ELISA (fermentinis imunosorbento tyrimas, ELISA) į praktinės medicinos gyvenimą įžengė kažkur praėjusio amžiaus 60-aisiais. Pradinė jo užduotis buvo histologiniai tyrimai moksliniais tikslais, kurie prilygo gyvo organizmo ląstelių antigeninės struktūros paieškai ir identifikavimui.
ELISA metodas pagrįstas specifinių (AT) ir susijusių antigenų (AG) sąveika su „antigeno-antikūno“ komplekso susidarymu, kuris aptinkamas naudojant fermentą. Šis faktas paskatino mokslininkus galvoti, kad šis metodas gali būti naudojamas diagnostikos tikslais, siekiant nustatyti specifinius įvairių klasių imunoglobulinus, susijusius su imuniniu atsaku į tam tikrą infekciją. Ir tai buvo proveržis klinikinėje laboratorinėje diagnostikoje!
Metodas buvo pradėtas aktyviai naudoti tik devintojo dešimtmečio pradžioje, o vėliau daugiausia specializuotose įstaigose. Pirmuosiuose imunofermentų analizatoriuose buvo įrengti kraujo perpylimo centrai ir stotys, infekcinių ligų ir venerologijos ligoninės, nes mūsų horizonte pasirodė didžiulis AIDS, gimęs Afrikos žemyne ir iškart prisijungė prie „senųjų“ infekcijų, reikalavo neatidėliotinų diagnostinių priemonių ir paieškos. dėl jį veikiančių gydomųjų vaistų.
ELISA metodo taikymo sritis
Fermentinio imunologinio tyrimo galimybės yra tikrai plačios. Dabar sunku įsivaizduoti, kaip apsieiti be tokių tyrimų, kurie naudojami pažodžiui visose medicinos srityse. Atrodo, ką ELISA gali padaryti onkologijoje? Pasirodo, gali. Ir daug. Analizės gebėjimas rasti žymenis, būdingus tam tikroms piktybinių navikų rūšims, yra pagrindas anksti aptikti naviką, kai dėl mažo dydžio jis dar nėra aptiktas jokiu kitu būdu.
Šiuolaikinė klinikinė laboratorinė diagnostika (CDL), be navikų žymenų, turi nemažą ELISA panelių arsenalą ir jomis diagnozuoja įvairias patologines būkles (infekcinius procesus, hormoninius sutrikimus) bei stebi farmacinius vaistus, siekiant nustatyti jų poveikį paciento organizmui. ir, beje, ne tik žmogus. Šiuo metu fermentinis imunologinis tyrimas plačiai naudojamas veterinarijos tarnybose, nes „mūsų mažieji broliai“ taip pat yra jautrūs daugeliui ligų, nuo kurių kartais labai kenčia.
Taigi, ELISA dėl savo jautrumo ir specifiškumo iš kraujo mėginio, paimto iš venos, gali nustatyti:
- Hormoninė būklė (skydliaukės ir antinksčių hormonai, lytiniai hormonai);
- Virusinių ir bakterinių infekcijų buvimas (ŽIV, B ir C, chlamidijos, sifilis ir daugelis kitų ligų, kurias sukelia patogeniniai mikroorganizmai);
- Mikroorganizmų gyvybinės veiklos pėdsakai, kurie inicijavo infekcinį procesą, kuris baigėsi sėkmingai ir perėjo į imuninio atsako į šį sukėlėją formavimosi stadiją. Tokie pėdsakai, tai yra antikūnai, daugeliu atvejų lieka cirkuliuoti kraujyje visą gyvenimą, taip apsaugodami žmogų nuo pakartotinio užsikrėtimo.
Kokia ELISA esmė?
Fermentinio imunologinio tyrimo metodas leidžia nustatyti ne tik paties patogeno buvimą (kokybinė analizė), bet ir kiekybinį jo kiekį paciento kraujo serume.
Viruso ar bakterijų dozė reikšmingai įtakoja infekcinio proceso eigą ir jo baigtį, todėl kiekybinė analizė vaidina svarbų vaidmenį diagnozuojant ir gydant įvairių formų ir stadijų ligas.
Tačiau žinant fermentų imunologinius tyrimus kaip ELISA metodą, net nesusimąstome, kaip jis sugeba aprėpti tokį platų mūsų planetoje gyvenančių mikroorganizmų spektrą, kurių daugelis kelia tiesioginę grėsmę žmonių ir gyvūnų sveikatai bei gyvybei. Tačiau faktas yra tas, kad ELISA turi daugybę galimybių (nekonkurencinių ir konkurencinių – tiesioginių ir netiesioginių), kurių kiekviena išsprendžia savo problemą ir leidžia atlikti tikslinę paiešką.
Vienos ar kitos klasės imunoglobulinams identifikuoti naudojama tradicinė 96 šulinėlių polistireno plokštė (plokštė), kurios duobutėse kietoje fazėje koncentruojami sorbuoti rekombinantiniai baltymai. Antikūnai arba antigenai, patekę į šulinėlį su kraujo serumu, randa „pažįstamą“ objektą ir sudaro su juo kompleksą (AG - AT), kuris, fiksuotas fermento konjugatu, pasireikš duobutės spalvos pasikeitimu, kai skaitydami rezultatus.
Fermentinis imunologinis tyrimas atliekamas naudojant tam tikro specifiškumo testavimo sistemas, pagamintas specialiose laboratorijose ir aprūpintas visais reikalingais reaguojančiais komponentais. Tyrimai gali būti atliekami naudojant skalbimo mašinas („skalbykles“) ir skaitymo spektrofotometrus, kurie dažniausiai apima rankų darbą. Visiškai automatinėse mašinose, kurios atlaisvina laborantą nuo monotoniško lašinimo, plovimo ir kitų įprastų užduočių, žinoma, dirbti greičiau ir patogiau, tačiau ne visos laboratorijos gali sau leisti tokią prabangą ir toliau dirbti senamadiškai. pusiau automatinės mašinos.
ELISA rezultatų interpretavimas priklauso laboratorinės diagnostikos gydytojo kompetencijai, taip pat reikia atsižvelgti į beveik visų imunocheminių reakcijų savybę duoti klaidingai teigiamus arba klaidingai neigiamus atsakymus.
Vaizdo įrašas: šiuolaikinis fermentų imunologinis tyrimas
ELISA rezultatai naudojant sifilio pavyzdį
Fermentinis imunologinis tyrimas tinka visoms formoms nustatyti, ir, be to, naudojamas atrankos tyrimuose. Analizei atlikti naudojamas paciento veninis kraujas, paimtas tuščiu skrandžiu. Darbe naudojamos tam tikro specifiškumo tabletės (AB klasės A, M, G) arba suminiai antikūnai.
Atsižvelgiant į tai, kad sifilio antikūnai gaminami tam tikra seka, ELISA gali lengvai atsakyti į klausimą, kada įvyko infekcija ir kokiame proceso etape, o gautų rezultatų interpretacija gali būti pateikta tokia forma:
- IgM rodo infekcinio proceso trukmę (gali atsirasti paūmėjus lėtinėms uždegiminėms ligoms);
- IgA teigia, kad infekcija įvyko daugiau nei prieš mėnesį;
- IgG rodo, kad infekcija įsibėgėjo arba neseniai buvo atliktas gydymas, o tai nesunku nustatyti surinkus anamnezę.
Atliekant tyrimą dėl sifilio, neigiamos duobutės (ir neigiama kontrolė) išliks bespalvės, o teigiamos duobutės (ir teigiama kontrolė) bus ryškiai geltonos spalvos dėl testo metu pridėto chromogeno spalvos pasikeitimo. Tačiau spalvos intensyvumas ne visada sutampa su kontroliniu, tai yra, jis gali būti šiek tiek blyškesnis arba šiek tiek gelsvas. Tai yra abejotini rezultatai, kurie, kaip taisyklė, turi būti iš naujo išnagrinėti, privalomai atsižvelgiant į kiekybinius rodiklius, gautus spektrofotometru, tačiau apskritai spalva yra tiesiogiai proporcinga imuninių kompleksų (susijusių Ag ir AT) skaičiui. .
Labiausiai įdomus fermentų imunologinis tyrimas yra ŽIV ELISA
Analizė plačiam gyventojų sluoksniui galbūt yra įdomesnė nei kitos, nes dar negalima tvirtai teigti, kad daugelis socialinių problemų išnyko (prostitucija, narkomanija ir kt.). Deja, ŽIV paveikia ne tik šiuos visuomenės sluoksnius, galite užsikrėsti įvairiomis aplinkybėmis, nesusijusiomis su seksualiniu amoralumu ar narkotikų vartojimu. Bet jei reikia atlikti ŽIV testą, nereikėtų bijoti, kad visi aplinkiniai sužinos apie jūsų apsilankymą tokioje laboratorijoje. Dabar ŽIV infekuotus žmones saugo įstatymai, o abejojantys gali kreiptis į anoniminius biurus, kur gali išspręsti problemą nebijodami viešumo ir pasmerkimo.
Fermentinis imunologinis tyrimas, naudojamas ŽIV infekcijai diagnozuoti, yra vienas iš svarbiausių standartinių tyrimų, tačiau tam reikalingos specialios sąlygos, nes tema yra labai subtili.
Tikslinga atlikti ŽIV ELISA tyrimą po lytinių santykių, kraujo perpylimo, kitų medicininių procedūrų, kurios rodo infekciją, ir pasibaigus inkubaciniam periodui („seronegatyvus langas“), tačiau reikia turėti omenyje, kad šis laikotarpis yra nėra pastovus. Jis gali baigtis per 14–30 dienų arba gali trukti iki šešių mėnesių, todėl vidutinė vertė laikoma intervalu nuo 45 iki 90 dienų. Dėl ŽIV kraujas dovanojamas taip pat, kaip ir nuo kitų infekcijų – iš venos tuščiu skrandžiu. Rezultatai bus paruošti priklausomai nuo medžiagos sukaupimo laboratorijoje ir jos darbo krūvio (nuo 2 iki 10 dienų), nors dažniausiai laboratorijos atsakymą pateikia tą pačią arba kitą dieną.
Ko galite tikėtis iš savo ŽIV rezultatų?
ELISA ŽIV infekcijai nustatyti aptinka dviejų tipų viruso antikūnus: ŽIV-1 (dažniau Rusijoje ir kitose Europos bei Azijos šalyse) ir ŽIV-2 (dažniau Vakarų Afrikoje).
ŽIV ELISA užduotis – ieškoti G klasės antikūnų, kurie aptinkami visose tyrimo sistemose, bet vėliau, ir A bei M klasės antikūnų, aptiktų naujos kartos rekombinantinių tyrimų rinkiniuose, kurie leidžia rasti antikūnus. ankstyviausiose stadijose (inkubacinis laikotarpis – „seronegatyvus langas“). Iš ELISA galima tikėtis šių atsakymų:
- Pirminis teigiamas rezultatas: kraujas turi būti pakartotinai tiriamas naudojant tos pačios rūšies, bet, jei įmanoma, kitos serijos tyrimų sistemą ir kitas asmuo (laborantas);
- Pakartotinis (+) apima naują paciento kraujo paėmimą, kurio tyrimas panašus į pirminę analizę;
- Kitas teigiamas rezultatas taikomas etaloninei analizei, kuriai naudojami labai specifiniai testų rinkiniai (2-3 vnt.);
- Teigiamas rezultatas abiejose (ar trijose) sistemose siunčiamas imunoblotuoti (ta pati ELISA, bet atliekama atskirai, naudojant ypač didelio specifiškumo testų rinkinius).
Išvada apie ŽIV infekciją daroma tik remiantis imunoblotingu. Pokalbis su užkrėstu asmeniu vyksta visiškai konfidencialiai. Už medicininių paslapčių atskleidimą Rusijoje, kaip ir kitose šalyse, gresia baudžiamoji atsakomybė.
Ypatingo populiarumo sulaukė ir chlamidijų bei citomegaloviruso tyrimai naudojant fermentinį imunologinį tyrimą, nes jie leidžia nustatyti užsikrėtimo laiką, ligos stadiją ir gydymo priemonių efektyvumą.
Diegimo metu taip pat galima stebėti įvairių klasių antikūnų atsiradimą.įvairiose infekcinės ligos sukėlėjo sukeltos patologinės būklės fazėse:
- IgM galima nustatyti jau praėjus septynioms dienoms po užsikrėtimo;
- IgA rodo, kad infekcija organizme gyvena ilgiau nei mėnesį;
- IgG patvirtina chlamidijos diagnozę ir padeda stebėti gydymą bei nustatyti jo veiksmingumą. Reikėtų pažymėti, kad G klasės antikūnai organizme išlieka ir cirkuliuoja nepriklausomai nuo ligos trukmės, todėl norint teisingai interpretuoti analizę, reikia atsižvelgti į pamatines vertes (normas), kurios, beje, , yra skirtingi kiekvienam CDL: atsižvelgiant į bandymo sistemos prekės ženklą ir į rinkinį įtrauktų reagentų specifiškumą. Normalios vertės įvedamos į formą šalia ELISA rezultato.
Kalbant apie , čia viskas šiek tiek kitaip: M klasės antikūnai atsiranda maždaug po mėnesio iki pusantro, ty teigiamas rezultatas (IgM+) tampa pirminės infekcijos fazėje arba latentinės infekcijos reaktyvacijos metu ir toks išlieka nuo 4 mėnesių iki šešių mėnesių.
G klasės antikūnų buvimas būdingas pirminės ūminės infekcijos ar pakartotinės infekcijos atsiradimui. Analizė teigia, kad virusas yra, tačiau nepateikiama informacija, kurioje stadijoje yra infekcinis procesas. Tuo tarpu normalaus IgG titro nustatymas taip pat sukelia sunkumų, nes tai visiškai priklauso nuo konkretaus žmogaus imuninės būklės, kuri vis dėlto nustatoma identifikuojant G klasės imunoglobulinus, diagnozuojant CMV, reikia įvertinti G klasės antikūnų gebėjimą sąveikauti su CMV, siekiant vėliau jį „neutralizuoti“ (AT avidity). Pradinėje ligos stadijoje IgG labai silpnai jungiasi su viruso antigenais (mažas avidiškumas) ir tik tada pradeda rodyti aktyvumą, todėl galime kalbėti apie antikūnų avidiškumo padidėjimą.
Galime daug kalbėti apie fermentinio imunologinio tyrimo privalumus, nes šiuo metodu pavyko išspręsti daugybę diagnostinių problemų naudojant tik veninį kraują. Nereikia ilgai laukti, nerimauti ir nesklandumų renkant medžiagą tyrimams. Be to, ELISA testų sistemos ir toliau tobulinamos ir jau ne už kalnų diena, kai testas duos 100% patikimą rezultatą.
Vaizdo įrašas: Maskvos valstybinio medicinos universiteto mokomasis filmas. Sechenovą apie ELISA pagrindus
– modernus laboratorinis tyrimas, kurio metu kraujyje ieškoma specifinių antikūnų ar specifinių ligų antigenų, siekiant nustatyti ne tik etiologiją, bet ir ligos stadiją. ELISA rezultatai gali būti pateikti kokybiškai ir kiekybiškai.
Šiuo metu ELISA yra naudojamas šiose situacijose:
1) Ieškoti specifinių antikūnų prieš bet kurią infekcinę ligą;
2) bet kokių ligų (infekcinių, venerologinių) antigenų paieška;
3) paciento hormoninės būklės tyrimas;
4) naviko žymenų tyrimas;
5) tyrimas dėl autoimuninių ligų buvimo.
ELISA metodo pranašumai:
1) Didelis ELISA metodo specifiškumas ir jautrumas (daugiau nei 90%).
2) Gebėjimas nustatyti ligą ir sekti proceso dinamiką, tai yra lyginti antikūnų skaičių skirtingais laikotarpiais.
3) ELISA diagnostikos prieinamumas bet kurioje gydymo įstaigoje.
Santykinis trūkumas:
1) Imuninio atsako (antikūnų), bet ne paties patogeno, nustatymas.
Pagrindinės sąvokos
Prieš išsiaiškindami ELISA metodo esmę, trumpai supraskime kai kurias sąvokas.
Antikūnai (arba imunoglobulinai – Ig)
- specifiniai baltymai, kuriuos gamina B
limfocitai (imuninės ląstelės), reaguojant į bet kokio infekcinio patogeno (virusų, bakterijų, grybelių ir kt.) patekimą į organizmą. Yra imunoglobulinai A (IgA), imunoglobulinai E (IgE), imunoglobulinai M (IgM), imunoglobulinai G (IgG), imunoglobulinai D (IgD). Jie skiriasi vienas nuo kito molekuline forma ir svoriu, pusinės eliminacijos periodu, dalyvavimu/nedalyvavimu infekciniuose procesuose ir aptikimo laiku nuo užsikrėtimo momento. Jei atsižvelgsime į molekulinę masę, tai IgM turi didžiausią svorį - tai yra pentameras (950 000 daltonų), priešingai nei kiti Ig (nuo 150 iki 200 000 Da), dėl kurių IgM tiesiog negali praeiti pro placentos barjerą. Todėl IgM aptikimas 1 metų vaikui visada yra infekcijos požymis vaisiui. Kraujo serume didžiąją imunoglobulinų dalį sudaro IgG (75–85%), o mažiausią – IgE (0,003%). Infekciniame procese tiesiogiai dalyvauja tik IgA, M, G. IgE yra alerginių reakcijų ir ligų požymis, o IgD galima rasti tik limfmazgių ir tonzilių audiniuose ir vaidina vietinio imuniteto formavimąsi.
Antigenai – organinės kilmės didelės molekulinės medžiagos, ypač infekcinių ir kitų ligų sukėlėjai, taip pat įvairių pakitusių ląstelių medžiagos, susidarančios tam tikros ligos metu (autoimuninės ligos, onkologijos).
Imuninis kompleksas – antigeno-antikūnų kompleksas, dalyvaujantis imuniniame procese.
Kuo pagrįstas ELISA metodas?
Yra keletas ELISA tipų (tiesioginis, netiesioginis, blokuojantis metodas, konkurencinis), tačiau praktikoje dažniausiai naudojamas heterogeninis kietosios fazės imunologinis tyrimas arba ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
Fermentinio imunologinio tyrimo pagrindas – antigeno ir antikūno imuninė reakcija, susidarant imuniniam kompleksui: antigenui-antikūnui, dėl kurio pasikeičia specifinių žymių antikūnų paviršiuje fermentinis aktyvumas.
Paprastais žodžiais tariant, šį procesą galima suskirstyti į kelis etapus:
1) Tyrimą atliekančio gydytojo tabletės šulinėlių paviršiuje yra išgrynintas tam tikro patogeno antigenas. Pridėjus biologinės medžiagos (kraujo serumo) iš paciento, tarp šio antigeno ir norimo antikūno (imunoglobulino) įvyksta specifinė reakcija. Šis junginys kitame etape veiks kaip „specialus antigenas“.
2) Šiame etape susidaro IC (imuniniai kompleksai) - reakcija tarp „specialaus antigeno“ ir konjugato (tai imunoglobulinas, pažymėtas fermentu peroksidaze). Pridedamas specialus chromogenas. Šios fermentinės reakcijos rezultatas – tabletės duobutėje susidaro spalvota medžiaga, kurios spalvos intensyvumas priklauso nuo imunoglobulinų (antikūnų) kiekio paciento medžiagoje.
3) Toliau vertinamas rezultatas: fotometrija naudojant daugiakanalį spektrofotometrą, tiriamos medžiagos optinio tankio palyginimas su kontrolinių mėginių optiniu tankiu, matematinis rezultatų apdorojimas. Antikūnų kiekis paciente tiesiogiai priklauso nuo tam tikros duobutės optinio tankio aukščio.
Paprastai praktiškai naudojamos 96 šulinėlių plokštelės.
Matuojant tiriamojo skysčio optinį tankį (OD), apskaičiuojamas antikūnų kiekis (arba koncentracija) tam tikrame tūrio vienete. Tada rezultatas lyginamas su kontroliniu mėginiu.
Reikia prisiminti:Kiekvienai bandymų sistemai sukuriami individualūs rodikliai rezultatams fiksuoti, normalumo ir patologijos rodikliai (tai yra „atskaitos vertės“). Į tai reikia atsižvelgti vertinant kiekvieno konkretaus tyrimo rezultatus. Neteisinga vienos laboratorijos rezultatus interpretuoti remiantis kitos laboratorijos „etaloninėmis vertėmis“. Taip pat neteisinga lyginti skirtingų laboratorijų rezultatus tarpusavyje.
Atliekant ELISA reakcijas, svarbi ir antikūnų avidiškumo samprata.
Antikūnų avidiškumas
- tai antikūno ir antigeno ryšio stiprumas ir antigeno kiekis, susijęs su imunoglobulinais (antikūnais). Avidumas turi didelę reikšmę vertinant numatomą užsikrėtimo trukmę, o tai itin svarbu diagnozuojant pirminę infekciją nėščioms moterims.
Antikūnų avidiškumo tyrimo pagrindas yra imuninio komplekso (antigeno-antikūno) apdorojimas karbamido tirpalu, siekiant sunaikinti baltymą. Didelio avidiškumo ryšiai lieka nepažeisti, o mažo avidiškumo ryšiai sunaikinami. Rezultatas pateikiamas kaip avidumo indeksas, išreikštas procentais (%).
Kokios ligos nustatomos naudojant ELISA diagnostiką?
2. Autoimuninių ligų žymenys ir žmogaus imuniteto rodikliai(bendras IgE, bendras IgG, bendras IgA, bendras IgM, bendras IgD, sekrecinis IgA, IgG 2, IgG4, CEC cirkuliuojantys imuniniai kompleksai, IgA ir IgG į gliadiną ir kt.)
3. Onkologiniai žymenys(TNF – naviko nekrozės faktorius, CEA – karcinoembrioninis antigenas, PSA – prostatos specifinis antigenas, hCG – žmogaus chorioninis gonadotropinas, CA 125, alveomucinas ir daugelis kitų)
4. Reprodukciniai sutrikimai I (estradiolis, progesteronas, prolaktinas, testosteronas, AFP-alfafetoproteinas, FSH - folikulus stimuliuojantis hormonas ir kt.)
5. Skydliaukės ligos(laisvas ir surištas T3, T4, tiroglobulinas, skydliaukės peroksidazė – TPO, skydliaukę stimuliuojantis hormonas – TSH).
Šiame sąraše nėra visų ligų, kurios diagnozuojamos naudojant fermentų imunologinį tyrimą.
Medžiaga ELISA analizei ir jos rinkimo taisyklės
Dažniausia medžiaga ELISA reakcijai atlikti yra paciento kraujo serumas, paimtas tuščiu skrandžiu. Medžiaga taip pat gali būti smegenų skystis, vaisiaus vandenys, stiklakūnio turinys, gimdos kaklelio kanalo ir šlaplės gleivės, tepinėliai.
Pacientų paruošimas pateikti medžiagą ELISA tyrimui
ELISA gamybos laikas
Medžiagos fermentinis imunologinis tyrimas atliekamas greitai, per 24 valandas. Skirtingose laboratorijose gali atsirasti delsų dėl tam tikro serumo kiekio susikaupimo.
Galimi ELISA diagnostikos rezultatai
Vertinant konkrečių infekcijų rezultatus, svarbi aptiktų antikūnų klasė ir jų kiekis. Ne tik infekcijos etiologijos klausimas (ar ji egzistuoja, ar ne), bet ir numatoma ligos stadija (ūminė, lėtinė), taip pat aktyvios infekcijos (ūminės ar lėtinės paūmėjimo) buvimas. Nuo to priklauso tyrimo laikas.
Koks yra apytikslis antikūnų (imunoglobulinų – Ig) atsiradimo laikas?
Ankstyviausi antikūnai yra IgM. Jas galima nustatyti praėjus 1-3 savaitėms po galimo užsikrėtimo, kuris apibūdina ūminę infekcinio proceso fazę. Antroji IgM antikūnų atsiradimo situacija yra lėtinio proceso suaktyvėjimas (arba paūmėjimas). IgM antikūnai cirkuliuoja vidutiniškai apie 3 mėnesius, vėliau jų skaičius palaipsniui nyksta. Tačiau kai kuriems pacientams IgM pėdsakai gali būti aptinkami praėjus 1–2 metams po užsikrėtimo.
Šiuolaikinės testų sistemos yra labai jautrios, todėl gaunami nespecifiniai klaidingai teigiami rezultatai (dažnai nėščioms moterims). Todėl šioje pacientų grupėje turi būti pakartotinai patikrintas teigiamas IgM!
IgA antikūnai atsiranda praėjus 2-4 savaitėms po užsikrėtimo, tačiau jų pakanka aptikti per mėnesį. Serumo IgA sintetina blužnies, limfmazgių ir gleivinių plazminės ląstelės Sekretorinis IgA koncentruojasi ant gleivinės, kad atliktų savo apsauginę funkciją – jos dalyvauja vietiniame imunitete.
Nuo 4 savaitės po užsikrėtimo pradeda atsirasti IgG antikūnų. Sergant daugeliu infekcijų, jų titras laipsniškai didėja maksimaliai skirtingu metu (vidutiniškai po 1,5-2 mėnesių), tada titras išlieka žemas ir rodo imunitetą. Sergant kai kuriomis ligomis (mikoplazmoze, chlamidijomis, trichomonoze) IgG lygis nėra didelis ir labai sumažėja dėl imuniteto stokos šioms infekcijoms.
Skirtingų klasių antikūnų aptikimo parinktys:
Atskirai aptikti IgM antikūnai rodo pirminį antikūnų buvimą
infekcija.
– Pirminei infekcijai būdingas IgM ir IgG nustatymas kraujyje vienu metu
per pastaruosius 2-3 mėnesius, taip pat lėtinės ligos paūmėjimo metu. Todėl nėštumo metu IgM buvimas ne visada yra pirminės infekcijos požymis.
- Išskirto IgG aptikimas gali rodyti imunitetą šiai ligai,
taip pat dėl lėtinės infekcijos. Antroje situacijoje svarbus ir antikūnų kiekis (titras), ir šio titro pokytis laikui bėgant. Paprastai tyrimai atliekami kas 2-4-6 savaites.
- IgA aptikimas izoliuoto arba su IgM rodo pirminę infekciją. At
IgA atsiradimas kartu su IgG rodo lėtinės infekcijos suaktyvėjimą (vidutiniškai 2 savaites nuo paūmėjimo momento).
Apibrėžimas IgG antikūnų avidiškumas yra puikus papildomas pirminės užsikrėtimo nuo ilgalaikės infekcijos diagnostikos etapas, turintis savo klinikinę reikšmę, visų pirma, vertinant vaisiaus intrauterinės infekcijos riziką. Mažo avidiškumo IgG nustatymas rodo pirminę infekciją ir nustatomas vidutiniškai 4-6 mėnesius po užsikrėtimo, retai ilgiau. Mažo avidiškumo IgG reikalingas kitas laboratorinis pirminės infekcijos (IgM) patvirtinimas. Didelio avidiškumo antikūnai yra arba lėtinės ligos ir jos paūmėjimo, arba susiformavusio imuniteto požymis.
Kūdikių savybės:vaikams iki vienerių metų, o kartais net 1,5 metų, motinos IgG nuo įvairių infekcijų cirkuliuoja kraujyje (tai yra, jie prasiskverbė per placentą iš motinos į vaisius intrauterinio vystymosi metu). Jie patys savaime nėra infekcijos buvimo šiuo metu požymis. Jei IgM aptinkamas šiame amžiuje (atminkite, kad motinos IgM negali prasiskverbti pro placentą), tai yra intrauterinės infekcijos arba po gimdymo įgytos infekcijos požymis.
Kiekybinis ELISA metodas
ELISA diagnostikos (naudojant fermentų imuninės analizės analizatorių) rezultatas pateikiamas tam tikrais matavimo vienetais:
- Mėginio optinis tankis (OD) – specifinių antikūnų koncentracija tūrio vienete. Kuo didesnis mėginio OD, tuo didesnė antikūnų koncentracija. Kai kurie rezultatai nurodo teigiamumo koeficientą (CP), kuris taip pat yra mėginio optinis tankis.
- Antikūnų koncentracijos vienetai (nanograma / mililitras arba ng / ml).
- Serumo titrų pavidalu: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 ir pan. Diagnostiniai titrai (pagal kuriuos nustatoma ligos diagnozė, o ne infekcijos faktas) skirtingoms ligoms yra skirtingi.
- Simbolių pavidalu – „+“, „-“, „? (+, ++, +++, ++++).
- Kokybinio įvertinimo forma pagal nurodytą kriterijų (teigiamas arba neigiamas).
Tik gydytojas gali teisingai įvertinti antikūnų skaičių, imunoglobulinų klasės aptikimo galimybę, taigi ir nustatyti ligos stadiją bei gydymo poreikį.
Nereikia pamiršti, kad bet kuriai testų sistemai sukuriamos savo „referencinės vertės“ (normos variantai), o viršijus diagnozuojama konkreti liga (patologijos variantai). Skirtingoms bandymų sistemoms „atskaitos vertės“ skiriasi.
Teisingas ELISA rezultatų palyginimas laikui bėgant įmanomas tik tuo atveju, jei jie buvo gauti toje pačioje laboratorijoje.
Infekcinių ligų gydytojas N. I. Bykova
Atstovaujantis šiuolaikiniam laboratorinių tyrimų tipui ELISA arba su fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas leidžia kraujyje rasti specifinių antikūnų ar antigenų prieš tam tikras ligas. Tai leidžia nustatyti tiek ligos etiologiją, tiek nustatyti jos stadiją. Be to, tokio tipo tyrimų rezultatai gali būti pateikti tiek kiekybiškai, tiek kokybiškai. Taigi, išsamiai pažvelkime į fermentinio imunologinio tyrimo metodo principą, jo metodiką ir esmę.
Kas yra fermentinis imunologinis tyrimas
Išsamiausiam visapusiškam sveikatos įvertinimui paskirtas fermentinis imunologinis tyrimas leidžia įvertinti bendrą sveikatos būklę ir įvertinti jo apsaugines funkcijas. Šis laboratorinis tyrimas leidžia diagnozuoti infekcines, autoimunines, hematologines patologijas naudojant kraujo tyrimą.
Fermento imunologinio tyrimo esmė aptariama toliau pateiktame vaizdo įraše:
Kam jis skirtas?
Šis tyrimas gali būti skiriamas pacientams, kuriems diagnozuojamos šios ligos:
- virusinės kilmės ligos, įskaitant hepatitą;
- lytiniu keliu plintančios ligos - chlamidijos, trichomonai, sifilis, ureaplazma, mikoplazma;
- imunodeficitas;
- atlikti išsamų priešoperacinį tyrimą.
Taip pat skiriamas ELISA kraujo tyrimas hormonų kiekiui nustatyti ir atliekamos terapijos rūšies kokybei įvertinti.
Gydytojas gali paskirti šį tyrimą, kad nustatytų esamos ligos stadiją, o tai leidžia laiku koreguoti taikomą gydymą. O didelis gautų duomenų tikslumas leidžia susidaryti kuo išsamesnį sveikatos vaizdą. Tuo pačiu metu duomenys gaunami po tyrimo per labai trumpą laiką, o tai leidžia stebėti patologinio proceso vystymosi dinamiką.
Kam daryti tokius testus?
Kadangi ELISA kraujo analizės dėka galima gauti daug informacijos apie sveikatos būklę ir organizme vykstančius patologinius procesus, tai leidžia maksimaliai atsižvelgti į pradinius duomenis (bendrą sveikatos būklę, ligos stadiją). liga, patologinio proceso vystymosi dinamika, taikyto gydymo efektyvumo rodiklis) sudarant gydymo schemas.
Dėl šios priežasties, norint gauti ryškiausią gydymo rezultatą ir greičiausią patologinio proceso sustabdymą organizme, skiriamas ELISA kraujo tyrimas. Remiantis gautais duomenimis, efektyviausiais metodais galima greičiau išgydyti sunkias imuninės sistemos ligas, antigenų buvimą kraujyje ir alergijos priežastis.
ELISA analizė skiriama esant įvairioms patologijoms, ir tai turėtų būti atliekama tik gydytojo nurodymu. Analizės dažnumą taip pat nustato gydytojas, o paaukojus kraujo ELISA tyrimui, ligos vaizdas būna išsamiausias. Kadangi ligos eigos dinamiką galima gauti atlikus šį tyrimą ne vieną kartą, dažniausiai kraujo donorystė gali būti skiriama nuo trijų iki penkių kartų. Tai leidžia palyginti antikūnų kiekį kraujyje skirtingais laikotarpiais.
Tokios procedūros rūšys
Yra keletas fermentų imunologinių tyrimų tipų. Jie skiriasi skysčių, paimtų iš žmogaus kūno, tipu, kurio pagrindu tiriama jo sudėtis ir tam tikrų antigenų buvimas.
Tokiu atveju analizei galima paimti ne tik žmogaus kraują, bet ir kitus jo skysčius:
- amniono skystis,
- cerebrospinalinis skystis,
- stiklakūnio turinys,
- smūgiai,
- gleivių iš šlaplės ir gimdos kaklelio kanalo.
Pati tam tikros rūšies skysčio paėmimo operacija yra standartinė ir atliekama dienos stacionare.
Indikacijos bandymams
Paprastai ELISA testą skiria gydytojas, jei reikia gauti išsamų vaizdą apie esamą ligą, kuri pasireiškia bet kokia forma: lėtine, vangia ar ūmia. Ir šios sąlygos ir gydymo tikslai gali būti laikomi šio tipo analizės indikacijomis:
- tam tikrų ligų antigenų paieška;
- hormoninės būklės nustatymas;
- hepatito viruso aptikimas organizme;
- tyrimai apie ;
- ieškoti antikūnų prieš bet kokią infekcinę ligą;
- autoimuninių kūno pažeidimų tyrimas.
Norėdami gauti daugiau informacijos apie fermentų imuninį tyrimą, žiūrėkite toliau pateiktą vaizdo įrašą:
Kontraindikacijos dėl
Iki šiol fermentų imunologiniam tyrimui kontraindikacijų nenustatyta.
Nėštumo metu, kai nuolat kinta hormonų kiekis kraujyje, šią analizę būtina atlikti pakartotinai, kad būtų patvirtintas gautas rezultatas. Naujagimiams ir kūdikiams taip pat gali būti neteisingi tyrimų duomenys: vaisiaus vystymosi metu tam tikros rūšies antikūnai gali patekti į vaisiaus kraują per motinos placentą. Todėl jų buvimas analizėje neturėtų būti laikomas esamos infekcijos požymiu.
Bandymo saugumas
Bet kokio tipo skysčių paėmimo iš žmogaus kūno procedūra nesukelia neigiamo poveikio organizmui. Visiškas sterilumas manipuliacijų metu apsaugo nuo užsikrėtimo bet kokiomis ligomis pavojaus.
Pasiruošimas renginiui
Norėdami gauti patikimiausius tyrimo rezultatus, prieš imdami kraują (ar kitą skystį) analizei, negerkite alkoholinių gėrimų ir narkotikų.
Kaip vyksta procedūra ir ką jaučiate jos metu
Norint atlikti ELISA tyrimą, paciento kraujas imamas griežtai tuščiu skrandžiu: likus bent valandoms iki procedūros negalima valgyti jokio maisto. Analizė paimama iš alkūnkaulio venos.
Apie bet kokias ligas ir vartojamus vaistus iš anksto pranešama gydytojui, dažniausiai kraujo donorystės metu vaistų vartojimas bus nutrauktas. Pojūčiai procedūros metu yra panašūs į kraujo paėmimą biocheminei analizei.
Rezultatų dekodavimas
ELISA diagnostika leidžia nustatyti infekcijos buvimą organizme, patologinio proceso aktyvumą ir esamos infekcijos etiologiją. Greitas analizės rezultatų gavimas (per 24 val.) yra vienas iš tokio tipo tyrimų privalumų.
Gautos informacijos iššifravimo procesą atlieka gydytojas. Reikėtų atsižvelgti į tai, kad bet kokių procesų dinamikos rezultatų teisingumas garantuojamas, kai bandymai atliekami vienoje laboratorijoje.
Vidutinė procedūros kaina
Vidutinė ELISA tyrimo kaina priklauso nuo analizės fokusavimo ir konkrečių verčių nustatymo. Taigi įvairių tipų infekcinių ligų (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) serologinių žymenų nustatymas kainuos nuo 200 iki 320 rublių ir atliekamas per 2 darbo dienas. Šios procedūros kaina taip pat laikoma jos pranašumu: bet kokio tipo tyrimų kainų prieinamumas leidžia atlikti tyrimus bet kokio dydžio biudžetu.
ELISA tyrimo kaina priklauso nuo gydymo įstaigos politikos, tačiau tai turėtų būti laikoma visuotinai prieinama procedūra, leidžiančia gauti išsamų esamos ligos vaizdą ir suteikti išsamiausią gydymą.
Apie ELISA tyrimo normas ir ypatybes žiūrėkite toliau pateiktame vaizdo įraše:
Kaip atliekamas ELISA tyrimas?
Reakcijos mechanizmas
Su fermentu susietas imunosorbentinis tyrimas yra pagrįstas antigeno imunine reakcija su antikūnu, o fermento žymens prijungimas prie antikūnų leidžia atsižvelgti į antigeno ir antikūno reakcijos rezultatą, kai atsiranda fermentinis aktyvumas arba jo lygio pokytis Supaprastinta forma reakcijos mechanizmas gali būti pateiktas taip:
|
Pirmoji reakcija vyksta tarp aptikto Ig (Ab) ir išgryninto patogeno antigeno (Ag), pritvirtinto prie imunologinės tabletės šulinėlių paviršiaus. |
|
|
|
Norint nustatyti susidariusius imuninius kompleksus, atliekama antroji imunologinė reakcija, kurios metu surištas specifinis Ig veikia kaip antigenas, o konjugatas, atstovaujantis Ig (Ab) su atitinkamu žmogaus Ig, paženklintas fermentu -peroksidaze (K). , naudojamas kaip antikūnai prieš jį. |
|
|
Toliau vyksta fermentinė reakcija, kurią katalizuoja fermentinė konjugato molekulės dalis. Šios reakcijos substratas yra bespalvė medžiaga – chromogenas, kuris reakcijos metu suformuoja spalvotą medžiagą. Spalvos intensyvumas duobutėje tam tikru būdu priklauso nuo mėginyje esančių imunoglobulinų kiekio. |
Rezultatų skaičiavimas
Atlieka fermentų imunologinį tyrimą
Serodiagnostikai naudojamos 96 šulinėlių polistireno plokštelės, ant kurių ląstelių sienelių iš anksto adsorbuojamas antigenas. Tiriamasis serumas įpilamas į tabletės ląstelę. Šiuo atveju prie jo prisitvirtina antigenui homologiniai antikūnai. Neprisirišę antikūnai pašalinami plaunant. Tada į ląsteles pridedami antikūnai prieš žmogaus imunoglobulinus (antikūnai), pažymėti fermentu. Jei tiriamajame serume buvo aptinkamų antikūnų, šiame etape jie veiks kaip antigenai, su kuriais reaguos pažymėti antikūnai. Chromogeninės medžiagos (dažiklio) pridėjimas po plovimo leis atsižvelgti į besivystančios spalvos reakciją ląstelėse. Spalvos intensyvumas yra proporcingas fermento kiekiui, taigi ir antikūnų kiekiui Matuojant skysčio optinį tankį (OD) ląstelėje ir lyginant jį su kontroliniu mėginiu, antikūnų koncentracija skaičiuojama vienetais. Dažniausiai naudojamas rezultatams skaičiuoti optinio tankio vienetus. Reikia atsižvelgti į tai, kad kiekviena testavimo sistema turi savo rodiklius rezultatams ir normalumo bei patologijos rodikliams, kuriais turėtų vadovautis interpretuojant. rezultatus.
Kokias infekcijas galima nustatyti ELISA metodu?
Daugiausia šiuolaikinėje venerologijoje naudojamas sifiliui (kartu su kitomis reakcijomis), ŽIV infekcijai, virusiniam hepatitui diagnozuoti. Taip pat taikomas ELISA metodas nustatyti antikūnus sergant įvairiomis infekcinėmis ligomis, hormonų lygius, autoantikūnus ir įvairius vėžio žymenis.
Kaip interpretuoti ELISA rezultatus
Įvairių klasių antikūnų buvimo ir lygio tyrimas kai kuriais atvejais padeda nustatyti infekcinio proceso etapus
|
Ligos stadija |
IgM |
IgA |
IgG |
|
Pirminė fazė |
|||
|
Pirminė fazė |
|||
|
Pirminė fazė |
|||
|
Lėtinės fazės paūmėjimas |
|||
|
Lėtinė fazė |
|||
|
Praeitis (išgydyta infekcija) |
|||
|
Atsigavimas |
po sėkmingo gydymo titras sumažėja 2-4 kartus |
titras sumažėja 4-8 kartus po 1-1,5 mėnesio po sėkmingo gydymo |
|
|
Neigiamas rezultatas |
Deja, toks svarbus ELISA privalumas kaip kiekybinis antikūnų nustatymas praktiniame darbe neturi didelės reikšmės – t.y. neleidžia tiksliai diagnozuoti ir neturi įtakos vaistų dozei bei vartojimo laikui.
Koks yra ELISA metodo vaidmuo diagnozuojant sifilį
ELISA metodas sifilio diagnozei pirmą kartą panaudotas 1975 m. Šiuo metu jis plačiai naudojamas serologinei sifilio diagnostikai Rusijoje ir naudojamas kaip patvirtinantis sifilio tyrimas Paprastai atliekamas tyrimas, kuriuo nustatomas vadinamasis visų antikūnų prieš Treponema pallidum antigenus (IgM ir IgG), nors kai kuriais atvejais galima nustatyti tik „ankstyvuosius“ sifilio ELISA antikūnus po 3 savaičių nuo užsikrėtimo ir išlieka teigiami gana a ilgą laiką net ir po gydymo (kartais visą gyvenimą), todėl kaip sifilio išgydymą patvirtinantis testas nenaudojamas Daugeliu atvejų atliekamas tik kokybinis ELISA nustatymas – t.y. tik teigiamas arba neigiamas rezultatas, nors galimas ir kiekybinis nustatymas.
Samoilikovas Pavelas Vladimirovičius, Klinikinės laboratorinės diagnostikos katedros stažuotojas
Rusijos valstybinis medicinos universitetas
Medicinos praktikoje plačiai naudojami imunologiniai tyrimai. Visose šiuolaikinės medicinos srityse imunologiniai tyrimai naudojami daugiausia diagnostikos ir analizės tikslais. Ypač svarbu, kad jie leistų identifikuoti mažos ir labai mažos koncentracijos biologinius komponentus (hormonus, fermentus, neuropeptidus, imuninės sistemos produktus, antigenus ir kt.). Šiais metodais aptinkami visi produktai, prieš kuriuos galima gauti antikūnų.
Imunologinis tyrimas pagrįstas antigeno (AG) ir antikūno (AT) sąveika, naudojant įvairias vieno iš komponentų (fermento, radionuklido, fluorescencinio dažiklio ir kt.) žymėjimo parinktis. Reakcija įvertinama automatiškai, naudojant specialią įrangą, kuri leidžia standartizuoti šiuos metodus.
Priklausomai nuo naudojamos etiketės tipo ir tyrimo sąlygų, imunologinis tyrimas vadinamas su fermentu susietu imunosorbentu (ELISA), radioimuniniu tyrimu (RIA), imunofluorescenciniu ir kt. Kai reakcijos vyksta vienu ar keliais etapais, jos įvardijamos kaip tiesioginės arba netiesioginės. Aplinka, kurioje vyksta reakcija, yra svarbi. Jei reakcija atliekama naudojant reagentus, pritvirtintus prie paviršiaus, tada bandymas vadinamas kietosios fazės būdu, pavyzdžiui, ELISA (fermentinis imunosorbento tyrimas).
Šiame darbe bus nagrinėjamas tik fermentinis imunologinis tyrimas – biologijoje ir medicinoje plačiai naudojamas metodas, tiek praktinis, tiek fundamentalus.
ELISA pasirodė septintojo dešimtmečio viduryje ir iš pradžių buvo sukurtas kaip metodas antigenui identifikuoti histologiniame mėginyje, taip pat nusodinimo linijų vizualizavimui imunodifuzijos ir imunoelektroforezės testuose, o vėliau buvo pradėtas naudoti kiekybiniam antigenų ir antikūnų nustatymui. biologiniai skysčiai. Kuriant metodą dalyvavo E. Engvall ir R. Pählman, taip pat nepriklausomai W. Van Weemanas ir R. Schursas.
1 pav. Pagrindinis ELISA principas.
1) nustatyti antigenus. 2) Aptikti antikūnus.
Metodas pagrįstas specifiniu antikūno prisijungimu prie antigeno, kai vienas iš komponentų yra konjuguotas su fermentu dėl reakcijos su atitinkamu chromogeniniu substratu, susidaro spalvotas produktas, kurio kiekį galima nustatyti; spektrofotometriškai (1 pav.).
Atradus galimybę imobilizuoti antigeną ir antikūnus ant įvairių nešėjų, išlaikant jų rišamąjį aktyvumą, tapo įmanoma išplėsti ELISA naudojimą įvairiose biologijos ir medicinos srityse.
Monokloninių antikūnų atsiradimas prisidėjo prie tolesnės ELISA plėtros, o tai leido padidinti jos jautrumą, specifiškumą ir rezultatų atkuriamumą.
Teoriškai ELISA yra pagrįsta šiuolaikinės imunochemijos ir cheminės enzimologijos duomenimis, antigeno ir antikūno reakcijos fizikinių ir cheminių dėsnių žiniomis, taip pat pagrindiniais analitinės chemijos principais. ELISA jautrumą ir laiką, kurio reikia atlikti, lemia keli pagrindiniai veiksniai: antigeno-antikūno reakcijos kinetinės ir termodinaminės charakteristikos, reagentų santykis, fermento aktyvumas ir jo nustatymo metodų skiriamoji geba. Apskritai antigeno ir antikūno reakciją galima apibūdinti pagal paprastą schemą:
+[AG]↔[ATAG]
Tyrimų objektų įvairovė nuo mažos molekulinės masės junginių iki virusų ir bakterijų, taip pat neįprastai platus užduočių spektras, susijęs su ELISA naudojimo sąlygų įvairove, lemia itin daug šio metodo variantų.
Bet kurią ELISA versiją sudaro 3 privalomi etapai:
1. tiriamojo junginio atpažinimo pagal jam specifinį antikūną stadija, dėl kurios susidaro imuninis kompleksas;
2. konjugato jungties su imuniniu kompleksu arba su laisvosiomis jungimosi vietomis susidarymo stadija;
3. fermento etiketės pavertimo įrašytu signalu etapas.
ELISA metodų klasifikacija grindžiama keliais metodais:
1. Pagal pirmajame ELISA etape esančių reagentų tipą išskiriami konkurenciniai ir nekonkurenciniai metodai.
A) Atliekant konkurencinį ELISA, pirmajame etape sistemoje yra ir analizuojamas junginys, ir jo analogas, paženklintas fermentu ir konkuruojantis dėl specifinių surišimo vietų.
B) Nekonkurenciniams metodams būdinga tai, kad pirmajame etape sistemoje yra tik analizuojamas junginys ir jam būdingi surišimo centrai.
2. Visi ELISA metodai skirstomi į homogeninius ir nevienalyčius.
Jei visi trys ELISA etapai vyksta tirpale ir tarp pagrindinių etapų nėra papildomų etapų susidariusiems imuniniams kompleksams atskirti nuo nesureagavusių komponentų, metodas priklauso vienarūšių grupei.
Vienalytės ELISA, paprastai naudojamos mažos molekulinės masės medžiagoms nustatyti, pagrindas yra fermento aktyvumo slopinimas, kai jis susijungia su antigenu arba antikūnu. Dėl antigeno ir antikūnų reakcijos atkuriamas fermentų aktyvumas.
Kai antikūnas prisijungia prie antigeno, turinčio fermento žymę, fermento aktyvumas yra slopinamas 95 % didelės molekulinės masės substrato atžvilgiu, o tai yra dėl substrato sterinio išskyrimo iš aktyvaus fermento centro. Didėjant antigeno koncentracijai, jungiasi daugiau antikūnų ir lieka daugiau laisvų antigeno-fermento konjugatų, galinčių hidrolizuoti didelės molekulinės masės substratą. Analizė atliekama labai greitai, vienam nustatymui reikia 1 minutės. Metodo jautrumas yra gana didelis. Jis gali būti naudojamas medžiagai nustatyti pikomolių lygiu.
Heterogeniniams metodams būdinga analizė dviejų fazių sistemoje, kurioje dalyvauja kietoji nešiklio fazė, ir privalomas imuninių kompleksų atskyrimas nuo nesureagavusių komponentų (plovimas), kurie yra skirtingose fazėse (susidarę imuniniai kompleksai yra ant kieta fazė, o nesureagavę kompleksai yra tirpale). Heterogeniniai metodai, kai imuninių kompleksų susidarymas pirmajame etape vyksta kietojoje fazėje, vadinami kietosios fazės metodais.
Metodai priskiriami homogeniniams-heterogeniniams, jei 1 etapas - tirpale susidaro specifiniai kompleksai, o tada komponentams atskirti naudojama kieta fazė su imobilizuotu reagentu.
3. Pagal bandomosios medžiagos nustatymo principą:
A) Tiesioginis medžiagos (antigeno arba antikūno) koncentracijos nustatymas pagal su ja sąveikaujančių surišimo vietų skaičių. Tokiu atveju fermento etiketė bus suformuotame specifiniame AG-AT komplekse. Analitės koncentracija bus tiesiogiai proporcinga įrašytam signalui.
B) Medžiagos koncentracijos nustatymas pagal bendro surišimo vietų ir likusių laisvųjų jungimosi vietų skaičiaus skirtumą. Tokiu atveju analitės koncentracija padidės, o įrašytas signalas sumažės, todėl šiuo atveju yra atvirkštinis ryšys su įrašyto signalo dydžiu.
Fermentai.
Fermentų žymės turi itin galingą katalizinį poveikį, viena fermento molekulė gali reaguoti su daugybe substrato molekulių. Taigi, fermentą, esantį nedideliais kiekiais, galima identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti pagal produktų susidarymą ir jo katalizuojamą reakciją. Kitas fermentų naudojimo kaip etiketės pranašumas yra dėl to, kad molekulėje yra daugybė funkcinių grupių (sulfhidrilo, karboksilo, tirazino liekanų ir kt.), per kurias kovalentiškai gali būti prijungtos ligandų molekulės.
ELISA naudojami fermentų žymenys turi turėti šias savybes:
– didelis fermento aktyvumas ir stabilumas analizės sąlygomis, kai jis yra modifikuotas ir konjuguotas su antikūnais ar kitais baltymais;
– jautrių substratų buvimas ir fermentinės reakcijos produktų arba substratų nustatymo metodo paprastumas;
– gebėjimas pritaikyti substrato sistemas tolesniam stiprinimui;
– fermento ir jo inhibitorių nebuvimas tiriamame biologiniame skystyje.
ELISA gali būti naudojama mažiausiai 15 skirtingų fermentų. Plačiausiai naudojamos, laikantis aukščiau pateiktų reikalavimų, yra krienų peroksidazė (HRP), šarminė fosfatazė (ALP) ir β-D-galaktozidazė (1 lentelė). Visi trys yra stabilūs ir katalizuoja labai jautrias reakcijas. Be to, šių fermentų katalizuojamų reakcijų produktus, priklausomai nuo naudojamo substrato, galima aptikti ne tik kolorimetriniais, bet ir fluorescenciniais metodais. Kiti fermentai naudojami daug rečiau. Tai paaiškinama mažesniu jų specifiniu aktyvumu, palyginti su PC ir AP.
Substratai.
Substrato pasirinkimą pirmiausia lemia fermentas, naudojamas kaip žyma, nes fermento ir substrato reakcija yra labai specifinė.
Pagrindiniai substrato reikalavimai:
– didelio metodo jautrumo užtikrinimas nustatant fermentą konjugate;
– gerai atpažįstamų (pavyzdžiui, spalvotų) fermentų ir substratų reakcijos produktų susidarymas;
– pagrindas turi būti saugus, pigus, prieinamas ir patogus naudoti.
1 lentelė.
ELISA tyrime plačiausiai naudojami fermentai ir jų substratai.
Dažniau naudojami chromogeniniai substratai, kuriuos sunaikinus susidaro spalvota medžiaga. Didelės energijos substratų – fluorescencinių, chemiliuminescencinių – naudojimas yra perspektyvus. Tokių substratų naudojimas leidžia teoriškai padidinti ELISA jautrumą dviem dydžiais.
Antigenai ir antikūnai.
ELISA naudojami AG ir AT turi būti labai išgryninti ir labai aktyvūs. Be to, antigenai turi turėti didelį antigeniškumą, optimalų tankį ir antigeninių determinantų skaičių, svetimumą ir homogeniškumą. Daugelis sintetinių ir rekombinantinių virusų ir bakterijų antigenų pasitvirtino naudojant ELISA. Tai žymiai padidino metodo specifiškumą ir atkuriamumą sumažinant kryžmines reakcijas.
Vienas iš svarbiausių ELISA reagentų yra antikūnai. ELISA jautrumas priklauso nuo naudojamų antikūnų koncentracijos, aktyvumo ir specifiškumo. Naudojami antikūnai gali būti poli- arba monokloniniai, įvairių klasių (IgG arba IgM) ir poklasių (IgGl, IgG2), antialotipiniai arba antiidiotipiniai. Esant mažam AT afinitetui, AG-AT komplekso suskaidymas veda prie surišto AG pašalinimo iš sistemos. Metodo jautrumas ir specifiškumas padidėja naudojant monokloninius antikūnus. Tokiu atveju tampa įmanoma aptikti mažas AG (AT) koncentracijas tiriamuosiuose mėginiuose.
Konjugato susidarymas
Konjugatas yra antigenas arba antikūnas, pažymėtas fermento žyma. Konjugato susidarymas yra vienas iš svarbių ELISA etapų.
Formuojant konjugatą, parenkamas optimalus fermento etiketės įvedimo būdas, kad abu konjugato komponentai išlaikytų savo biologinį aktyvumą: fermentas - gebėjimas sąveikauti su substratu, o antigenas arba antikūnas - antigeniškumas ir antigeno surišimo aktyvumas. , atitinkamai. Pažymėto, labai išgryninto antigeno buvimas leidžia naudoti konkurencinius metodus. Tokiu atveju paskutiniame etape galima išmatuoti konjugato, nesusijusio su imobilizuotais antikūnais, aktyvumą, todėl išvengiama plovimo procedūros ir analizė tampa patogesnė. Tačiau antigenai skiriasi savo fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis bei struktūra, o tai reiškia, kad neįmanoma sukurti universalių metodų konjugatui su antigenu gauti. Šiuo atveju antigeno ir fermento konjugato gavimas yra atskira sudėtinga užduotis. Pažymėtų antikūnų paruošimas ELISA tyrimui yra metodiškai prieinamesnis.
Fermento konjugacija su imunochemiškai aktyviais baltymais atliekama įvairiais būdais: cheminiu kryžminiu ryšiu, kovalentiniu fermento molekulės surišimu su Ag arba AT ir junginių susidarymu nekovalentiniais ryšiais, pavyzdžiui, kai susijungia fermento ryšys. ir Ag arba AT yra atliekami imunologiškai, per antigeno ir antikūno sąveiką.
Plačiausiai naudojami kovalentiniai konjugatų paruošimo metodai. Ryšio reakcijos pasirinkimas priklauso nuo funkcinių grupių, esančių tam tikrose baltymų molekulėse, tipo. Glutaraldehidas, natrio perjodatas ir kt. naudojami kaip reagentai, naudojami fermentui įvesti į antigeno ir antikūnų molekules.
Yra vieno ir dviejų pakopų metodai, skirti gauti konjugatus naudojant glutaraldehidą. Gali susidaryti įvairaus dydžio konjugatai su sumažintu fermentiniu aktyvumu (15 - 60 % laisvo fermento). Gautas didelio dydžio konjugatas gali steriškai trukdyti nustatyti bandomąją medžiagą. Santykinai mažos molekulinės masės konjugatai susideda iš Fab fragmento ir vienos fermento molekulės.
Dėl dviejų etapų sintezės, kurią sudaro fermento, pirmiausia modifikuoto kryžminio ryšio agentu, laipsniškas gamyba, jo išskyrimas, o vėliau sąveika su antigenu (antikūnu), Susidaro vienalytė kompozicija, kurioje yra 1-2 fermentų molekulės vienoje imunoglobulino molekulėje ir išlaikomas aukštas fermentinis ir imunologinis aktyvumas. Tačiau tokių konjugatų susidaro nedaug (krienų peroksidazei – 5–10%).
Didžiausias praktinis pritaikymas nustatytas imunoperoksidazės konjugatų gavimo būdui, paremtam fermento angliavandenių komponento oksidavimu natrio perjodatu (peroksidazės prisijungimas prie konjugato siekia 70-90% pradinio fermento kiekio).
Patikimas konjugatas turi turėti šias savybes:
Didelis antikūnų stiprumas ir didelis afinitetas antigenui, kad jį būtų galima naudoti dideliu praskiedimu ir taip sumažinti nespecifinį surišimą;
Pakankamas darbinio skiedimo specifiškumas;
Monomerinių formų vyravimas prieš polimerines, nes polimerinės formos linkusios nespecifiškai prilipti prie plastiko, todėl susidaro aukštas foninis reakcijos lygis;
Optimalus molinis santykis tarp fermento ir antikūnų (optimalus santykis yra apie 1:1);
Pakankamas konjugato fermentinis aktyvumas. Šią savybę daugiausia lemia konjugacijos sąlygos ir fermentų molekulių bei antikūnų santykis konjugate.
Kieta fazė
Kaip kieta ELISA fazė gali būti naudojamos įvairios medžiagos: polistirenas, polivinilchloridas, polipropilenas ir kitos medžiagos. Kieta fazė gali būti mėgintuvėlio sienelės, 96 šulinėlių ir kitos plokštelės, rutuliukai, karoliukai, taip pat nitroceliuliozė ir kitos aktyviai baltymus sugeriančios membranos.
Antigeno ar antikūnų imobilizavimas ant kietosios fazės galimas trimis būdais:
– pasyvi adsorbcija, pagrįsta stipria hidrofobine sąveika tarp baltymų ir sintetinio paviršiaus;
– kovalentinis prisirišimas prie kietosios fazės;
– imunocheminis ir kt. (nekovalentinis ir neadsorbcinis papildymas).
Pasyvi baltymų adsorbcija plačiai naudojama atliekant ELISA titravimo plokštelėse ir nitroceliuliozės membranose. Pasyvioji adsorbcija vyksta pagal prisotinimo principą ir koreliuoja su adsorbuotos medžiagos molekuline mase. Įvairių tipų membranų (nitroceliuliozės, nailono ir kt.) adsorbcinis paviršius yra 100-1000 kartų didesnis nei plastiko.
Polisacharidai ir labai glikozilinti baltymai dažnai turi mažą afinitetą polistirenui. Norint juos imobilizuoti, reikalingi kiti metodai, pvz., kovalentinis prijungimas naudojant glutaraldehidą. Kovalentinis tvirtinimas yra efektyvus, kai kaip kietoji fazė naudojamos hidrofilinės granulės (agarozė) ir polistireno granulės.
Imunocheminiai metodai yra pagrįsti iš anksto adsorbuotų „spąstų“ antikūnų naudojimu antigenui ar antikūnams imobilizuoti. Imunochemiškai imobilizuotas antigenas yra 10 kartų aktyvesnis nei pasyviai adsorbuotas antigenas. Gali būti naudojami lektinai arba imunoglobulinus surišantys baltymai iš bakterijų, kurios lengvai adsorbuojasi ant plastikinių ar kitų hidrofobinių paviršių, pavyzdžiui, konkanavalinas A (Con A) arba stafilokokinis baltymas A. Con A gali imobilizuoti gp 120 – ŽIV viruso baltymą.
Laisvos vietos kietosios fazės paviršiuje, nesusijusios su sorbuotu agentu, bandymo metu gali fiksuoti kitas molekules, įskaitant konjugatus, o tai padidina foninį signalą. Kad būtų išvengta nespecifinio surišimo, po imobilizacijos kieta bazinės medžiagos fazė apdorojama medžiagomis, kurios yra neutralios bandymui. Populiariausios blokuojančios medžiagos yra galvijų serumo albuminas (BSA), kazeinas ir kt. Blokuojančios medžiagos pasirinkimas ir šio etapo sąlygos priklauso nuo kietosios fazės tipo ir sistemos jautrumo.
Šiuo metu naudojama daugybė įvairių ELISA veislių ir modifikacijų. Plačiai paplito įvairūs su fermentais susieto imunosorbento tyrimo (ELISA) variantai.
Kietosios fazės ELISA buvo pasiūlyta 1971 m. Pagrindiniai kietosios fazės ELISA principai, neatsižvelgiant į modifikaciją, yra šie:
1. Pirmoje reakcijos stadijoje antigenai arba antikūnai adsorbuojami ant kietosios fazės. Tokiu atveju su kietąja faze nesusiję reagentai lengvai pašalinami plaunant.
2. Tiriamasis mėginys inkubuojamas jautrintuose šulinėliuose. Teigiamos kontrolės šulinėliuose yra standartinių reagentų. Tokiu atveju kietosios fazės paviršiuje susidaro imuniniai kompleksai. Neprisirišę komponentai pašalinami plaunant.
3. Pridėjus antikūno-fermento arba antigeno-fermento konjugato ir prijungus jį prie imobilizuoto imuninio komplekso, aktyvi fermento vieta lieka prieinama vėlesnei sąveikai su substratu. Substrato inkubavimas šulinėliuose su imobilizuotu konjugatu sukelia spalvos reakciją. Šią reakciją galima sustabdyti norimoje stadijoje, galima įvertinti dažymosi stiprumą vizualiai arba pagal optinį tankį.
Svarbus bet kurio kietosios fazės analizės varianto etapas yra plovimas nuo nesusijungusių reagentų. Svarbu ne tik nuplauti kietoje fazėje fiksuotus komponentus, bet ir pašalinti reagentus iš viso sluoksnio gylio. Tai daugiausiai laiko ir darbo reikalaujantys analizės etapai. Mėginius galima plauti automatiškai, naudojant specialų įrenginį – poveržlę arba rankiniu būdu naudojant daugiakanalę pipetę. Norėdami atlikti ELISA, jums reikia:
– naudojamos polistireno tabletės arba kitos kietosios fazės galimybės;
– plovimo tirpalas;
– konjugatas (fermentu pažymėti antigenai arba antikūnai);
– naudojamas substratų mišinys;
– stabdymo tirpalas (Stop reagent – tirpalas reakcijai stabdyti);
– mėginiai, naudojami teigiamai ir (arba) neigiamai kontrolei;
– standartinis antigenas (kalibracinės kreivės sudarymui);
– vienkanalės ir daugiakanalės pipetės;
– poveržlė (skalbyklė);
– optinis prietaisas tiriamojo tirpalo optiniam tankiui nustatyti (ELISA skaitytuvas, skaitytuvas, kuris nuosekliai fotografuoja visus šulinėlius);
– 5-100 µl tiriamos biologinės medžiagos.
Tiesioginė ELISA
1. Antigenai arba antikūnai (tiriamoji medžiaga) adsorbuojami plokščių šuliniuose. Aukščiau buvo pažymėta, kad antigenai labai skiriasi savo gebėjimu adsorbuotis ant įvairių tipų plastiko, priklausomai nuo to, kuriai medžiagų klasei (baltymų, angliavandenių ar lipoproteinų) jie priklauso. Dažnai atliekant tiesioginį ELISA antigenas, imobilizuotas ant kietosios fazės, yra ląstelės ir kiti korpuskuliniai antigenai.
Kontrolė. Kaip kontrolė naudojami šulinėliai su adsorbuotu teigiamu kontroliniu mėginiu, kuriame būtinai yra norimas antigenas, ir neigiamu kontroliniu mėginiu, kuriame akivaizdžiai nėra tiriamo antigeno. Jei yra išgrynintas standartinis antigenas, reakcija atliekama keliais praskiedimais, kad būtų galima sudaryti kalibravimo kreivę.
2. „Blokuokite laisvas surišimo vietas, likusias ant kietos fazės, naudodami BSA kazeiną ir kitus (kad būtų išvengta nespecifinės konjugato sorbcijos ant kietos fazės).
3. Fermentu pažymėti antikūnai arba antigenai (konjugatas) dedami į duobutes ir inkubuojami. Konjugato surišimas su kietąja faze įvyks tik tuo atveju, jei abu sistemos komponentai yra vienas kitą papildantys. Po inkubacijos su konjugatu šulinėliai išplaunami, taip pašalinant nesurištą konjugato dalį.
4. Tada į duobutes įpilamas substratas, būdingas naudojamam fermentui ir inkubuojamas. Kai teigiamos kontrolės šulinėliuose pasiekiamas optimalus dažymo lygis, fermentinė reakcija sustabdoma.
5. Reakcijos apskaita. Pirma, į reakcijos rezultatus atsižvelgiama vizualiai. Norint tiksliau užfiksuoti rezultatus, dažymo intensyvumas įvertinamas naudojant ELISA skaitytuvą su atitinkamu šviesos filtru. Remiantis analizės rezultatais, sudaromas optinio tankio priklausomybės nuo koncentracijos grafikas (2 pav.).
2 pav. Tiesioginė ELISA.
a) nustatyti antigeną; b) aptikti antikūnus.
Ši ELISA versija paprastai naudojama specifiniams antikūnams aptikti. Standartinis antigenas adsorbuojamas į plokščių šulinėlius ir inkubuojamas su serumo ar kitos biologinės medžiagos mėginiais, gautais iš paciento (likvoro, seilių ir kt.). Specifiniai antikūnai, prijungti prie kietosios fazės antigeno, aptinkami naudojant antiglobulino konjugatą. Priklausomai nuo analizės tikslo, naudojami skirtingi antiglobulino reagentai, aptinkantys visų izotipų antikūnus arba specifinius atskiroms imunoglobulinų klasėms ir poklasiams. Pagrindinis metodo privalumas yra konjugato universalumas. Tas pats konjugatas gali būti naudojamas žmogaus antikūnams prieš įvairius antigenus aptikti bet kuriame mėginyje. Reakcija metodiškai paprasta.
Pagrindiniai netiesioginio ELISA etapai antikūnams nustatyti:
1. Antigenas adsorbuojamas ant kietosios fazės, po to nuplaunamas, kad būtų pašalinti neprisirišę komponentai.
2. Blokuokite nemokamas surišimo vietas. Išskalbtas.
3. Tiriamoji medžiaga supilama į duobutes, inkubuojama, tada atliekama plovimo procedūra. Lygiagrečiai dedami mėginiai su teigiama ir neigiama kontrole.
4. Įpilkite antiglobulino konjugato darbiniame praskiedime, inkubuokite ir nuplaukite neprisijungusius komponentus.
5. Substratas įpilamas ir inkubuojamas. Kai teigiamos kontrolės duobutėse pasiekiamas optimalus dažymo lygis, reakcija sustabdoma pridedant stabdymo tirpalo.
6. Išmatuokite reakcijos produkto kiekį naudodami ELISA skaitytuvą (3 pav.).
Optimaliomis analizės sąlygomis metodas yra labai specifinis ir jautrus. Tai leidžia aptikti nanogramų antikūnų kiekius tirtų pacientų serume. Norint gauti patenkinamus rezultatus, būtina standartizuoti reagentus ir metodinius metodus. Ši ELISA versija taip pat gali būti naudojama tiriant monokloninius antikūnus.
Antigenai, aptikti naudojant šį ELISA variantą, turi turėti kelis epitopus, galinčius surišti antikūnus, arba pasikartojančius, erdviškai atskirtus to paties specifiškumo epitopus.
Atliekant šią ELISA versiją, labai specifiniai poli- arba monokloniniai antikūnai, adsorbuoti ant kietosios fazės, yra inkubuojami su tiriamuoju mėginiu. Po plovimo į duobutes įdedami fermentu pažymėti antikūnai (konjugatas) prieš tą patį antigeną ir tada atliekami visi kiti reakcijos etapai. Konkretaus komplekso susidarymo efektyvumas kiekviename analizės etape priklauso nuo antigeno-antikūno reakcijos surišimo konstantos.
Pagrindiniai analizės etapai:
1. Monokloniniai antikūnai arba afinitetu išgryninti polikloniniai antikūnai yra imobilizuojami ant kietosios fazės.
2. Tiriamasis mėginys dedamas į plokščių šulinėlius, o teigiamas kontrolinis mėginys ir neigiamas kontrolinis mėginys įvairiais praskiedimais dedami lygiagrečiai. Inkubuoti ir nuplauti.
3. Į duobutes dedami fermentu pažymėti monokloniniai arba polikloniniai antikūnai – konjugatas. Po inkubacijos atliekamas plovimas.
4. Substratas įpilamas ir inkubuojamas. Reakcija sustabdoma, kai teigiamos kontrolės šulinėliuose pasiekiamas optimalus dažymas.
5. Rezultatų įrašymas į ELISA skaitytuvą.
Pagrindinis metodo privalumas – didelis jautrumas, viršijantis kitų ELISA schemų galimybes (4 pav.).
3 pav. Netiesioginis ELISA antikūnų aptikimui.
Šis tyrimas pagrįstas paženklintų (konjuguotų) ir nepažymėtų (bandomųjų) antikūnų konkurencija dėl prisijungimo prie antigeno, adsorbuoto ant kietosios fazės. Prie kietosios fazės prisijungusio fermento kiekis mažės proporcingai laisvųjų antikūnų kiekiui mišinyje. Norint nustatyti antigeną, naudojama ta pati parinktis, tačiau šiuo atveju norimas antigenas konkuruoja su žymėtu standartiniu antigenu dėl prisijungimo prie antikūnų, imobilizuotų ant kietosios fazės paviršiaus.
Konkurencinis metodas reikalauja minimalaus operacijų skaičiaus, mažo reagentų suvartojimo ir gali būti lengvai automatizuotas. Atliekant konkurencinę ELISA antikūnams aptikti, geriau naudoti pažymėtus monokloninius antikūnus, tada konjugatas konkuruoja su tiriamuoju mėginiu dėl vieno antigeno epitopo, adsorbuoto ant kietosios fazės. Ši ELISA versija naudojama nustatyti įvairius junginius, tokius kaip žmogaus imunoglobulinai, karcinoembrioninis antigenas, insulinas ir kt. Tai leidžia aptikti antikūnus prieš diagnostiškai reikšmingus infekcinių agentų epitopus.
Pagrindiniai antigeno nustatymo analizės etapai (5 pav.):
1. Monokloniniai antikūnai, specifiniai aptinkamam antigenui, imobilizuojami ant kietosios fazės.
2. Antigenas, pažymėtas fermentu, ir tiriamasis mėginys įpilami į plokščių šulinėlius žinomos koncentracijos. Atliekamas inkubavimas ir plovimas. Lygiagrečiai teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai dedami į gretimus šulinius. Kalibravimui atlikti naudojamas standartinis nepažymėtas antigenas įvairiais praskiedimais.
3. Įpilkite substrato, inkubuokite, sustabdykite reakciją, kai teigiamos kontrolės šulinėliuose susidaro optimalus dažymas.
4. ELISA skaitytuvo reakcijos apskaita.
Šiuo atveju antigeno kiekis tiriamajame mėginyje yra atvirkščiai proporcingas fermentiniam aktyvumui kietojoje fazėje.
Šioje ELISA versijoje antigenas, esantis tiriamajame mėginyje, jungiasi su fermentu pažymėtais monokloniniais antikūnais ir slopina jų sąveiką su standartiniu antigenu, imobilizuotu ant kietosios fazės. Netgi konjugatui specifinio antigeno pėdsakų buvimas mėginyje slopins pažymėtų antikūnų prisijungimą prie imobilizuoto antigeno. Slopinimo laipsnis yra tiesiogiai proporcingas antigeno kiekiui tirpale. Kiekybinei analizei kalibravimo kreivė sudaroma naudojant standartinio antigeno nuoseklius skiedimus. Pagrindiniai antigeno nustatymo slopinančio ELISA etapai (6 pav.).
1. Standartinis antigenas adsorbuojamas į plokščių duobutes. Pažymėtų antikūnų darbinis skiedimas parenkamas titruojant.
4 pav. „Sumuštinis“ ELISA versija.
2. Išankstinė konjugato inkubacija atliekama praskiedus prieš darbinį mėginį, praskiedus tiriamąjį mėginį, standartinį antigeną ir teigiamus kontrolinius mėginius.
3. Mišinys perpilamas į plokščių šulinius. Norint kontroliuoti 100 % surišimą, į keletą šulinėlių pridedami tik pažymėti antikūnai be slopinančio antigeno. Plokštės inkubuojamos ir nuplaunamos.
4. Pridėkite substrato.
5. Užrašykite rezultatus.
Antigeno koncentracija tiriamajame mėginyje yra atvirkščiai proporcinga fermentiniam aktyvumui kietojoje fazėje.
ELISA metodu galima nustatyti ne tik tirpų antigeną ar antikūną, bet ir ląsteles, gaminančias įvairius baltymus.
1983 m. ELISA technologija buvo pritaikyta aptikti limfoidines ląsteles, išskiriančias antikūnus arba antigenus (pvz., citokinus) in vitro. Metodas vadinamas ELISPOT (su fermentu susietas imunospoto dėmės metodas). Pagrindinis metodo principas:
1. Polistireno šulinio paviršiuje (ląstelių kultūrai naudojamos 24 šulinėlių plokštės) sorbuojami antigenai arba antikūnai, kurie tarnauja kaip „gaudyklės“ reagentai.
2. Tiriamos limfoidinės ląstelės pridedamos ir keletą valandų kultivuojamos 37°C temperatūroje, suteikiant galimybę užimti konkrečią vietą ir atlikti sekrecinę funkciją. Tokių ląstelių išskiriami antikūnai arba antigenai sulaikomi reagentais, adsorbuotais ant kietosios fazės.
3. Ląstelės pašalinamos naudojant plovimo tirpalą su plovikliu, kuris ląsteles lizuoja.
4. Sekrecijos produktų kaupimosi sritys atskleidžiamos pridedant su fermentais susietų antikūnų (antiglobulino reagentas).
5. Pridedamas substrato ir agarozės mišinys (naudojami substratai turi ištirpti agarozėje ir sudaryti netirpius reakcijos produktus), kietosios fazės paviršiuje susidaro rudos arba mėlynos dėmės (priklausomai nuo naudojamų fermentų ir substratų), atidengiant vietas, kuriose ląstelės buvo įsikūrę.
Susidariusios dėmės skaičiuojamos po mikroskopu, tai bus išskiriančių ląstelių skaičius.
Nitroceliuliozės membrana gali būti naudojama kaip kietoji fazė. Šiuo atveju yra nemažai privalumų: dėl didelės NCM adsorbcijos, reikalingas žymiai mažesnis antigeno kiekis, papildomai naudojamas kaip „spąstai“. , į substratą nereikia dėti agarozės.
Vienu metu nustačius išskiriamų ląstelių skaičių ir bendrą išskiriamo antigeno ar antikūno kiekį duobutėje, kas įmanoma naudojant skirtingą substratą, galima nustatyti vienos ląstelės išskiriamos medžiagos kiekį.
Šis metodas plačiai naudojamas įvertinti ląstelių, išskiriančių antigeną, sugautų adsorbuotų antikūnų, skaičių. TNF-a).
Naudojant didelio afiniteto antikūnus, atskirų ELISA variantų jautrumas yra labai didelis ir teoriškai leidžia aptikti pavienes antigeno molekules, tačiau praktiškai jautrumą riboja daugybė veiksnių: fermentų aktyvumas, signalo intensyvumas ir signalo registravimo metodai. Signalo stiprinimo sistemos leidžia padidinti įvairių ELISA parinkčių jautrumą. Pažvelkime į kai kurias iš šių sistemų:
Remiantis avidino ir biotino sąveika.
Biotino kofermento molekulės (mw 244 Da) konjuguojamos su antikūnais naudojant biotinil-N-hidroksisukcimidą. Maža biotino molekulė lengviau prisiriša prie imunoglobulino ar kito baltymo, nepažeidžiant jo imuninių ar fermentinių savybių. Fermentas šiuo atveju siejamas su kiaušinio baltymo glikoproteinu avidinu. Avidino jungimosi afinitetas su biotinu yra labai didelis (komplekso disociacijos konstanta yra 10-15 mol), avidino-fermento konjugatas yra tvirtai pritvirtintas prie antigeno-antikūno-biotino komplekso. Pridėjus atitinkamą substratą, reakcijos produktas nustatomas spektrofotometriškai arba liuminescencijos intensyvumu.
Viena avidino molekulė susideda iš keturių identiškų subvienetų ir gali sąveikauti su keturiomis biotino molekulėmis, todėl ji gali būti naudojama kaip jungiamoji molekulė tarp dviejų biotino turinčių junginių. Šiuo atveju fermentas taip pat yra biotinilinamas, o avidinas veikia kaip tiltas, jungiantis dvi molekules, kuriose yra biotino likučių. Į gautą antigeno-antikūno-biotino kompleksą pridedamas laisvas avidinas ir tada biotinilintas fermentas. Atsižvelgiama į reakciją.
Avidino baltymas gali būti nespecifiškai adsorbuotas ant kitų molekulių, todėl vis dažniau naudojamas kitas biotiną surišantis baltymas – streptavidinas, randamas bakterijoje Streptomyces avidinii. Streptavidinas taip pat sudaro stiprų kompleksą su biotinu ir susideda iš keturių identiškų subvienetų.
Avidino ir biotino komplekso naudojimas gali žymiai padidinti ELISA jautrumą, nes sintetinant konjugatą su viena AT molekule gali būti surištos dešimtys biotino molekulių. Konjugatų (antikūnų ir fermentų su biotinu) gavimas yra gana paprastas ir lydimas minimalių jų imunologinio ir fermentinio aktyvumo pokyčių. Fermentų konjugatai su biotinu gali būti naudojami kaip universalūs reagentai.
Chemiliuminescencinių reakcijų naudojimas.
Chemiliuminescencinėmis reakcijomis galima gauti ELISA signalą, kuris padidina metodo jautrumą ir sumažina analizės laiką. Krienų peroksidazė plačiai naudojama kaip žymė atliekant ELISA, jai nustatyti galima naudoti įvairias chemiliuminescencines reakcijas. Chemiliuminescencinės reakcijos yra pagrįstos luminolio savybe švyti, kai oksiduojamas vandenilio peroksidu. Atliekant tiesioginę analizę, vykstant fermentinei reakcijai susidaro vandenilio peroksidas ir oksiduojamas luminolis, šią reakciją katalizuoja krienų peroksidazė. Signalui sustiprinti naudojami įvairūs junginiai, pavyzdžiui, liuciferinas, fenoliai, šiuo atveju liuminescencijos intensyvumas padidinamas 10-100 kartų, kai kuriais atvejais ir 500 kartų (sustiprinta chemiliuminescencinė analizė). Liuminescencinis signalas labai stabilus, jo lygis maksimumą pasiekia per 30 s (palyginimui: spalvinė reakcija su OFD kaip indikatoriumi pilnai išsivysto tik per 30 min.).
Atliekant netiesioginę analizę, antikūnas yra paženklintas luminoliu arba jo dariniais. Tokia laisvos būsenos etiketė gali būti oksiduojama vandenilio peroksidu, išskirdama šviesą. Jei susidarė kompleksas, jis praranda gebėjimą oksiduotis.
Remiantis kaskadinėmis sistemomis.
Norint padidinti ELISA jautrumą, galima naudoti fermentų kaskadų sistemas. Šiuo atveju pirmasis su antikūnais susietas fermentas gamina redukuojamą substratą antrajai fermentų sistemai. Antroji fermentų sistema gali būti substrato ciklinė arba redoksiciklinė. Šiuo atveju fosfo-gliukoizomerazė, aldolazė ir šarminė fosfatazė gali būti fermentų žymės. Galutinis reakcijos produktas nustatomas vizualiai arba spektrofotometriškai.
ELISA stiprinimo sistemos gali pasiekti didelį jautrumą. Tokios ELISA sistemos naudojamos hormonų (skydliaukę stimuliuojančių, progesterono ir kt.) kiekiui nustatyti.
Dėl santykinio metodo paprastumo ir didelio jautrumo ELISA buvo plačiai pritaikytas įvairiose medicinos ir biologijos srityse. ELISA sėkmingai naudojama:
Masinė infekcinių ligų diagnostika (įvairių specifinių antigenų ar antikūnų prieš juos nustatymas);
Hormonų ir vaistų kiekio aptikimas ir nustatymas biologiniuose mėginiuose;
Antikūnų prieš konkretų antigeną izotipų (IgG, IgM ir kitų) nustatymas;
Imuninių kompleksų nustatymas;
Naviko žymenų identifikavimas;
Serumo baltymų (feritino, fibronektino ir kt.) nustatymas;
Bendrojo IgE ir specifinių IgE antikūnų nustatymas;
Atranka dėl miokloninių antikūnų;
Citokinų nustatymas biologiniuose skysčiuose.
Metodo jautrumas
ELISA pakeitė anksčiau klinikinėje praktikoje plačiai naudotus agliutinacijos, nusodinimo ir RIA metodus. Lyginant su aukščiau pateiktais metodais, ELISA yra mažiau darbo reikalaujantis ir mažiau laiko reikalaujantis ir patogus atliekant daugybę panašių testų.
ELISA sujungia unikalų imunocheminio tyrimo specifiškumą su dideliu jautrumu nustatant fermento etiketę. Metodo jautrumą (jautrumu reiškia minimalų aptinkamą antikūnų ar antigeno kiekį) lemia šie veiksniai: antikūnų afinitetas, pageidautina naudoti monokloninius antikūnus; specifinis fermento aktyvumas; signalo intensyvumas; signalo matavimo jautrumas. Skirtingos ELISA parinktys skiriasi savo jautrumu. Tam tikri kietosios fazės ELISA variantai leidžia aptikti atskiras molekules mėginyje. Vidutinis ELISA jautrumas yra 10-9 – 10-12 mol.
Galaktionovas V.G. Imunologija. Maskvos universiteto leidykla, 1998 m
Kishkun A.A. Imunologiniai tyrimai ir infekcinių ligų diagnostikos metodai klinikinėje praktikoje. Medicinos informacijos agentūra, 2009 m
Kondratjeva I.A. Imunologijos seminaras. Vadovėlis universitetams. Akademija, 2004 m
Lefkovits I., Pernis B. Imunologiniai tyrimo metodai. Pasaulis, 1988 m
Royt A., Brostoff D., Meil D. Pasaulis, 2000 m
Sokolovas E.I. Klinikinė imunologija. Medicina, 1998 m
Frimel G. Imunologiniai metodai. Medicina, 1987 m
Khaitovas R. M. Imunologija. Medicina, 2000 m
Shigina Yu.V. Imunologija: vadovėlis. Leidykla RIOR, 2007 m
Yarilin A.A. Imunologijos pagrindai. Medicina, 1999 m
