Системами вторичных посредников действия гормонов являются:

1. Аденилатциклаза и циклический АМФ,

2. Гуанилатциклаза и циклический ГМФ,

3. Фосфолипаза С:

Диацилглицерол(ДАГ),

Инозитол-три-фсфат (ИФ3),

4. Ионизированный Ca – кальмодулин

Гетеротромный белок G-белок.

Этот белок образует в мембране петли и имеет 7 сегментов. Их сравнивают с серпантиновыми лентами. Имеет выступающую (наружную) и внутреннюю части. К наружной части присоединяется гормон,а на внутренней поверхности имеются 3 субъединицы – альфа, бета и гамма. В неактивном состоянии этот белок имеет гуанозиндифосфат. Но при активации гуанозиндифосфат меняется на гуанозинтрифосфат. Изменение активности G-белка приводит либо к изменению ионной проницаемости мембраны, либо в клетке активируется ферментная система (аденилатциклаза, гуанилатциклаза, фосфолипаза С). Это вызывает образование специфических белков, активируется протеинкиназа (необходима для процессов фосфолилирования).

G-белки могут быть активирующими (Gs) и ингибирующими, или по-другому, тормозящие(Gi).

Разрушение циклического АМФ происходит под действием фермента фосфодиэстеразы. Циклический ГМФ оказывает противоположное действие. При активации фосфолипазы C образуются вещества, которые способствуют накоплению внутри клетки ионизированного кальция. Кальций активирует протеинциназы, способствует мышечному сокращению. Диацилглицерол способствует превращению фосфолипидов мембраны в арахидоновую кислоту, которая является источником образования простагландинов и лейкотриенов.

Гормонрецепторный комплекс проникает в ядро и действует на ДНК, что меняет процессы транскрипции и образуется мРНК, которая выходит из ядра и идет к рибосомам.

Следовательно, гормоны могут оказывать:

1. Кинетическое или пусковое действие,

2. Метаболическое действие,

3.Морфогенетическое действие (дифференцировка тканей, рост, метаморфоз),

4. Корригирующие действие(исправляющие, приспосабливающее).

Механизмы действия гормонов в клетках:

Изменение проницаемости клеточных мембран,

Активация или угнетение ферментных систем,

Влияние на генетическую информацию.

Регуляция строится на тесном взаимодействии эндокринной и нервной системы. Процессы возбуждения в нервной системе могут активировать, либо тормозить деятельность эндокринных желез. (Рассмотрим, напр., процесс овуляции у кролика. Овуляция у кролика наступает только после акта спаривания, который стимулирует выделение гонадотропного гормона гипофиза. Последний вызывает процесс овуляции).

После перенесения психических травм может возникать тиреотоксикоз. Нервная система контролирует выделение гормонов гипофиза(нейрогормона), а гипофиз влияет на активность других желез.

Имеют место механизмы обратной связи. Накопление в организме гормона приводит к торможению выработки этого гормона соответствующей железой, а недостаток будет являться механизмом стимуляции образования гормона.

Существует механизм саморегуляции. (Напр., содержание глюкозы в крови определяет выработку инсулина и (или) глюкагона; если уровень сахара повышается вырабатывается инсулин, а если понижается - глюкагон. Недостаток Na стимулирует выработку альдостерона).

5. Гипоталамо-гипофизарная система. Ее функциональная организация. Нейросекреторный клетки гипоталамуса. Характеристика тропных гормонов и рилизинг-гормонов (либеринов, статинов). Эпифиз (шишковидное железа).

6. Аденогипофиз, связь его с гипоталамусом. Характер действия гормонов передней доли гипофиза. Гипо- и гиперсекреция гормонов аденогипофиза. Возрастные изменения образования гормонов передней доли.

Клетки аденогипофиза (их строение и состав смотрите в курсе гистологии) продуцируют следующие гормоны: соматотропин (гормон роста), пролактин, тиротропин (тиреотропный гормон), фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, кортикотропин (АКТГ), меланотропин, бета-эндорфин, диабетогенный пептид, экзофтальмический фактор и гормон роста яичников. Рассмотрим более подробно эффекты некоторых из них.

Кортикотропин . (адренокортикотропный гормон - АКТГ) секретируется аденогипофизом непрерывно пульсирующими вспышками, имеющими четкую суточную ритмичность. Секреция кортикотропина регулируется прямыми и обратными связями. Прямая связь представлена пептидом гипоталамуса - кортиколиберином, усиливающим синтез и секрецию кортикотропина. Обратные связи запускаются содержанием в крови кортизола (гормон коры надпочечников) и за- мыкаются как на уровне гипоталамуса, так и аденогипофиза, причем прирост концентрации кортизола тормозит секрецию кортиколиберина и кортикотропина.

Кортикотропин обладает двумя типами действия - надпочечниковым и вненадпочечниковым. Надпочечниковое действие является основным и заключается в стимуляции секреции глюкокортикоидов, в существенно меньшей степени - минералокортикоидов и андрогенов. Гормон усиливает синтез гормонов в коре надпочечников - стероидогенез и синтез белка, приводя к гипертрофии и гиперплазии коры надпочечников. Вненадпочечниковое действие заключается в липолизе жировой ткани, повышении секреции инсулина, гипогликемии, повышенном отложении меланина с гиперпигментацией.

Избыток кортикотропина сопровождается развитием гиперкортицизма с преимущественным увеличением секреции кортизола и носит название "болезнь Иценко-Кушинга". Основные проявления типичны для избытка глюкокортикоидов: ожирение и другие метаболические сдвиги, падение эффективности механизмов иммунитета, развитие артериальной гипертензии и возможности возникновения диабета. Дефицит кортикотропина вызывает недостаточность глюкокортикоидной функции надпочечников с выраженными метаболическими сдвигами, а также падение устойчивости организма к неблагоприятным условиям среды.

Соматотропин . . Соматотропный гормон обладает широким спектром метаболических эффектов, обеспечивающих морфогенетическое действие. На белковый обмен гормон влияет, усиливая анаболические процессы. Он стимулирует поступление аминокислот в клетки, синтез белка за счет ускорения трансляции и активации синтеза РНК, увеличивает деление клеток и рост тканей, подавляет протеолитические ферменты. Стимулирует включение сульфата в хрящи, тимидина в ДНК, пролина в коллаген, уридина в РНК. Гормон вызывает положительный азотистый баланс. Стимулирует рост эпифизарных хрящей и их замену костной тканью, активируя щелочную фосфатазу.

Действие на углеводный обмен двояко. С одной стороны, соматотропин повышает продукцию инсулина как из-за прямого эффекта на бета клетки, так и из-за вызываемой гормоном гипергликемии, обусловленной распадом гликогена в печени и мышцах. Соматотропин активирует инсулиназу печени - фермент, разрушающий инсулин. С другой стороны, соматотропин оказывает контраинсулярное действие, угнетая утилизацию глюкозы в тканях. Указанное сочетание эффектов при наличии предрасположенности в условиях избыточной секреции может вызывать сахарный диабет, по происхождению называемый гипофизарным.

Действие на жировой обмен заключается в стимуляции липолиза жировой ткани и липолитического эффекта катехоламинов, повышении уровня свободных жирных кислот в крови; из-за избыточного поступления их в печень и окисления повышается образование кетоновых тел. Эти влияния соматотропина также относят к числу диабетогенных.

Если избыток гормона возникает в раннем возрасте, формируется гигантизм с пропорциональным развитием конечностей и туловища. Избыток гормона в юношеском и зрелом возрасте вызывает усиление роста эпифизарных участков костей скелета, зон с незавершенным окостенением, что получило название акромегалия. . Увеличиваются в размерах и внутренние органы - спланхомегалия.

При врожденном дефиците гормона формируется карликовость, получившая название "гипофизарный нанизм". Таких людей после выхода в свет романа Дж. Свифта о Гулливере называют в разговорной речи лилипутами. В других случаях приобретенный дефицит гормона вызывает не резко выраженное отставание в росте.

Пролактин . Секреция пролактина регулируется гипоталамическими пептидами - ингибитором пролактиностатином и стимулятором пролактолиберином. Продукция гипоталамических нейропептидов находится под дофаминэргическим контролем. На величину секреции пролактина влияет уровень в крови эстрогенов, глюкокортикоидов

и тиреоидных гормонов.

Пролактин специфически стимулирует развитие молочных желез и лактацию, но не его выделение, которое стимулируется окситоцином.

Помимо молочных желез, пролактин оказывает влияние на половые железы, способствуя поддержанию секреторной активности желтого тела и образованию прогестерона. Пролактин является регулятором водно-солевого обмена, уменьшая экскрецию воды и электролитов, потенцирует эффекты вазопрессина и альдостерона, стимулирует рост внутренних органов, эритропоэз, способствует проявлению инстинкта материнства. Помимо усиления синтеза белка, увеличивает образование жира из углеводов, способствуя послеродовому ожирению.

Меланотропин . . Образуется в клетках промежуточной доли гипофиза. Продукция меланотропина регулируется меланолиберином гипоталамуса. Основной эффект гормона заключается в действии на меланоциты кожи, где он вызывает депрессию пигмента в отростках, увеличение свободного пигмента в эпидермисе, окружающем меланоциты, повышение синтеза меланина. Увеличивает пигментацию кожи и волос.

Нейрогипофиз, связь его с гипоталамусом. Эффекты гормонов задней доли гипофиза (оксигоцина, АДГ). Роль АДГ в регуляции объема жидкости в организме. Несахарное мочеизнурение.

Вазопрессин . . Образуется в клетках супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса и накапливается в нейрогипофизе. Основные стимулы, регулирующие синтез вазопрессина в гипоталамусе и его секрецию в кровь гипофизом в общем могут быть названы осмотическими. Они представлены: а) повышением осмотического давления плазмы крови и стимуляцией осморецепторов сосудов и нейронов-осморецепторов гипоталамуса; б) повышением в крови содержания натрия и стимуляцией гипоталамических нейронов, выполняющих роль рецепторов натрия; в) уменьшением центрального объема циркулирующей крови и артериального давления, воспринимаемыми волюморецепторами сердца и механорецепторами сосудов;

г) эмоционально-болевым стрессом и физической нагрузкой; д) активацией ренин- ангиотензиновой системы и стимулирующим нейросекреторные нейроны влиянием ангиотензина.

Эффекты вазопрессина реализуются за счет связывания гормона в тканях с двумя типами рецепторов. Связывание с рецепторами Y1-типа, преимущественно локализованными в стенке кровеносных сосудов, через вторичные посредники инозитолтрифосфат и кальций вызывает сосудистый спазм, что способствует названию гормона - "вазопрессин". Связывание с рецепторами Y2-типа в дистальных отделах нефрона через вторичный посредник ц-АМФ обеспечивает повышение проницаемости собирательных трубочек нефрона для воды, ее реабсорбцию и концентрацию мочи, что соответствует второму названию вазопрессина - "антидиуретический гормон, АДГ".

Кроме действия на почку и кровеносные сосуды, вазопрессин является одним из важных мозговых нейропептидов, участвующим в формировании жажды и питьевого поведения, механизмах памяти, регуляции секреции аденогипофизарных гормонов.

Недостаток или даже полное отсутствие секреции вазопрессина проявляется в виде резкого усиления диуреза с выделением большого количества гипотонической мочи. Этот синдром получил называние "несахарный диабет ", он бывает врожденным или приобретенным. Синдром избытка вазопрессина (синдром Пархона) проявляется

в чрезмерной задержке жидкости в организме.

Окситоцин . Синтез окситоцина в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса и выделение его в кровь из нейрогипофиза стимулируется рефлекторным путем при раздражении рецепторов растяжения шейки матки и рецепторов молочных желез. Повышают секрецию окситоцина эстрогены.

Окситоцин вызывает следующие эффекты: а) стимулирует сокращение гладкой мускулатуры матки, способствуя родам; б) вызывает сокращение гладкомышечных клеток выводных протоков лактирующей молочной железы, обеспечивая выброс молока; в) оказывает при определенных условиях диуретическое и натриуретическое действие; г) участвует в организации питьевого и пищевого поведения; д) является дополнительным фактором регуляции секреции аденогипофизарных гормонов.

Общие представления о путях сигнальной трансдукции

Для большинства регуляторных молекул между их связыванием с мембранным рецептором и окончательной реакцией клетки, т.е. изменением ее работы, вклиниваются сложные серии событий - определенные пути передачи сигнала, иначе называемые путями сигнальной трансдукции.

Регуляторные вещества принято подразделять на эндокринные, нейрокринные и паракринные. Эндокринные регуляторы (гормоны) выделяются эндокринными клетками в кровь и переносятся ею к клеткам-мишеням, которые могут находиться в любом месте организма. Нейрокринные регуляторы выделяются нейронами в непосредственной близости от клеток-мишеней. Паракринные вещества освобождаются несколько дальше от мишеней, но все же достаточно близко к ним, чтобы достичь рецепторов. Паракринные вещества секретируются одним типом клеток, а действуют на другой, однако в некоторых случаях регуляторы предназначены тем клеткам, которые их выделили, или соседним клеткам, относящимся к тому же типу. Это называется аутокринной регуляцией.

В ряде случаев последний этап сигнальной трансдукции состоит в фосфорилировании определенных эффекторных белков, что ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы.

Изменения протеинкиназной активности происходят в результате связывания регуляторной молекулы (в общем случае называемой лигандом) с ее мембранным рецептором, что запускает каскады событий, некоторые из которых приведены на рисунке (рис. 2-1). Активность различных протеинкиназ регулируется рецептором не прямо, а через вторичные мессенджеры (вторичные посредники), в роли которых выступают, например, циклический АМФ (цAMФ), циклический ГМФ (цГMФ), Са 2+ , инозитол-1,4,5-три- фосфат (IP 3) и диацилглицерол (DAG). При этом связывание лиганда с мембранным рецептором изменяет внутриклеточный уровень вторичного мессенджера, что, в свою очередь, отражается на активности протеинкиназы. Многие регулятор-

ные молекулы влияют на клеточные процессы через пути сигнальной трансдукции с участием гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков) или мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Когда молекулы лиганда связываются с мембранными рецепторами, взаимодействующими с гетеротримерными G-белками, происходит переход G-белка в активное состояние путем связывания с ГТФ. Активированный G-белок может затем взаимодействовать со многими эффекторными белками, прежде всего ферментами, такими, как аденилатциклаза, фосфодиэстераза, фосфолипазы С, А 2 и D. Это взаимодействие запускает цепи реакций (рис. 2-1), которые заканчиваются активацией различных протеинкиназ, таких, как протеинкиназа А (ПКА), протеинкиназа G (ПKG), протеинкиназа C (ПИС).

В общих чертах пути сигнальной трансдукции с участием G-белков - протеинкиназ включает следующие этапы.

1.Лиганд связывается с рецептором на мембране клетки.

2.Связанный с лигандом рецептор, взаимодействуя с G-белком, активирует его, и активированный G-белок связывает ГТФ.

3.Активированный G-белок взаимодействует с одним или несколькими следующими соединениями: аденилатциклазой, фосфодиэстеразой, фосфолипазами С, А 2 , D, активируея или ингибируя их.

4.Внутриклеточный уровень одного или нескольких вторичных мессенджеров, таких, как цАМФ, цГМФ, Са 2+ , IP 3 или DAG, возрастает или снижается.

5.Увеличение или уменьшение концентрации вторичного мессенджера влияет на активность одной или нескольких зависимых от него протеинкиназ, таких, как цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А), цГМФ-зависимая протеинкиназа (ПКG), кальмодулинзависимая протеинкиназа (КМПК), протеинкиназа С. Изменение концентрации вторичного мессенджера может активировать тот или иной ионный канал.

6.Уровень фосфорилирования фермента или ионного канала изменяется, что влияет на активность ионного канала, обуславливая конечный ответ клетки.

Рис. 2-1. Некоторые каскады событий, реализующиеся в клетке благодаря вторичным посредникам.

Обозначения: * - активированный фермент

Мембранные рецепторы, связанные с G-белками

Мембранные рецепторы, опосредующие агонист-зависимую активацию G-белков, составляют особое семейство белков, в котором 500 с лишним представителей. К нему относятся α- и β-адренергические, мускариновые ацетилхолиновые, серотониновые, аденозиновые, обонятельные рецепторы, родопсин, а также рецепторы большинства пептидных гормонов. Представители семейства рецепторов, связанных с G-белками, имеют семь трансмембранных α-спиралей (рис. 2-2 А), каждая из которых содержит 22-28 преимущественно гидрофобных аминокислотных остатков.

Для некоторых лигандов, например, ацетилхолина, адреналина, норадреналина и серотонина, известны разные подтипы связанных с G-белками рецепторов. Зачастую они различаются сродством к конкурентным агонистам и антагонистам.

Далее представлена (рис. 2-2 Б) молекулярная организация аденилатциклазы - фермента, продуцирующего цАМФ (первый открытый вторичный мессенджер). Регуляторный путь аденилатциклазы считается классическим путем сигнальной трансдукции, обусловленной G-белками.

Аденилатциклаза служит основой позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции через G-белки. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например, адреналина, действующего через β-адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа as («s» означает стимуляцию). Активация Gs-типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его as-субъединица связывает ГТФ, и затем диссоциирует от βγ-димера.

На рисунке 2-2 В показано, как фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол. Оба вещества, инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол, относятся к вторичным мессенджерам. IP3, связываясь со специфическими лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует другой важный класс протеинкиназ - протеинкиназу С.

Затем показана структура некоторых вторичных мессенджеров (рис. 2-2 Г-Е): цАМФ, ГМФ,

цГМФ.

Рис. 2-2. Примеры молекулярной организации некоторых структур, участвующих в путях сигнальной трансдукции.

А - рецептор мембраны клетки, связывающий на внешней поверхности лиганд, а внутри - гетеротримерный G-белок. Б - молекулярная организация аденилатциклазы. В - структура фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфата и образованных под действием фосфолипазы С инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола. Г - структура 3",5"-циклического АМФ (активатора протеинкиназы А). Д - структура ГМФ. Е - структура 3",5"-циклического ГМФ (активатора протеинкиназы G)

Гетеротримерные G-белки

Гетеротримерный G-белок состоит из трех субъединиц: α (40 000-45 000 Да), β (около 37 000 Да) и γ (8000-10 000 Да). Сейчас известно около 20 различных генов, кодирующих эти субъединицы, в том числе не менее четырех генов β-субъединиц и примерно семь генов γ-субъединиц млекопитающих. Функция и специфичность G-белка обычно, хотя и не всегда, определяются его α-субъединицей. У большинства G-бел- ков субъединицы β и γ плотно связаны между собой. Некоторые гетеротримерные G-белки и пути трансдукции, в которых они задействованы, перечислены в табл. 2-1.

Гетеротримерные G-белки служат посредниками между рецепторами плазматической мембраны для более 100 внеклеточных регуляторных веществ и внутриклеточными процессами, которые они контролируют. В общих чертах, связывание регуляторного вещества с его рецептором активирует G-белок, а тот либо активирует, либо ингибирует фермент и/или вызывает цепь событий, приводящих к активации определенных ионных каналов.

На рис. 2-3 представлен общий принцип работы гетеротримерных G-белков. В большинстве G-белков α-субъединица представляет собой «рабочий элемент» гетеротримерных G-белков. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению этой субъединицы. Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров,

с ГДФ в позициях, связывающих нуклеотид. Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму с повышенным сродством к ГТФ и пониженной афинностью его к βγ-комплексу. В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица затем взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции. Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса.

Работа некоторых ионных каналов модулируется G-белками непосредственно, т.е. без участия вторичных мессенджеров. Например, связывание ацетилхолина с мускариновыми М 2 -рецепторами сердца и некоторых нейронов ведет к активации особого класса К + -каналов. В этом случае связывание ацетилхолина с мускариновым рецептором ведет к активации G-белка. Его активированная α-субъединица затем отделяется от βγ-димера, а βγ-димер напрямую взаимодействует с особым классом К + -каналов, приводя их в открытое состояние. Связывание ацетилхолина с мускариновыми рецепторами, повышающее К+-проводимость пейсмекерных клеток в синоатриальном узле сердца - один из главных механизмов, посредством которого парасимпатические нервы вызывают уменьшение частоты сердечных сокращений.

Рис. 2-3. Принцип работы гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков).

Таблица 2-1. Некоторые гетеротримерные ГТФ-связывающие белки млекопитающих, классифицированные на основе их α-субъединиц *

* В каждом классе α-субъединиц различают несколько изоформ. Идентифицировано более 20 α-субъединиц.

Мономерные G-белки

Клетки содержат еще одно семейство ГТФсвязывающих белков, которые называют мономерными ГТФ-связывающими белками. Они также известны как G-белки с низкой молекулярной массой или малые G-белки (молекулярная масса 20 000-35 000 Да). В таблице 2-2 перечислены основные подклассы мономерных ГТФсвязывающих белков и некоторые из их свойств. Ras-подобные и Rho-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от тирозинкиназы, рецептора фактора роста, на внутриклеточные эффекторы. Среди процессов, регулируемых путями сигнальной трансдукции, в которые вовлечены мономерные ГТФсвязывающие белки, можно назвать элонгацию полипептидной цепи в ходе белкового синтеза, пролиферацию и дифференцировку клеток, их злокачественное перерождение, контроль актинового цитоскелета, связь между цитоскелетом

и внеклеточным матриксом, транспорт везикул между различными органеллами и экзоцитозную секрецию.

Мономерные ГТФ-связывающие белки, как и их гетеротримерные аналоги, представляют собой молекулярные переключатели, существующие в двух формах - активированной «включенной» и инактивированной «выключенной» (рис. 2-4 Б). Однако активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требует дополнительных регуляторных белков, которые, насколько известно, не требуются для работы гетеротримерных G-белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками, а инактивируются ГТФаза-активирующими белками. Таким образом, активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков контролируется сигналами, которые изменяют активность гуанин-нуклеотид-освобождающих белков или ГТФаза-активирующих белков скорее, чем путем прямого воздействия на мономерные G-белки.

Рис. 2-4. Принцип работы мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Таблица 2-2. Подсемейства мономерных ГТФ-связывающих белков и некоторые регулируемые ими внутриклеточные процессы

Механизм работы гетеротримерных G-белков

Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров, с ГДФ в их позициях, связывающих нуклеотид (рис. 2-5 А). Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродством к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу (рис. 2-5 Б). В большинстве гетеротримерных G-белков именно α-субъединица представляет собой структуру, передающую информацию. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы.

В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ (рис. 2-5 В), а затем диссоциирует от βγ-димера (рис. 2-5 Г). У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица сразу взаимодействует с эффекторными белками (Е 1) в пути сигнальной трансдукции (рис. 2-5 Г). Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или за некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса. Затем βγ-димер взаимодействует с эффекторным белком Е 2 (рис. 2-5 Д). Далее показано, что члены RGS семьи G-белка стимулируют гидролиз ГТФ (рис. 2-5 Е). Это инактивирует α-субъединицу и объединяет все субъединицы в αβγ-гетеротример.

Рис. 2-5. Цикл работы гетеротримерного G-белка, запускающего дальнейшую цепь событий с помощью своей α -субъединицы.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд, Е - эффекторный белок

Пути сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки

На рисунке 2-6 А показаны три лиганда, их рецепторы, связанные с разными G-белками, и их молекулярные мишени. Аденилатциклаза является основой для позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции, которые обусловлены G-белками. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например норадреналина, действующего через β- адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа α S («s» означает стимуляцию). Поэтому такой G-белок называют G-белком G S -типа. Активация G s -типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его α s - субъединица связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера.

Другие регуляторные вещества, такие, как адреналин, действующий через α 2 -рецепторы, или аденозин, действующий через α 1 -рецепторы, или дофамин, действующий через D 2 -рецепторы, участвуют в негативном или ингибирующем контроле аденилатциклазы. Эти регуляторные вещества активируют G i -тип G-белков, которые имеют α-субъединицу типа α i («i» означает ингибирование). Связывание ингибирующего лиганда с его

рецептором активирует G i -тип G-белков и вызывает диссоциацию его α i -субъединицы от βγ-димера. Активированная α i -субъединица связывается с аденилатциклазой и подавляет ее активность. Кроме того, βγ-димеры могут связывать свободные α s -субъединицы. Этим путем связывание βγ-димеров со свободной α s -субъединицей дополнительно подавляет стимуляцию аденилатциклазы, блокируя действие стимулирующих лигандов.

Еще один класс внеклеточных агонистов (рис. 2-6 А) связывается с рецепторами, которые активируют посредством G-белка, называемого G q , β-изоформу фосфолипазы С. Она расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (фосфолипид, в малых количествах присутствующий в плазматической мембране) на инозитол-1,4,5- трифосфат и диацилглицерол, которые относятся ко вторичным мессенджерам. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Са 2+ -каналы эндоплазматического ретикулума вовлечены в электромеханическое сопряжение в скелетной и сердечной мышце. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует протеинкиназу С. К ее субстратам относятся, например, белки, участвующие в регуляции клеточного деления.

Рис. 2-6. Примеры путей сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки.

А - в трех приведенных примерах связывание нейротрансмиттера с рецептором ведет к активации G-белка и последующему включению путей вторичных мессенджеров. G s , G q , и G i подразумевают три различных типа гетеротримерных G-белков. Б - регуляция клеточных белков фосфорилированием ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы. Протеинкиназа переносит фосфатную группу (Pi) от АТФ на сериновые, треониновые или тирозиновые остатки белков. Это фосфорилирование обратимо меняет структуру и функции клеточных белков. Оба типа ферментов - киназы и фосфатазы - регулируются различными внутриклеточными вторичными мессенджерами

Пути активации внутриклеточных протеинкиназ

Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродство к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы, которая освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. Далее диссоциированная α-субъединица взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции.

На рисунке 2-7 А продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G s -типа с α-субъединицей типа α s , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α s -субъединица G-белков G s -типа связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с аденилатциклазой. Это приводит к повышению уровня цАМФ и активации ПКА.

На рисунке 2-7 Б продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G t -типа с α-субъединицей типа α t , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α t -субъединица G-белков G t -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфодиэстеразой. Это приводит к повышению уровня цГМФ и активации ПKG.

Рецептор катехоламинов α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей, активирующей фосфолипазу С. На рисунке 2-7 В продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G αq -типа с α-субъединицей типа α q , которая происходит благодаря связыванию лиганда с рецептором и приводит к тому, что α q -субъединица G-белков G αq -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфолипазой С. Она расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. Это приводит к повышению уровня IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ - каналами эндоплазматического ретикулума,

высвобождает из него Са 2+ . DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке значительное количество этого фермента находится в цитозоле в неактивной форме. Са 2+ заставляет протеинкиназу С связываться с внутренней поверхностью плазматической мембраны. Здесь фермент может активироваться диацилглицеролом, который образуется при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

Описано около 10 изоформ протеинкиназы С. Хотя некоторые из них присутствуют во многих клетках млекопитающих, однако подтипы γ и ε обнаружены, главным образом, в клетках центральной нервной системы. Подтипы протеинкиназы С различаются не только распределением по организму, но, по-видимому, и механизмами регуляции своей активности. Некоторые из них в нестимулированных клетках связаны с плазматической мембраной, т.е. не требуют для активации увеличения концентрации Са 2+ . Некоторые изоформы протеинкиназы С активируются арахидоновой кислотой или другими ненасыщенными жирными кислотами.

Первоначальная кратковременная активация протеинкиназы С происходит под действием диацилглицерола, который освобождается, когда фосфолипаза С β активируется, а также под влиянием Са 2+ , освобожденного из внутриклеточных хранилищ с помощью IP 3 . Долго длящаяся активация протеинкиназы С запускается рецептор-зависимыми фосфолипазами А 2 и D. Они действуют первично на фосфатидилхолин - основной мембранный фосфолипид. Фосфолипаза А 2 отделяет от него жирную кислоту во втором положении (обычно ненасыщенную) и лизофосфатидилхолин. Оба эти продукта активируют определенные изоформы протеинкиназы С. Рецептор-зависимая фосфолипаза D расщепляет фосфатидилхолин таким образом, что образуется фосфатидная кислота и холин. Фосфатидная кислота далее расщепляется до диацилглицерола, участвующего в долговременной стимуляции протеинкиназы С.

Рис. 2-7. Основные принципы активации протеинкиназы А, протеинкиназы G и протеинкиназы С.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд

цAMФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) и связанные с ней сигнальные пути

В отсутствии цАМФ, цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) состоят из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. У большинства типов клеток каталитическая субъединица одна и та же, а регуляторные субъединицы высокоспецифичны. Присутствие регуляторных субъединиц почти полностью подавляет ферментативную активность комплекса. Таким образом, активация ферментативной активности цАМФ-зависимой протеинкиназы должна вовлекать отделение регуляторных субъединиц от комплекса.

Активация происходит в присутствии микромолярных концентраций цАМФ. Каждая регуляторная субъединица связывает две его молекулы. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах и снижает аффинность их взаимодействия с каталитическими субъединицами. В результате этого регуляторные субъединицы отделяются от каталитических, и каталитические субъединицы становятся активированными. Активная каталитическая субъединица фосфорилирует белкимишени по определенным сериновым и треониновым остаткам.

Сравнение аминокислотных последовательностей цАМФ-зависимой и других классов протеинкиназ показывает, что, несмотря на сильные различия в их регуляторных свойствах, все эти ферменты высокогомологичны по первичной структуре срединной части. Эта часть содержит АТФ-связывающий домен и активный центр фермента, обеспечивающий перенос фосфата с АТФ на белок-акцептор. Участки киназ за пределами этой каталитической срединной части белка участвуют в регуляции киназной активности.

Определена также кристаллическая структура каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы. Каталитическая средняя часть молекулы, имеющаяся у всех известных протеинкиназ, состоит из двух долей. Меньшая из них содержит необычный АТФ-связывающий участок, а большая доля содержит участок связывания пептида. Многие протеинкиназы содержат также регуляторный участок, известный как псевдосубстратный домен. По аминокислотной последовательности он напоминает фосфорилируемые участки субстратных белков. Псевдосубстратный домен, связываясь с активным центром протеинкиназы, ингибирует фосфорилирование истинных субстратов протеинкиназы. Активация киназы может включать фосфорилирование или нековалентную аллостерическую модификацию протеинкиназы для устранения ингибирующего действия псевдосубстратного домена.

Рис. 2-8. цAMФ-зависимая протеинкиназа А и мишени.

Когда адреналин связывается с соответствующим рецептором, активация α s -субъединицы стимулирует аденилатциклазу с увеличением уровня цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А, которая путем фосфорилирования дает три основных эффекта. (1) Протеинкиназа А активирует киназу фосфорилазы гликогена, которая фосфорилирует и активирует фосфорилазу гликогена. (2) Протеинкиназа А инактивирует гликогенсинтазу и таким образом уменьшает образование гликогена. (3) Протеинкиназа А активирует ингибитор фосфопротеин-фосфатазы-1 и тем самым ингибирует фосфатазу. Эффект в целом заключается в координации изменений уровня глюкозы.

Обозначения: УДФ-глюкоза - уридиндифосфатглюкоза

Гормональная регуляция активности аденилатциклазы

На рисунке 2-9 А представлен принципиальный механизм индуцированной гормонами стимуляции и ингибирования аденилатциклазы. Взаимодействие лиганда с рецептором, связанным с α-субъединицей типа α s (стимулирующая), вызывает активацию аденилатциклазы, тогда как взаимодействие лиганда с рецептором), связанным с α-субъединицей типа α i (ингибирующая), вызывает ингибирование фермента. G βγ -субъединица и в стимулирующих, и в ингибирующих G-белках идентична. G α -субъединицы и рецепторы различны. Лиганд-стимулирован-ное образование активных G α ГТФ комплексов происходит с помощью одинаковых механизмов в обоих G αs ,- и G αi -протеинах. Однако G αs ГТФ и G αi ГТФ по-разному взаимодействуют с аденилатциклазой. Одна (G αs ГТФ) стимулирует, а другая G αi ГТФ) ингибирует ее каталитическую активность.

На рисунке 2-9 Б представлен механизм индуцированной определенными гормонами активации и ингибирования аденилатциклазы. β 1 -, β 2 - и D 1 -рецепторы взаимодействуют с субъединицами, которые активируют аденилатциклазу и повышают уровень цАМФ. α 2 -и D 2 -рецепторы взаимодействуют с G αi субъединицами, которые ингибируют аденилатциклазу. (Что касается α 1 -рецептора, то он взаимодействует с G -субъединицей, которая активирует фосфолипазу С.) Рассмотрим один из примеров, представленных на рисунке. Адреналин связывается с β 1 -рецептором, что приводит к активации G αs -белка, который стимулирует аденилатциклазу. Это приводит к увеличению внутриклеточного уровня цАМФ, и, таким образом, усиливает активность ПКА. С другой стороны, норадреналин связывается с α 2 -рецептором, что приводит к активации G αi -белка, который ингибирует аденилатциклазу и тем самым снижает внутриклеточный уровень цАМФ, уменьшая активность ПКА.

Рис. 2-9. Индуцированная лигандами (гормонами) активация и ингибирование аденилатциклазы.

А - принципиальный механизм. Б - механизм применительно к конкретным гормонам

Протеинкиназа С и связанные с ней сигнальные пути

Рецептор α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей G-белка, которая активирует фосфолипазу С. Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лиганд-зависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке этот фермент находится в цитозоле в неактивной

форме. Если цитозольный уровень Са 2+ повышается, происходит взаимодействие Са 2+ с протеинкиназой С, что приводит к связыванию протеинкиназы С с внутренней поверхностью клеточной мембраны. В таком положении фермент активируется диацилглицеролом, образующимся при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфа- та. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

В таблице 2-3 приведены изоформы протеинкиназы С млекопитающих и свойства этих изоформ.

Таблица 2-3. Свойства изоформ протеинкиназы С млекопитающих

ДАГ - диацилглицерол; ФС - фосфатидилсерин; ФФА - цис-ненасыщенные жирные кислоты; ЛФХ - лизофосфатидилхолин.

Рис. 2-10. Сигнальные пути диацилглицерол / инозитол-1,4,5-трифосфат

Фосфолипазы и связанные с ними сигнальные пути на примере арахидоновой кислоты

Некоторые агонисты посредством G-белков активируют фосфолипазу А 2 , которая действует на мембранные фосфолипиды. Продукты их реакций могут активировать протеинкиназу С. В частности, фосфолипаза A 2 отделяет от фосфолипидов находящуюся во втором положении жирную кислоту. Вследствие того, что некоторые фосфолипиды содержат в этом положении арахидоновую кислоту, вызванное фосфолипазой A 2 , расщепление этих фосфолипидов освобождает значительное ее количество.

Вышеописанный сигнальный путь арахидоновой кислоты, связанный с фосфолипазой А 2 , называют прямым. Непрямой путь активации арахидоновой кислоты связан с фосфолипазой С β .

Арахидоновая кислота сама по себе является эффекторной молекулой, а кроме того, служит предшественником для внутриклеточного синтеза простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и лейкотриенов - важных классов регуляторных молекул. Арахидоновая кислота также образуется из продуктов расщепления диацил-глицеролов.

Простагландины, простациклины и тромбоксаны синтезируются из арахидоновой кислоты циклооксигеназно-зависимым путем, а лейкотриены - липоксигеназно-зависимым путем. Один из противовоспалительных эффектов глюкокортикоидов заключается как раз в ингибировании фосфолипазы A 2 , которая освобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов. Ацетилсалициловая кислота (аспирин  ) и другие нестероидные противовоспалительные средства ингибируют окисление арахидоновой кислоты циклооксигеназой.

Рис. 2-11. Сигнальные пути арахидоновой кислоты.

Обозначения: ПГ - простагландин, ЛГ - лейкотриен, ГПЭТЕ - гидропероксиэйкозатетраеноат, ГЭТЕ - гидроксиэйкозатетраеноат, ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Кальмодулин: строение и функции

Множество жизненно важных клеточных процессов, включая освобождение нейротрансмиттеров, секрецию гормонов и мышечное сокращение, регулируется цитозольным уровнем Са 2+ . Один из путей влияния этого иона на клеточные процессы заключается в его связывании с кальмодулином.

Кальмодулин - белок с молекулярным весом 16 700 (рис. 2-12 А). Он присутствует во всех клетках, иногда составляя до 1% их общего белкового содержимого. Кальмодулин связывает четыре иона кальция (рис. 2-12 Б и В), после чего этот комплекс регулирует активность различных внутриклеточных белков, многие из которых не относятся к протеинкиназам.

Комплекс Са 2+ c кальмодулином активирует также кальмодулин-зависимые протеинкиназы. Специфический кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют специфические эффекторные белки, например, регуляторные легкие цепи миозина, фосфорилазу и фактор элонгации II. Мультифункциональные кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют многочисленные белки ядра, цитоскелета или мембранные белки. Некоторые кальмодулинзависимые протеинкиназы, такие, как киназа

легкой миозиновой цепи и киназа фосфорилазы, действуют только на один клеточный субстрат, тогда как другие полифункциональны и фосфорилируют более чем один субстратный белок.

Кальмодулин-зависимая протеинкиназа II относится к мажорным белкам нервной системы. В некоторых областях головного мозга на нее приходится до 2% общего белка. Эта киназа участвует в механизме, при котором увеличение концентрации Са 2+ в нервном окончании вызывает освобождение нейротрансмиттера по типу экзоцитоза. Ее главным субстратом служит белок под названием синапсин I, присутствующий в нервных окончаниях и связывающийся с наружной поверхностью синаптических везикул. Когда синапсин I связан с везикулами, он предотвращает экзоцитоз. Фосфорилирование синапсина I вызывает его отделение от везикул, позволяя им выбросить нейротрансмиттер в синаптическую щель путем экзоцитоза.

Киназа легких цепей миозина играет важную роль в регуляции сокращения гладких мышц. Повышение цитозольной концентрации Са 2+ в клетках гладких мышц активирует киназу легких цепей миозина. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина приводит к длительному сокращению гладкомышечных клеток.

Рис. 2-12. Кальмодулин.

А - кальмодулин без кальция. Б - связывание кальция с кальмодулином и пептидной мишенью. В - схема связывания.

Обозначения: EF - Са 2+ -связывающие домены кальмодулина

Рецепторы с собственной ферметативной активностью (каталитические рецепторы)

Гормоны и факторы роста связываются с протеинами поверхности клетки, которые имеют ферментативную активность на цитоплазматической стороне мембраны. На рисунке 2-13 представлены пять классов каталитических рецепторов.

Один из характерных экземпляров трансмембранных рецепторов с гуанилатциклазной активностью, рецептор предсердного натрий-уретического пептида (ANP). Мембранный рецептор, с которым связывается ANP, не зависит от рассмотренных систем сигнальной трансдукции. Выше было описано действие внеклеточных агонистов, которые, связываясь с мембранными рецепторами, либо активируют аденилатциклазу через G s -белки, либо угнетают ее через G i . Мембранные рецепторы для ANP интересны тем, что сами рецепторы обладают гуанилатциклазной активностью, стимулирующейся связыванием ANP с рецептором.

ANP-рецепторы имеют внеклеточный ANP-свя- зывающий домен, единственную трансмембранную спираль и внутриклеточный гуанилатциклазный домен. Связывание ANP с рецептором повышает внутриклеточный уровень цГМФ, что стимулирует цГМФ-зависимую протеинкиназу. В противоположность цАМФ-зависимой протеинкиназе, имеющей регуляторную и каталитическую субъединицы, регуляторные и каталитические домены цГМФ-зависимой протеинкиназы находятся на одной полипептидной цепи. цГМФзависимая киназа затем фосфорилирует внутриклеточные белки, что приводит к различным клеточным ответам.

Рецепторы с серин-треонин-киназной активностью фосфорилируют белки только по остаткам серина и/или треонина.

Еще одно семейство мембранных рецепторов, не сопряженных с G-белками, состоит из белков с собственнойтирозин-протеинкиназнойактивностью. Рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью служат белки с гликозилированным внеклеточным доменом, единственным

трансмембранным участком и внутриклеточным доменом с тирозин-протеинкиназной активностью. Связывание с ними агониста, например фактора роста нервов (NGF), стимулирует тирозин-протеинкиназную активность, что фосфорилирует специфичные белки-эффекторы по определенным тирозиновым остаткам. Большинство рецепторов для факторов роста димеризуются, когда с ними связывается NGF. Именно димеризация рецептора ведет к появлению у него тирозинпротеинкиназной активности. Активированные рецепторы часто фосфорилируют сами себя, что называется аутофосфорилированием.

К надсемейству пептидных рецепторов относят рецепторы инсулина. Это также тирозин-протеинкиназы. В подклассе рецепторов, относящихся к семейству инсулиновых рецепторов, нелигандный рецептор существует как дисульфид-связанный димер. Взаимодействие с инсулином приводит к конформационным изменениям обоих мономеров, что повышает связывание инсулина, активирует рецепторную тирозинкиназу и ведет к увеличению аутофосфорилирования рецептора.

Связывание гормона или фактора роста с его рецептором запускает разнообразные клеточные ответы, включая поступление в цитоплазму Са 2+ , увеличение Na + /H + обмена, стимуляцию захвата аминокислот и сахара, стимуляцию фосфолипазы С β и гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата.

Рецепторы гормона роста, пролактина и эритропоэтина, также как рецепторы интерферона и многих цитокинов, непосредственно не служат протеинкиназами. Однако после активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. Именно потому они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними.

На основе структуры можно полагать, что трансмембранные тирозин-протеинфосфатазы также представляют собой рецепторы, а их с тирозин-протеинфосфатазная активность модулируется внеклеточными лигандами.

Рис. 2-13. Каталитические рецепторы.

А - рецептор гуанилциклазы, Б - рецептор с серин-треонин киназной активностью, В - рецептор с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, Г - рецепторы, ассоциированные с тирозин-протеинкиназной активностью

Рецептор-связанные тирозинпротеинкиназы на примере рецепторов интерферона

Рецепторы интерферона непосредственно не являются протеинкиназами. После активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. То есть они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними таке рецепторы называются рецептор-связанными (рецептор-зависимыми) тирозин-протеинкиназами.

Механизмы, благодаря которому эти рецепторы оказывают действие, запускаются, когда гормон связывается с рецептором, что вызывает его димеризацию. Рецепторный димер связывает одну или несколько членов Janus -семейства тирозин-протеинкиназ (JAK). JAK затем перекрестно

фосфорилируют друг друга, а также рецептор. Члены семейства преобразователей сигнала и активаторов транскрипции (STAT) связывают фосфорилированные домены на комплексе рецептора и JAK. STAT-белки фосфорилируются JAK-киназами и затем отсоединяются от сигнального комплекса. В конечном итоге фосфорилированные STAT-белки образуют димеры, которые двигаются к ядру, чтобы активировать транскрипцию определенных генов.

Специфичность рецептора для каждого гормона отчасти зависит от специфики членов семейства JAK или STAT, объединяющихся для образования сигнального комплекса. В некоторых случаях сигнальный комплекс также активирует MAP-(митоген-активирующий протеин)-киназный каскад с помощью адапторных белков, используемых рецепторными тирозинкиназами. Некоторые из ответов рецепторных тирозинкиназных лигандов также вовлекают JAK и STAT пути.

Рис. 2-14. Пример каталитических рецепторов, ассоциированных с тирозин-протеинкиназной активностью. Рецептор, активируемый α -интерфероном (А) и γ -интерфероном (Б)

Ras-подобные мономерные G-белки и опосредованные ими пути трансдукции

Лиганд, например фактор роста, связывается с рецептором, обладающим собственной тирозинпротеинкиназной активностью, что приводит к увеличению транскрипции в 10-ступенчатом процессе. Ras-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от рецепторов с собственной тирозин-протеинкиназной активностью (например, рецепторов фактора роста) на внутриклеточные эффекторы. Активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требуют дополнительных регуляторных белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками (GNRP), а инактивируются ГТФаза-активирующими белками (GAP).

Мономерные ГТФ-связывающие белки семейства Ras служат посредниками связывания митогенных лигандов и их тирозин-протеинкиназных рецепторов, что запускает внутриклеточные процессы, ведущие к пролиферации клеток. Когда Ras-белки неактивны, клетки не реагируют на факторы роста, действующие через тирозинкиназные рецепторы.

Aктивация Ras запускает путь сигнальной трансдукции, приводящий в конечном итоге к транскрипции определенных генов, способствующих клеточному росту. Каскад MAP-киназы (МАРК) вовлекается в ответы при активации Ras. Протеинкиназа С также активирует каскад MAP- киназы. Таким образом, каскад MAP-киназы оказывается важной точкой конвергенции для разнообразных эффектов, вызывающих клеточную пролиферацию. Более того, здесь наблюдается перекрест между протеинкиназой С и тирозинкиназами. Например γ-изоформа фосфолипазы С активируется путем связывания с активированным Ras-белком. Эта активация передается на протеинкиназу С в процессе стимуляции фосфолипидного гидролиза.

На рисунке 2-15 представлен механизм, включающий 10 ступеней.

1. Связывание лиганда приводит к димеризации рецептора.

2.Активированнаятирозин-протеинкиназа (RTK) фосфорилирует себя.

3.GRB 2 (growth factor receptor-bound protein-2), SH 2 -содержащий протеин, узнает фосфотирозиновые остатки на активированном рецепторе.

4.Связывание GRB 2 включает SOS (son of sevenless) обменный протеин гуаниннуклеотида.

5.SOS активирует Ras, формируя на Ras ГТФ вместо ГДФ.

6.Активный комплекс Ras-ГТФ активирует другие протеины физическим включением их в плазматическую мембрану. Активный комплекс Ras-ГТФ взаимодействует с N-терминальной частью серин-треонин киназы Raf-1 (известной как митоген-активирующий протеин, MAP) первой в серии последовательности активированных протеинкиназ, которые передают активационный сигнал в ядро клетки.

7.Raf-1 фосфорилирует и активирует протеинкиназу, названную MEK, которая известна как киназа МАP-киназы (МАРКК). MEK - это мультифункциональная протеинкиназа, фосфорилирующая субстраты остатков тирозина и серина / треонина.

8.MEK фосфорилирует МАP-киназу (МАРК), которая также вызывается внеклеточным сигналом - регуляторной киназой (ERK 1 , ERK 2). Активация МАРК требует двойного фосфорилирования на соседних остатках серина и тирозина.

9.МАРК служит важнейшей эффекторной молекулой в Ras-зависимой сигнальной трансдукции, поскольку она фосфорилирует много клеточных протеинов после митогенной стимуляции.

10.Активированная МАРК переносится в ядро, где она фосфорилирует фактор транскрипции. В целом, активированный Ras активирует МАР

путем связывания с ней. Результатом этого каскада являются фосфорилирование и активация МАР-киназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует факторы транскрипции, белковые субстраты и другие протеинкиназы, важные для деления и других ответов клеток. Активация Ras зависит от адаптерных белков, связывающихся с фосфотирозиновыми доменами на активированных факторами роста рецепторах. Эти адаптерные белки присоединяются и активируют GNRF (гуанин-нуклеотидобменный протеин), который активирует Ras.

Рис. 2-15. Регуляция транскрипции Ras-подобными мономерными G-белками, запускаемая с рецептора с собственной тирозин-протеинкиназной активностью

Регуляция транскрипции белком, взаимодействующим с цАМФзависимым элементом ДНК (CREB)

CREB -широко распространенный транскрипционный фактор - в норме связан с участком ДНК, названным CRE (сАМР response element). В отсутствии стимуляции CREB дефосфорилирован и не влияет на транскрипцию. Многочисленные пути сигнальной трансдукции посредством активации киназ (таких, как ПКА, Са 2+ /кальмо- дулин-киназа IV, МАР-киназа) приводят к фосфорилированию CREB. Фосфорилированный CREB связывается CBP (CREB-binding protein - CREB-связывающим протеином), который имеет домен, стимулирующий транскрипцию. Параллельно фосфорилирование активирует РР1

(фосфопротеинфосфатазу 1), которая дефосфорилирует CREB, что приводит к остановке транскрипции.

Показано, что активация CREB-опосредованно- го механизма важна для реализации таких высших когнитивных функций, как обучение и память.

На рисунке 2-15 показано также строение цАМФзависимой ПКА, которая в отсутствии цАМФ состоит из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. Присутствие регуляторных субъединиц подавляет ферментативную активность комплекса. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах, в результате чего регуляторные субъединицы отделяются от каталитических. Каталитические ПКА попадают в ядро клетки и запускают изложенный выше процесс.

Рис. 2-16. Регуляция генной транскрипции с помощью CREB (сАМР response element binding protein) через увеличение уровня циклического аденозинмонофосфата

Краткое описание:

Учебный материал по биохимии и молекулярной биологии: Строение и функции биологических мембран.

МОДУЛЬ 4: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

_Темы _

4.1. Общая характеристика мембран. Строение и состав мембран

4.2. Транспорт веществ через мембраны

4.3. Трансмембранная передача сигналов _

Цели изучения Уметь:

1. Интерпретировать роль мембран в регуляции метаболизма, транспорте веществ в клетку и удалении метаболитов.

2. Объяснять молекулярные механизмы действия гормонов и других сигнальных молекул на органы-мишени.

Знать:

1. Строение биологических мембран и их роль в обмене веществ и энергии.

2. Основные способы переноса веществ через мембраны.

3. Главные компоненты и этапы трансмембранной передачи сигналов гормонов, медиаторов, цитокинов, эйкозаноидов.

ТЕМА 4.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАН.

СТРОЕНИЕ И СОСТАВ МЕМБРАН

Все клетки и внутриклеточные органеллы окружены мембранами, которые играют важную роль в их структурной организации и функционировании. Основные принципы построения всех мембран одинаковы. Однако плазматическая мембрана, а также мембраны эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, митохондрий и ядра имеют существенные структурные особенности, они уникальны по своему составу и по характеру выполняемых функций.

Мембраны:

Отделяют клетки от окружающей среды и делят ее на компартменты (отсеки);

Регулируют транспорт веществ в клетки и органеллы и в обратном направлении;

Обеспечивают специфику межклеточных контактов;

Воспринимают сигналы из внешней среды.

Согласованное функционирование мембранных систем, включающих рецепторы, ферменты, транспортные системы, помогает поддерживать гомеостаз клетки и быстро реагировать на изменения состояния внешней среды путем регуляции метаболизма внутри клеток.

Биологические мембраны построены из липидов и белков, связанных друг с другом с помощью нековалентных взаимодействий. Основу мембраны составляет двойной липидный слой, в состав которого включены белковые молекулы (рис. 4.1). Липидный бислой образован двумя рядами амфифильных молекул, гидрофобные «хвосты» которых спрятаны внутрь, а гидрофильные группы - полярные «головки» обращены наружу и контактируют с водной средой.

1. Липиды мембран. В состав липидов мембран входят как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты. Ненасыщенные жирные кислоты встречаются в два раза чаще чем насыщенные, что определяет текучесть мембран и конформационную лабильность мембранных белков.

В мембранах присутствуют липиды трех главных типов - фосфолипиды, гликолипиды и холестерол (рис. 4.2 - 4.4). Чаще всего встречаются глицерофосфолипиды - производные фосфатидной кислоты.

Рис. 4.1. Поперечный разрез плазматической мембраны

Рис. 4.2. Глицерофосфолипиды.

Фосфатидная кислота - это диацилглицеролфосфат. R 1 , R 2 - радикалы жирных кислот (гидрофобные «хвосты»). Со вторым углеродным атомом глицерола связан остаток полиненасыщенной жирной кислоты. Полярной «головкой» является остаток фосфорной кислоты и присоединенная к нему гидрофильная группа серина, холина, этаноламина или инозитола

Существуют также липиды - производные аминоспирта сфингозина.

Аминоспирт сфингозин при ацилировании, т.е. присоединении жирной кислоты к NH 2 -группе, превращается в церамид. Церамиды различаются по остатку жирной кислоты. С ОН-группой церамида могут быть связаны разные полярные группы. В зависимости от строения полярной «головки» эти производные разделены на две группы - фосфолипиды и гликолипиды. Строение полярной группы сфингофосфолипидов (сфингомиелинов) сходно с глицерофосфолипидами. Много сфингомиелинов содержится в составе миелиновых оболочек нервных волокон. Гликолипиды представляют собой углеводные производные церамида. В зависимости от строения углеводной составляющей различают цереброзиды и ганглиозиды.

Холестерол содержится в мембранах всех животных клеток, он придает мембранам жесткость и снижает их жидкостность (текучесть). Молекула холестерола располагается в гидрофобной зоне мембраны параллельно гидрофобным «хвостам» молекул фосфо- и гликолипидов. Гидроксильная группа холестерола, как и гидрофильные «головки» фосфо- и гликолипидов,

Рис. 4.3. Производные аминоспирта сфингозина.

Церамид - ацилированный сфингозин (R 1 - радикал жирной кислоты). К фосфолипидам относятся сфингомиелины, у которых полярная группа состоит из остатка фосфорной кислоты и холина, этаноламина или серина. Гидрофильной группой (полярной «головкой») гликолипидов является углеводный остаток. Цереброзиды содержат моноили олигосахаридный остаток линейного строения. В состав ганглиозидов входит разветвленный олигосахарид, одним из мономерных звеньев которого является НАНК - N-ацетилнейраминовая кислота

обращена к водной фазе. Молярное соотношение холестерола и других липидов в мембранах равно 0,3-0,9. Самое высокое значение имеет эта величина для цитоплазматической мембраны.

Увеличение содержания холестерола в мембранах уменьшает подвижность цепей жирных кислот, что влияет на конформационную лабильность мембранных белков и снижает возможность их латеральной диффузии. При повышении текучести мембран, вызванном действием на них липофильных веществ или перекисным окислением липидов, доля холестерола в мембранах возрастает.

Рис. 4.4. Положение в мембране фосфолипидов и холестерола.

Молекула холестерола состоит из жесткого гидрофобного ядра и гибкой углеводородной цепи. Полярной «головкой» является ОН-группа у 3-го углеродного атома молекулы холестерола. Для сравнения на рисунке представлено схематическое изображение фосфолипида мембран. Полярная головка этих молекул значительно больше и имеет заряд

Липидный состав мембран различен, содержание того или другого липида, по-видимому, определяется разнообразием функций, которые выполняют эти молекулы в мембранах.

Главные функции липидов мембран состоят в том, что они:

Формируют липидный бислой - структурную основу мембран;

Обеспечивают необходимую для функционирования мембранных белков среду;

Участвуют в регуляции активности ферментов;

Служат «якорем» для поверхностных белков;

Участвуют в передаче гормональных сигналов.

Изменение структуры липидного бислоя может привести к нарушению функций мембран.

2. Белки мембран. Белки мембран различаются по своему положению в мембране (рис. 4.5). Мембранные белки, контактирующие с гидрофобной областью липидного бислоя, должны быть амфифильными, т.е. иметь неполярный домен. Амфифильность достигается благодаря тому, что:

Аминокислотные остатки, контактирующие с липидным бислоем, в основном неполярны;

Многие мембранные белки ковалентно связаны с остатками жирных кислот (ацилированы).

Ацильные остатки жирных кислот, присоединенные к белку, обеспечивают его «заякоревание» в мембране и возможность латеральной диффузии. Кроме того, белки мембран подвергаются таким посттрансляционным модификациям, как гликозилирование и фосфорилирование. Гликозилирование наружной поверхности интегральных белков защищает их от повреждения протеазами межклеточного пространства.

Рис. 4.5. Белки мембран:

1, 2 - интегральные (трансмембранные) белки; 3, 4, 5, 6 - поверхностные белки. В интегральных белках часть полипептидной цепи погружена в липидный слой. Те участки белка, которые взаимодействуют с углеводородными цепями жирных кислот, содержат преимущественно неполярные аминокислоты. Участки белка, находящиеся в области полярных «головок», обогащены гидрофильными аминокислотными остатками. Поверхностные белки разными способами прикрепляются к мембране: 3 - связанные с интегральными белками; 4 - присоединенные к полярным «головкам» липидного слоя; 5 - «заякоренные» в мембране с помощью короткого гидрофобного концевого домена; 6 - «заякоренные» в мембране с помощью ковалентно связанного ацильного остатка

Наружный и внутренний слои одной и той же мембраны различаются по составу липидов и белков. Эта особенность в строении мембран называется трансмембранней асимметрией.

Белки мембран могут участвовать в:

Избирательном транспорте веществ в клетку и из клетки;

Передаче гормональных сигналов;

Образовании «окаймленных ямок», участвующих в эндоцитозе и экзоцитозе;

Иммунологических реакциях;

Качестве ферментов в превращениях веществ;

Организации межклеточных контактов, обеспечивающих образование тканей и органов.

ТЕМА 4.2. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ

Одна из главных функций мембран - регуляция переноса веществ в клетку и из клетки, удержание веществ, которые нужны клетке и выведение ненужных. Транспорт ионов, органических молекул через мембраны может проходить по градиенту концентрации - пассивный транспорт и против градиента концентрации - активный транспорт.

1. Пассивный транспорт может осуществляться следующими способами (рис. 4.6, 4.7):

Рис. 4.6. Механизмы переноса веществ через мембраны по градиенту концентрации

К пассивному транспорту относится диффузия ионов по белковым каналам, например диффузия Н+, Са 2 +, N+, К+. Функционирование большинства каналов регулируется специфическими лигандами или изменением трансмембранного потенциала.

Рис. 4.7. Са 2 +-канал мембраны эндоплазматического ретикулума, регулируемый инози- тол-1,4,5-трифосфатом (ИФ 3).

ИФ 3 (инозитол-1,4,5-трифосфат) образуется при гидролизе мембранного липида ФИФ 2 (фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата) под действием фермента фосфолипазы С. ИФ 3 связывается специфическими центрами протомеров Са 2 +- канала мембраны эндоплазматического ретикулума. Изменяется конформация белка и канал открывается - Са 2 + поступает в цитозоль клетки по градиенту концентрации

2. Активный транспорт. Первично-активный транспорт происходит против градиента концентрации с затратой энергии АТФ при участии транспортных АТФаз, например Na+, К+-АТФаза, Н+-АТФаза, Са 2 +-АТФаза (рис. 4.8). Н + -АТФазы функционируют как протонные насосы, с помощью которых создается кислая среда в лизосомах клетки. С помощью Са 2+ -АТФазы цитоплазматической мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулума поддерживается низкая концентрация кальция в цитозоле клетки и создается внутриклеточное депо Са 2+ в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме.

Вторично-активный транспорт происходит за счет градиента концентрации одного из переносимых веществ (рис. 4.9), который создается чаще всего Na+, К+-АТФазой, функционирующей с затратой АТФ.

Присоединение в активный центр белка-переносчика вещества, концентрация которого выше, изменяет его конформацию и увеличивает сродство к соединению, которое проходит в клетку против градиента концентрации. Вторично-активный транспорт бывает двух типов: активный симпорт и антипорт.

Рис. 4.8. Механизм функционирования Са 2 +-АТФазы

Рис. 4.9. Вторично-активный транспорт

3. Перенос макромолекул и частиц с участием мембран - эндоцитоз и экзоцитоз.

Перенос из внеклеточной среды в клетку макромолекул, например белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов или еще более крупных частиц, происходит путем эндоцитоза. Связывание веществ или высокомолекулярных комплексов происходит в определенных участках плазматической мембраны, которые называются окаймленными ямками. Эндоцитоз, происходящий с участием рецепторов, встроенных в окаймленные ямки, позволяет клеткам поглощать специфические вещества и называется рецептор-зависимым эндоцитозом.

Макромолекулы, например пептидные гормоны, пищеварительные ферменты, белки внеклеточного матрикса, липопротеиновые комплексы, секретируются в кровь или межклеточное пространство путем экзоцитоза. Этот способ транспорта позволяет выводить из клетки вещества, которые накапливаются в секреторных гранулах. В большинстве случаев экзоцитоз регулируется путем изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток.

ТЕМА 4.3. ТРАНСМЕМБРАННАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ

Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из окружающей среды. Восприятие клетками внешних сигналов происходит при их взаимодействии с рецепторами, расположенными в мембране клеток-мишеней. Рецепторы, присоединяя сигнальную молекулу, активируют внутриклеточные пути передачи информации, это приводит к изменению скорости различных метаболических процессов.

1. Сигнальная молекула, специфически взаимодействующая с мембранным рецептором, называется первичным мессенджером. В качестве первичных мессенджеров выступают различные химические соединения - гормоны, нейромедиаторы, эйкозаноиды, ростовые факторы или физические факторы, например квант света. Рецепторы клеточной мембраны, активированные первичными мессенджерами, передают полученную информацию системе белков и ферментов, которые образуют каскад передачи сигнала, обеспечивающий усиление сигнала в несколько сот раз. Время ответа клетки, заключающееся в активации или инактивации метаболических процессов, мышечного сокращения, транспорта веществ из клеток-мишеней, может составлять несколько минут.

Мембранные рецепторы подразделяются на:

Рецепторы, содержащие субъединицу, связывающую первичный мессенджер, и ионный канал;

Рецепторы, способные проявлять каталитическую активность;

Рецепторы, с помощью G-белков активирующие образование вторичных (внутриклеточных) мессенджеров, передающих сигнал специфическим белкам и ферментам цитозоля (рис. 4.10).

Вторичные мессенджеры имеют небольшую молекулярную массу, с высокой скоростью диффундируют в цитозоле клетки, изменяют активность соответствующих белков, а затем быстро расщепляются или удаляются из цитозоля.

Рис. 4.10. Рецепторы, локализованные в мембране.

Мембранные рецепторы можно разделить на три группы. Рецепторы: 1 - содержащие субъединицу, связывающую сигнальную молекулу и ионный канал, например рецептор ацетилхолина на постсинаптической мембране; 2 - проявляющие каталитическую активность после присоединения сигнальной молекулы, например рецептор инсулина; 3, 4 - передающие сигнал на фермент аденилатциклазу (АЦ) или фосфолипазу С (ФЛС) при участии мембранных G-белков, например разные типы рецепторов адреналина, ацетилхолина и других сигнальных молекул

Роль вторичных мессенджеров выполняют молекулы и ионы:

ЦАМФ (циклический аденозин-3",5"-монофосфат);

ЦГМФ (циклический гуанозин-3",5"-монофосфат);

ИФ 3 (инозитол-1,4,5-трифосфат);

ДАГ (диацилглицерол);

Существуют гормоны (стероидные и тиреоидные), которые, проходя липидный бислой, проникают в клетку и взаимодействуют с внутриклеточными рецепторами. Физиологически важным различием между мембранными и внутриклеточными рецепторами является скорость ответа на поступающий сигнал. В первом случае эффект будет быстрым и непродолжительным, во втором - медленным, но длительным.

Рецепторы, сопряженные с G-белками

Взаимодействие гормонов с рецепторами, сопряженными с G-белками, приводит к активации инозитолфосфатной системы трансдукции сигнала или изменению активности аденилатциклазной регуляторной системы.

2. Аденилатциклазная система включает (рис. 4.11):

- интегральные белки цитоплазматической мембраны:

R s - рецептор первичного мессенджера - активатора аденилатциклазной системы (АЦС);

R ; - рецептор первичного мессенджера - ингибитора АЦС;

Фермент аденилатциклазу (АЦ).

- «заякоренные» белки:

G s - ГТФ-связывающий белок, состоящий из α,βγ-субъединиц, в котором (α,-субъединица связана с молекулой ГДФ;

Рис. 4.11. Функционирование аденилатциклазной системы

G ; - ГТФ-связывающий белок, состоящий из αβγ-субъединиц, в котором а; -субъединица связана с молекулой ГДФ; - цитозольный фермент протеинкиназу А (ПКА).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью аденилатциклазной системы

Рецептор имеет центры связывания первичного мессенджера на наружной поверхности мембраны и G-белка (α,βγ-ГДФ) на внутренней поверхности мембраны. Взаимодействие активатора аденилатциклазной системы, например гормона с рецептором (R s), приводит к изменению конформации рецептора. Увеличивается сродство рецептора к G..-белку. Присоединение комплекса гормон-рецептор к GS-ГДФ снижает сродство α,-субъединицы G..-белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. В активном центре α,-субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает изменение конформации субъединицы α, и снижение ее сродства к субъединицам βγ. Отделившаяся субъединица α,-ГТФ латерально перемещается в липидном слое мембраны к ферменту аденилатциклазе.

Взаимодействие α,-ГТФ с регуляторным центром аденилатциклазы изменяет конформацию фермента, приводит к его активации и увеличению скорости образования вторичного мессенджера - циклического аденозин- 3",5"-монофосфата (цАМФ) из АТФ. В клетке повышается концентрация цАМФ. Молекулы цАМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами протеинкиназы А (ПКА), которая состоит из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С) субъединиц - (R 2 С 2). Комплекс R 2 С 2 ферментативной активностью не обладает. Присоединение цАМФ к регуляторным субъединицам вызывает изменение их конформации и потерю комплементарности к С-субъединицам. Каталитические субъединицы приобретают ферментативную активность.

Активная протеинкиназа А с помощью АТФ фосфорилирует специфические белки по остаткам серина и треонина. Фосфорилирование белков и ферментов повышает или понижает их активность, поэтому изменяется скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Активация сигнальной молекулой рецептора R стимулирует функционирование Gj-белка, которое протекает по тем же правилам, что и для G..-белка. Но при взаимодействии субъединицы α i -ГТФ с аденилатциклазой активность фермента снижается.

Инактивация аденилатциклазы и протеинкиназы А

α,-Субъединица в комплексе с ГТФ при взаимодействии с аденилатциклазой начинает проявлять ферментативную (ГТФ-фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Образующаяся молекула ГДФ остается в активном центре α,-субъединицы, изменяет ее конформацию и уменьшает сродство к АЦ. Комплекс АЦ и α,-ГДФ диссоциирует, α,-ГДФ включается в G..-белок. Отделение α,-ГДФ от аденилатциклазы инактивирует фермент и синтез цАМФ прекращается.

Фосфодиэстераза - «заякоренный» фермент цитоплазматической мембраны гидролизует образовавшиеся ранее молекулы цАМФ до АМФ. Снижение концентрации цАМФ в клетке вызывает расщепление комплекса цАМФ 4 К" 2 и повышает сродство R- и С-субъединиц, образуется неактивная форма ПКА.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму, изменяется их конформация, активность и скорость процессов, в которых участвуют эти ферменты. В результате система приходит в исходное состояние и готова вновь активироваться при взаимодействии гормона с рецептором. Таким образом, обеспечивается соответствие содержания гормона в крови и интенсивности ответа клеток-мишеней.

3. Участие аденилатциклазной системы в регуляции экспрессии генов. Многие белковые гормоны: глюкагон, вазопрессин, паратгормон и др., передающие свой сигнал посредством аденилатциклазной системы, могут не только вызвать изменение скорости реакций путем фосфорилирования уже имеющихся в клетке ферментов, но и увеличивать или уменьшать их количество, регулируя экспрессию генов (рис. 4.12). Активная протеинкиназа А может проходить в ядро и фосфорилировать фактор транскрипции (СRЕВ). Присоединение фосфорного

Рис. 4.12. Аденилатциклазный путь, приводящий к экспрессии специфических генов

остатка повышает сродство фактора транскрипции (СRЕВ-(Р) к специфиче-ской последовательности регуляторной зоны ДНК-СRЕ (цАМФ-response element) и стимулирует экспрессию генов определенных белков.

Синтезированные белки могут быть ферментами, увеличение количества которых повышает скорость реакций метаболических процессов, или мембранными переносчиками, обеспечивающими поступление или выход из клетки определенных ионов, воды или других веществ.

Рис. 4.13. Инозитолфосфатная система

Работу системы обеспечивают белки: кальмодулин, фермент протеинкиназа С, Са 2 +-кальмодулин-зависимые протеинкиназы, регулируемые Са 2 +-каналы мембраны эндоплазматического ретикулума, Са 2 +-АТФазы клеточной и митохондриальной мембран.

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью инозитолфосфатной системы

Связывание активатора инозитолфосфатной системы с рецептором (R) приводит к изменению его конформации. Повышается сродство рецептора к Gф лс -белку. Присоединение комплекса первичный мессенджер-рецептор к Gф лс -ГДФ снижает сродство аф лс -субъединицы к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. В активном центре аф лс -субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает изменение конформации субъединицы аф лс и снижение сродства к субъединицам βγ, происходит диссоциация Gф лс -белка. Отделившаяся субъединица аф лс -ГТФ латерально перемещается по мембране к ферменту фосфолипазе С.

Взаимодействие аф лс -ГТФ с центром связывания фосфолипазы С изменяет конформацию и активность фермента, возрастает скорость гидролиза фосфолипида клеточной мембраны - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфа- та (ФИФ 2) (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ 2)

В ходе реакции образуются два продукта - вторичные вестники гормонального сигнала (вторичные мессенджеры): диацилглицерол, который остается в мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С, и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ 3), который, будучи гидрофильным соединением, уходит в цитозоль. Таким образом, сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается. ИФ 3 связывается специфическими центрами Са 2+ - канала мембраны эндоплазматического ретикулума (Э)), что приводит к изменению конформации белка и открытию Са 2+ -канала. Так как концентрация кальция в ЭР примерно на 3-4 порядка выше, чем в цитозоле, после открытия канала Са 2+ по градиенту концентрации поступает в цитозоль. В отсутствие ИФ 3 в цитозоле канал закрыт.

В цитозоле всех клеток содержится небольшой белок кальмодулин, имеющий четыре центра связывания Са 2+ . При повышении концентрации

кальция он активно присоединяется к кальмодулину, образуя комплекс 4Са 2+ -кальмодулин. Этот комплекс взаимодействует с Са 2+ -кальмодулинзависимыми протеинкиназами, другими ферментами и повышает их активность. Активированная Са 2 +-кальмодулин-зависимая протеинкиназа фосфорилирует определенные белки и ферменты, в результате чего изменяется их активность и скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле клетки увеличивает скорость взаимодействия Са 2 + с неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С (ПКС). Связывание ПКС с ионами кальция стимулирует перемещение белка к плазматической мембране и позволяет ферменту вступать во взаимодействие с отрицательно заряженными «головками» молекул фосфатидилсерина (ФС) мембраны. Диацилглицерол, занимая специфические центры в протеинкиназе С, в еще большей степени увеличивает ее сродство к ионам кальция. На внутренней стороне мембраны образуется активная форма ПКС (ПКС? Са 2 + ? ФС? ДАГ), которая фосфорилирует специфические ферменты.

Включение ИФ-системы непродолжительно, и после ответа клетки на стимул происходит инактивация фосфолипазы С, протеинкиназы С и Са 2 +-кальмодулин-зависимых ферментов. аф лс -Субъединица в комплексе с ГТФ и фосфолипазой С проявляет ферментативную (ГТФ-фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Связанная с ГДФ аф лс -субъединица теряет сродство к фосфолипазе С и возвращается в исходное неактивное состояние, т.е. включается в комплекс αβγ-ГДФ Gф лс -белок).

Отделение аф лс -ГДФ от фосфолипазы С инактивирует фермент и гидролиз ФИФ 2 прекращается. Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле активирует работу Са 2+ -АТФаз эндоплазматического ретикулума, цитоплазматической мембраны, которые «выкачивают» Са 2 + из цитозоля клетки. В этом процессе принимают участие также Na+/Са 2 +- и Н+/Са 2 +-переносчики, функционирующие по принципу активного антипорта. Снижение концентрации Са 2+ приводит к диссоциации и инактивации Са 2+ -кальмодулинзависимых ферментов, а также потере сродства протеинкиназы С к липидам мембраны и снижению ее активности.

ИФ 3 и ДАГ, образовавшиеся в результате активации системы, могут снова взаимодействовать друг с другом и превращаться в фосфатидилинозитол- 4,5-бисфосфат.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму, изменяется их конформация и активность.

5. Каталитические рецепторы. Каталитические рецепторы являются ферментами. Активаторами этих ферментов могут быть гормоны, ростовые факторы, цитокины. В активной форме - рецепторы-ферменты фосфорилируют специфические белки по -ОН-группам тирозина, поэтому их называют тирозиновыми протеинкиназами (рис. 4.15). При участии специальных механизмов сигнал, полученный каталитическим рецептором, может быть передан в ядро, где он стимулирует или подавляет экспрессию определенных генов.

Рис. 4.15. Активация рецептора инсулина.

Фосфопротеинфосфатаза дефосфорилирует специфические фосфопротеины.

Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ.

ГЛЮТ 4 - переносчики глюкозы в инсулинзависимых тканях.

Тирозиновая протеинфосфатаза дефосфорилирует β-субъединицы рецептора

инсулина

Примером каталитического рецептора может служить рецептор инсулина, в состав которого входят две а- и две β-субъединицы. а-Субъединицы расположены на наружной поверхности клеточной мембраны, β-субъединицы пронизывают мембранный бислой. Центр связывания инсулина образован N-концевыми доменами а-субъединиц. Каталитический центр рецептора находится на внутриклеточных доменах β-субъединиц. Цитозольная часть рецептора имеет несколько остатков тирозина, которые могут фосфорилироваться и дефосфорилироваться.

Присоединение инсулина в центр связывания, образованный а-субъединицами, вызывает кооперативные конформационные изменения рецептора. β-Субъединицы проявляют тирозинкиназную активность и катализируют трансаутофосфорилирование (первая β-субъединица фосфорилирует вторую β-субъединицу, и наоборот) по нескольким остаткам тирозина. Фосфорилирование приводит к изменению заряда, конформации и субстратной специфичности фермента (Тир-ПК). Тирозиновая-ПК фосфорилирует определенные клеточные белки, которые получили название субстратов рецептора инсулина. В свою очередь эти белки участвуют в активации каскада реакций фосфорилирования:

фосфопротеинфосфатазы (ФПФ), которая дефосфорилирует специфические фосфопротеины;

фосфодиэстеразы, которая превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ;

ГЛЮТ 4 - переносчиков глюкозы в инсулинзависимых тканях, поэтому повышается поступление глюкозы в клетки мышц и жировой ткани;

тирозиновой протеинфосфатазы, которая дефосфорилирует β-субъединицы рецептора инсулина;

регуляторных белков ядра, факторов транскрипции, повышающих или снижающих экспрессию генов определенных ферментов.

Реализация эффекта ростовых факторов может осуществляться с помощью каталитических рецепторов, которые состоят из одной полипептидной цепи, но при связывании первичного мессенджера образуют димеры. Все рецепторы этого типа имеют внеклеточный гликозилированный домен, трансмембранный (а-спираль) и цитоплазматический домен, способный при активации проявлять протеинкиназную активность.

Димеризация способствует активации их каталитических внутриклеточных доменов, которые осуществляют трансаутофосфорилирование по аминокислотным остаткам серина, треонина или тирозина. Присоединение фосфорных остатков приводит к формированию у рецептора центров связывания для специфических цитозольных белков и активации протеинкиназного каскада передачи сигнала (рис. 4.16).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров (ростовых факторов) при участии Ras- и Raf-белков.

Связывание рецептора (R) с фактором роста (ФР) приводит к его димеризации и трансаутофосфорилированию. Фосфорилированный рецептор приобретает сродство к Grb2-белку. Образованный комплекс ФР*R*Grb2 взаимодействует с цитозольным белком SOS. Изменение конформации SOS

обеспечивает его взаимодействие с заякоренным белком мембраны Ras-ГДФ. Образование комплекса ФР?R?Gгb2?SOS?Ras-ГДФ снижает сродство Ras- белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ.

Замена ГДФ на ГТФ изменяет конформацию Ras-белка, который отделяется от комплекса и взаимодействует с Raf-белком в примембранной области. Комплекс Ras-ГТФ?Raf проявляет протеинкиназную активность и фосфорилирует фермент МЕК-киназу. Активированная МЕК-киназа в свою очередь фосфорилирует МАП-киназу по треонину и тирозину.

Рис.4.16. МАП-киназный каскад.

Рецепторы такого типа имеют эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста нервов (ФРН) и другие ростовые факторы.

Grb2 - протеин, взаимодействующий с рецептором ростового фактора (growth receptor binding protein); SOS (GEF) - ГДФ-ГТФ обменный фактор (guanine nucleotide exchange factor); Ras - G-белок (гуанидинтрифосфатаза); Raf-киназа - в активной форме - фосфорилирующая МЕК-киназу; МЕК-киназа - киназа МАП-киназы; МАП-киназа - митогенактивированная протеинкиназа (mitogen-aktivated protein kinase)

Присоединение группы -РО 3 2- к аминокислотным радикалам МАП-киназы изменяет ее заряд, конформацию и активность. Фермент фосфорилирует по серину и треонину специфические белки мембран, цитозоля и ядра.

Изменение активности этих белков оказывает влияние на скорость метаболических процессов, функционирование мембранных транслоказ, митотическую активность клеток-мишеней.

Рецепторы с гуанилатциклазной активностью также относятся к каталитическим рецепторам. Гуанилатциклаза катализирует образование из ГТФ цГМФ, который является одним из важных мессенджеров (посредников) внутриклеточной передачи сигнала (рис. 4.17).

Рис. 4.17. Регуляция активности мембранной гуанилатциклазы.

Мембранно-связанная гуанилатциклаза (ГЦ) - трансмембранный гликопротеин. Центр связывания сигнальной молекулы находится на внеклеточном домене, внутриклеточный домен гуанилатциклазы в результате активации проявляет каталитическую активность

Присоединение первичного мессенджера к рецептору активирует гуанилатциклазу, которая катализирует превращение ГТФ в циклический гуанозин-3",5"-монофосфат (цГМФ) - вторичный мессенджер. В клетке повышается концентрация цГМФ. Молекулы цГМФ могут обратимо присоединяться к регуляторным центрам протеинкиназы G (ПКЧ5), которая состоит из двух субъединиц. Четыре молекулы цГМФ изменяют конформацию и активность фермента. Активная протеинкиназа G катализирует фосфорилирование определенных белков и ферментов цитозоля клетки. Одним из первичных мессенджеров протеинкиназы G является предсердный натриуретический фактор (ПНФ), регулирующий гомеостаз жидкости в организме.

6. Передача сигнала с помощью внутриклеточных рецепторов. Гидрофобные по химической природе гормоны (стероидные гормоны и тироксин) могут диффундировать через мембраны, поэтому их рецепторы находятся в цитозоле или ядре клетки.

Цитозольные рецепторы связаны с белком-шапероном, который предотвращает преждевременную активацию рецептора. Ядерные и цитозольные рецепторы стероидных и тиреоидных гормонов содержат ДНКсвязывающий домен, обеспечивающий в ядре взаимодействие комплекса гормон-рецептор с регуляторными участками ДНК и изменение скорости транскрипции.

Последовательность событий, приводящих к изменению скорости транскрипции

Гормон проходит через двойной липидный слой клеточной мембраны. В цитозоле или ядре гормон взаимодействует с рецептором. Комплекс гормон-рецептор проходит в ядро и присоединяется к регуляторной нуклеотидной последовательности ДНК - энхансеру (рис. 4.18) или сайленсеру. Доступность промотора для РНК-полимеразы увеличивается при взаимодействии с энхансером или уменьшается при взаимодействии с сайленсером. Соответственно увеличивается или уменьшается скорость транскрипции определенных структурных генов. Зрелые мРНК выходят из ядра. Увеличивается или уменьшается скорость трансляции определенных белков. Изменяется количество белков, которые влияют на метаболизм и функциональное состояние клетки.

В каждой клетке существуют рецепторы, включенные в состав разных сигнал-трансдукторных систем, преобразующих все внешние сигналы во внутриклеточные. Число рецепторов для конкретного первичного мессенджера может варьировать в пределах от 500 до более 100 000 на клетку. Они располагаются на мембране отдаленно друг от друга либо сосредоточены в определенных ее участках.

Рис. 4.18. Передача сигнала на внутриклеточные рецепторы

б) из таблицы выберите липиды, участвующие в:

1. Активации протеинкиназы С

2. Реакции образования ДАГ под действием фосфолипазы С

3. Формировании миелиновых оболочек нервных волокон

в) напишите реакцию гидролиза липида, выбранного вами в п. 2;

г) укажите, какой из продуктов гидролиза участвует в регуляции Са 2 +-канала эндоплазматического ретикулума.

2. Выберите правильные ответы.

На конформационную лабильность белков-переносчиков может влиять:

Б. Изменение электрического потенциала на мембране

B. Присоединение специфических молекул Г. Жирнокислотный состав липидов бислоя Д. Количество переносимого вещества

3. Установите соответствие:

A. Кальциевый канал ЭР Б. Са 2 +-АТФаза

Г. Ка+-зависимый переносчик Са 2 + Д. N+, К+-АТФаза

1. Переносит Na+ по градиенту концентрации

2. Функционирует по механизму облегченной диффузии

3. Переносит Na+ против градиента концентрации

4. Перенесите табл. 4.2. в тетрадь и заполните ее.

Таблица 4.2. Аденилатциклазная и инозитолфосфатная системы

Строение и этапы функционирования	Аденилатциклазная система	Инозитолфосфатная система
Пример первичного мессенджера системы
Интегральный белок клеточной мембраны, взаимодействующий комплементарно с первичным мессенджером
Белок, активирующий фермент сигнальной системы
Фермент системы, образующий вторичный (е) мессенджер (ы)
Вторичный (ые) мессенджер (-ы) системы
Цитозольный (е) фермент (ы) системы, взаимодействующий (е) с вторичным мессенджером
Механизм регуляции (в данной системе) активности ферментов метаболических путей
Механизмы снижения концентрации вторичных мессенджеров в клетке-мишени
Причина снижения активности мембранного фермента сигнальной системы

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Установите соответствие:

A. Пассивный симпорт Б. Пассивный антипорт

B. Эндоцитоз Г. Экзоцитоз

Д. Первично-активный транспорт

1. Транспорт вещества в клетку происходит вместе с частью плазматической мембраны

2. Одновременно в клетку по градиенту концентрации проходят два разных вещества

3. Перенос веществ идет против градиента концентрации

2. Выберите правильный ответ.

ag -Субъединица G-белка, связанная с ГТФ, активирует:

A. Рецептор

Б. Протеинкиназу А

B. Фосфодиэстеразу Г. Аденилатциклазу Д. Протеинкиназу С

3. Установите соответствие.

Функция:

A. Регулирует активность каталитического рецептора Б. Активирует фосфолипазу С

B. Переводит в активную форму протеинкиназу А

Г. Повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле клетки Д. Активирует протеинкиназу С

Вторичный мессенджер:

4. Установите соответствие.

Функционирование:

A. Способен к латеральной диффузии в бислое мембраны

Б. В комплексе с первичным мессенджером присоединяется к энхансеру

B. Проявляет ферментативную активность при взаимодействии с первичным мессенджером

Г. Может взаимодействовать с G-белком

Д. В процессе передачи сигнала взаимодействует с фосфолипазой С Рецептор:

1. Инсулина

2. Адреналина

3. Стероидного гормона

5. Выполните «цепное» задание:

а) пептидные гормоны взаимодействуют с рецепторами:

A. В цитозоле клетки

Б. Интегральными белками мембран клеток-мишеней

B. В ядре клетки

Г. Ковалентно связанными с ФИФ 2

б) взаимодействие такого рецептора с гормоном вызывает повышение концентрации в клетке:

A. Гормона

Б. Промежуточных метаболитов

B. Вторичных мессенджеров Г. Ядерных белков

в) этими молекулами могут быть:

A. ТАГ Б. ГТФ

B. ФИФ 2 Г. цАМФ

г) они активируют:

A. Аденилатциклазу

Б. Са 2+ -зависимый кальмодулин

B. Протеинкиназу А Г. Фосфолипазу С

д) этот фермент изменяет скорость метаболических процессов в клетке путем:

A. Повышения концентрации Са 2 + в цитозоле Б. Фосфорилирования регуляторных ферментов

B. Активации протенфосфатазы

Г. Изменения экспрессии генов регуляторных белков

6. Выполните «цепное» задание:

а) присоединение фактора роста (ФР) к рецептору (R) приводит к:

A. Изменению локализации комплекса ФР-R

Б. Димеризации и трансаутофосфорилированию рецептора

B. Изменению конформации рецептора и присоединению к Gs-белку Г. Перемещению комплекса ФР-R

б) такие изменения в структуре рецептора увеличивают его сродство к поверхностному белку мембраны:

Б. Raf Г. Grb2

в) это взаимодействие повышает вероятность присоединения к комплексу цитозольного белка:

А. Кальмодулина B. Ras

Б. ПКС Г. SOS

г) который увеличивает комплементарность комплекса к «заякоренному» белку:

д) изменение конформации «заякоренного» белка снижает его сродство к:

А. цАМФ B. ГТФ

Б. ГДФ Г. АТФ

е) это вещество заменяется на:

А. ГДФ B. АМФ

Б. цГМФ Г. ГТФ

ж) присоединение нуклеотида способствует взаимодействию «заякоренного» белка с:

А. ПКА B. Кальмодулином

з) этот белок входит в состав комплекса, который фосфорилирует:

А. МЕК-киназу В. Протеинкиназу С

Б. Протеинкиназу А Г. МАП-киназу

и) этот фермент в свою очередь активирует:

А. МЕК-киназу В. Протеинкиназу G

Б. Raf-белок Г. МАП-киназу

к) фосфорилирование белка повышает его сродство к:

А. Белкам SOS и Raf В. Регуляторным белкам ядра Б. Кальмодулину Г. Ядерным рецепторам

л) активация этих белков приводит к:

A. Дефосфорилированию ГТФ в активном центре белка Ras Б. Снижению сродства рецептора к фактору роста

B. Повышению скорости матричных биосинтезов Г. Диссоциации комплекса SOS-Grb2

м) вследствие этого:

A. Белок SOS отделяется от рецептора

Б. Происходит диссоциация протомеров рецептора (R)

B. Ras-белок отделяется от Raf-белка

Г. Возрастает пролиферативная активность клетки-мишени.

ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ К «ЗАДАНИЯМ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ»

1. 1-В, 2-А, 3-Д

3. 1-В, 2-Д, 3-Г

4. 1-В, 2-Г, 3-Б

5. а) Б, б) В, в) Г, г) В, д) Б

6. а) Б, б) Г, в) Г, г) А, д) Б, е) Г, ж) Г, з) А, и) Г, к) В, л) В, м) Г

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

1. Структура и функции мембран

2. Транспорт веществ через мембраны

3. Особенности строения белков мембран

4. Трансмембранные системы передачи сигналов (аденилатциклазная, инозитолфосфатная, гуанилатциклазная, каталитические и внутриклеточные рецепторы)

5. Первичные мессенджеры

6. Вторичные мессенджеры (посредники)

ЗАДАНИЯ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомьтесь с рис. 4.19 и выполните следующие задания:

а) назовите вид транспорта;

б) установите порядок событий:

A. Cl - по градиенту концентрации выходит из клетки

Б. Протеинкиназа А фосфорилирует R-субъединицу канала

B. Изменяется конформация R-субъединицы

Г. Происходят кооперативные конформационные изменения мембранного белка

Д. Активируется аденилатциклазная система

Рис. 4.19. Функционирование С1 - -канала эндотелия кишечника.

R - регуляторный белок, который переходит в фосфорилированную форму под действием протеинкиназы А (ПКА)

в) сравните функционирование Са 2+ -канала мембраны эндоплазматического ретикулума и Cl - -канала клетки эндотелия кишечника, заполнив табл. 4.3.

Таблица 4.3. Способы регуляции функционирования каналов

Решите задачи

1. Сокращение сердечной мышцы активирует Са 2 +, содержание которого в цитозоле клетки повышается за счет функционирования цАМФ-зависимых переносчиков цитоплазматической мембраны. В свою очередь, концентрация цАМФ в клетках регулируется двумя сигнальными молекулами - адреналином и ацетилхолином. Причем известно, что адреналин, взаимодействуя с β 2 -адренорецепторами, повышает концентрацию цАМФ в клетках миокарда и стимулирует сердечный выброс, а ацетилхолин, взаимодействуя с М 2 -холинорецепторами, снижает уровень цАМФ и сократимость миокарда. Объясните, почему два первичных мессенджера, используя одну и ту же систему трансдукции сигнала, вызывают различный клеточный ответ. Для этого:

а) представьте схему передачи сигнала для адреналина и ацетилхолина;

б) укажите различие в каскадах передачи сигналов этих мессенджеров.

2. Ацетилхолин, взаимодействуя с М 3 -холинорецепторами слюнных желез, стимулирует выход Са 2+ из ЭР. Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле обеспечивает экзоцитоз секреторных гранул и высвобождение в слюнной проток электролитов и небольшого количества белков. Объясните, как регулируется работа Са 2+ -каналов ЭР. Для этого:

а) назовите вторичный мессенджер, обеспечивающий открытие Са 2+ -каналов ЭР;

б) напишите реакцию образования вторичного мессенджера;

в) представьте схему трансмембранной передачи сигнала ацетилхолина, в ходе активации которой образуется регуляторный лиганд Са 2+ -кана-

3. Исследователи рецептора инсулина установили значительное изменение в гене белка - одного из субстратов инсулинового рецептора. Как нарушение в структуре этого белка скажется на функционировании системы передачи сигнала инсулина? Для ответа на вопрос:

а) приведите схему трансмембранной передачи сигнала инсулина;

б) назовите белки и ферменты, которые активирует инсулин в клеткахмишенях, укажите их функцию.

4. Белок Ras является «заякоренным» белком цитоплазматической мембраны. Функцию «якоря» выполняет 15-углеродный остаток фарнезила Н 3 С-(СН 3)С=СН-СН 2 -[СН 2 -(СН 3)С=СН-СН 2 ] 2 -, который присоединяется к белку ферментом фарнезилтрансферазой в ходе посттрансляционной модификации. В настоящее время ингибиторы этого фермента проходят клинические испытания.

Почему использование этих препаратов приводит к нарушению трансдукции сигнала ростовых факторов? Для ответа:

а) представьте схему передачи сигнала с участием Ras-белков;

б) объясните функцию Ras-белков и последствия нарушения их ацилирования;

в) предположите, для лечения каких заболеваний были разработаны эти препараты.

5. Стероидный гормон кальцитриол активирует всасывание пищевого кальция, увеличивая количество белков-переносчиков Са 2+ в клетках кишечника. Объясните механизм действия кальцитриола. Для этого:

а) приведите общую схему передачи сигнала стероидных гормонов и опишите ее функционирование;

б) назовите процесс, который активирует гормон в ядре клетки-мишени;

в) укажите, в каком матричном биосинтезе будут участвовать молекулы, синтезированные в ядре, и где он протекает.

Ответ клетки-мишени на действие гормона формируется созданием гормонрецепторного (ГР) комплекса, что приводит к активации самого рецептора, инициации ответа клетки. Гормон адреналин при взаимодействии с рецептором открывает мебранная каналы, a Na + - входной ионный ток обусловливает функцию клетки. Однако большинство гормонов открывают или закрывают мембранные каналы не самостоятельно, а во взаимодействии с G-белком.

Механизм действия гормонов на клетки-мишени связан с их химическим строением:

■ водорастворимые гормоны - белки и полипептиды, а также производные аминокислоты - катехоламины, взаимодействуют с рецепторами мембраны клетки-мишени, образуя комплекс «гормон - рецептор" (ГР). Возникновение этого комплекса приводит к образованию вторичного или внутриклеточного посредника (мессенджера), с которым связаны изменения функции клетки. Количество рецепторов на поверхности мембраны клетки-мишени составляет примерно 104-105;

■ жирорастворимые гормоны - стероидные - проходят сквозь мембрану клетки-мишени и взаимодействуют с плазматическими рецепторами, количество которых колеблется от 3000 до 104, образуя комплекс ГР, который далее поступает к мембране ядра. Стероидные гормоны и производные аминокислоты тирозина - тироксин и трийодтиронин - проникают через ядерную мембрану и взаимодействуют с ядерными рецепторами, соединенными с одной или более хромосом, следствием чего являются изменения синтеза белка в клетке-мишени.

Согласно современным представлениям, действие гормонов обусловлена стимуляцией или угнетением каталитической функции некоторых ферментов в клетках-мишенях. Этот эффект может достигаться двумя путями:

■ взаимодействием гормона с рецепторами поверхности клеточной мембраны и запуска цепи биохимических превращений в мембране и цитоплазме;

■ проникновением гормона через мембрану и связывания с рецепторами цитоплазмы, после чего гормонрецепторний комплекс проникает в ядро и органеллы клетки, где и реализует свой регуляторный эффект путем синтеза новых ферментов.

Первый путь приводит к активации мембранных ферментов и образования вторичных мессенджеров. На сегодня известно четыре системы вторичных мессенджеров:

■ аденилатциклаза - цАМФ;

■ гуанилатциклаза - цГМФ;

■ фосфолипаза - инозитолтрифосфат;

■ кальмодулин - ионизированный Са 2+.

Второй путь влияния на клетки-мишени - комплексирования гормона с рецепторами, которые содержатся в ядре клетки, ведет к активации или торможения ее генетического аппарата.

Мембранные рецепторы и вторичные посредники (мессенджеры)

Гормоны, связываясь с рецепторами мембраны клетки-мишени, образуют комплекс "гормон - рецептор" ГР (шаг 1) (рис. 6.3). Конформационные изменения рецептора активируют стимулирующий G-белок (объединенный с рецептором), который представляет собой комплекс из трех субъединиц (α-, β-, γ-) и гуанозиндифосфат (ГДФ). замена

ТАБЛИЦА 6.11. Краткая характеристика гормонов

Где продуцируются гормоны		Название гормона		сокращенное название	Влияния на клетки-мишени
гипоталамус		Тиреотропин-рилизинг-гормон			Стимулирует продукцию аденогипофизом тиреотропину
гипоталамус		Кортикотропин-рилизинг-гормон			Стимулирует продукцию аденогипофизом АКТГ
гипоталамус		Гонадотропин-рилизинг-гормон			Стимулирует продукцию аденогипофизом лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСП гормонов
гипоталамус		Рилизинг-фактор гормона роста			Стимулирует продукцию аденогипофизом соматотропина - гормона роста
гипоталамус		соматостатин			Подавляет продукцию аденогипофизом гормона роста
гипоталамус		Пролактин-ингибирующий фактор (допамин)			Подавляет продукцию аденогипофизом пролактина
гипоталамус		Пролактинстимулюючий фактор			Стимулирует продукцию аденогипофизом пролактина
гипоталамус		окситоцин			Стимулирует выделение молока, сокращение матки
гипоталамус		Вазопрессин - антидиуретический гормон			Стимулирует реабсорбцию воды в дистальном отделе нефрона
Передняя доля гипофиза		ТТГ, или тиреостимулирующие гормон		ТТГ абоТСГ	Стимулирует синтез и секрецию щитовидной железой тироксина, трийодтиронина
Передняя доля гипофиза					Стимулирует секрецию корой надпочечников глюкокортикоидов (кортизола)
Передняя доля гипофиза		фолликулостимулирующий гормон			Стимулирует рост фолликулов и секрецию эстрогенов яичниками
Передняя доля гипофиза		лютеинизирующий гормон			Стимулирует овуляцию, образование желтого тела, а также синтез эстрогенов и прогестерона яичниками
Передняя доля гипофиза		Гормон роста, или соматотропный гормон			Стимулирует синтез белка и рост в целом
Передняя доля гипофиза		пролактин			Стимулирует продукцию и секрецию молока
Передняя доля гипофиза		β-липотропин
Промежуточная доля гипофиза		Мелзнотропин			Стимулирует синтез меланина у рыб, амфибий, рептилий (у людей стимулирует рост скелета (оссификация костей), увеличивает интенсивность метаболизма, теплопродукции, увеличивает утилизацию клетками белков, жиров, углеводов, стимулирует становление умственных функций после рождения ребенка
щитовидная железа		L-тироксин
		трийодтиронин
Кора надпочечников (сетчатая зона)		половые гормоны			Стимулируют продукцию дигидрогепиандростерону и андростендиона
Кора надпочечников (пучковая зона)		Глюкокортикоидов (кортизол)			Стимулирует глюконеогенез, противовоспалительное действие, подавляет иммунную систему
Кора надпочечников (клубочковая зона)		альдостерон			Увеличивает реабсорбцию ионов Na +, секрецию ионов К + в канальцах нефрона
мозговая вещество надпочечников		Адреналин, норадреналин			Активация альфа-, бета-адренорецепторов
		эстрогены			Рост и развитие женских половых органов, пролиферативная фаза менструального цикла
		прогестерон			Секреторная фаза менструального цикла
		тестостерон			Сперматогенез, вторичные половые мужские признаки
Пара щитовидные железы		Парат гормон (паратиреоидний гормон)			Увеличивает концентрацию ионов Са 2+ в крови (деминерализация костей)
Щитовидная железа (С-клетки)	кальцитонин					Уменьшает концентрацию ионов Ca2 + в крови
Активация в почках	1,25-дигидроксихолекальциферол (кальцитриол)					Увеличивает всасывание в кишечнике ионов Са 2+
Поджелудочная железа - бета-клетки						Уменьшает концентрацию глюкозы в крови
Поджелудочная железа - альфа-клетки	глюкагон					Увеличивает концентрацию глюкозы в крови
плацента	Хориональний гонадотропин человека					Увеличивает синтез эстрогена и прогестерона
плацента	Плацентарный лактоген человека					Действует подобно гормона роста и пролактина во время беременности

РИС. 6.3. Схема механизма действия гормона с образованием вторичного внутриклеточного посредника цАМФ. ГДФ - гуаниндифосфат, ГТФ - гуанинтрифосфат

ГДФ на гуанозинтрифосфат ГТФ (шаг 2) приводит к отрыву α-субъединицы, которая тут же взаимодействует с другими сигнальными белками, изменяя активность ионных каналов или клеточных ферментов - аденилатциклазы или фосфолипазы С - и функцию клетки.

Действие гормонов на клетки-мишени с образованием вторичного посредника цАМФ

Активированный мембранный фермент аденилатциклаза превращает АТФ на вторичный посредник - циклического аденозинмонофосфата цАМФ (шаг 3) (см. Рис. 6.3), который в свою очередь активирует фермент протеин киназу А (шаг 4), что приводит к фосфорилирования специфических белков (шаг 5) , следствием чего является изменение физиологической функции (шаг 6), например, образование новых мембранных каналов для ионов кальция, что приводит к росту силы сердечных сокращений.

Вторичный посредник цАМФ распадается под воздействием фермента фосфодиэстеразы в неактивной формы 5"-АМФ.

Некоторые гормоны (натрийуретический) взаимодействуют с тормозными G-белками, что приводит к снижению активности мембранных ферментов аденилатциклазы, уменьшение функции клетки.

Действие гормонов на клетки-мишени с образованием вторичных посредников - диацилглицеролу и инозитол-3-фосфат

Гормон образует комплекс с рецептором мембраны - ОС (шаг 1) (рис. 6.4) и через G-белок (шаг 2) активирует фосфолипазу С, прикрепленную к внутренней поверхности рецептора (шаг 3).

Под влиянием фосфолипазы С, которая гидролизует мембранные фосфолипиды (фосфатидилинозитолбифосфат), образуются два вторичных посредников - диацилглицерол (ДГ) и инозитол-3-фосфат (ИФ3) (шаг 4).

Вторичный посредник ИФ3 мобилизует выход ионов Са 2+ из митохондрий и эндоплазматического ретикулума (шаг 5), которые ведут себя как вторичные посредники. Ионы Ca2 + вместе с ДГ (липидный вторичный посредник) активируют фермент протеинкиназа С (шаг 6), которая фосфорилирует белки и вызывает изменение физиологических функций клетки-мишени.

Действие гормонов с помощью систем "кальций - кальмодулин", который выступает в роли вторичного посредника. Кальций при проникновении в клетку связывается с кальмодулином и активирует его. Активированный кальмодулин, в свою очередь, повышает активность протеинкиназы, которая приводит к фосфорилирования белков, изменения функций клетки.

Действие гормонов на генетический аппарат клетки

Жирорастворимые стероидные гормоны проходят сквозь мембрану клетки-мишени (шаг 1) (рис. 6.5), где связываются с белками-рецепторами цитоплазмы. Образованный комплекс ГР (шаг 2) диффундирует в ядро и связывается со специфическими участками ДНК хромосомы (шаг 3), активируя процесс транскрипции путем образования мРНК (шаг 4). мРНК переносит матрицу в цитоплазму, где обеспечивает процессы трансляции на рибосомах (шаг 5), синтез новых белков (шаг 6), что приводит к изменению физиологических функций.

Жирорастворимые тиреоидные гормоны - тироксин и трийодтиронин - проникают в ядро, где связывается с белком-рецептором, который представляет собой протеины, которые находятся на хромосомах ДНК. Эти рецепторы контролируют функцию как промоутеров, так и операторов генов.

Гормоны активируют генетические механизмы, которые находятся в ядре, благодаря чему производится более 100 типов клеточных белков. Многие из них являются ферментами, которые повышают метаболическую активность клеток организма. Однократно прореагировав с внутриклеточными рецепторами, тиреоидные гормоны обеспечивают контроль экспрессии гена на несколько недель.

Рис. 3. Схема стимулирования распада гликогена повышением уровня цАМФ

Цитоскелет сигнализирует

Регулируемая цАМФ каскадная схема взаимодействий ферментов кажется непростой, а в действительности устроена еще более сложно. В частности, связавшиеся с первичными мессенджерами рецепторы оказывают влияние на активность аденилатциклазы не непосредственно, а через так называемые G-белки (рис. 4), работающие под контролем гуанинтрифосфорной кислоты (ГТФ).

А что происходит, когда почему-либо нарушается нормальная связь событий? Примером может быть заболевание холерой. Токсин холерного вибриона оказывает воздействие на уровень ГТФ и влияет на активность G-белков. В результате уровень цАМФ в клетках кишечника больных холерой оказывается постоянно высоким, что вызывает переход больших количеств ионов натрия и воды из клеток в просвет кишечника. Следствие этого – изнуряющие поносы и потеря воды организмом.

В норме под воздействием фермента фосфодиэстеразы цАМФ в клетке быстро инактивируется, превращаясь в нециклический аденозинмонофосфат АМФ. Течение другого заболевания – коклюша, вызываемого бактериями Bordetella pertussis, сопровождается образованием токсина, который тормозит превращение цАМФ в АМФ. Отсюда возникают и неприятные симптомы болезни – покраснение горла и доходящий до рвоты кашель.

На активность фосфодиэстеразы, превращающей цАМФ в АМФ, влияют, например, кофеин и теофиллин, что обуславливает стимулирующее действие кофе и чая.

Многообразие эффектов цАМФ и способов регуляции его концентрации в клетках делает его универсальным вторичным мессенджером, играющим ключевую роль в активации различных протеинкиназ.

В разных клетках цАМФ может приводить к совершенно различным эффектам. Это соединение не только принимает участие в распаде гликогена и жиров, но также увеличивает частоту сердечных сокращений, влияет на расслабление мускулатуры, контролирует интенсивность секреции и скорость поглощения жидкостей. Оно является вторичным мессенджером для целого спектра различных гормонов: адреналина, вазопрессина, глюкагона, серотонина, простогландина, тироид-стимулирующего гормона; цАМФ работает в клетках скелетной мускулатуры, сердечной мышцы, в гладких мышцах, почках, печени, в тромбоцитах.

Резонно возникает вопрос: почему же различные клетки реагируют на цАМФ по разному? Можно сформулировать его и иначе: почему при повышении концентрации цАМФ в разных клетках активируются различные протеинкиназы, которые фосфорилируют разные белки? Эту ситуацию можно проиллюстрировать с помощью такой аналогии. Представьте себе, что к двери офиса постоянно подходят различные визитеры – лиганды и первичные мессенджеры. При этом они звонят в один-единственный звонок: раздается сигнал – вторичный мессенджер. Как при этом служащим заведения определить, кто именно пожаловал с визитом и как надо реагировать на данного посетителя?

Загадка ионов кальция

Рассмотрим сначала, что происходит со вторым чрезвычайно распространенным вторичным мессенджером – кальцием, вернее его ионами. Впервые их ключевая роль в ряде биологических реакций была показана еще в 1883 г. когда Сидней Рингер заметил, что изолированные мышцы лягушки не сокращаются в дистиллированной воде. Чтобы в ответ на электрическую стимуляцию мышца сократилась, ей необходимо присутствие в окружающей ее среде ионов кальция.

Теперь последовательность основных событий, происходящих при сокращении скелетной мускулатуры, хорошо известна (рис. 5). В ответ на электрический импульс, который доходит до мышцы по аксону нервной клетки, внутри мышечной клетки – миофибриллы – открываются резервуары ионов кальция – мембранные цистерны, в которых концентрация ионов кальция может быть выше, чем в цитоплазме, в тысячу и более раз (рис. 6). Высвободившийся кальций соединяется с белком тропонином С, который связан с выстилающими внутреннюю поверхность клетки актиновыми филаментами. Тропонин (рис. 7) играет роль блокатора, препятствующего скольжению миозиновых нитей по актиновым филаментам. В результате присоединения кальция к тропонину блок отсоединяется от нити, миозин скользит по актину, и мышца сокращается (рис. 8). Как только акт сокращения заканчивается, специальные белки – кальциевые АТФазы – закачивают ионы кальция обратно во внутриклеточные резервуары.

На концентрацию внутриклеточного кальция оказывают влияние не только нервные импульсы, но и другие сигналы. Например, это может быть уже знакомый нам цАМФ. В ответ на появление адреналина в крови и соответствующее повышение концентрации цАМФ в клетках сердечной мышцы в них высвобождаются ионы кальция, что приводит к учащению сердцебиения.

Вещества, оказывающие влияние на кальций, могут содержаться также непосредственно в клеточной мембране. Как известно, мембрана состоит из фосфолипидов, среди которых один – фосфоинозитол-4, 5-дифосфат – играет особую роль. Помимо инозита молекула фосфоинозитол-4, 5-дифосфата содержит две длинные углеводородные цепи, состоящие из 20 и 17 атомов углерода (рис. 9). Под воздействием определенных внеклеточных сигналов и под контролем уже знакомых читателям G-белков они отсоединяются, в результате чего образуются две молекулы – диацилглицерин и инозитолтрифосфат. Последний участвует в высвобождении внутриклеточного кальция (рис. 10). Такого рода сигнализация используется, например, в оплодотворенной икре шпорцевой лягушки.

Проникновение первого же из множества спермиев в готовую для оплодотворения икринку вызывает образование в ее мембране инозитолтрифосфата. В результате ионы кальция высвобождаются из внутренних резервуаров и оболочка оплодотворенной яйцеклетки мгновенно разбухает, отсекая путь внутрь яйцеклетки менее удачливым или менее расторопным сперматозоидам.

Как же такое простое вещество, как ион кальция, может регулировать активность белков? Выяснилось, что он связывается внутри клетки со специальным белком кальмодулином (рис. 11). Этот достаточно крупный белок, состоящий из 148 аминокислотных остатков, как и цАМФ, обнаружен практически во всех изученных клетках.