sejtmigráció és invázió modulálása, valamint a melanomasejtek mitogén hatásának biztosítása.

Urokináz receptor (u-PAR) monocitákon találhatók. Elősegíti a plazminogén urokináz általi aktiválását, amely szükséges a monocitáknak a fibrin thrombus lebontásában való részvételéhez. Ugyanez a receptor található a vérlemezkéken. Két receptort írtak le, amelyek eltávolítják az urokinázt és az urokináz-szerpin komplexet a véráramból.

Egyéb plazminogén aktivátorok

A fent említett főbb fiziológiás plazminogén aktivátorokon kívül más fiziológiás és nem fiziológiás aktivátorokat is leírtak.

Bizonyíték van arra, hogy az f.XIIa közvetlenül képes aktiválni a plazminogént. A plazminogén aktiválási sebessége f.XIIa a t-PA ekvimoláris mennyiségéhez képest 10-szer kisebb, de annak

a keringő vér moláris koncentrációja 5000-szer magasabb. Így az f.XIIa plazminogén közvetlen aktiválásának szerepe meglehetősen nagy lehet. További ismert plazminogén aktivátorok a sztreptokináz, sta-filokináz és a vámpírdenevérek nyálából izolált plazminogén aktivátor.

A fibrinolízis aktiválásának mechanizmusa

A fibrinolízisben, valamint a véralvadási rendszerben 2 út létezik: a plazminogén aktiválódásának külső és belső útja (57. ábra). Külső út

a plazminogén aktivációt főként szöveti aktivátor biztosítja, a belső út az urokináz.

Rizs. 57. A fibrinolízis fő láncszemei. A fő fibrinolízis enzim, a plazmin képződése a fibrinolízis aktiválásának belső vagy külső útjában lévő tényezők hatására A belső út a prourokináz aktiválásával kezdődik. Az extrinsic útvonalat a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) hatása határozza meg. A szabad plazmin felhalmozódását a szisztémás keringésben gátolja az akut fázisú fehérjék egy csoportja, a KK - kallikrein, HMK - nagy molekulatömegű kininogén, u-PA - urokináz, Cl-Ing - az 1. komplement komponens inhibitora, PAI- 1 - 1-es típusú szöveti plazminogén aktivátor inhibitor, PDF - fibrin bomlástermékek

Fibrinolízis rendszer

Az "Eozinofilek. Monociták. Thrombocyták. Vérzéscsillapítás. Véralvadási rendszer. Antikoagulációs rendszer" témakör tartalomjegyzéke:
1. Eozinofilek. Az eozinofilek funkciói. Az eozinofil leukociták funkciói. Eozinofília.
2. Monociták. Makrofágok. A monociták - makrofágok funkciói. A monociták normál száma - makrofágok.
3. Granulocitopoiesis és monocitopoiesis szabályozása. Granulocyta telep-stimuláló faktorok. Keylons.
4. Vérlemezkék. A vérlemezkék szerkezete. A vérlemezkék funkciói. A glikoproteinek funkciói. Zóna szol - gél hialoplazma.
5. Thrombocytopoiesis. A thrombocytopoiesis szabályozása. Thrombopoietin (thrombocytopoietin). Megakariociták. Thrombocytopenia.
6. Vérzéscsillapítás. A véralvadás mechanizmusai. Thrombocyta hemosztázis. Thrombocyta reakció. Elsődleges hemosztázis.
7. Véralvadási rendszer. A véralvadás aktiválásának külső útja. Véralvadási faktorok.
8. A véralvadás aktiválásának belső útja. Thrombin.
9. Antikoaguláns vérrendszer. A vér antikoaguláns mechanizmusai. Antitrombin. Heparin. Fehérjék. Prosztaciklin. Thrombomodulin.
10. Szöveti plazminogén aktivátor. Ektoenzimek. Az endotélium szerepe az antikoaguláns rendszerben. Szövettényező. Plazminogén aktivátor inhibitor. von Willebrand faktor. Antikoagulánsok.

Szöveti plazminogén aktivátor. Ektoenzimek. Az endotélium szerepe az antikoaguláns rendszerben. Szövettényező. Plazminogén aktivátor inhibitor. von Willebrand faktor. Antikoagulánsok.

Szöveti plazminogén aktivátor egy fehérje, amelyet a vaszkuláris endotélium reprodukál és folyamatosan szekretál. Közvetlen lokális trombolitikus aktivitást biztosít a kialakult trombus ellen. Ennek a faktornak a szintje állandó marad a vérben, ami biztosítja a vér szisztémás trombolitikus aktivitását.

Ektoenzimek- Ezek az endotélium által termelt ADPáz, ATPáz és az adenozin-konvertáló enzim. Az endothel ADPáz gyorsan lebontja az aktivált vérlemezkék által kiválasztott proaggregáns ADP-t.

Vaszkuláris endoteliális sejtek szintetizálni és protrombotikus faktorok: szöveti faktor, plazminogén aktivátor inhibitorok, von Willebrand faktor.

Rizs. 7.11. A vérerek endotéliumának szerepe a véralvadásban. Az „Anticoagulants” felirat alatt olyan endothel faktorok találhatók, amelyek véralvadásgátló hatást fejtenek ki a vérlemezke-aggregáció gátlása, a fibrinrögképződés és a fibrinolízis aktiválása miatt. „Prokoagulánsok” néven olyan endoteliális faktorokat jelölnek, amelyek részt vesznek a vérlemezkék trombusának, a fibrinrög képződésében és a fibrinolízis elnyomásában.

Szövettényező egy összetett sejtmembrán fehérje, amelynek tömege 46 kDa. Amikor egy sejt károsodik, molekulájának egy része szorosan kötődik a Vila alvadási faktorhoz, támogatva a sejt gyorsító funkcióját a külső koagulációs útvonalban.

Plazminogén aktivátor inhibitor-Az I egy 52 kDa-os fehérje, amely a keringő vérben található. A plazminogén aktivátorhoz szorosan kötődve inaktiválja azt, így részt vesz a fibrinolízis szabályozásában a szervezetben.

von Willebrand faktor egy többdimenziós, 1-20 millió Da tömegű molekula, amelyet az endotélium szintetizál és endothel szekréciós granulumokban tárol. Ezektől felszabadulva a vérlemezkék tapadó molekulájaként működik, és támogatja azok aggregációját. A von Willebrand faktor fokozott felszabadulását az endotéliumból a trombin indukálja.

Véralvadás egy edényben Az endotélium sima felülete megakadályozza az aktív protrombináz képződésének belső útját is. Az endotélium felszínén adszorbeált monomolekuláris fehérjeréteg taszítja az alvadási faktorokat és a vérlemezkéket, valamint megakadályozza a véralvadást.

Antikoagulánsok használják a klinikai gyakorlatban. Például szívkoszorúér-betegségben szenvedő betegek fokozott véralvadásának csökkentésére, kardiopulmonális bypass gép használatakor a vér folyékony állapotának fenntartására, ami a vérsejtek traumáját okozza, aminek következtében a belső véralvadási út aktiválódik.

A találmány tárgya egy új, továbbfejlesztett szövetaktív plazminogén (javított TPA), amelynek hosszabb a felezési ideje a szervezetben, és megnövekszik a hő- és savakkal szembeni stabilitása, és amely felhasználható a trombózis környéki gyulladás elnyomására. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás az említett szöveti plazminogén aktivátor előállítására rekombináns DNS-technológiával, valamint az ennek megvalósításához használt eszközök. Ismeretes, hogy a humán szöveti plazminogén aktivátor (TPA) jótékony fibrinolitikus hatással rendelkezik, és rendkívül hatékony a fibrinhez kötött plazminogénnel szemben, miközben a szervezetben a szabad keringési fázisban nem aktiválja olyan hatékonyan a plazminogént, mint a hagyományos trombolitikus szerek, a sztreptokináz (SK). ) és az urokináz (UK). A humán APT aminosavszekvenciája és a humán APT-t kódoló cDNS nukleotidszekvenciája ismert (Pennica. D. és munkatársai, Nature, 301, 214-221, 1983). A humán APT a vénás és artériás vérrögöket is feloldja. Nagy klinikai vizsgálatok azt mutatják, hogy az intravénásan beadott humán APT hatékony az elzáródott koszorúér reperfúziójában akut miokardiális infarktusban szenvedő betegeknél. Ennek a gyógyszernek a hátránya azonban a trombusképződéssel összefüggő betegségek kezelésében az enzimaktivitás rendkívül rövid felezési ideje a vérben (Rijken, D.C. et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, E. F. és munkatársai, Blood, 65, 539, 1985). Ha kezelésre használják, a humán APT-t folyamatos, nagy dózisú intravénás injekcióként kell beadni. Ismeretes, hogy a természetben előforduló humán APT doménszerkezettel rendelkezik, a molekula N-terminálisától kezdve egy ujjdomén, egy EGF domén (epidermális növekedési faktor), két domén „kringle 1” és „kringle 2” és egy szerin található. proteáz dómer. Rijken és munkatársai munkájában megjegyzik (Rijken D.C. és munkatársai, Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985), hogy az emberi APT rövid biológiai felezési ideje az összes doménnel összefügghet. humán APT, kivéve a szerin domén-proteázokat. Zonneveld et al. (Zonneveld, A.J.V. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) azt is megjegyzik, hogy az ujj domén, az EGF domén és a kringle 2 domén fontos lehet a természetben előforduló emberi fibrinkötő aktivitás szempontjából. Az APT, valamint az APT fibrinfüggő aktivációjának fenntartása. Azonban még nem dolgoztak ki specifikus intézkedéseket a természetben előforduló humán APT fibrinkötő aktivitásának és fibrinfüggő aktivitásának fenntartására, valamint a biológiai felezési idő meghosszabbítására. A 48378/1987. számú közzétett japán szabadalmi bejelentésben egy APT-t írnak le, amelyet egy természetben előforduló humán APT 87-175. aminosavainak törlésével nyernek, és amelyben a "kringle 1" ki van törölve. Ezt az APT-t egy további indukált pontmutáció jellemzi az epidermális növekedési faktor régióban. A japán szabadalmi bejelentés leírja, hogy a módosított APT képes a fibrinhez kötődni, de a szöveti plazminogén aktivátor inhibitorral való kölcsönhatás gyengül. A 241208 számú európai szabadalmi leírás egy APT-t ír le, amelyet a természetben előforduló humán APT 92-179. aminosavainak törlésével nyernek, és amelyben a Kringle 1 is deletálva van. Ez a munka megemlíti, hogy ennek az APT-nek fibrinolitikus aktivitása van. Ezenkívül a 231624 számú európai szabadalmi leírásban meghosszabbított felezési idővel rendelkező módosított APT-t ismertetnek. Az F-EGFK2-A szekvenciával rendelkező módosított APT-ből hiányzik a kringle 1 domén, de nem mutattak be specifikus módszert az előállítására. A fentiek fényében világos, hogy a találmány szerinti módosított APT-nek el kell térnie a természetben előforduló APT-től az aminosavszekvenciában a belső domének régiójában. Kiterjedt kutatás eredményeként a kérelmező egy továbbfejlesztett APT-t kapott, amely ujj domént, EFR domént, kringle 2 domént és szerin proteáz domént tartalmaz, de az első „kringle 1” domént egy adott helyen törölték, és a doménkötő helyen kringle 2 és szerin proteáz mutációt vezettek be, ami egy jobb APT-t eredményez, amely kiváló hő- és savállóságot, jelentősen meghosszabbodott biológiai felezési időt és jelentős gyulladáscsökkentő aktivitást mutat, miközben megtartja a kívánt tulajdonságait. természetesen előforduló emberi APT. A találmány továbbfejlesztett APT-re vonatkozik. A találmány szerinti APT kémiai szerkezetében jelentősen eltér a természetben előforduló emberi APT-től, és kiváló tulajdonságokat mutat. A találmány szerinti javított APT egy polipeptid, amelynek aminosav-szekvenciája a 2. ábrán bemutatott általános képletnek felel meg. 28-29. ábrák, ahol R jelentése közvetlen kapcsolat, Y jelentése A-Ile-B (A jelentése Arg vagy Glu és B jelentése lys vagy Ile), előnyösen Glu-Jle-Lys. A H2N az amino-terminálist, a -COOH pedig a karboxi-terminálist jelöli). A találmányban a "javított APT" kifejezést az APT egy analógjára használjuk, amelyben A és B az alábbiakban leírt aminosavakat jelenti:

Továbbfejlesztett APT (II): Arg, Lys;

Haladó APT (V): Arg, Ile;

Advanced APT (VI): Glu, Lys;

Továbbfejlesztett APT (VIII): Glu, Ile. A találmány tárgyát képezi az APT javasolt analógjának rekombináns DNS-technikák alkalmazásával történő expressziója is. Ehhez kapcsolódnak a javított APT-t kódoló új DNS-ek és a rekombináns DNS expressziós vektorok. Az 1. és 2. ábrák 16 oligodezoxinukleotidból álló szekvenciát mutatnak be, amelyeket egy javított APT-t (II) kódoló szintetikus gén fragmentumának megalkotására használtak; a 3-4. ábrákon a találmány szerinti javított APT(II) előállítására szolgáló szintetikus gén fragmense, amely a Bge 11 és Eco R1 restrikciós enzimek végeit tartalmazza, és amelyet az 1-2. ábrákon látható 16 oligodezoxinukleotid felhasználásával állítottunk elő. ; 5. ábra - módszer javított APT (II) létrehozására (az ábrán a fekete terület, az árnyékolt terület és az árnyékolatlan terület az érett APT fehérjét kódoló régiót, a proproppeptidet kódoló régiót és a nem transzlált régiót jelöli; 6. módszer egy szintetikus IV. génblokk fragmentumának tesztelésére a DNS-bázisok szekvenciájának meghatározásával a 7. ábrán a pVY1 expressziós vektor létrehozására állati sejtekben a javított APT DNS-ének integrációja a 8. ábrán látható javított APT-t (II) kódoló DNS-szekvenciák és a 14-19. ábrán látható javított APT-t kódoló aminosav-szekvenciák (II); 20. ábra - a természetes APT gén Eco R1-Xho fragmentumát (körülbelül 1000 bázispárt) tartalmazó pTPA2 plazmid restrikciós enzimei és funkcionális térképe, integrálva a pBR322 vektorba az Eco R1-nél és a Bam-nál; H1 hasítási helyek; 21. ábra - mp9 (javított APT (II), amely a gén BgL11-Xho 11 (körülbelül 1500 bázispár) fragmentumát tartalmazza, javított APT (II) integrálva a kettős szálú M13 mp9 DNS-be a BamH1 hasítási helyen; 22 - függőség "dózis-hatás" a javított APT (VI) és a természetesen előforduló APT APT aktivitására az S-2251 módszerrel fibrin szubsztituens jelenlétében (+Fb) és hiányában (-Fb); 23 - a javított APT (VI) és a natív APT aktivitásának változása egy nyúl vérében. 24. ábra - A javított APT (VI) reziduális aktivitásának változása a hőkezelés után limfocita aktiváló faktor (LAF) javított APT-vel (VI), 26. ábra - aktiválás denaturált proteinnel, javított APT-vel (VI); 27 - a denaturált fehérje lebomlása javított APT (VI) hatására. A rekombináns DNS és transzformált sejtek előállításának módszerét az alábbiakban részletesen ismertetjük. Módszer javított APT elérésére. A természetes APT-t kódoló gént, amelyből a jelen találmány szerinti APT származik, Bowes humán melanoma sejtekből előállított cDNS-bankból izoláljuk. Poli A+ RNS-t izoláltunk humán Bowes melanoma sejtekből, és szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással frakcionáltuk. Ezután kis mennyiségű frakcionált poli(A)+RNS-t választunk ki, és az APT gént kódoló mRNS-frakciót ponthibridizációval azonosítjuk egy specifikus APT mRNS szekvenciát felismerni képes oligonukleotid próbával. Ezt az APT mRNS-ben gazdag frakciót kiindulási anyagként használva cDNS-bankot készítünk és szkrínelünk a fent leírt APT mRNS azonosító próbával. Mivel egyetlen klónt sem izoláltak, amely az APT gén teljes szekvenciáját tartalmazza, a hiányzó bázisszekvenciát DNS-szintetizátorral szintetizálják a kívánt gén előállításához. A kívánt gént ezután helyspecifikus mutációs indukcióval állítjuk elő. Az Eco R1-Xho 11 fragmentum természetesen előfordul az APT génben (körülbelül 1000 bázispár), amelynek egy része az N = végén deletálódik, bekerül a pBR332 vektorba az Eco R1 és BamH1 hasítási helyeken, így a pTPA2 keletkezik. Az E. coli HB 101/pTPA2 törzset, amelyet az E. coli ezzel a plazmiddal történő transzformálásával kaptunk, a Japán Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség Fermentációs Kutatóintézeténél letétbe helyezték P-9649 regisztrációs számon (FERM BP-2107). A pTPA2 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 20. ábra mutatja. A javított APT gént beépítjük a pVY1 plazmidba. A pVY1 plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pRSV10 plazmid (gyártó: Fine Chemicals) BamH1-Kpn1 fragmentumát (körülbelül 2900 bázispár) ligáltuk a pAdD26SV (A) N 3 (N) plazmid Eco R1 emésztéséből származó fragmenssel (Dr. Hiroshitól szereztük be). Handa a Tokiói Egyetemről (miután mindkét tompa végét megkapta. Ennek megfelelően ez a vektor tartalmazza az egér dihidrofolát-reduktáz gén cDNS-ét az adenovírus fő késői promóterének (Ad2) transzkripciós szabályozása alatt, az SV 40 korai promotert az inszerciós hely előtt. a javított APT gén és a találmány szerinti géntől 5'-irányban elhelyezkedő intron és poliadenilációs szekvencia beépíthető egy másik megfelelő expressziós vektorba. Az expressziós vektort tovább juttatjuk egy megfelelő gazdasejtbe, hogy transzformánsokat kapjunk. Gazdasejtekként prokarióta sejtek, például E. coli, Bacillus subtilis stb., eukarióta mikroorganizmusok, például élesztő stb., valamint magasabb rendű állatok sejtjei használhatók. Az E. coli képviselőjeként általában a K12 törzshez tartozó JM109 törzset, W3110, Q törzset stb. használjuk, a Bacillus subtilis képviselőjeként pedig a BD170 törzset, a BR151 törzset stb. Élesztőből használhatja az RH218 törzset, a SHY1 törzset stb. élesztő Saccharomyces cerevisiae. Az expresszióhoz tipikusan plazmidvektort vagy fágvektort használnak, amely a gazdasejtekkel kompatibilis fajból származó replikont és egy szabályozó szekvenciát tartalmaz. E. coli vektorra példák például a pBR322, pUC18, pUC19 stb. plazmidok, fág, például qt, Charon 4A stb., M13 fág stb. A pUB110 felhasználható Bacillus subtilis vektorként , pSA2100 stb., valamint YRp7, YEp61 stb. használhatók élesztő vektorként. A vektornak olyan promotert kell hordoznia, amely képes kifejezni a kívánt fehérjét. Egy E. coli gén vagy egy fággén promótereként például Lae, trp, tac, trc, pL stb. Gazdaként tenyésztett állati sejtek, például rhesus majom vesesejtek, szúnyoglárva sejtek, afrikai zöld majom vesesejtek, egér magzati fibroblaszt sejtek, kínai hörcsög petefészek sejtek, emberi magzati vese sejtek, lepketojás szövetsejtek, humán nyakhámszerű sejtek sejtek, humán mielóma sejtek, egér fibroblasztok és így tovább. Vektorként használhatja az SV40 korai promotert, az SV40 késői promotert, az eukarióta génből származó promotert hordozó SV40-et (például ösztrogénnel indukálható madár ovalbumin gén, interferon gén, glükokortikoiddal indukálható tirozin aminotranszferáz gén, korai timidin kináz gén és késői adenovírus gének, foszfoglicerát kináz gén, faktor gén stb.), szarvasmarha papilloma vírus vagy ezekből származó vektorok. Ezen túlmenően ismert, hogy a sejtek által szekretált és termelt APT-k különböző N-terminusokkal rendelkeznek a hasítási helyek különbségeitől függően. A sejttenyésztő sejteket gazdaként használó APT szekréció és termelés esetén a szignálpeptidáz vagy proteáz hasítási módszer a sejttípustól függően változik, így különböző N-terminálissal rendelkező APT fajok nyerhetők. Ez a jelenség nem csak tenyésztési sejtek felhasználásával történő szekrécióra és termelésre alkalmas, hiszen vélhetően hasonló jelenség fordulhat elő az APT E. coli, Bacillus sublitis, élesztő és egyéb speciális módosításnak alávetett sejtek útján történő kinyerésekor is. A javított APT gént integráló expressziós vektorral történő gazdatranszformációhoz E. coli esetében Hanahan, Hanahan, D.J.Mol módszere használható. Biol., 166, 557, 1983), állati sejtek manipulálása esetén a kalcium-foszfát módszer alkalmazható (Vander Eb, A. J. és Graham, F. L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) és hamar. Amint fentebb leírtuk, a javított APT felhasználható különféle szerzett betegségek kezelésére, beleértve a vaszkuláris koagulációt (még a mélyvénát is), a tüdőembóliát, a perifériás artériás trombózist, a szív- vagy perifériás artériás embóliát, az akut szívinfarktust és a trombotikus rohamot. A természetesen előforduló humán APT-hez hasonlóan a továbbfejlesztett APT különösen alkalmas az akut miokardiális infarktus kezelésére. A természetben előforduló humán APT a közelmúltban hatékonynak bizonyult a koszorúér-elzáró trombus feloldásában, a szívizom perfúziójának regenerálásában és az ischaemiás szívizomréteg legtöbb részének helyreállításában, ha intravénásan adják be 30-70 mg-os dózisban 1-3 óra alatt. A javított APT biológiai felezési ideje a vérben meghosszabbodik, ezért ugyanolyan esetekben hatásos, mint a természetesen előforduló humán APT. Várható, hogy a javított APT a természetesen előforduló humán APT-hez hasonló klinikai hatást válthat ki a természetesen előforduló humán APT-vel javasolt dózis körülbelül 10%-ának megfelelő dózisban, még akkor is, ha egyszeri adagban adják be. Ezenkívül a jelen találmány szerinti javított APT a következő értékes tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek mindeddig ismeretlenek voltak a natív humán APT és a módosított APT esetében. a) Gyulladáscsökkentő hatás. A trombus helyén nemcsak magának a thrombusnak a képződését észlelik, hanem fibrin bomlástermékek vagy nyomokban kinin képződését is. Ezek az anyagok gyulladást kiváltó hatásukról ismertek, és így gyulladást okoznak a trombus területén. Emiatt kívánatos, hogy a trombózis kezelésére használt szer ne csak trombolitikus, hanem gyulladásgátló hatású is legyen. A kutatás eredményeként a kérelmező két funkció alapján tudott gyulladáscsökkentő hatást kölcsönözni a javult APT-nek. Az egyik, hogy a javított APT gátolja az interleukin 1 (IL-1) biológiai aktivitását, amely a gyulladásos válasz egyik mediátora. Úgy gondolják, hogy a makrofágok által termelt IL-1 részt vesz a gyulladásos válaszban a hipertermia, a fibroblasztok növekedésének felgyorsítása, a kollagenáz termelődése az ízületi sejtmembránban és így tovább, vagy a prosztaciklin szintézis felgyorsítása révén a vaszkuláris endoteliális sejtekben. Az is ismert, hogy az IL-1 a májsejtekre hatva felgyorsítja a fehérjék (szérum amiloid fehérje, fibrinogén stb.) termelődését az akut fázisban, ami a gyulladással fokozódik. A bejelentő azt találta, hogy a javított APT gátolja az aktivitást (LAF-aktivitás), hogy növelje az egér timociták mitogén reaktivitását, ami az IL-1 egyik biológiai aktivitása. Egy másik funkciója az, hogy a fejlett APT-nek van affinitása a denaturált fehérjéhez (denaturált immunglobulin G, denaturált albumin stb.), amely a trombus helyén fellépő gyulladás következtében alakul ki, továbbá az a tulajdonsága, hogy ez a denaturált fehérje aktiválja. Ennek az aktivitásnak köszönhetően a javított APT csak a denaturált fehérjét bontja le a gyulladás területén, és a gyulladás átmenetileg enyhíthető. A kérelmező nátrium-dodecil-szulfát gélelektroforézissel megerősítette, hogy a javított APT csak a denaturált fehérjét bontja le. ábrán látható módon. A 26. ábrán látható, hogy a denaturált fehérje által javított APT aktiválása és szelektivitása nyilvánvaló. A HCl-val kezelt immunglobulin G és többször alacsonyabb koncentrációk esetén ugyanazt az aktivitást mutatták ki, mint a BrCN-nel kezelt fibrinogénnél. Másrészt a normál immunglobulin C még 500 μg/ml koncentrációban sem mutat aktiváló hatást a javult APT-re. Újbóli elzáródás megelőzése az elzáródott véredény perfúziójának helyreállítása után. Ismeretes, hogy a trombózis természetes APT-vel történő kezelésekor az elzáródott véredény véráramlásának helyreállítása után nagy gyakorisággal ismételt elzáródás figyelhető meg. Emiatt a kombinált terápiát vérlemezke-alvadásgátlóval vagy antikoagulánssal végezzük. A kombinált terápia azonban magában foglalja a gyógyszerkölcsönhatások, az adagolás szabályozása, a hasonló hatások stb. problémáit. Előnyösen maga az APT is rendelkezik az újraelzáródást megelőző aktivitással. A találmány szerinti továbbfejlesztett APT kétféle aktivitáson keresztül képes megakadályozni az újraelzáródási eseményeket. Az első típus az APT-koncentráció gyors csökkenésének megelőzése egy javított APT bevezetése után a hosszabb hatástartam miatt, ami a Stewart-Holmes jel megszűnéséhez vezet, és ezáltal megakadályozza az újbóli elzáródás kialakulását. A második típus az, hogy az IL-1 által kiváltott vaszkuláris endothelsejtek károsodásának megakadályozásával a vérlemezke koagulációja közvetett módon gátolt, ezáltal megelőzhető az újraelzáródási események. c) Megnövelt stabilitás. A fehérjekészítmények általában instabilak, ezért a készítményeket fagyasztott száraz állapotban, vagy alacsony hőmérsékleten, oldat formájában célszerű tárolni. Ha akut szívinfarktusban szenvedő betegnek plazminogén aktivátort adnak be, akkor a mortalitás csökkentése érdekében a roham kezdete után néhány órán belül el kell végezni az eljárást. Ebben az esetben kívánatosak a stabil, szobahőmérsékleten tárolható készítmények. Ezenkívül a megnövelt stabilitás lehetővé teszi a hőkezelést, savas kezelést stb. a gyógyszerek elkészítése során. Közelebbről, ami a találmány szerinti javított APT-t illeti, amelyet sejttenyészetekkel állítanak elő, lehetővé válik egy sejtből származó retrovírus eltávolítása, amelyről ismert, hogy hőérzékeny. A találmányt az alábbiakban részletesebben példákra hivatkozva ismertetjük, de nem korlátozódik azokra. Eltérő rendelkezés hiányában a rekombináns DNS-t a laboratóriumi irányelvek szerint állítják elő. Maniatis T és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). 1. példa Klónozás DNS-hez APT. Bowes humán melanoma sejteket (a Dr. Roblin, R., National Cancer Research Institute, USA-tól vásároltunk) Opdenakker és munkatársai módszere szerint tenyésztettük. [Opdenakker, G. és munkatársai, Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)]. Az APT mRNS indukálására TFA-t (12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát) adtunk a tenyészelegyhez 100 ng/ml végső koncentrációban, majd 16 órán át tenyésztettük. A teljes sejt-RNS-t ezután a tenyésztett sejtekből Freeman és munkatársai módosított módszerével extraháltuk. ((Okayama)Berqa DNA Manual, 3. o., 1985, Pharmacy Fine Chemicals). Oligo-dT cellulóz oszlop (gyártó: Pharmacia Fine Chemicals) segítségével a poli(A)+RNS-t elválasztják a teljes sejt-RNS-től. Ennek eredményeként körülbelül 10 o sejtből körülbelül 400 μg poli(A) + RNS nyerhető. Ezt a poli(A)+RNS-t szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással frakcionáljuk hagyományos módon. A frakcionált poli(A)+RNS egy részét kiválasztjuk, és dot blot hibridizációt végzünk (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc.) APT mRNS-re specifikus oligonukleotid próbával. . Az itt használt próba (Y próba) bázisszekvenciája 5"-GCNNGGCAAAGATGGCA-3", amely komplementer a Pennicaetal által leírt APT szekvenciában a +291-től +297-ig terjedő aminosavakat kódoló mRNS régióval, és szintetizálja a -cianofoszfamidát módszer DNS-szintetizátorral, 380A modell (gyártó: Applied Biosystems). A DNS-oligomer szintézist, a védőcsoportok eltávolítását, a gyanta hasítását és a tisztítást a DNS-szintetizátor, 380A modell használati útmutatója szerint végezzük. Az Y próba 5"-os végén radioaktív jelölése a laboratóriumi kézikönyvnek megfelelően történik T4 polinukleotid kináz (gyártó: Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) és -(32 P) ATP felhasználásával. Az Y próba erősen hibridizál, főként 20-30S poli(A) + RNS-sel (ezt a frakciót nevezzük M-frakciónak). reverz transzkriptázt használva (gyártó: Biochemical Industry Co., Ltd.) a Gubler-Hoffman módszer szerint (Gubler, U. és Hoffman, B. J., Gene 25, 263, 1983), és hozzáadva a kétszálú cDNS-hez a A dezoxi-C-szál 3"-os vége a Denq-Wu módszer szerint (Denq, G. R. és Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). A dezoxi-C lánccal meghosszabbított kettős szálú cDNS-t ezután gélszűrésnek vetjük alá Sepharose CL 4B-n (gyártó: Fine Chemicals), hogy eltávolítsuk az 500 bázispárnál kisebb molekulatömegű nukleinsavakat. A cDNS-t ezután a pBR322-vel (gyártó: Bethesda Research) kapcsoltuk össze, amely egy dezoxi-G szálat tartalmazott a Pst1 helyen, hagyományos technikákkal. A lágyítás után kapott keveréket kompetens HB101 E. coli sejtekbe transzformáltuk (gyártó: Takara Shuzo Co. , Ltd.). Az eredmény egy körülbelül 4000 független transzformánsból álló cDNS-bank. Ezt a cDNS-t telephibridizációnak vetjük alá a fent leírt Y próbával Woods módszere szerint (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, Bethesda Research Lab.), így olyan klónokat kapunk, amelyek reagálnak az Y próbával. A klónok közül a leghosszabb APT cDNS-t tartalmazó pTPA1 klónt azonosították. Ezután a didezoxi-módszert hajtják végre (Carlson, J. és munkatársai, J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), az M13 fágvektor és a 7-DEAZA módszer (Mizusawa S. és munkatársai, Nucleis Acids) alkalmazásával. Res., 14, 1319, 1986). Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a pTPA1 plazmid tartalmazza a Pennicaetal által leírt APT gén T y+441-től A y+2544-ig terjedő bázisszekvenciáját. 2. példa Egy továbbfejlesztett APT (II) tervezése. Az 1. példában bemutatott pTPA1 plazmidban az N-terminális régió nem elegendő egy javított APT (II) létrehozásához, amelyből hiányzik a kringle 1 domén. Ezért a hiányos DNS-szegmenst a fent leírtak szerint szintetizáljuk egy 380A DNS-szintetizátorral (gyártó: Applied Biosystems). A szintetizált oligomer bázisszekvenciáját és a teljes szintetizált szekvenciát az 1. ábra mutatja. 1-4. A javított APT(II) ezen oligomerek felhasználásával történő előállításának specifikus technikáit a 3. ábra mutatja be. 5-6. 2-1). IV. blokk építése (Bql II-Eco R1 töredék, kb. 480 bázispár). ábra IV. blokk töredéke. Az 5. ábrát a következőképpen kapjuk meg. Először is, a laboratóriumi kézikönyv szerint, 40 pmol a 2., 3., 4., 5., 6., 7., 8., 9., 10., 11., 12., 13., 14. és 15. szintetikus oligonukleotidokból, amelyek az 1. ábrán láthatók. Az 1-2. vegyületet 10 egység T4 polinukleotid kinázzal (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) foszforiláltuk 37 °C-on 1 órán át 50 μl-es reakcióoldatban. A reakcióoldatot fenollal kezeljük. Etanollal történő kicsapás után a csapadékot csökkentett nyomáson szárítjuk és steril desztillált vízben feloldjuk. Miután mindegyik oligomerből 40 pmol-t 150 μl 6 mM Tris-HCl-t (pH 7,5), 20 mM NaCl-t, 7 mM MgCl 2-t és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban ülepítettünk 80 o C-on 5 percig, hőmérsékleten. 60 o C-on 5 percig és szobahőmérsékleten egy óráig, az I. blokk (1., 2., 3. és 4. oligomer), a II. blokk (5., 6., 7., 8., 9. és 10. oligomer) és blokk megfelelő blokkjaiban. A III (11., 12., 13., 14., 15. és 16. oligomerek) etanolos kicsapást és csökkentett nyomáson történő szárítást végeznek. A maradékot 40 µl steril desztillált vízben oldjuk. A reakciót 400 μl reakcióoldatban 4 °C-on 15 órán át végeztük DNS-ligáló készlettel (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.). Etanollal történő kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot steril desztillált vízben oldjuk: az I. blokk (1) esetében gélelektroforézist 5%-os poliakrilamidban (laboratóriumi kézikönyv) végezzük, elválasztjuk és hagyományos módon tisztítjuk. (laboratóriumi kézikönyv), körülbelül 100 bázispár fragmentum, a II. blokk (2) és a III. blokk (3) esetében pedig a gélelektroforézist 3%-os agaróz gélben (LMP agaróz, gyártó: BRL) végezzük (laboratóriumi kézikönyv ) és körülbelül 190 pár darabjait izoláljuk és elektroelucióval tisztítjuk (laboratóriumi őrlemény). Ezután 0,1 μg, 0,2 μg és 0,2 μg blokk I, blokk II és blokk III fragmentumokat ligáltunk a fenti DNS ligáló készlet segítségével. A gélelektroforézist 1,5%-os agarózkoncentráció mellett végezzük a körülbelül 480 bázispár méretű BglII-Eco R1 fragmentum (IV. blokk) izolálására. A DNS-t ezután elektroelucióval izoláljuk az agaróz gélből. Ezt a DNS-t ezután 100 μl-es reakcióoldatban 37 °C-on 1 órán át foszforilezzük 10 egység fenti T4 polinukleotid kináz felhasználásával, majd fenollal kezeljük, etanollal kicsapjuk és csökkentett nyomáson szárítjuk. Ezt a szintetikus génfragmenst és a blokk IV bázisszekvenciát a bázisszekvencia didezoxi-módszer szerinti meghatározásával igazoljuk, M13 fágvektor alkalmazásával. A speciális technikákat az 1. ábra mutatja. 6. A IV. blokk fent leírt Bgl II-Eco R1 fragmentumának ligálása után M13 mp18 DNS-sel (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.), amelyet BamH1 restrikciós enzimekkel emésztettünk (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.). .) és Eco R1 (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) bázisszekvenciáját az M13 szekvenáló készlettel (gyártó: Taraka Shuzo K., Ltd.) és a 7-DEAZA szekvenáló készlettel (gyártó: Takara) határozzuk meg. Shuzo Co., Ltd.). A Bgl11 restrikciós enzim hasítási helye és a BamH1 restrikciós enzim hasítási helye izoszkimer elrendezésben ligálódik (BamH1 - Bgl11 hasítási vég-hasítási hely), és a ligált fragmenst az Xho 11 restrikciós enzim hasítja, így a természetes Bgl. 11 és Bamh1 hasítási végek. Az alapszekvencia pontosabb meghatározása érdekében az E.cjli JM109 törzset M 13mp18 fággal (beleértve a IV. blokk fragmentumát) fertőzzük meg a Messing/Messing J. módszer szerint, Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983). )), amely után kettős szálú DNS-t kapunk (replikatív típus). Ezt a DNS-t (50 μg) Xho 11 (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) és Eco R1 restrikciós enzimekkel emésztjük, gélelektroforézist hajtottunk végre 1,5%-os agaróz gélen, hogy izoláljunk egy körülbelül 480 bázisos fragmentumot (IV blokk). párok. Ezt a DNS-t elektroelúcióval extraháljuk. Miután az extrahált DNS-t M13mp19 DNS-sel (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) ligáltuk, Eco R1 és BamH1 restrikciós enzimekkel a fent leírt módon emésztettük, a bázisszekvenciát DNS ligációs kit segítségével határoztuk meg. A fent leírtak szerint ez a szekvencia pontosabban ellenőrizhető mindkét DNS szekvenálásával M13mP18 és M13mp19 alkalmazásával. Ezenkívül az M13mp19 kettős szálú replikatív DNS-t (IV blokkkal) állítottuk elő a leírt módszerrel. Ezt a DNS-t (50 μg) Eco R1 és Xho 11 restrikciós enzimekkel emésztjük, 1,5%-os agarózban gélelektroforézist hajtunk végre, egy körülbelül 480 bázispár méretű fragmentumot (IV. blokk) izolálva. 2-2). Az V. blokk izolálása (Eco R1-Bal1 fragmentum, kb. 1250 bázispár). Az 1. példában kapott pTRA1 klónból a plazmid DNS-t nagy mennyiségben izoláltuk a laboratóriumi kézikönyvben leírt módszer szerint, amint az a 2. ábrán látható. 5. Ebből a DNS-ből 70 μg-nak a Bal1 (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) és Nar1 (gyártó: Nirro Gen Co., Ltd.) restrikciós enzimekkel történő emésztése után elektroforézist hajtunk végre 0,8%-os agaróz gélben, izolálva. a Nar1-Bal1 fragmentum (körülbelül 1540 bázispár). A DNS-t elektroelúcióval izoláljuk. Ennek a DNS-nek az Eco R1 restrikciós enzimmel történő további részleges emésztése után elektroforézist hajtunk végre 0,7%-os agaróz gélen, izoláljuk az Eco R1-Bal1 fragmentumot (körülbelül 1250 bázispár). A DNS-t elektroelúcióval izoláljuk. 2-3). A javított APT gén (II) megalkotása a IV. és V. blokkból. Amint az a 3. ábrán látható. Az 5. ábrán a javított APT gént az alábbiak szerint kapjuk. A 2-1. példában kapott IV blokk (Bgl11-Eco R1 fragmens, körülbelül 480 bp) a 2-2. példában kapott V blokkkal (Eco R1-Bal1 fragmentum, körülbelül 1250 bp) a fent leírt DNS-dopping készlettel az adalékolt terméket etanollal kicsapjuk. Csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot Xho 11 restrikciós enzimmel emésztjük a szokásos módon. Ezután 0,8%-os agaróz gélen elektroforézist hajtunk végre, hogy izoláljuk a Bgl 11-Xho 11 fragmentumot (körülbelül 1500 bázispár, a javított APT génjét tartalmazza). A DNS-t ezután elektroelúcióval izoláljuk. Az így kapott javított APT gén (II) teljes bázisszekvenciáját a 2. ábra mutatja. 8-13. A kikövetkeztetett aminosavszekvenciát az 1. ábra is mutatja. 14-19. 3. példa A javított APT V, VI és VIII gén megalkotása. A javított V., VI. vagy VIII. APT gén megalkotását a javított APT gén (II) alapján hajtjuk végre a következő publikációkra hivatkozva. A genetikai konverziót helyspecifikus mutáció indukálásával hajtják végre. Publikációk: Zoller M. J. és Smith M., Method in Fermentology, 100, 468-500 (1983), Zoller M. J. és Smith. M. DNA, 3, 479-488 (1984), Morinaga Y. és munkatársai, Biotechnology, 636-630 (1984. július), Adelman J. P. és munkatársai, DNA, 2, 183-193 (1983). ), 6. M13 Sequencing Manual (puC), amelyet a Gene Science Room Co., Ltd. adott ki). 3-1). A javított APT gén (V) felépítése. A) M13mp19 (APT/P/) létrehozása mutációhoz. A javított (II) APT génfragmenst, amelyet részletesen a 2. példa 2-3. pontjában ismertetünk, M13mp9 kettős szálú DNS-hez ligáltuk, amelyet BamH1 restrikciós enzimmel és alkalikus foszfatázzal kezeltünk (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.). A ligációs terméket E. cjli JM109 kompetens sejtekbe transzfektáltuk (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.). Minden olyan klónt, amely színtelen, steril foltot hoz létre, az E. Coli JM109 fertőzésére használjuk. Az egyszálú DNS-t a tenyészet felülúszójából, a kétszálú (replikatív) DNS-t pedig az E. cli sejtekből a Messing-módszerrel (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983) izoláljuk. ). E kettős szálú DNS-ek természetének elemzésével, a Pst1 restrikciós enzimmel agaróz gélelektroforézissel végzett emésztést követően az mp9 klónt (javított APT(II)) kapjuk, amelyben az APT(II) gént beépítjük az mp9 DNS-be Ezeknek a DNS-eknek a Pst restrikciós enzimmel történő hasítása után elektroforézissel 0,8%-os agaróz gélen, ahol az mp9 klón (javított APT (II)) egy egyszerű sávot mutat a 7300. pozícióban. Az ebből a klónból származó egyszálú DNS-t egy következő kísérletben alkalmazzuk helyspecifikus mutáció indukálására. B) Helyspecifikus mutációt indukálni képes primer szintézise. A javított APT (II) gén helyspecifikus mutációjának indukálására használt szintetikus oligonukleotidot α-cianoetil-foszfoamidát módszerrel szintetizálják Model 380 A DNS szintetizátor (gyártó: Applied Biosystems) segítségével. A DNS-oligomer szintézisét, a védőcsoport eltávolítását, a gyantáról való lehasítást és a tisztítást a 380 A DNS-szintetizátor használati utasítása szerint hajtják végre. Egy adott helyen mutáció indukálásához egy primert (1), amely képes helyspecifikus mutációt indukálva és egy primert (2) kapunk a didezoxiszekvenáláshoz az M13 fágvektor használatával (J. Carlson és munkatársai, Journal of Biotechnology, 1, 253., 1984). A javított APT (II) aminosav- és nukleotidszekvenciáját megadjuk. A mutáció indukálására képes primer (1) az aláhúzott bázisban különbözik a javított APT (II) génszekvenciájától (lásd 1. táblázat). C) Helyspecifikus mutáció indukálása. Az alábbiakban bemutatunk egy eljárást egy olyan klón létrehozására, amely egy mutációt előidéző ​​(1) primer bázisszekvenciáját tartalmazza, nevezetesen a javított APT gént (IV). A 3.3-1. példában leírt egyszálú DNS annealizálása (renaturálása), A) mp9 klón (javított APT (II) és primer (1) után a renaturációs termék kettős szálú DNS-vé alakul, amely ezután átalakul E. coli JM109 Azután egy szekvenáló primer alkalmazásával a DNS-szekvenciákat szkríneljük, és egy mutált, javított APT gént (II) hordozó fág klónt, nevezetesen a javított APT gént (V) extraháljuk ebből a klónból izoláljuk a javított APT gént (V) a szintetikus oligomer 5"-terminális foszforilációjával. A helyspecifikus mutációt előidéző ​​primer DNS-t (1) a 2.2-1. példában leírt módszerrel foszforiláljuk. heteroduplex DHE 0,5 μg egyszálú M13mp9 DNS-t (javított APT (II. )) és 1,5 μg kétszálú M13mp9 DNS-t, amelyet BamH1 restrikciós enzimmel emésztettünk, 2 pmol primert tartalmazó 30 μg-os oldatban melegítünk. (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA és 50 mM NaCl, 90 o C (2 perc), 50 o C (5 perc), 37 o C (5 perc) és szobahőmérsékleten ( 10 perc). Adjunk az oldathoz 36 μl 50 mM Tris-HCl oldatot (pH 8,0), amely 4 egység Klenow enzimet, 7 egység T4 fág DNS ligázt, 0,1 mM EDTA-t, 12 mM MgCl 2-t, 10 mM ditiotreitolt, 0,7 mM ATP-t tartalmaz. 0,07 dATP és egyenként 0,2 mM dGTP, dTTP és dCTP a primer megnyúlásának stimulálására. Az elegyet 20 o C-on 2 órán át, 4 o C-on 15 órán át reagáltatjuk. A transzformációt a fent leírt oldattal és kompetens E. coli JM109 sejtekkel (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) végezzük, amíg lízisfoltok képződnek. A színtelen folt elválasztása után a fágot E. coli JN109-cel fertőzzük meg proliferáció céljából. Ezután mindegyik klónhoz a tenyészet felülúszójából templát egyszálú DNS-t nyerünk. Ezeket az egyszálú DNS-eket csak a didezoxi-módszer "T" reakciójának (a 3-2. példában "A" és "T" reakció) vetjük alá, szekvenáló primer (2) alkalmazásával, majd poliakrilamid gélelektroforézissel. Szárítás után a gélt autoradiográfiával elemezzük. Az eredmények alapján azonosítjuk a kívánt mutáns szekvenciával rendelkező klónt. A klón tenyészet felülúszóját E. coli JM109 sejtek fertőzésére használjuk, és újra beoltjuk a lemezre, hogy egyetlen foltot izoláljunk. A kapott egyetlen foltból egyszálú DNS-t izolálunk a fenti módszer szerint. Ezen DNS-ek felhasználásával először a DNS bázisszekvenciáját határozzuk meg didezoxi-módszerrel, szekvenáló primer (2) alkalmazásával, így a kívánt bázisszekvenciára mutált klónt kapunk. Miután ezt a fágklónt a 2. példában leírt Messing-módszerrel JM-109 E. coli sejtekkel fertőztük, kettős szálú DNS-t kapunk. Ezt a kettős szálú DNS-t Xho 11 restrikciós enzimmel emésztjük, 0,8%-os agaróz gélen elektroforézist hajtunk végre, hogy izoláljunk egy fragmentumot (a javított APT gént tartalmazó, körülbelül 1500 bázispárból álló javított APT gén (V). Ezután a DNS Ezen túlmenően, a dideoxi módszerrel meghatározzuk az így kapott DNS teljes bázisszekvenciáját, amiből kiderül, hogy a DNS a javított APT (V) gén Az így kapott javított APT teljes bázisszekvenciája. V) gén (azonban tartalmazza a -35-től -1 szignálpeptidet) a 11-13. ábrákon látható. Az ebből származó aminosavszekvencia a 17-19. ábrákon is látható. 3-2. APT (VI) és (VIII). A technikák hasonlóak a 3. példában leírtakhoz, 3-1). Először az M13mp3-at (javított APT (II)) állítják elő, majd primereket szintetizálnak, hogy helyspecifikus mutációt indukáljanak. Ezeknek a primereknek a bázisszekvenciáját azonban fentebb leírtuk a javított APT gén (VI) és a javított APT gén (VIII), egy 5"-végű foszforilált primer (3) és egy 5"-végű foszforilált primer (5) létrehozása céljából. ) használatosak (lásd asztal 2). Helyspecifikus mutáció indukálását követően a teljes bázisszekvenciát didezoxi módszerrel határozzuk meg. Megerősítettük, hogy rendelkeznek a kívánt bázisszekvenciákkal. Így a javított APT (VI) és javított APT (VIII) génjeit kapjuk. Ezeket a géneket azután a 4. és 5. példában leírt eljárás szerint integráljuk a pVY1 vektorba. 4. példa A javított APT gén (II) integrálása a pVY1 vektorba. 4-1) A pVY1 vektor megalkotása. A pVY1 vektort az 1. ábrán látható módon állítjuk elő. 7. A) A pAdD26SV (A) N3 (N) előállítása és az Eco R1 hasítási hely tompa végződése. Először a pAdD26SV(A) N3 DNS-t (amelyet Dr. Hiroshi Handa-tól vásároltak a Tokiói Egyetemen, Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, 1982)) a Bgl11 restrikciós enzimmel (gyártva) emésztjük. Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) a DNS-t hagyományos módon, Klenow enzim segítségével (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tompa végűvé alakítjuk. és csökkentett nyomáson szárítjuk, majd a csapadékot steril desztillált vízben oldjuk, és a plazmid DNS-t tetraciklin rezisztenciát mutató transzformánsokkal transzformáljuk A szokásos módon ezeknek a DNS-eknek a BgL 1 restrikciós enzimmel történő emésztése után elektroforézist hajtunk végre, amely a BgL 11 restrikciós enzimmel nem emésztett DNS-t tartalmaz. (pAdD26SV(A) N3 (N)) ennek a klónnak a DNS-ét az Eco R1 restrikciós enzimmel a hagyományos módon, a DNS-t Klenow enzim segítségével tompavá tesszük a fent leírtak szerint. Fenollas kezelés, etanolos kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot desztillált steril vízben feloldjuk. B) A Kpn 1-BamH1 fragmentum (körülbelül 2900 bp) izolálása pKSV10-ből és tompa végek kialakítása. Miután a pKSV10 DNS-t (gyártó: Fine Chemicals) hagyományos módon Kpn1 és BamH1 restrikciós enzimekkel emésztettük, a DNS-t tompa végűvé tesszük T4 DNS polimeráz segítségével (laboratóriumi kézikönyv, 114-121. oldal). Az elektroforézist ezután 0,7%-os agarózgélben hajtjuk végre, hogy izoláljunk egy körülbelül 2900 bázispár méretű fragmentumot. A fragmentumot ezután elektroeluálással extraháljuk a DNS-t

C) A pVY1 megalkotása. Az A) lépésben kapott DNS-fragmens és a B-ben kapott DNS-fragmens ligálása után a kompetens E. coli HB101-sejteket transzformáljuk (lásd fent). A plazmid DNS-t a tetraciklinre rezisztens transzformánsokból nyerik ki hagyományos módszerrel. Miután ezen plazmid DNS-ek egy részét Pst1 restrikciós enzimmel emésztettük (gyártó: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.), elektroforézist hajtottunk végre 1,0%-os agarózgélen. Az eredmény egy klón (pVY1 plazmid), amelyet körülbelül 3400 bázispár, körülbelül 3200 bázispár és körülbelül 1400 bázispár hosszúságú sávok jellemeznek. Ezt a HB101 E/coli klónt (pVY1 a Japán Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség Fermentációs Kutatóintézetében helyezték letétbe P-9625 regisztrációs számon (FEPM BP 2106). 4-2) A javított APT gén integrációja (II. ) a pVY1 vektorba. Miután a 4-1. példában kapott pVY1 plazmid DNS-ét a BgL 11 restrikciós enzimmel hagyományos módon emésztettük, defoszforilációt végeztünk alkalikus foszfatázzal (gyártó: Takara Shuzo. Co. Ltd.). Ezután a fenolos kezelést háromszor végezzük. Etanollal történő kicsapás és csökkentett nyomáson történő szárítás után a csapadékot steril desztillált vízben oldjuk. Ezt a DNS-t a 3., 3-1. példákban kapott 11-Xho11 BgL-fragmenssel (körülbelül 1500 bázispár) és HB101-kompetens E. coli sejteket transzformáltuk a ligációs termékkel a fent leírt módszer szerint. A plazmid DNS-t tetraciklin-rezisztens transzformánsokból állítják elő hagyományos módon. Ezen DNS-ek restrikciós enzimekkel (BqL 11, Pst 1) történő emésztése után kiválasztják azt a klónt, amely a pVY1 vektorban a kívánt irányban integrálva a javított APT gént (II) tartalmazza, és a szelekciót az analízis alapján végezzük. az agaróz gél elektroforézis mintát. Először ezeknek a DNS-eknek egy részét emésztjük a BqL 11 restrikciós enzimmel, majd elektroforézissel 0,8%-os agaróz gélen, így kapunk egy klónt, amelynek fragmenssávja körülbelül 1500 bp, amikor a BqL 11-Xho 11 fragmentumot a BqL-hez ligáljuk. A pVY1 plazmidok 11. fragmentumát, az Xho 11 és BqL 11 ligált részét a BqL 11 restrikciós enzimmel levághatjuk. Ezen klónok plazmid DNS-ének egy részét tovább emésztjük a Pst1 restrikciós enzimmel, és a DNS-t elektroforézisnek vetjük alá. 0,8%-os agarózgélben, hogy olyan klónt kapjunk, amelynek egyetlen sávja körülbelül 3400 bp, két sáv körülbelül 2300 bp, egy sáv körülbelül 1400 bp és egy sáv körülbelül 80 bp. Ennek a klónnak (a pVY1-APT (II) plazmid a laboratóriumi kézikönyvnek megfelelően) felhasználásával plazmid DNS-t kapunk. 5. példa A javított APT (V), (VI) és (VIII) gének integrálása a pVY1 vektorba. Hasítás után A 4-1. példában kapott pVY1 plazmid DNS-ének BqL 11 restrikciós enzim defoszforilációját hagyományos módon alkalikus foszfatázzal (gyártó: Takara Shuzo Co., Ltd.) hajtottuk végre, majd háromszor kezeltük fenol, kicsapás etanollal, és szárítás csökkentett nyomáson. Az üledéket ezután steril desztillált vízben oldjuk. Miután ezt a DNS-t a 2., 2-3. példákban kapott, körülbelül 1500 bázispár méretű BqLII-Xho 11 fragmenssel ligáltuk, a ligálási terméket a fenti kompetens HB101 E. coli sejtekbe transzformáljuk. A plazmid DNS-eket tetraciklinrezisztenciát mutató transzformánsokból állítjuk elő hagyományos módszerrel. Ezeknek a DNS-eknek a BqL11 és Pstl restrikciós enzimekkel történő emésztése után agaróz gélelektroforézist hajtunk végre. Az elválasztási mintázat agaróz gélen történő elemzésével olyan klónokat választunk ki, amelyekben a javított APT (V) gént a kívánt irányban beépítjük a pVYI vektorba. Először, miután ezen DNS-ek közül néhányat megemésztettünk a BqL11 restrikciós enzimmel, elektroforézist hajtunk végre 0,8%-os agarózgélen, hogy klónokat kapjunk, és körülbelül 1500 bázispár hosszúságú sávot kapjunk. Ha a BqL11-Xholl fragmenst a pVYI vektor BqL11 fragmentumához kapcsoljuk, az Xholl és BqL11 részt a BqL11 restrikciós enzim lehasíthatja a fent említett izoskizomer konfiguráció miatt. E klónok plazma DNS-ének egy részének a Pstl restrikciós enzimmel történő további emésztése után elektroforézist hajtunk végre 0,8%-os agarózgél-koncentráció mellett, így kapunk egy klónt, amely körülbelül 3400 bp sávot, körülbelül 2300 bp sávot eredményez. két körülbelül 1400 bp sáv, egy körülbelül 800 bp és egy körülbelül 80 bp sáv. Egy klón (pVYI-APT (V) plazmid) segítségével a plazmid DNS-t nagy mennyiségben nyerjük a laboratóriumi kézikönyv alapján. Hasonlóképpen, a javított APT (VI) és (VIII) génjei beépülnek a pVYI vektorba. 6. példa Fejlett APT expressziója CHO-sejtekben. A pVYI - javított APT (VI), APT (II), APT (V) vagy APT (VIII) plazmidot DHFR-hiányos CHO-sejtekbe transzfektáljuk (Urlaub és munkatársai, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77). (7), 4216-4224, 1980) kalcium-foszfát módszerrel [Graham és mtsai. Viroloqy, 52, 456, 1973). Egy szelektív táptalajon (MEM A LPHA (-), GIBCO) metotrexát (MTX) jelenlétében nyert transzformáns klón APT aktivitása 50-100 egység/ml (az értéket a leírt fibrin/agaróz lemezes módszerrel határozták meg) lent). Ezt a klónt későbbi vizsgálatokhoz használják. A felhasznált gyártási közeg GIT táptalaj (gyártó: Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.) 20 nemzetközi egység/ml (SIGMA) aprotininnel kiegészítve. 7. példa Javított APT tisztítása CHO-sejtek tenyészet felülúszójából. A 6. példában kapott tenyészet felülúszóját részlegesen tisztítottuk anti-APT monoklonális antitest affinitási oszlopon. A humán melanomasejtekből származó APT-re monoklonális antitesteket termelő hibridet állítanak elő hagyományos módon. Az antitest-termelő hibridet egerekbe oltják be, majd az ascitesben kifejlesztett monoklonális antitestet (alosztály: IgGM1) Cellulophin Protein A-val (gyártó: Biochemical Industry Co., Ltd.) és MAPS monoklonális antitest-tisztító pufferrendszerrel extrahálják és tisztítják. a Biorad Laboratories által. Az antitestet CN3r-aktivált Sepharose-hoz (gyártó: Pharmacia Fine Chemicals) kapcsoljuk 4 mg/1 ml gél arányban, hagyományos módon. Az antitestgélt (24 ml) összekeverjük 4 liter tenyészet felülúszójával. Egy éjszakán át 4 °C-on enyhe rázatás után a gélt egy oszlopba töltjük (átmérője 1,5 cm x 20 cm). A gélt ezután egymás után 125 ml-rel mossuk az alábbi oldatok mindegyikével (1) Tris-HCl puffer pH 7,4 (A puffer), amely 25 nemzetközi egység/ml aprotinint (gyártó: SIGMA) és 0,01 tömeg/térfogat% Tween 80-at tartalmaz. (2) 0,5 M NaCl-ot tartalmazó A puffer, (3) 4 M karbamidot tartalmazó A puffer és (4) A puffer. A fejlett gélhez kötött APT-t 0,2 M glicin-HCl pH 2 pufferrel eluáltuk, amely 25 internacionalit tartalmazott egység/ml aprotinint és 0,01% (w/v) Tween 80-at. Az aktív frakciókat redukáljuk és egyesítjük. 10 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4), amely 25 nemzetközi egység/ml aprotinint és 0,01% (w/v) Tween 80-at tartalmaz egy éjszakán át, a dializátumot 20-30-szor töményítjük vákuum centrifugális koncentrátummal (Speed ​​VAC, gyártott). SAVANT Inc.). A koncentrátumot ismét 10 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4), amely 0,15 M NaCl-ot, 25 nemzetközi egység/ml aprotinint és 0,01% (wt/v) Tween 80-at tartalmaz, egy éjszakán át dializáljuk, majd a következő in vitro és in vivo vizsgálatokhoz használjuk. . Végül a fajlagos aktivitás 3700-5000-szeresére nő, és a hozam az APT aktivitásának 36-42%-a (fibrin/agaróz lemezes módszerrel meghatározva). Ezt az aktív frakciót nátrium-dodecil-szulfát elektroforézissel és ezüstfestéssel analizáljuk. Redukáló körülmények között egy nagyon erős sáv figyelhető meg 54 kilodaltonnál, számos más sáv mellett. Az elektroforézisgélt ezután 2,5 tömeg/térfogat%-os Triton X-100-zal kezeljük, és fibrin/agaróz lemezre helyezzük, hogy 37 °C-on leírjuk a fibrin autogramját, miáltal az oldott sávot körülbelül 50 kilodaltonnál detektáljuk. Ugyanezen a lemezen a természetes APT körülbelül 60 kilodaltonnal jelenik meg. Az eredmények azt mutatják, hogy az antitest-affinitási oszlopon adszorbeált és ezzel a módszerrel eluált APT egy olyan javított APT-nek felel meg, amelynek molekulatömege körülbelül 10 000-rel kisebb, mint a természetben előforduló típus molekulatömege. 8. példa: A javított APT fajlagos aktivitásának mérése. A részben tisztított fejlett APT-ben lévő fehérje mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a BradFord-módszerrel [Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)] mérjük a teljes fehérjét, referenciafehérjeként marhaszérumalbumint használva. Az APT antigén mennyiségét enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) mérik. A fibrinolitikus aktivitást fibrin/agaróz lemezes módszerrel és 125 1-gyel jelölt fibrinfilm-oldó módszerrel határoztuk meg. Fibrin/agaróz lemezt készítünk úgy, hogy agart adunk 95%-os koagulált fibrinogénhez. Az 1-jelzett fibrinfilm 125 feloldásának módszerét Hoyraeerts és munkatársai ismertették. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), a Bioscott Inc. által gyártott humán melanomasejtekből származó standard APT-t használva. és az International Standard of APT (Gaffuey és Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985) szerint standardizáltuk. A 125 1-fibrin filmoldási módszerrel meghatározott aktivitási értékből és az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) meghatározott antigén mennyiségéből számított fajlagos aktivitás érték 300 000 és 420 000 egység/mg antigén között volt. 9. példa Javított APT affinitása fibrinhez és fibrin általi aktiválás

Verheijen és munkatársai munkája szerint/EMBOJ, 5, 3525, 1986) a javított APT fibrin iránti affinitását tanulmányozták. Javított vagy természetesen előforduló APT-t (1000 egység/ml) adnak a fibrinogénhez különböző koncentrációkban, majd egy egység harsonát adnak hozzá, majd szobahőmérsékleten 3 percig reagáltatják. A keletkező fibrinrögöt centrifugálással 16 000 fordulat/perc mellett 8 percig kicsapjuk, és a fibrin/agaróz lemezes módszer aktivitásának mérésével meghatározzuk a fibrinhez nem kötődő APT mennyiségét. Ennek eredményeként azt találtuk, hogy a javított APT (VI) ugyanolyan affinitást mutat a fibrin iránt, mint a természetes forma. A plazminogén aktiválásának mértéke javított APT által fibrin jelenlétében vagy hiányában a következő kísérletet végeztük. Titrálólemez segítségével a természetben előforduló vagy fokozott APT-t adjuk 0,1 M Tris-HCl pufferhez (pH 7,5), amely 0,3 mM szintetikus szubsztrát p-niroanilid tripeptid S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA. HCl, gyártó Kabi Inc.) .), 0,13 µM plazminogén plazmin nélkül, 120 µg/ml DESAFIB TM (gyártó: American Diagnostics Inc.) és 0,1 % Tween 80, így a teljes térfogat 200 µl. A rendszert 37 °C-on tartjuk. Egy bizonyos idő elteltével az abszorbanciát (optikai sűrűséget) 405 nm-es hullámhosszon mérjük egy Titertech Multiscan 310 modell segítségével. A javított APT (VI) és a természetben előforduló APT amidolitikus aktivitásának dózis-válasz görbéjét a 1. ábra mutatja. 22. A dózis-válasz görbe eltolódása a DESAFIB TM hozzáadásával a természetben előforduló APT esetében 158-szoros értéknek felel meg, míg a javított APT esetében eléri a 100-szorost. Ez annak köszönhető, hogy a javított APT (VI) aktivitása DESAFIB TM gyógyszer hiányában alacsonyabb, körülbelül 1/20-a, mint a természetes APT aktivitása. 10. példa A javított APT fibrinolitikus aktivitásának elemzése nyúl véráramában. Farmakinetika egy természetesen előforduló APT (n-APT) és a jelen találmány szerinti javított APT aktivitásának összehasonlításával nyúlban. Amint az a 3. ábrából látható. A 23. ábra szerint a javított APT az aktív állapotban való létezés biológiai felezési idejének észrevehető megnyúlását mutatja (a természetes APT felezési ideje 1-2 perc, míg a javított APT biológiailag aktív 8-15 percig). Ezen túlmenően nyilvánvaló, hogy az 5%-os aktivitásérték (a beadást követő 30 másodperces érték 100%) még 60 perccel a beadás után is megmarad a javított APT-ben (a természetes APT 0,1 aktivitást mutat 60 perc után). %-a az eredetinek). Ezt a kísérletet a következőképpen hajtjuk végre

Egy 2,4 kg súlyú japán fehér nyulat választanak ki vizsgálatra. Pentobarbitál érzéstelenítés mellett az APT-t perifériás fülvénán keresztül adják be. Az adag nyúlonként 15 400 egység (0,8 ml) javított APT és nyúlonként 5 400 egység (0,8 ml) n-APT (az értékeket fibrinlemezes módszerrel határozták meg). Ezután különböző időközönként (0,5-60 perc) 2,5 ml vért veszünk a femorális artériából katéter segítségével, és hozzáadjuk 1/9 térfogatú nátrium-citráthoz (3,8%). A vérvétel után 30 percen belül kis sebességgel centrifugáljuk, elválasztva a plazmát. Elválasztott plazma segítségével mérjük az APT aktivitást a vérben. (1) Az APT aktivitás mérése. 0,2 ml plazma 3 mM jégecettel 16-szoros hígítása után a hígított terméket alacsony forgási sebességgel centrifugáljuk, hogy csapadékot kapjunk. A csapadékot 20 mM Tris-HCl-ben (pH 7,4) oldjuk 140 mM NaCl-dal a plazmatérfogatnak megfelelő térfogatban, hogy megkapjuk az euglobulin-frakciót. Az APT aktivitást úgy határozzuk meg, hogy ezt az euglobulin-frakciót fibrin/agaróz edényhez adjuk. Miután a lemezt 37 °C-on 16 órán át inkubáltuk, az APT aktivitást plakk formájában figyeltük meg. A fibrin/agaróz lemez módszer standard görbéjét úgy készítjük el, hogy az állatnak beadott APT-t 0,1-10 000 egység/ml-re hígítjuk. Az így meghatározott vér APT-aktivitását százalékban fejezzük ki, a beadás után 30 másodperccel vett vérvételből kapott APT-aktivitást 100%-nak véve. 11. példa Javított APT (VI) stabilitása hővel és savakkal szemben. A hőállóság meghatározásához a javított APT-t (VI) és a természetes APT-t 100 mM NaCl-t és 0,01% Tween 80-at (pH 7,4) tartalmazó 50 mM Tris pufferrel hígítottuk 100 μg/ml koncentrációra. Mindegyik oldatot forrásban lévő vízben (98 o C-os) tartjuk 2-60 percig. Lehűlés után a maradék aktivitást fibrinlemezes módszerrel határozzuk meg. ábrán látható módon. A 24. ábra szerint a javított APT (VI) aktivitásának csökkenése elenyésző a természetes APT aktivitásának csökkenéséhez képest. Például 2 perces hőkezelés után a természetes APT aktivitása 25%-ra csökken, míg a továbbfejlesztett APT (VI) továbbra is 71%-on tartja aktivitását. A savállóság vizsgálatához a javított APT-t (VI) és a természetes APT-t 0,5 N-ben oldják. HCl-oldat 100 μg/ml koncentrációban, majd szobahőmérsékleten 30 percig ülepítjük. A semlegesítés után az aktivitást fibrinlemezes módszerrel határozzuk meg. A javított APT aktivitása nem mutat változást, míg a természetes APT aktivitása 50%-kal csökken. 12. példa Az aktív limfocita stimuláló faktor gátlása javított APT-vel (VI)

A javított APT-t (VI) és a természetes APT-t megfelelően hígítottuk PPM1 1640 szövettenyésztő tápközegben, amely 7% magzati borjúszérumot és 58 μM 2-merkaptoetanolt tartalmazott. A hígításból 100 µl-t egy 96 lyukú szövettenyésztő lemezre töltünk, majd 50 µl sejtszuszpenziót, amely 4-6 hetes hím C3H/He J egerekből származó timocitákat (210 7 sejt/ml), concanavalin A-t (1,2) tartalmaz. μg/ml), valamint 50 μl IL-1-et (4 egység/ml, Aenzyme Inc), majd 48 órán át tenyésztjük 37 o C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó inkubátorban. Ezután H 3 -timidint adunk hozzá 0,5 μ koncentrációban. kocka hüvelyk /20 µl/lyuk. 18 órás tenyésztés után a sejteket üvegszálas szűrőn összegyűjtjük, és a sejtekbe juttatott3H-timidin mennyiségét folyadékszcintillációs számlálóval mérjük, hogy meghatározzuk a limfocita stimuláló faktor aktivitását. Amint a 25. ábrán látható, a természetes APT nem gátolja a limfocita stimuláló faktor aktivitását, de a javított APT jelentősen elnyomja azt. Ha csak oldószerrel tesztelték, nem figyeltek meg hatást. 13. példa Denaturált fehérjén alapuló gyulladásgátló hatás. 1) Denaturált fehérje kinyerése. A fehérjeoldat (5 mg/ml) 0,1 N oldatban történő inkubálása után. HCl-oldat vagy 0,1 N. NaOH-oldatot 37 o C-on 2-3 órán át, a fehérjeoldatot azonos mennyiségű NaOH-val vagy HCl-lel semlegesítjük. 2) A javított APT (VI) affinitása a denaturált fehérjéhez. Módszer: Az alábbiakban ismertetett eljárás szerint a denaturált fehérjét egy nitrocellulóz filmhez „ragasztják”. Ezután megmérjük a fehérje- és nitrocellulózfilm kezeléssel kapcsolatos javított APT mennyiségét, ezáltal értékeljük a javított APT affinitását a denaturált fehérjéhez. Egy darab nitrocellulóz filmet merítünk 20 mM Tris-HCl pufferoldatba (pH 7,5), amely 140 mM NaCl-ot tartalmaz. Szárítás. A denaturált fehérje (50 μg/10 μl) cseppenként felszabadul egy darab nitrocellulóz filmre. Szárítás. Blokkolás 3%-os zselatin oldattal. Öblítés. Egy darab nitrocellulóz filmet a javított APT /1 μg/ml/ oldatába merítünk. Öblítés. Hozzáadjuk a plazminogént és az S-2251 szintetikus szubsztrátot, majd 37 °C-on inkubáljuk (az abszorbeált fejlett APT kvantitatív elemzése). Abszorbanciamérés 405 nm-en. Eredmények: Amint a 3. táblázat mutatja, a javított APT affinitást mutatott a HCl-lel kezelt immunglobulin G, a HCl-lel kezelt albumin és a NaOH-val kezelt albumin iránt. Másrészt a javított APT nem mutat affinitást az érintetlen immunglobulin G és albumin iránt. 3) A javított APT (VI) aktiválása denaturált fehérjével. Módszer: plazminogént (0,0078 egység 10 μl-ben), 100 μl 3 mM S-2251 szintetikus szubsztrátot és különböző mennyiségű TBS puffert adunk a javított APT aktivátor (denaturált fehérje, BrCN - feldolgozott fibrinogén stb.) reakcióoldatához. különböző koncentrációkban, így 0,275 ml reakcióoldatot kapunk. Advanced APT-t (2,5 n/g 25 µl-ben) adunk a reakcióoldathoz a reakció megindítására. Egy bizonyos ideig tartó reakció után 2%-os nátrium-dodecil-szulfátot (ekvimoláris mennyiség) adunk a reakcióelegyhez a reakció leállítására. Az optikai sűrűség (OD 405) mérésével meghatározzuk a javított APT aktivitását. Eredmények: Amint a 26. ábrán látható, a NaOH-val kezelt albumin és a HCl-kezelt immunglobulin G erős aktiváló hatást mutatott a javított APT-re. Különösen a HCl-kezelt immunglobulin G-ben az aktiválás erős, és a HCl-kezelt immunglobulin G aktivitása megközelítőleg megegyezik a BrCN-vel kezelt fibrinogén aktivitásával, többszörösen alacsonyabb koncentrációban. Az érintetlen albumin és immunglobulin G nem mutat aktivációt. 4) A denaturált fehérje lebontása javított APT (VI) hatására. Módszer: Miután a denaturált fehérjét a javított APT-vel az előző albekezdésben leírt módszerrel megegyező körülmények között reagáltattuk, azzal az eltéréssel, hogy az S-2251 szintetikus szubsztrátot nem adjuk a reakciórendszerhez, és a denaturált fehérje mennyisége 133 μg/ Az elektroforézist poliakrilamid gélben végezzük nátrium-dodecil-szulfáttal -merkaptoetanol jelenlétében. Eredmények: Amint a 27. ábrán látható, a NaOH-kezeléssel vagy HCL-kezeléssel denaturált fehérje az ef-fehérje sávok eltűnését és bomlástermékek képződését eredményezi, jelezve a bomlását. Másrészt, ép albumin alkalmazásakor nem észleltünk változást az ef-mintázatban a javított APT-vel való interakció után, így a denaturált fehérje degradációját sem észleltük.

KÖVETELÉS

1. Rekombináns szöveti plazminogén aktivátor, amelynek aminosav-szekvenciája a p. ahol Y jelentése Glu-Ile-Lys;

H2N - amino-terminális;

COOH - karboxi vég;

R - közvetlen kapcsolat vagy hasonló szekvencia, amely szubsztitúciókat és/vagy deléciókat és/vagy inszerciókat tartalmaz, amelyek nem kapcsolódnak az aktivitás változásaihoz,

A következő tulajdonságokkal rendelkezik: fibrinolitikus aktivitás, amelyet az 1 2 5 I-fibrin film feloldásának módszere határoz meg, a fibrin általi aktiválódás képessége és a javított tpA aktivitása fibrin hiányában, amely alacsonyabb, mint a fibrinfilm aktivitása. természetes tpA, a természetes formához képest megnövekedett felezési idő, a természetes tpA-hoz képest megnövekedett savakkal és hővel szembeni rezisztencia, limfocita aktiváló faktor gátlási képessége, denaturált fehérje általi aktiválódás képessége. 2. Eljárás rekombináns szöveti plazminogén aktivátor előállítására, beleértve a tpA analógját kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS-sel transzformált gazdasejtek tenyésztését és a céltermék ezt követő tisztítását, azzal jellemezve, hogy a gazdasejteket egy rekombináns vektorral transzformálva tenyésztjük. tpA-t kódoló DNS-szekvencia az 1. záradék szerint.