Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA)

Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) se provádí ve dvou fázích: první je interakce protilátek s antigenem, druhá je enzymatická indikace komplexu antigen-protilátka v důsledku výskytu barvy v reakční směsi a registrace barvy vizuálně nebo spektrofotometrickou metodou .

Pro ELISA existují dvě možnosti: pevná fáze a kapalná fáze, které se liší způsobem separace složek imunochemické reakce. Ve srovnání s dříve popsanými metodami detekce antigenů a protilátek má ELISA významné výhody:

vysoká citlivost umožňující detekci až 0,05 ng/ml látky;

schopnost použít minimální objemy testovaného materiálu (1--2 µl);

možnost přístrojového nebo vizuálního záznamu reakce;

expresivita a schopnost automatizovat všechny fáze reakce.

ELISA je v současné době v praxi široce využívána pro diagnostiku mnoha infekčních onemocnění bakteriální, mykotické etiologie, protozoálních infekcí a helmintiáz, ale zejména virových infekcí, zejména hepatitidy A, B, C, D, E, G, HIV infekce, herpesviru, rotavirus, adenovirus, astrovirus, parvovirus a další infekce.

Imunitní blotting

Principem metody imunoblotování je průkaz protilátek proti jednotlivým antigenům patogenu. Pomocí této metody se stanoví protilátky proti antigenům HIV (virové obalové glykoproteiny, jádrové proteiny a virové enzymy). Výsledky imunoblotu jsou hodnoceny jako pozitivní, pochybné a negativní v závislosti na kvantitativním a kvalitativním souboru detekovaných protilátek.

Je třeba poznamenat, že imunitní blotting je nižší v citlivosti na ELISA, v některých případech může být zaznamenán negativní výsledek, pokud má pacient infekci HIV. Možnost registrace falešně pozitivních výsledků v ELISA pro infekci HIV však vyžaduje integrovaný přístup k diagnostice infekce HIV, zohledňující kromě výsledků imunologických reakcí (ELISA, immunoblotting) také epidemiologická a klinická data.

Polymerázová řetězová reakce (PCR)

Metodu PCR vyvinul americký biochemik Kary Mullis v roce 1983 na základě jím objevené termostabilní DNA polymerázy (Tag polymeráza). Principem metody je zvýšení 106-108násobku počtu kopií specifické oblasti DNA patogenu, katalyzované in vitro DNA polymerázou v automatickém režimu.

Za umělých podmínek je možná reprodukce procesu replikace oblasti genomu specifické pro určitý druh nebo rod patogenů za předpokladu, že je známa její nukleotidová sekvence. Použití metod pro detekci replikačních produktů takových oblastí (amplikonů) nám umožňuje určit přítomnost patogenu v testovaném vzorku.

Výše popsaná komplementární tvorba řetězce začíná pouze v určitých výchozích blocích, kterými jsou krátké dvouvláknové úseky. Když jsou takové bloky připojeny ke konkrétním úsekům DNA, proces syntézy nového řetězce je řízen pouze ve vybraném úseku, nikoli po celé délce řetězce DNA. K vytvoření startovacích bloků v daných úsecích DNA se používají dva oligonukleotidové primery, nazývané primery. Primery jsou komplementární k sekvencím DNA na levé a pravé hranici specifického fragmentu a jsou orientovány tak, že k dokončení nového řetězce DNA dochází pouze mezi nimi.

NA výhody metody PCR by měl obsahovat:

vysoká citlivost umožňující stanovení 10-1000 buněk ve vzorku;

vysoká specificita, protože testovaný materiál odhaluje fragment DNA jedinečný pro daný patogen;

univerzálnost postupu pro detekci různých patogenů z jednoho biovzorku;

Vysoká rychlost analýzy (4--4,5 h);

Možnost diagnostiky nejen akutních, ale i latentních infekcí.

Použití PCR je účinné pro diagnostiku široké škály bakteriálních a virových infekcí.

V poslední době byly poměrně úspěšně implementovány kvantitativní metody PCR analýzy, které umožňují stanovit koncentraci patogenu v materiálu (mikrobiální nebo virovou zátěž), například posoudit replikační aktivitu viru hepatitidy B, HIV C .

Je však třeba mít na paměti, že metoda PCR má také svá omezení, zejména pro diagnostiku infekcí způsobených oportunní autoflórou.

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace nukleových kyselin, stejně jako PCR umožňuje identifikovat patogen ve vzorku bez předchozí izolace. Pro provedení analýzy se syntetizuje jednovláknová sonda DNA nebo RNA, komplementární ke specifickým nukleotidovým sekvencím patogenu. Sonda je označena radionuklidem, enzymem nebo jinou snadno rozpoznatelnou značkou. Studovaný materiál je podroben zpracování za účelem lýzy mikroorganismů přítomných v biotestu, izolaci a denaturaci DNA. Poté se sonda inkubuje s testovaným vzorkem a měří se množství značené DNA, které vstoupilo do hybridizace s DNA v testovaném vzorku. Reakce může probíhat jak na sorbentech v pevné fázi, tak v roztoku, ale předpokladem je promytí nenavázaných množství značené sondy. Citlivost metody hybridizace nukleových kyselin je nižší než u PCR a je 103 mikrobiálních buněk ve vzorku.

Sada reagencií „MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2“ je určena k potvrzení detekce protilátek proti jednotlivým proteinům (antigenům) HIV-1 a/nebo HIV-1 skupiny O a/nebo HIV-2 v lidské sérum nebo plazma metodou imunoblot.

Charakteristické rysy:

Sada reagencií „MPBA – Blot – HIV-1, HIV-2“ obsahuje purifikované lyzátové virové proteiny HIV 1 a peptid – antigenní determinantu gp36 HIV-2;
Poskytuje detekci protilátek proti HIV-1, HIV-1 skupiny O, HIV 2 na jednom proužku;
Jednoduchý postup přípravy a provádění testů;
Vnitřní kontrola kvality reakce*
Maximální rychlost analýzy (3 hodiny);
Malý objem zkušebního vzorku - 20 µl;
Nevyžaduje další vybavení pro výzkum;
Kvalita sady je zaručena použitím ruských a mezinárodních standardních vzorků**

* Vnitřní kontrola kvality je zajištěna přítomností:

vnitřní kontrolní proužky, poskytuje kontrolu nad zavedením vzorku séra nebo plazmy;
kontrolní negativní sérum (K-);
kontrolní pozitivní sérum (K+), které umožňuje identifikaci proužků detekovaných na proužku;
kontrolní slabě pozitivní sérum (K+cl), které poskytuje kontrolu nad citlivostí reagenční soupravy.

**Zajištění kvality:

Charakteristiky soupravy činidel MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 byly stanoveny testováním vzorků od náhodného vzorku dárců, pacientů s diagnózou HIV infekce, komerčních panelů sérokonverze, standardních panelů a vzorků s „potenciálně interferujícími s určovací“ složky.

Sada reagencií nedává falešně pozitivní výsledky při vyšetření standardních panelových sér, která neobsahují protilátky proti HIV 1,2 a HIV-1 antigenu („AT (-) HIV Standard“, č. FSR 2007/00953 ze dne 25. 10. 2007 ). Specifičnost - 100%.

Diagnostická specificita byla stanovena studiem náhodného vzorku 200 dárců z různých krevních center a klinik s dříve potvrzenou nepřítomností infekce HIV-1 a HIV-2. Specificita při studiu náhodného vzorku dárců byla 100%;

Specifičnost reagenční soupravy byla stanovena testováním 250 vzorků, včetně vzorků séra nebo plazmy získaných od těhotných žen, hospitalizovaných pacientů, pacientů s hepatitidou C a E a vzorků s „potenciálně interferujícími“ složkami. Při použití soupravy MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2 pro tyto vzorky nebyly zjištěny žádné falešně pozitivní výsledky.

Diagnostická citlivost byla stanovena pomocí:
- vzorky plazmy z panelu Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) z různých oblastí obsahujících různé podtypy HIV-1: skupina M (podtypy A, B, C, D, E, F) a skupina O; citlivost reagenční soupravy byla 100 %;

Citlivost reagenční soupravy byla stanovena ve studii mezinárodních sérokonverzních panelů Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. č. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932

Sada reagencií detekuje protilátky proti HIV-1 v sérech standardního panelu obsahujícího protilátky proti HIV-1 („AT (+) HIV-1 Standard“, č. FSR 2007/00953 ze dne 25. října 2007), detekuje protilátky proti HIV-2 ve standardních panelových sérech obsahujících protilátky proti HIV-2 („AT (+) HIV-2 Standard“, č. FSR 2007/00953 ze dne 25. října 2007). Citlivost - 100%.

Osvědčení o registraci č. FSR 2010/07958 ze dne 13. července 2011 (platnost neomezená)

Sloučenina:

Imunosorbent. Proužky bílé nitrocelulózové membrány s jednotlivými HIV-1 proteiny (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) na ně sorbovány elektrotransferem a naneseny na proužek se syntetickým HIV-2 peptidem, analogem proteinu gp36 a lidské anti-IgG (interní kontrola) - 18 ks;
K- - kontrolní negativní sérum. Lidské krevní sérum, které neobsahuje protilátky proti HIV-1,2, HCV, HIV antigen, HBsAg, je inaktivováno zahřátím na 560C; průhledná světle žlutá kapalina - 1 zkumavka (0,08 ml). Obsahuje konzervační látky: thimerosal a azid sodný;
K+ - kontrolní pozitivní sérum. Lidské krevní sérum obsahující protilátky proti HIV-1,2 (titr ne méně než 1:10000), neobsahující HBsAg, HIV antigen, protilátky proti HCV, se inaktivuje zahřátím na 560C; průhledná světle žlutá tekutina - 1 zkumavka (0,08 ml) Obsahuje konzervační látky: thimerosal a azid sodný.
K+sl - kontrolní slabě pozitivní sérum. Lidské krevní sérum obsahující protilátky proti HIV-1,2 (titr ne více než 1:200), neobsahující HBsAg, HIV antigen, protilátky proti HCV, se inaktivuje zahřátím na 56 °C; průhledná světle žlutá kapalina - 1 zkumavka (0,08 ml). Obsahuje konzervační látky: thimerosal a azid sodný;
RPOKk (x10) - roztok pro ředění vzorků a konjugátu. Koncentrát - Tris pufr obsahující předem upravené normální kozí sérum; neprůhledná šedá tekutina - 1 lahvička (10 ml). Obsahuje konzervační látku: thimerosal;
PRk (x20) - promývací roztok. Koncentrát - Tris pufr obsahující Tween-20; průhledná bezbarvá kapalina - 1 lahvička (70 ml). Obsahuje konzervační látku: thimerosal;
Sdružené. Kozí anti-lidské IgG protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou; průhledná bezbarvá kapalina - 1 zkumavka (0,06 ml);
Substrát (barvicí roztok). Roztok 5-brom-4-fluorindolylfosfátu (BCIP) a nitrotetrazolia (NBT); průhledná světle žlutá kapalina - 1 lahvička (50 ml);
Prášek pro imunoblotování. Sušené odstředěné mléko - amorfní bílý nebo světle žlutý prášek - 5 balení x 1g;
Tableta s víkem pro nastavení reakce - 2 kusy;
Plastová pinzeta - 1 kus.

HIV imunoblot detekuje protilátky proti virovým proteinům umístěné na speciální nitrocelulózové membráně. Jedná se o vysoce přesnou studii, která identifikuje přítomnost frakcí, ve kterých jsou umístěny hlavní proteiny ve formě malých proužků.

Obal viru HIV-1 obsahuje glykoproteiny s molekulovou hmotností v rozmezí od 41 kd do 160 kd (kilodaltonů). Velký význam pro imunoblotování má HIV-2 glykoprotein s molekulovou hmotností od 32 kd do 140 kd. Jádrové proteiny HIV-1 a virové enzymy jsou reprezentovány proteiny p17, p24, p55.

Původce HIV-2 se skládá z proteinů označených p16, p25, p56. Tvoří jeho vnitřní obal. Genom obsahuje 6 regulačních a 3 strukturální geny. Často během buněčného dělení vznikají genetické nepřesnosti a objevuje se několik podtypů patogenu.

Pozitivní testy

K odstranění chyb v laboratorní diagnostice infekce HIV je pacientovi předepsán další test. Jeho výsledky jsou integrovány jako pozitivní, pokud jsou detekovány protilátky proti 2 nebo 3 proteinům HIV-1 nebo HIV-2.

Imunoblot potvrzuje všechny dobré výsledky ELISA. V tomto případě jsou detekovány protilátky proti gp120/160, gp41 nebo p24, což jsou strukturální jednotky tří hlavních genů AIDS - gag, pol a env. U některých pacientů, kteří mají negativní výsledky ELISA a PCR, imunoblot ukazuje několik pozitivních proužků. Lékař předepíše další test p24 ke stanovení správné diagnózy a vyloučení rané fáze infekce HIV.

Pokud jsou získané výsledky pochybné, je pacient požádán, aby test opakoval během následujících 3 měsíců. Téměř všechny případy HIV jsou potvrzeny pomocí imunoblotovacího systému – zařízení Sanofi. Ve většině případů jsou detekovány antigeny HIV, proteiny p25, gp110/120 a gp160, což ukazuje na infekci virem. Falešně pozitivní test je registrován u pacientů trpících onemocněním pojivové tkáně se zvýšenou hladinou bilirubinu při interakci s různými virovými antigeny.

Negativní výsledek

Pokud chybí pozitivní linie odpovídající proteinům viru AIDS, imunoblot je interpretován jako negativní výsledek. Analýza jasně potvrzuje nepřítomnost infekce virem imunodeficience nebo ukazuje „období okna“. Pokud imunoblot dává negativní výsledek, osoba není nosičem viru AIDS.

Pro studii se odebírají vzorky krevního séra od pacientů infikovaných HIV. Skladují se zmrazené při -20 °C. Analýza se provádí pomocí testovacích systémů:

Antigen;
rekombinantní HIV;
Peptosscreen.

Registrace negativního výsledku indikuje nepřítomnost protilátek proti obalovým glykoproteinům HIV gp120, gp160, Sp41 v séru.

Pacienta často zajímá otázka, zda pacient, který má infikovaného sexuálního partnera, může mít negativní výsledek imunoblotu na HIV. Po studii je často získán sporný výsledek nebo jsou detekovány protilátky proti proteinům gp120 a gp160, což ukazuje na úplnou absenci negativních dat. Někdy je u pacientů s asymptomatickou infekcí zaznamenána pochybná odpověď.

Neinterpretovatelné výsledky

Testy provedené pomocí různých testů na protilátky proti HIV jsou někdy negativní a nesplňují kritéria séropozitivity. Pro lékaře je obtížné určit příčinu pochybného výsledku.

Někteří pacienti nejsou ohroženi infekcí HIV. Lékař se může při interpretaci výsledků testu dopustit chyby, pokud je infekce způsobena jiným sérotypem.

Krevní sérum pacienta musí být časem vyšetřeno. Pokud během 6 měsíců nejsou pozorovány žádné klinické projevy AIDS a neexistují žádné rizikové faktory, je pacient zaznamenán jako bez infekce.

U pacientů s nízkým rizikem infekce jsou získány pochybné výsledky testů. V některých případech je výskyt nejasných údajů způsoben imunitními komplexy a autoprotilátkami obsaženými v krevním séru.

U některých pacientů je výskyt sporných výsledků způsoben vývojem patologických procesů:

infekční choroby;
rakovinný nádor;
alergická reakce.

Pacient zaznamená změny v klinickém krevním testu, zvýšení C-reaktivního proteinu nebo zvýšení ESR. U lidí trpících infekčními chorobami je často zjištěna pochybná imunoblotová reakce na HIV.

Pacienti s neurčitými výsledky nemohou darovat krev a biologické materiály.

Lineární metoda

Princip imunoblotování zahrnuje:

Použití nativního formátu virové substance HIV nebo antigenů ve formátu Western Blot.
Kombinace HIV proteinů s jednotlivými protilátkami detekovanými v krevním séru.
Inkubační proces, ke kterému dochází po přidání značených protilátek k lidskému Ig.
Interpretace barevných pruhů.

Analýza umožňuje lékaři včas interpretovat výsledky studie. Pozitivní blot je dešifrován jako 2ENV+/- GAG+/POL, neurčitý - 1 ENV+/- GAG+/POL. Negativní výsledek znamená žádné pruhy.

K provedení analýzy se používají rekombinantní a lyzátové imunobloty. Studie je specifická a činí 99,5 %.

Pacienti se ptají, zda lze výsledek testu interpretovat jako nepravdivý. Získaná data mohou být generována jako výsledek stimulace obranyschopnosti organismu (těhotenství, hemodialýza). Pokud je podezření na akutní retrovirový syndrom a doporučuje se kontakt s pacientem s HIV infekcí, doporučuje se pacientovi darovat sérum pro PCR reakci. Opakované sérologické vyšetření je potvrzeno měřením virové zátěže v předloženém vzorku biologického materiálu.

Diagnostika HIV u novorozenců

Test na AIDS u malého dítěte se provádí, pokud je navázán kontakt s matkou infikovanou HIV. Sérologické reakce mohou být pozitivní po dobu 1,5 roku. Protilátky v krevním séru novorozence jsou detekovány pomocí ELISA, RIF a imunoblotovacích reakcí.

Během 9 měsíců života dítěte se objeví pozitivní výsledek v důsledku přítomnosti mateřských protilátek v krevním séru. Antigen p24 má specificitu přibližně 65 %. V některých případech není možné u nemocného dítěte detekovat protilátky, pokud je u něj diagnostikována vrozená nízká hladina globulinů v krvi. Stanovený negativní výsledek imunoblotu nezaručuje nepřítomnost infekce.

Testování se provádí v několika fázích:

1-2 dny po narození;
po 1-2 měsících;
v šesti měsících věku.

Další studie protilátek se provádí, dokud nejsou získány 2 negativní výsledky imunoblotu. Diagnóza AIDS u dítěte narozeného ženě infikované HIV je možná na základě 2 pozitivních výsledků PCR. Přenos patogenu HIV na novorozence je vyloučen, pokud žena nekojí.

Těhotenský test

Nastávající matce je předepsán imunologický a line blotting, pokud je pomocí testu ELISA získán pozitivní výsledek na HIV. Pokud se blot potvrdí, má pacient AIDS. V tomto případě je od 14. týdne těhotenství předepsána terapie, aby se zabránilo infekci dítěte.

Může se odborník při provádění testu krevního séra v těhotenství zmýlit, ptají se pacientky svého ošetřujícího lékaře. Je povinen předat těhotné ženě kopie testů PCR a ELISA, aby byly vyloučeny pochybnosti o jejich spolehlivosti.

Problémy někdy nastávají při provádění imunoblotu, ale pokud jsou ELISA, blot a PCR pozitivní, je diagnóza HIV infekce nakonec potvrzena. Pravděpodobnost falešně pozitivního testu během těhotenství je vysoká. Pokud je ELISA (+) a imunoblot (-), je žena požádána, aby znovu odebrala krevní sérum.

Výměnný průkaz těhotné ženy ukazuje výsledek studie. Pokud je jeho hodnota kladná, žena má zakázáno krmit své dítě po porodu, aby se nenakazilo virem AIDS. Konečné závěry jsou učiněny na základě laboratorních, klinických a epidemiologických studií. Teprve po jejich dešifrování je pacientovi diagnostikována infekce HIV.

V kontaktu s

Co je imunoblot? Jedná se o běžnou metodu laboratorní diagnostiky lidských virových infekcí. Je považován za jeden z nejpřesnějších a nejspolehlivějších způsobů, jak detekovat přítomnost HIV. Ve své spolehlivosti předčí i výsledky imunoblotu jsou považovány za nevyvratitelné a konečné.

obecná informace

Imunoblot - co to je? K rozpoznání HIV infekce u člověka je nutné podstoupit laboratorní vyšetření krevního séra na přítomnost protilátek. Technika imunoblotování se také nazývá Western blot. Používá se k detekci lidských virových infekcí jako další expertní metoda. Je nutné potvrdit ELISA - laboratorní test, který umožňuje určit přítomnost protilátek HIV v krvi. Pozitivní test ELISA se dvakrát kontroluje imunoblotem. Je považován za nejcitlivější, nejsložitější a nejdražší.

Účel

Co je imunoblot? Jedná se o laboratorní metodu testování krevního séra na přítomnost protilátek proti viru. Během studie odborník nejprve oddělí virové proteiny v gelu a přenese je na nitrocelulózovou membránu. Postup imunoblotování je určen k detekci HIV v různých fázích. V první fázi se purifikovaný virus z jeho složek podrobí elektroforéze a antigeny obsažené v jeho složení se oddělí podle molekulové hmotnosti.

Rozmnožuje se v živé buňce a vkládá do ní svou genetickou informaci. V této fázi se člověk stává přenašečem viru HIV, pokud byl infikován. Specifikem onemocnění je, že se nemusí projevit po dlouhou dobu. Virus ničí lymfocyty, takže imunita člověka klesá a tělo se stává neschopným odolávat infekcím. Pokud je HIV léčeno správně a včas, pacient se dožije vysokého věku. Nedostatek terapie nevyhnutelně vede ke smrti. Od okamžiku infekce, ale bez léčby, není maximální životnost delší než deset let.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spolehlivá metoda, která umožňuje určit přítomnost protilátek proti HIV antigenům prvního a druhého typu. Pokud je člověk infikován, do dvou týdnů se objeví protilátky, které lze zjistit mnohem později. Zvláštností HIV je, že množství protilátek se rychle zvyšuje a zůstává v krvi pacienta. I když jsou přítomny, onemocnění se nemusí projevit až za dva a více let. Metoda ELISA ne vždy přesně určí přítomnost onemocnění, proto je nutné potvrzení výsledků pomocí imunoblotu a PCR, pokud enzymatická imunoanalýza vykazuje pozitivní výsledek.

Indikace pro použití

Co je „imunoblot“ již bylo zjištěno, ale komu je tato studie předepsána? Důvodem, proč se nechat testovat pomocí imunoblotu, je pozitivní výsledek ELISA. U pacientů, kteří podstoupí operaci, je nutné podstoupit enzymový imunotest. Kromě toho by měly být testovány ženy plánující těhotenství, stejně jako každý, kdo je promiskuitní. Imunoblotting je předepsán pacientům s HIV, pokud jsou výsledky testu ELISA pochybné. Následující alarmující příznaky mohou být důvodem k návštěvě lékaře:

náhlá ztráta hmotnosti;
slabost, ztráta výkonu;
střevní nevolnost (průjem), která trvá tři týdny;
dehydratace těla;
horečka;
zvětšené lymfatické uzliny na těle;
rozvoj kandidózy, tuberkulózy, pneumonie, toxoplazmózy, exacerbace herpesu.

Před darováním žilní krve se pacient nemusí připravovat. 8-10 hodin před testem byste neměli jíst jídlo. Den před darováním krve se nedoporučuje pít alkoholické nebo kávové nápoje, věnovat se namáhavé fyzické námaze nebo prožívat úzkost.

Kde provést analýzu?

Kde se mohu nechat otestovat na HIV? ELISA a imunoblotové studie se provádějí na městských soukromých klinikách, výsledky jsou uvedeny do 24 hodin. Je možná i urgentní diagnóza. Ve veřejných zdravotnických zařízeních se testy ELISA a imunoblotting provádějí zdarma v souladu s legislativou Ruské federace. Těhotné ženy, stejně jako pacienti podstupující hospitalizaci nebo operaci, jsou povinni podstoupit vyšetření na infekční onemocnění.

Jak probíhá výzkum?

Jak se provádí analýza ELISA? Pozitivní/negativní imunoblot potvrzuje nebo vyvrací výsledky enzymového imunotestu. Postup výzkumu je poměrně jednoduchý. Specialista odebere žilní krev, což netrvá déle než pět minut. Po odběru vzorků je třeba místo vpichu dezinfikovat a přelepit náplastí. Odběr se provádí nalačno, takže po zákroku neuškodí sníst tabulku hořké čokolády nebo vypít sladký horký nápoj.

Abyste obdrželi doporučení na bezplatný test ve veřejném zdravotnickém zařízení, musíte navštívit praktického lékaře. Imunoblotting se obecně neliší od jiných krevních testů, pokud jde o způsob odběru vzorků. Metodika výzkumu je jednoduchá. Pokud je v krvi člověka virus, tělo začne produkovat protilátky, aby ho zničilo. Každý virus má svou vlastní sadu antigenních proteinů. Detekce těchto protilátek je základem techniky imunoblotování.

Cena

Kolik stojí analýza? Imunoblot na HIV není levný test. V průměru stojí screeningové vyšetření pomocí metod enzymové imunoanalýzy od 500 do 900 rublů. Imunoblotting je ověřovací studie, jejíž náklady jsou od tří do pěti tisíc rublů. Složitější metody jsou mnohem dražší. Například budete muset zaplatit asi 12 000 rublů.

Interpretace výsledku

Nejběžnějšími metodami pro diagnostiku infekce HIV jsou enzymatické imunosorbentní testy a imunobloty. Používají se ke stanovení protilátek proti viru imunodeficience v krevním séru. Přítomnost infekce je obvykle potvrzena dvěma testy: screeningovým a konfirmačním. Interpretaci výsledků studie by měl provádět lékař, který také stanoví diagnózu a předepíše léčbu. Pokud je imunoblot pozitivní, znamená to, že v lidském těle je přítomen virus.

Pozitivní výsledek by neměl být důvodem pro nezávislou léčbu, protože každý pacient může mít jiný obrázek o nemoci. Kvalitativní analýza zahrnuje screening a ověřování. Pokud pacient nemá virus, je výsledek označen jako „negativní“. Pokud se zjistí screeningem, provede se dodatečná ověřovací studie. Imunoblot je test, který potvrzuje nebo vyvrací screening. Pokud se na testovacím proužku objeví ztmavnutí v určitých oblastech (umístění proteinů), je stanovena diagnóza HIV. Pokud jsou výsledky pochybné, testy se provádějí do tří měsíců.

Infekci virem imunodeficience můžete předejít, pokud budete dodržovat určitá pravidla: vyhýbejte se náhodnému sexu, při kontaktu používejte kondom, neberte drogy. Pokud je onemocnění zjištěno u těhotné ženy, je důležité přísně dodržovat doporučení ošetřujícího lékaře a nezapomenout na vyšetření na přítomnost viru.

Imunoblotting -(z anglického „blot“ - spot) - metoda identifikace antigenů (nebo protilátek) pomocí známých sér (nebo antigenů). Jedná se o kombinaci gelové elektroforézy a ELISA. Nejprve jsou bakteriální buňky nebo viriony zničeny pomocí ultrazvuku a poté jsou všechny antigeny viru nebo bakteriálních buněk separovány elektroforézou a na speciálním nitrocelulózovém filmu je získáno komerční činidlo. Při provádění imunoblotingu se sérum zkoumaného pacienta nanese na film se známými antigeny. Po inkubaci a promytí nenavázaných protilátek přistoupíme k ELISA - antisérum na lidské imunoglobuliny značené enzymem a na film se nanese chromogenní substrát, který při interakci s enzymem mění barvu. V přítomnosti komplexů antigen-protilátka-antisérum až imunoglobulin-enzym se na nosiči objevují barevné skvrny. Metoda imunoblotování umožňuje samostatně detekovat protilátky proti různým antigenům patogenů (např. při infekci HIV imunoblotting detekuje protilátky proti gp120, gp24 a dalším virovým antigenům).

Radioimunoanalýza (RIA)

Metoda je založena na reakci antigen-protilátka za použití radionuklidem značeného antigenu nebo protilátky. Jako značky se používají 125I, 14C, 3H, 51Cr a další radionuklidy. Vzniklé imunitní komplexy jsou izolovány ze systému a jejich radioaktivita je stanovena na počítačích (β-záření). Intenzita záření je přímo úměrná počtu navázaných molekul antigenu a protilátky.

Rozšířená je verze RIA na pevné fázi využívající značené protilátky nebo antigeny sorbované v jamkách polystyrénových panelů.

RIA se používá k průkazu antigenů mikrobů, virů, různých hormonů, enzymů, léků, imunoglobulinů, ale i dalších látek obsažených v testovaném materiálu v malých koncentracích 10-12-10-15 g/l.

Kontrolní otázky

Reakce imunitní bakteriolýzy: o jaký druh reakce se jedná; co je to antigen, co je to protilátka, reakční mechanismus, způsoby výroby, praktické využití. Imunitní hemolytická reakce: potřebné složky, postup; ovládání, praktické použití. Lokální hemolytická reakce v gelu (Jerneova reakce): princip reakce, způsob formulace, praktická aplikace. Reakce fixace komplementu: reakční princip; co se tvoří, když imunitní sérum interaguje se specifickým antigenem; co se stane s doplňkem, pokud je přítomen během této interakce? Jaký je osud komplementu, pokud mezi antigenem a protilátkami neexistuje specifická afinita? Jakou reakci lze použít k určení toho, co se stalo s komplementem; proč se tato konkrétní reakce používá; Jaký je viditelný pozitivní výsledek RSC? Proč? Jaká vlastnost komplementu se využívá v první fázi RSC? Ve druhé fázi? Pokud je konečným výsledkem RSC hemolýza, znamená to pozitivní nebo negativní výsledek? Vysvětlete výsledky: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Vyjmenujte složky prvního systému RSK a složky druhého systému RSK. Proč musí být testovací sérum inaktivováno? Jak se komplement titruje? Hemolytické sérum: co obsahuje, jak se získává, jaký je titr a jak se určuje? Jaká zvířata se používají k získávání komponent RSC? Metodika nastavení RSC za studena. Při stagingu, která z následujících reakcí vyžaduje účast komplementu: precipitace, flokulace, aglutinace, průkaz nekompletních protilátek, imunitní bakteriolýza, imunitní hemolýza, Jerne, RSC? Imunofluorescenční reakce (RIF) - označují sled událostí v přímé Koonsově reakci; potřebné přísady. Co je to antigen, co je to protilátka, čím jsou protilátky značené, jak se bere v úvahu výsledek reakce, jak vypadá pozitivní výsledek? Praktická aplikace - co lze pomocí této reakce zjistit? Nepřímá imunofluorescenční reakce - uveďte sled událostí během této reakce, potřebné složky, jaký je antigen, jaká imunitní séra se používají; praktické použití; výhoda nepřímého RIF ve srovnání s přímou reakcí. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) – princip reakce; potřebné přísady; indikovat sekvenci událostí při provádění reakce k detekci antigenu v testovaném materiálu; potřebné přísady; Co se stane, když je výsledek pozitivní, jak to vypadá? Uveďte sled akcí při provádění testu ELISA k detekci protilátek v testovacím séru; potřebné přísady; co se stane, když bude výsledek pozitivní? Imunoblotting – princip reakce; hlavní etapy; potřebné přísady; jak je výsledek zohledněn; výhody reakce. Radioimunoanalýza (RIA) - jaké jsou hlavní fáze reakce; Čím jsou protilátky nebo antigeny značeny, jak se zohledňuje výsledek? Imunoelektronová mikroskopie - princip metody; hlavní etapy; potřebné přísady; čím jsou protilátky značeny? jak se bere v úvahu výsledek reakce. Imobilizační reakce – princip metody, technika nastavení, komponenty, záznam výsledků.

Úkoly k plnění během samostudia.

Vyplňte tabulku „Imunitní reakce“ ve vztahu k reakcím diskutovaným v rámci tohoto tématu.

Imunitní reakce

Práce studentů v praktické hodině

Okamžitě začněte pracovat s nastavením fáze 1 RSK, ale zapište si to do svého poznámkového bloku později (viz níže).

1. Imunitní hemolytická reakce. Prohlédněte si demonstrační reakci imunitní hemolýzy, načrtněte ji ve formě diagramu, vysvětlete výsledek v experimentální a kontrolní zkumavce.

2. Reakce fixace komplementu

a) analyzujte RSK podle tabulky;

b) nakreslit do sešitu schéma nastavení RSC ve formě tabulky;

c) umístit druhou fázi RSK (první fáze je uvedena na začátek lekce);

d) analyzovat diagnostické přípravky nezbytné pro RSC;

d) vzít v úvahu výsledek. Formulujte závěr o přítomnosti specifických protilátek v testovacím séru.

3. Imunofluorescenční reakce. Prostudujte si tabulku, vytvořte si schéma reakce do sešitu; podívejte se na diagnostická séra; určit, co sérum obsahuje, jak se připravuje, pro jakou reakci (přímá nebo nepřímá RIF) se používá. Podívejte se na demonstrační výsledek RIF ve fluorescenčním mikroskopu.

4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). V zápisníku si sepište schéma pro nastavení reakce ve dvou verzích: pro detekci antigenu ve studovaném materiálu a pro detekci protilátek v séru. Projděte si sadu přísad pro HIV a hepatitidu B Identifikujte, co která složka obsahuje a k čemu se používá.

5. Imunoblotování. Udělejte si diagram reakce do sešitu; podívejte se na ukázku - výsledek reakce.

6. Radioimunoanalýza (RIA). Udělejte si nákres reakce do sešitu.

7. Imunitní elektronová mikroskopie (IEM). Podívejte se na ukázku - výsledek reakce, sepište si do sešitu schéma reakce, označte šipkami antigen (virus) a označené protilátky.

Imunoblotting je vysoce citlivá metoda pro detekci proteinů, založená na kombinaci elektroforézy a ELISA nebo RIA. Imunoblotting se používá jako diagnostická metoda pro infekci HIV atd.

V obecném smyslu se imunoblotování týká analýzy směsi proteinů přenesených na pevný membránový nosič, ke kterému jsou vázány kovalentními vazbami, s následnou imunodetekcí.

Můžete analyzovat směs proteinů přímo nanesenou na substrát - dot blot analýza - nebo po její předběžné frakcionaci elektrofokusací, diskovou elektroforézou nebo dvourozměrnou elektroforézou - Western blot analýzou.

Patogenní antigeny jsou separovány pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu, poté přeneseny z gelu na aktivovaný papír nebo nitrocelulózovou membránu a vyvinuty pomocí ELISA.

Společnosti vyrábějí takové proužky s „bloty“ antigenů. Na tyto proužky se aplikuje pacientovo sérum. . Poté, po inkubaci, je pacient omyt od nenavázaných protilátek a je aplikováno sérum proti lidským imunoglobulinům značeným enzymem . Komplex vytvořený na proužku (antigen + protilátka pacienta + protilátka proti lidskému Ig) je detekován přidáním chromogenního substrátu, který působením enzymu mění barvu.

Tato metodologie se také používá k selekci klonů bakterií, fágů nebo virů, které exprimují cílové klonované genové produkty.

Přenos proteinů na membránu se provádí buď pasivně nebo pomocí elektropřenosového zařízení. Účinnost přenosu proteinu na membránu je ovlivněna mnoha faktory, jako je molekulová hmotnost proteinů, porozita gelu, doba přenosu a složení použitého pufrovacího roztoku (trans-pufru).

V závislosti na cílech a podmínkách experimentu se zvolí podmínky přenosu, které poskytují nejlepší výsledky. Jako substráty se běžně používají nitrocelulózové, polyvinylidendifluorid (PVDF) nebo kladně nabité nylonové membrány. Nitrocelulóza dokáže vázat až 80 - 100 μg bílkovin na 1 cm2.

Nízkomolekulární proteiny (s molekulovou hmotností menší než 20 kDa) mohou být ztraceny v důsledku promytí. To umožňuje předběžně studovat polymorfismus určitých genetických lokusů na základě délek odpovídajících DNA restrikčních fragmentů.

Pomocí Southern hybridizace navíc snadno zjistíte, zda má cílový gen ve své vnitřní části místo hydrolýzy určitým restrikčním enzymem, což umožňuje zvolit optimální strategii klonování studované oblasti genomu.

Pomocí podobného schématu lze molekuly RNA přenést z agarózového gelu na nitrocelulózový filtr. Tato metoda se nazývala Northern blotting, na rozdíl od Southern blotting, protože název Southern znamená v angličtině „jižní“.

Přenos proteinů na filtry z gelu byl proto nazýván Western blotting. Velké proteiny (>100 kDa) denaturované v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) mohou být špatně přeneseny na membránu, pokud je v trans pufru přítomen ethanol. Alkohol výrazně zlepšuje přenos proteinů z SDS-polyakrylamidového gelu, ale zužuje póry v gelu, což vede k zadržování velkých proteinů.

PVDF membrána je optimalizována pro imunodetekci a je schopna zadržet až 160 μg/cm2 specificky vázaných proteinů s velmi nízkou úrovní nespecifické vazby.

Imunoblotting

Důležitou vlastností této membrány je možnost jejího opakovaného použití. Nylonové membrány Zeta-Probe účinně vážou proteiny SDS v nepřítomnosti alkoholu a tato vazba je odolná vůči následným úpravám. Nízkomolekulární proteiny jsou také účinně zadržovány. S vysokou vazebnou kapacitou přibližně 480 μg proteinu na cm2 umožňují membrány Zeta-Probe detekci stopových množství proteinu v testovacích směsích.

Jakmile je antigen imobilizován na membráně, zbývající vazebná místa jsou blokována roztoky želatiny, hovězího sérového albuminu nebo odstředěného mléka.

Poté je membrána inkubována v roztoku polyklonálních nebo monoklonálních protilátek proti studovanému antigenu. Po smytí nenavázaných protilátek je membrána inkubována v roztoku sekundárních protilátek, které jsou konjugátem enzymů alkalické fosfatázy (AP) nebo křenové peroxidázy (HRP) s protidruhovými protilátkami (kozí protilátky proti králičím, myším nebo lidským imunoglobulinům ) nebo proteiny A (protein Staphylococcus aureus) nebo G (protein Streptococcus sp.), které mají vysokou afinitu k Fc oblasti imunoglobulinů.

Detekce vytvořených imunitních komplexů se provádí chemicky nebo chemiluminiscenčně. Substráty pro chemickou reakci při použití konjugátů alkalické fosfatázy jsou 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát (BCIP) nebo modré tetrazolium (NBT), a při použití konjugátů křenové peroxidázy - 4-chlor-1-naftol a peroxid vodíku .

V důsledku enzymatických reakcí se na membráně v místě lokalizace komplexu antigen-protilátka vytvoří barevný pruh nebo skvrna.

Citlivost této metody je 100 pg proteinu při použití AP konjugátů a 100-500 pg při použití HRP konjugátů. Chemiluminiscenční detekce imunitních komplexů umožňuje detekci méně než 5 pg antigenu. Princip této metody spočívá v tom, že při reakci HRP s peroxidem vodíku a cyklickým diacylhydrazin luminolem je emitováno světlo o vlnové délce 428 nm, které lze zaznamenat na fotocitlivý film.

Reakce imunoblotování (IB) byla vyvinuta na základě ELISA. Je to nejspecifičtější a nejcitlivější metoda imunochemické analýzy. Imunoblotting (z anglického blot - blot, skvrna) kombinuje ELISA s elektroforézou. Slouží k průkazu nikoli komplexních protilátek proti HIV, ale protilátek proti jeho jednotlivým strukturním proteinům (proteiny p24, glykoproteiny gp120, gp 41 aj.). Odkazuje na odborné (potvrzující) reakce pro diagnostiku infekce HIV.

Reakce se provádí v několika fázích:

Virus je rozrušen na složky - antigeny (p24, gp120, gp 41 atd.), které jsou podrobeny elektroforéze v polyakrylamidovém gelu, tedy separaci antigenů do frakcí podle molekulové hmotnosti.

2. Gel se překryje nitrocelulózovou membránou a pomocí elektroforézy se do něj přenesou frakce antigenu. Nitrocelulóza se chová jako savý papír. Membrána se nařeže na proužky. Společnosti vyrábějí takové proužky s „bloty“ antigenů.

Imunoblotting - další nepřímá metoda

Proužky potažené antigeny HIV se ponoří do séra subjektu a poté se promyjí, aby se odstranil nenavázaný materiál.

4. Proužky se inkubují s antiglobulinovým sérem značeným peroxidázou a promyjí se.

Přidá se substrát a zaznamená se počet barevných frakcí (skvrn), které odpovídají lokalizační zóně komplexu AG-AT.

Přítomnost proužků v určitých oblastech proužku potvrzuje přítomnost protilátek proti přesně definovaným antigenům HIV v testovaném séru. Výsledek imunoblotu je považován za pozitivní, pokud jsou na membráně viditelné pruhy odpovídající kterýmkoli dvěma ze tří HIV antigenů - p24, gp41 a gp 120 (obr. 37).

KRESBY

SEZNAM POUŽITÝCH REFERENCÍ

Hlavní literatura

Lékařská mikrobiologie, virologie a imunologie: učebnice pro studenty medicíny. univerzity 2. vyd., rev. a doplňkové — 702 s. Ed. A.A. Vorobyová. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologie, virologie a imunologie: příručka pro laboratorní hodiny: učebnice/(V.B. Sboychakov a další); upravil V.B. Sboychaková, M.M. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: ill.

3. Lékařská mikrobiologie, imunologie a virologie [Elektronický zdroj]: učebnice pro med.

univerzity - 760 s. — Režim přístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Petrohrad: Spetslit, 2010.

4. Lékařská mikrobiologie, virologie a imunologie [Elektronický zdroj]: učebnice: ve 2 svazcích / 1. - 448 s. — Režim přístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Lékařská mikrobiologie, virologie a imunologie [Elektronický zdroj]: učebnice: ve 2 svazcích T. 2. - 480 s. Režim přístupu: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

doplňková literatura

1. Imunodiagnostické reakce: učebnice / komp.: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F .

Khusnarizanova, Yu.Z Gabidullin, M.M Alsynbaev - Ufa: Nakladatelství Státní rozpočtové vzdělávací instituce vyššího odborného vzdělávání BSMU Ministerstva zdravotnictví Ruska, 2016. - 86 s.

2. Vlastnosti některých vlastností, které určují patogenní potenciál kokultivovaných variací bakterií Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: vědecká publikace / Yu Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s

Úvod » Immunoblot – co to je? Imunoblot v diagnostice infekčních onemocnění

Imunoblot - co to je? Imunoblot v diagnostice infekčních onemocnění

Co je imunoblot? Jedná se o běžnou metodu laboratorní diagnostiky lidských virových infekcí. Je to jeden z nejpřesnějších a nejspolehlivějších způsobů, jak odhalit přítomnost HIV.

Kvůli spolehlivosti je dokonce větší než enzymová imunoanalýza (elisa). Výsledky imunoblotu jsou považovány za průkazné a průkazné

Imunoblot - co to je? Abyste u člověka rozpoznali, že má HIV, musíte podstoupit laboratorní test na vyšetření krevního séra na přítomnost protilátek.

Sekce Western blot se také nazývají Western bloty. Používá se k detekci lidských virových infekcí jako další expertní metoda. To je nezbytné pro potvrzení pomocí ELISA - laboratorního testu, který umožňuje určit přítomnost protilátek proti HIV v krvi. Imunoblot znovu zkontrolujte pozitivní ELISA.

Je považován za nejcitlivější, nejsložitější a nejdražší.

cílová

Co je imunoblot? Tato metoda laboratorního testování krevního séra na přítomnost protilátek proti viru.

Během speciálních studií byly celkové virové proteiny v gelu a na nitrocelulózových membránách.

Imunoblotting (detekce protilátek v séru pacienta proti určitým patogenním antigenům)

Postup Western blot sekce je určen k určení infekce HIV v různých fázích. V první fázi je purifikovaný virus z jeho složek podroben elektroforéze a antigeny v něm obsažené jsou rozděleny podle molekulové hmotnosti.

Virus lidské imunodeficience se množí v živých buňkách uložených v jeho genetické informaci. V této fázi se člověk stává přenašečem viru HIV, pokud jste byli infikováni.

Specifikem tohoto onemocnění je, že se dlouho neprojevuje. Virus ničí lymfocyty, čímž se snižuje imunita člověka a tělo se stává neschopným bojovat s infekcemi.

Pokud je HIV správně a rychle léčeno, pacient se dožije vysokého věku. Nedostatek léčby nevyhnutelně vede ke smrti. Od okamžiku infekce, ale bez léčby, není maximální doba delší než deset let.

Zvláštnosti

Imunoblotová analýza je spolehlivá metoda, která umožňuje určit přítomnost protilátek proti HIV antigenům prvního a druhého typu.

Pokud je člověk infikován, po dvou týdnech mohou být protilátky detekovány mnohem později. Zvláštností HIV je, že množství protilátek se rychle zvyšuje a zůstává v krvi pacienta. I když jsou přítomny, onemocnění se nemusí projevit až za dva a více let. Metoda ELISA ne vždy přesně indikuje přítomnost onemocnění a vyžaduje potvrzení výsledků z PCR a Western blot, pokud enzymatická imunoanalýza ukázala pozitivní výsledek.

Indikace pro

Jaký druh „imunoblotu“ již byl nalezen, ale který se ve studii zavádí?

Důvodem pro testování na virus lidské imunodeficience (HIV) bude pozitivní výsledek ELISA. U pacientů, kteří se chystají podstoupit operaci, je nutné projít enzymatickým imunosorbentním testem. Kromě toho byste měli udělat analýzu žen plánujících těhotenství a také těch, které jsou promiskuitní. Řezy Western blot jsou předepisovány pacientům s infekcí HIV, pokud jsou výsledky Elisy nejednoznačné.

Následující alarmující příznaky mohou být důvodem pro kontakt s lékařem: rychlý úbytek hmotnosti, ztráta funkce střev (průjem), která trvá tři týdny; , zápal plic, toxoplazmóza, exacerbace herpesu.

Před darováním žilní krve se pacient nemusí připravovat.

Nejezte 8-10 hodin před testem. Den před darováním krve se nedoporučuje pít alkohol nebo kávové nápoje, dělat těžké fyzické cvičení nebo zažívat úzkost.

Kde provést analýzu?

Kde se mohu nechat otestovat na HIV?

ELISA, imunoblotová analýza, prováděná na městských soukromých klinikách, poskytuje výsledky během jednoho dne. Je možná i urgentní diagnóza. Ve veřejných institucích jsou lékařské testy Elisa a Western blot v souladu s legislativou Ruské federace zdarma.

Povinný screening na infekční onemocnění u těhotných žen a pacientů vyžadujících hospitalizaci nebo operaci Jak se toto vyšetření provádí?

Jak provést ELISA? Imunoblot pozitivní/negativní potvrzuje nebo vyvrací výsledky testu elisa. Postup je vcelku jednoduchý. Specialista odebírá žilní krev, což trvá méně než pět minut.

Po odběru vzorku je třeba místo vpichu dezinfikovat a překrýt obvazem. Odběr se provádí nalačno, takže po zákroku neuškodí sníst tabulku hořké čokolády nebo sladký horký nápoj.

Chcete-li získat doporučení na bezplatný test ve veřejném zdravotnickém zařízení, musíte navštívit lékaře.

Obecně se imunoblot neliší od ostatních krevních testů odběrem. Metodika výzkumu je jednoduchá. Pokud je virus přítomen v krvi člověka, tělo začne produkovat protilátky, aby ho zničilo. Pro každý virus existuje mnoho proteinových antigenů. Detekce těchto protilátek je základem metody Western blot section. Cena

Jak dlouho je analýza? HIV imunoblot je jedním z nejlevnějších testů.

V průměru se imunotestové metody screeningu pohybují od 500 do 900 rublů. Sekce Western blot jsou studiem kontrol, jejichž náklady se pohybují od tří do pěti tisíc rublů. Složitější metody jsou mnohem dražší. Například za analýzu polymerázové řetězové reakce (PCR) budete muset zaplatit asi 12 000 rublů.

Interpretace výsledků

Nejběžnějšími metodami pro diagnostiku infekce HIV jsou enzymatická imunoanalýza a imunoblot.

Používají se ke stanovení protilátek proti viru lidské imunodeficience v séru. Infekce je obvykle potvrzena dvěma testy: screeningovým a konfirmačním. Výsledky musí interpretovat lékař, který diagnostikuje a předepisuje léčbu. Pokud je imunoblot pozitivní, znamená to, že v lidském těle je virus.

Pozitivní výsledek by neměl být důvodem pro nezávislou léčbu, protože každý pacient může mít svůj vlastní obrázek o nemoci.

Kvalitativní analýza zahrnuje screening a certifikaci. Pokud není virus u pacienta detekován, výsledek je „negativní“. Po zjištění tohoto certifikátu se provedou další screeningové studie. Imunoblot analýza, která potvrdí nebo vyvrátí screening. Pokud se testovací proužky objeví v určitých tmavých oblastech (lokalizace proteinů), je stanovena diagnóza HIV.

Pokud jsou výsledky pochybné, pak se testy provádějí do tří měsíců.

Chcete-li zabránit infekci virem lidské imunodeficience, je možné, pokud budete dodržovat určitá pravidla: vyvarujte se příležitostnému sexuálnímu kontaktu, během kontaktu používejte kondomy, nepoužívejte drogy.

Pokud je onemocnění zjištěno u těhotné ženy, je důležité dodržovat doporučení ošetřujícího lékaře a nezapomenout na test na přítomnost viru.

Co je Western blotting?

Identifikace proteinů ve složitých směsích nebo extraktech různých tkání je jedním z často se vyskytujících problémů. Pomocí nástroje, jako jsou specifické protilátky, je možné stanovit zkoumaný protein s minimálními časovými a finančními náklady.

Při metodě Western blotting je v první fázi směs proteinů separována elektroforézou v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS), poté přenesena na nitrocelulózovou membránu elektroblotováním.

Podstatou této metody je, že po elektroforéze je gel umístěn na nitrocelulózovou membránu mezi vrstvy filtračního papíru. Takto sestavený „sendvič“ je umístěn do elektrického pole, takže komplexy protein-SDS se pohybují po gelové destičce a jsou imobilizovány (v důsledku nespecifické sorpce) na povrchu nitrocelulózové membrány.

Vazba komplexu protein-SDS na nitrocelulózovou membránu zahrnuje především síly elektrické povahy a tato interakce je vícebodová a vede k „rozprostření“ proteinů na povrch membrány. Po elektropřenosu tak získáme repliku gelu na nitrocelulóze s proteiny umístěnými stejně jako v polyakrylamidovém gelu.

Po SDS elektroforéze, elektrotransferu a sorpci proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu je terciární konformace proteinu značně změněna, pokud je obecně správné hovořit o existenci terciární struktury proteinu po takovém tvrdém zacházení. Proto se pro imunochemickou detekci studovaného proteinu obvykle používají pouze mono- nebo polyklonální protilátky specifické pro lineární oblasti molekuly proteinu.

51. Enzymová imunoanalýza, imunoblotování. Mechanismus, komponenty, aplikace.

Protilátky specifické pro konformační epitopy (nebo oblasti zahrnující kontakty mezi podjednotkami) obecně nejsou vhodné pro použití ve Western blottingu.

Po přenosu proteinu je membrána inkubována postupně s protilátkami specifickými pro studovaný protein a poté se sekundárními protilátkami specifickými pro Fc fragmenty primárních protilátek, konjugované s enzymatickou (nebo nějakou jinou) značkou (obr.

1A). V případě, že primární protilátky specifické ke studovanému antigenu jsou přímo konjugovány se značkou, sekundární protilátky nejsou vyžadovány (obr. 1 B). Imunitní komplexy vytvořené v místě lokalizace studovaného proteinu se „projevují“ pomocí chromogenního substrátu (v závislosti na typu značky).

Senzitivita a specifičnost metody velmi závisí na tom, jaké protilátky jsou při výzkumu použity.

Použité protilátky musí být specifické pro jedinečnou aminokyselinovou sekvenci charakteristickou pouze pro studovaný protein. V opačném případě je možná interakce (zejména v případě surových proteinových extraktů) protilátek s několika molekulami proteinu, což následně povede k výskytu několika barevných pruhů na membráně.

Identifikace studovaného proteinu je v tomto případě často obtížná nebo dokonce nemožná.

Druhým důležitým faktorem, který je třeba mít na paměti při výběru protilátek, je afinita. Čím vyšší je afinita použitých protilátek, čím jasnější a jasnější jsou obarvené proteinové pásy, tím vyšší je citlivost metody. Při použití vysokoafinitních protilátek lze dosáhnout citlivosti 1 ng nebo i vyšší.

Pro vizualizaci výsledku interakce mezi membránově vázaným antigenem a protilátkami se používají sekundární protilátky, konjugované s činidly schopnými produkovat určitý signál za určitých podmínek.

Typicky se jako takové činidlo používá enzym (peroxidáza nebo fosfatáza), jehož reakční produkt se zbarví a vysráží se na membráně ve formě nerozpustné sraženiny.

V této metodě je také možné použít fluorescenční značky.

Rýže. 1. Schéma imunochemického barvení studovaného proteinu: A - pomocí sekundárních protilátek konjugovaných s enzymatickou značkou; B - primární protilátka je přímo konjugována s enzymatickou značkou.

Protokol:

I. Příprava gelu a membrány a elektrotransfer proteinů

Po elektroforéze se polyakrylamidový gel umístí do lázně s blotovacím pufrem (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycin, 10% ethanol).

Dva listy filtračního papíru, nařezané do tvaru sací kazety a navlhčené savým pufrem, se umístí na část kazety, která bude směřovat k anodě. Poté se na filtrační papír umístí nitrocelulózová membrána předem navlhčená stejným pufrem, aby se zajistilo, že mezi membránou a papírem nejsou žádné vzduchové bubliny.

Gel by měl být poté opatrně umístěn na membránu, přičemž opět věnujte zvláštní pozornost tomu, aby mezi gelem a membránou nebyly žádné vzduchové bubliny. Tvorbu sendviče doplňují dvě vrstvy navlhčeného filtračního papíru, které se položí na povrch gelu (obr. 2). Výsledný sendvič je upnut v kazetě a umístěn mezi elektrody tak, aby membrána směřovala k anodě.

Rýže. 2. Schéma elektropřenosu proteinů na membránu.

II. Elektrický přenos

Elektrotransfer proteinů na nitrocelulózovou membránu se provádí v pufru obsahujícím 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycin, 10% ethanol po dobu 30-50 minut při konstantním napětí 100 V.

Doba elektrotransferu závisí na velikosti přenášených proteinů, čím větší je protein, tím déle elektrotransfer trvá. Kvalita elektrotransferu a umístění proteinových pásů se hodnotí barvením nitrocelulózové membrány 0,3% roztokem Ponceau S v 1% kyselině octové. Před imunochemickým barvením by měla být membrána několikrát promyta slabě alkalickým vodným roztokem Tris, aby se odstranilo barvivo navázané na proteiny.

III. Imunochemické barvení proteinů imobilizovaných na nitrocelulózové membráně

Pro blokování míst nespecifické vazby protilátek se membrána inkubuje za stálého míchání při teplotě místnosti po dobu 30 minut v PBST (pro lepší blokování lze použít roztok PBST obsahující 10 % sušeného odstředěného mléka).

Po zablokování se membrána inkubuje hodinu při teplotě místnosti za stálého míchání v PBST obsahujícím 1-10 μg/ml specifických protilátek.

Optimální koncentrace protilátek se volí empiricky a závisí na afinitě interakce protilátek s antigenem.

Na konci inkubace promyjte membránu 5x PBST a přeneste ji do roztoku sekundárních protilátek konjugovaných s křenovou peroxidázou. Ředění konjugátu je obvykle uvedeno výrobcem na obalu nebo je empiricky zvoleno výzkumníkem. Inkubujte membránu v roztoku sekundární protilátky po dobu 1 hodiny za stálého míchání.

Po důkladném promytí (změna pufru alespoň 5-6x) se membrána PBST přenese do chromogenního substrátového roztoku obsahujícího 3 mg diaminobenzidinu (DAB) a 10 μl 30% peroxidu vodíku v 10 ml 0,1 M Tris-HCl pH 7,6.

Inkubace se provádí za míchání po dobu 5 až 10 minut. Po dokončení inkubace se substrátem by měla být membrána promyta PBST, vysušena blotováním filtračním papírem a okamžitě by měla být vytvořena elektronická kopie barevným skenováním. Pokud membrána zcela vyschne, namalované proteinové pruhy vyblednou a obraz se ukáže jako méně jasný a kontrastní.

Poznámka: DAB je toxický a potenciální karcinogen. Pracujte pouze s gumovými rukavicemi!