Расшифровка анализа крови на иммуноферментный анализ. Анализ на сифилис ИФА — расшифровка анализа. Норма и отклонения. Плюсы и минусы анализа

ИФА (иммуноферментный анализ, ELISA – англ.) вошел в жизнь практической медицины еще где-то в 60-х прошлого столетия. Первоначальной его задачей были гистологические исследования в научных целях, которые сводились к поиску и идентификации антигенной структуры клеток живого организма.

В основе метода ИФА лежит взаимодействие специфических (АТ) и родственных антигенов (АГ) с образованием комплекса «антиген – антитело» , который выявляют при помощи фермента. Этот факт натолкнул ученых на мысль, что метод может быть использован в диагностических целях для выявления специфических иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе на ту или иную инфекцию. И это был прорыв в клинической лабораторной диагностике!

Активно использоваться метод начал только в начале 80-х и то, в основном, в специализированных учреждениях. Первыми иммуноферментными анализаторами были снабжены центры и станции переливания крови, инфекционные и венерологические стационары, поскольку рожденный на африканском континенте, появившийся на горизонте у нас и тут же примкнувший к «старым» инфекциям грозный СПИД, требовал незамедлительных мер диагностики и поиска лечебных препаратов, воздействующих на него.

Область применения метода ИФА

Возможности иммуноферментного анализа поистине обширны. Теперь и представить себе трудно, как можно обойтись без подобных исследований, применяемых буквально во всех отраслях медицины. Кажется, что может сделать ИФА в онкологии? Оказывается, может. И многое. Способность анализа находить маркеры, свойственные некоторым видам злокачественных новообразований, лежит в основе раннего выявления опухоли, когда другим способом она еще не определяется из-за своих небольших размеров.

Современная клиническая лабораторная диагностика (КДЛ), кроме онкомаркеров, располагает значительным арсеналом панелей для ИФА и использует их для диагностики различных патологических состояний (инфекционных процессов, гормональных нарушений) и мониторинга фармацевтических лечебных препаратов с целью выявления их влияния на организм больного и, кстати, не только человека. В настоящее время иммуноферментный анализ широко используется и в ветеринарной службе, ведь «братья наши меньшие» тоже подвержены многим заболеваниям, от которых, порой, очень сильно страдают.

Таким образом, ИФА, благодаря своей чувствительности и специфичности, по образцу крови, взятому из вены, может определить:

Гормональный статус (гормоны щитовидной железы и надпочечников, половые гормоны);
Присутствие вирусной и бактериальной инфекции (ВИЧ, В и С, хламидиоз, сифилис, и , и , а также многие другие болезни, вызванные патогенными микроорганизмами);
Следы жизнедеятельности микроорганизмов, возбудивших инфекционный процесс, который благополучно закончился и перешел в стадию формирования иммунного ответа на этот возбудитель. Такие следы, то есть, антитела, во многих случаях остаются циркулировать в крови пожизненно, чем защищают человека от повторного заражения.

В чем суть ИФА?

Иммуноферментный метод, позволяет определить не только присутствие самого возбудителя (качественный анализ), но и его количественное содержание в сыворотке крови больного.

Вирусовая или бактериальная доза существенно влияет на течение инфекционного процесса и его исход, поэтому количественному анализу отведена не последняя роль в диагностике и лечении заболеваний в различных формах и стадиях.

Однако зная иммуноферментные исследования, как метод ИФА, мы даже не задумываемся, как же ему удается охватить такой широкий круг микроорганизмов, населяющих нашу планету, многие из которых несут прямую угрозу здоровью и жизни человека и животных. А дело в том, что ИФА имеет много вариантов (неконкурентный и конкурентный – прямой и непрямой), каждый из которых решает свою задачу и, таким образом, позволяет проводить целенаправленный поиск.

Для выявления иммуноглобулинов того или иного класса используется традиционная 96-луночная полистироловая панель (планшет), в лунках которой в твердой фазе сосредоточены сорбированные рекомбинантные белки. Попавшие в лунку с сывороткой крови антитела или антигены, находят «знакомый» объект и образуют с ним комплекс (АГ – АТ), который, закрепившись ферментным конъюгатом, при считывании результатов проявится изменением окраски лунки.

Иммуноферментный анализ проводится на тест-системах определенной специфичности, изготовленных в специальных лабораториях и укомплектованными всеми необходимыми реагирующими компонентами. Исследования можно проводить с помощью промывных аппаратов («вошеров») и считывающих спектрофотометров, где большей частью задействован ручной труд. На полных автоматах, освобождающих лаборанта от монотонного закапывания, промывания и прочих рутинных дел, конечно, работать быстрее и удобнее, но не все лаборатории могут позволить себе такую роскошь и продолжают работать по старинке – на полуавтоматах.

Интерпретация результатов ИФА находится в компетенции врача лабораторной диагностики, при этом обязательно берется в расчет и присущее практически всем иммунохимическим реакциям свойство давать ложноположительные или ложноотрицательные ответы.

Видео: современное проведение иммуноферментного анализа

Результаты ИФА на примере сифилиса

Иммуноферментный анализ подходит для выявления всех форм , а, кроме этого, применяется в проведении скрининговых исследований. Для проведения анализа используют венозную кровь пациента, взятую натощак. В работе используются планшеты с определенной специфичностью (АТ классов А, М, G) или суммарные антитела.

Учитывая то, что АТ при сифилисе продуцируются в конкретной последовательности, ИФА может легко ответить на вопрос, когда произошло заражение и в какой стадии находится процесс, а расшифровка полученных результатов может быть представлена в следующем виде:

IgM указывают на продолжительность инфекционного процесса (могут появляться при обострении хронических воспалительных заболеваний);
IgA констатируют, что заражение случилось более месяца назад;
IgG свидетельствуют о том, что инфекция находится в самом разгаре или о проведенном недавно лечении, что легко выясняется при сборе анамнеза.

При проведении анализа на сифилис, лунки с отрицательным ответом (и отрицательный контроль) останутся бесцветными, в то время как положительный результат (как и положительный контроль) даст ярко-желтое окрашивание за счет изменения цвета хромогена, добавленного в ходе исследования. Однако интенсивность окраски не всегда совпадает с контролем, то есть, она может быть немного бледнее или слегка желтоватой. Это сомнительные результаты, которые, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре, но в целом, окраска находится в прямо пропорциональной зависимости от количества иммунных комплексов (связанные между собой АГ и АТ).

Самый волнительный из иммуноферментных анализов – ИФА на ВИЧ

Анализ на , пожалуй, больше других интересен широкому кругу населения, ведь пока нельзя с уверенностью утверждать, что исчезли многие социальные проблемы (проституция, наркомания и др.). К сожалению, ВИЧ затрагивает не только эти слои человеческого общества, заразиться можно при различных обстоятельствах, не связанных с половой распущенностью или приемом наркотиков. Но коль возникла необходимость обследования на ВИЧ, то бояться не следует, что все вокруг узнают о посещении такой лаборатории. Сейчас ВИЧ-инфицированные люди защищены законом, а сомневающиеся могут обратиться в анонимные кабинеты, где можно решить проблему, не боясь огласки и осуждения.

Иммуноферментный метод, применяемый для диагностики ВИЧ инфекции, относится к первостепенным стандартным исследованиям, которые, однако, требуют особых условий, поскольку тема очень деликатная.

ИФА на ВИЧ имеет смысл проводить после полового контакта, переливания крови, других медицинских манипуляций , предполагающих заражение, и по окончании инкубационного периода («серонегативное окно»), но следует учитывать, что этот промежуток времени не является постоянным. Он может закончиться через 14-30 дней, а может продолжаться до полугода, поэтому средним значением принято считать интервал от 45 до 90 дней. На ВИЧ кровь сдают так же, как и на другие инфекции – из вены на голодный желудок. Результаты будут готовы в зависимости от накопления материала в лаборатории и ее загруженности (от 2 до 10 дней), хотя чаще всего лаборатории обеспечивают получение ответа в тот же день или на следующий.

Что можно ожидать от результатов на ВИЧ?

ИФА на ВИЧ-инфекцию определяет антитела к двум разновидностям вируса: ВИЧ-1 (более распространенный в России и других странах Европы и Азии) и ВИЧ-2 (встречающийся чаще на территории Западной Африки).

Задачей ИФА ВИЧ является поиск АТ класса G, которые выявляются на всех тест-системах, но в более позднем периоде, и АТ классов А и М, выявляемых на рекомбинантных тест-наборах нового поколения, позволяющих найти антитела на самых ранних стадиях (инкубационный период – «серонегативное окно»). От ИФА можно ожидать следующие варианты ответов:

Первичный положительный результат: кровь подлежит перепроверке на тест-системе такого же типа, но по возможности другой серии и другим человеком (лаборантом);
Повторный (+) предполагает новый забор крови у пациента с исследованием ее подобно первичному анализу;
Очередной положительный результат подлежит референтному анализу, при котором используются высокоспецифичные тест-наборы (2-3 шт.);
Положительный результат в обеих (или в трех) системах направляется на иммуноблотинг (тот же ИФА, но выполненный в индивидуальном порядке на тест наборах особо высокой специфичности).

Заключение о ВИЧ инфицировании выносится только на основании иммуноблотинга. Проводится беседа с инфицированным в условиях полной конфиденциальности. Разглашение медицинской тайны в России, как, впрочем, и в других странах, подлежит уголовному наказанию.

Анализы на хламидии и цитомегаловирус иммуноферментным методом также обрели особую популярность, ввиду того, что позволяют определить время заражения, стадию заболевания и эффективность лечебных мероприятий.

При внедрении тоже можно наблюдать появление антител различных классов в разных фазах патологического состояния, вызванного инфекционным агентом:

IgM могут обнаружиться уже дней через семь после заражения;
IgA говорят о том, что инфекция в организме живет уже более месяца;
IgG подтверждают диагноз хламидиоза, помогает следить за лечением и определить его действенность. Следует заметить, что антитела класса G остаются и циркулируют в организме независимо от давности болезни, поэтому для правильной расшифровки анализа нужно принимать во внимание референтные значения (нормы), которые, кстати, для каждой КДЛ свои: с учетом марки тест-системы и специфичности реагентов, входящих в набор. Значения нормы вписываются в бланк рядом с результатом ИФА.

Что касается , то здесь несколько иначе: антитела класса М появляются приблизительно через месяц-полтора, то есть, положительным результат (IgM+) становится в фазе первичного инфицирования или при реактивации скрытой инфекции и остается таковым от 4 месяцев до полугода.

Наличие АТ класса G характерно для начала первичной острой инфекции или реинфекции. Анализ констатирует, что вирус имеет место, однако информации, в какой стадии находится инфекционный процесс – не дает. Между тем, определение нормы титра IgG тоже вызывает затруднения, так как она целиком зависит от иммунного статуса конкретного человека, который, впрочем, устанавливается выявлением иммуноглобулинов класса G. Учитывая такое поведение антител, при диагностике ЦМВИ возникает необходимость в оценке способностей антител класса G взаимодействовать с ЦМВ, чтобы потом «обезвредить» его (авидность АТ). На начальном этапе болезни IgG очень плохо связываются с антигенами вируса (низкая авидность) и лишь потом начинают проявлять активность, стало быть, можно говорить о повышении авидности антител.

О достоинствах иммуноферментного анализа можно говорить долго и много, ведь этот метод сумел решить многие диагностические задачи, используя лишь венозную кровь. Не нужно долгих ожиданий, волнений и проблем с забором материала для исследования. К тому же тест-системы для ИФА продолжают совершенствоваться и не за горами тот день, когда тест выдаст 100% достоверность результата.

Видео: учебный фильм МГМУ им. Сеченова об основах ИФА

– современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни. Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);
3) исследование гормонального статуса пациента;
4) обследование на онкомаркеры;
5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).
2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.
3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:

1) Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Основные понятия

Перед тем, как прояснить суть метода ИФА, кратко разберемся в некоторых понятиях.
Антитела (или иммуноглобулины - Ig) – специфические белки, вырабатываемые B -
лимфоцитами (иммунные клетки) в ответ на попадание в организм какого-либо инфекционного патогена (вирусы, бактерии, грибы и др). Выделяют иммуноглобулины А (IgA), иммуноглобулины Е (IgE), иммуноглобулины М (IgM), иммуноглобулины G (IgG), иммуноглобулины D (IgD). Отличаются они друг от друга молекулярной формой и массой, периодом полураспада, участием/неучастием в инфекционных процессах, сроками обнаружения с момента инфицирования. Если рассмотреть молекулярный вес, то больше всего он у IgM – это пентамер (950 000 дальтон) в отличие от остальных Ig (от 150 до 200 000 Да), благодаря чему IgM просто не могут проходить через плацентарный барьер. Поэтому обнаружение IgM у ребенка 1 года жизни всегда является признаком наличия инфекции у плода. В сыворотке крови основная масса иммуноглобулинов представлена именно IgG (75-85%), а самая низкая - IgE (0,003%). В инфекционном процессе непосредственное участие принимают только IgA, M, G. IgE являются признаком аллергических реакций и заболеваний, а IgD – можно обнаружить лишь в ткани лимфоузлов и миндалин, играет роль в формировании местного иммунитета.

Антигены – высокомолекулярные вещества органического происхождения, в частности возбудителей инфекционных и других заболеваний, а также вещества различных измененных клеток, образующихся при той или иной болезни (аутоиммунные заболевания, онкология).

Иммунный комплекс – комплекс антиген-антитело, участвующий в иммунном процессе.

На чем основан метод ИФА.

Выделяют несколько разновидностей ИФА (прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный), однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Простым языком этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1) На поверхности лунок планшета доктора, проводящего обследование, находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении биологического материала (сыворотки крови) пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Это соединение будет выступать «особым антигеном» в следующем этапе.

2) На данном этапе идет образование ИК (иммунных комплексов) - реакция между «особым антигеном» и конъюгатом (это иммуноглобулин, меченый ферментом пероксидазой). Добавляется особый хромоген. Результатом такой ферментативной реакции является образование окрашенного вещества в лунке планшета, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в материале пациента иммуноглобулинов (антител).

3) Далее происходит оценка результата: фотометрирование с помощью многоканального спектрофотометра, сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб, математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Обычно на практике используют 96 луночные планшеты.

При измерении оптической плотности (ОП) исследуемой жидкости подсчитывается количество (или концентрация) антител в определенной единице объема. Затем результат сравнивается с контрольным образцом.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии (то есть «референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования. Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При постановке реакций ИФА имеет значение и такое понятие как авидность антител.
Авидность антител – это прочность связи антитела с антигеном и то количество антигена, находящегося во взаимосвязи с иммноглобулинами (антителами). Авидность имеет большое значение при оценке предполагаемого срока инфицирования, что чрезвычайно важно при диагностике первичного инфицирования у беременных.

Основа теста на авидность антител состоит из обработки иммунного комплекса (антиген-антитело) раствором мочевины с целью разрушения белка. Высокоавидные связи остаются целыми, а низкоавидные разрушаются. Результат выдается в виде индекса авидности, выражаемого в процентах (%).

Какие заболевания выявляются с помощью ИФА-диагностики?

2. Маркеры аутоиммунных заболеваний и показатели иммунитета человека (общий IgE, общий IgG, общий IgA, общий IgM, общий IgD, секреторный IgA, IgG 2, IgG4, ЦИК-циркулирующие иммунные комплексы, IgA и IgG к глиадину и другие)

3. Онкологичсекие маркеры (ФНО – фактор некроза опухоли, РЭА – раково-эмбриональный антиген, ПСА – простатспецифический антиген, ХГ – хорионический гонадотропин, СА 125, альвеомуцин и многие другие)

4. Репродуктивные нарушени я (эстрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, АФП- альфафетопротеин, ФСГ – фолликулостимулирующий гормон и другие)

5. Заболевания щитовидной железы (свободные и связанные Т3, Т4, тиреоглобулин, тиреопероксидаза – ТПО, тиреотропный гормон - ТТГ).

Данный список представлен далеко не всеми заболеваниями, которые диагностируются с помощью иммуноферментного анализа.

Материал для ИФА анализа и правила его забора

Наиболее распространенный материал для реакции ИФА – это сыворотка крови пациента, взятая натощак. Материалом также могут служить спинномозговая жидкость, околоплодные воды, содержимое стекловидного тела, слизь цервикального канала и уретры, мазки.

Подготовка пациентов к сдаче материала для ИФА

Сроки изготовления ИФА

Иммуноферментный анализ материала проводится быстро, в течение суток. Задержки могут быть в разных лабораториях из-за накопления определенного количества сывороток.

Возможные результаты ИФА-диагностики

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции (есть она или нет), но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител (иммуноглобулинов - Ig)?

Самыми ранними антителами являются IgM . Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM – активация (или обострение) хронического процесса. Антитела IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

Современные тест-системы обладают высокой чувствительностью, вследствие чего встречаются неспецифические ложноположительные результаты (нередко у беременных). Поэтому у данной группы пациентов положительные IgM нужно перепроверять!

Антитела IgA появляются через 2-4 недели после инфицирования, но в количестве, достаточном для обнаружения – через месяц. Сывороточные IgA синтезируются плазматическими клетками селезенки, лимфоузлов и слизистых оболочек,Секреторные IgA концентрируются на слизистых оболочках для выполнения своей защитной функции – участвуют в местном иммунитете.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG . При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях (микоплазмоз, хламидиоз, трихомониаз) уровень IgG не бывает высоким, снижается существенно из-за отсутствия иммунитета при данных инфекциях.

Варианты обнаружения антител разных классов:

Изолированное обнаружение антител IgM предполагает наличие первичного
инфицирования.
- Одновременное выявление в крови IgM и IgG характерно для первичного инфицирования
в предыдущие 2-3 месяца, а также при обострении хронического заболевания. Следовательно, при беременности наличие IgM не всегда является признаком первичного инфицирования.
- Выявление изолированно IgG может указывать как на иммунитет к данному заболеванию,
так и на хроническую инфекцию. Во второй ситуации имеет значение и количество антител (титр), и изменение этого титра в динамике. Обычно исследования проводят с интервалом в 2-4-6 недель.
- Обнаружение IgA изолировано или с IgM указывают на первичную инфекцию. При
появлении IgA вместе с IgG предполагается активация хронической инфекции (в среднем 2 недели от момента обострения).

Определение авидности антител IgG является прекрасным дополняющим этапом диагностики первичной инфекции от давнего заражения, что имеет свое клиническое значение, прежде всего, при оценке риска внутриутробного заражения плода. Обнаружение низкоавидных IgG указывает на первичную инфекцию и выявляются в среднем спустя 4-6 месяцев после инфицирования, реже дольше. Низкоавидные IgG требуют других лабораторных подтверждений первичного инфицирования (IgM). Высокоавидные антитела являются либо признаком хронического заболевания и его обострения, либо сформировавшегося иммунитета.

Особенности у детей грудного возраста: у детей до года, а иногда и 1,5 лет в крови циркулируют материнские IgG к разным инфекциям (то есть произошло их проникновение через плаценты от матери к плоду в период внутриутробного развития). Она не являются сами по себе признаком наличия инфекции в настоящем. Если же в такjм возрасте обнаруживаются IgM (напомним, что материнские IgM проникнуть через плаценту не могут), то это признак внутриутробного инфицирования или приобретенной после рождения инфекции.

Количественный ИФА-метод

Результат ИФА-диагностики (с помощью иммуноферментного анализатора) выдается в определенных единицах измерения:
- Оптическая плотность (ОП) пробы – концентрация специфических антител в единице объема. Чем выше ОП пробы, тем выше концентрация антител. В некоторых результатах говорится о коэффициенте позитивности (КП) – это тоже оптическая плотность образца.
- Единицы концентрации антител (нанограмм/ миллилитр или нг/мл).
- В виде титров сывороток: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и так далее. Диагностические титры (при которых ставится диагноз именно болезни, а не факт инфицирования) для разных болезней разные.
- В виде символов – «+», «-», «?» (+, ++, +++, ++++).
- В виде качественной оценки по заданному критерию (положительно или отрицательно).

Правильно оценить количество антител, вариант классового выявления иммуноглобулинов, а, следовательно, выставить стадию болезни и необходимость лечения может только врач.

Нельзя забывать, что для любой тест-системы разрабатываются свои «референтные значения» (варианты нормы), при превышении которых и диагностируется то или иное заболевание (варианты патологии). Для разных тест-систем «референтные значения» различные.

Корректное сравнивание результатов ИФА, взятых в динамике, возможно только в случае их изготовления в одной и той же лаборатории.

Врач инфекционист Быкова Н.И.

Представляя собой современный вид лабораторного исследования, ИФА, или иммуноферментный анализ позволяет найти в крови специфические антитела либо антигены к определенным заболеваниям. Это позволяет обнаружить как этиологию болезни, так и определить ее стадию. При этом результаты подобного вида исследования могут выдаваться как количественно, так и качественно. Итак, давайте рассмотрим в подробностях принцип метода иммуноферментного анализа, его методику и суть.

Что такое иммуноферментный анализ

Назначаемый для максимально полной комплексной оценки состояния здоровья, иммуноферментный анализ позволяет оценить общее состояние здоровья и дать оценку его защитным функциям. Данное лабораторное исследование позволяет диагностировать инфекционные, аутоиммунные, гематологические патологии при анализе крови.

Суть иммуноферментного анализа рассмотрена в видео ниже:

Кому его назначают

Данное исследование может быть назначены тем больным, у которых выявляется наличие следующих заболеваний:

болезни вирусного происхождения, к которым относятся гепатиты, ;
заболевания, которые передаются половым путем — хламидиоз, трихомонада, сифилис, уреаплазма, микоплазма;
иммунодефицит;
проведение предоперационного комплексного обследования.

ИФА анализ крови назначается также для определения уровня гормонов и оценки качества проводимого вида терапии.

Врачом может быть назначен данный анализ для установки стадии имеющегося заболевания, что позволяет своевременно вносить корректировки в применяемое лечение. А высокая точность получаемых данных позволяет иметь максимально развернутую картину здоровья. При этом получение данных после проведенного исследования происходит в очень короткий промежуток времени, что позволяет отслеживать динамику развития патологического процесса.

Зачем сдавать такие анализы

Поскольку благодаря ИФА анализу крови можно получить значительное количество информации о состоянии здоровья и патологических процессах, происходящих в организме, именно он дает возможность наиболее полно учитывать исходные данные (общее состояние здоровья, стадия заболевания, динамика развития патологического процесса, показатель эффективность применяемой терапии) при составлении схемы лечения.

По этой причине для получения наиболее выраженного результата лечения и быстрейшего прекращения патологического процесса в организме назначается ИФА анализ крови. Серьезные заболевания иммунной системы, наличие антигенов в крови и причины аллергии на основе полученных данных можно вылечить более быстро, применяя наиболее результативные методы.

Назначение ИФА анализа проводится при множестве патологий, и делать его следует только по назначению врача. Частота проведения анализа также устанавливается врачом, и при сдаче крови для проведения ИФА анализа картина болезни наиболее полная. Поскольку получение динамики течения болезни возможно при сдаче данного анализа более одного раза, наиболее часто может назначаться сдача крови от трех до пяти раз. Это дает возможность сравнить количество антител в крови в различные временные промежутки.

Виды такой процедуры

Существует несколько разновидностей иммуноферментного анализа. Различаются они видом взятой жидкости из организма человека, на основании которой проводится изучение ее состава и наличия определенных антигенов.

При этом для анализа может браться не только кровь человека, но и другие его жидкости:

околоплодные воды,
спинномозговая жидкость,
содержимое стекловидного тела,
мазки,
слизь из уретры и цервикального канала.

Проведение самой операции по взятию определенного вида жидкости стандартный и проводится в условиях дневного стационара.

Показания для проведения

Обычно ИФА анализ назначается врачом при необходимости получения развернутой картины текущего заболевания, проходящего в любой форме: хронической, вялотекущей либо острой. И показаниями к проведению данного вида анализа могут считаться следующие состояния и лечебные цели:

поиск антигенов определенных заболеваний;
определение гормонального статуса;
выявление в организме вируса гепатита;
исследование на ;
поиск антител к любому виду инфекционного заболевания;
обследование на наличие аутоиммунных поражений организма.

О проведении иммуноферментного анализа смотрите в видео ниже:

Противопоказания для проведения

Противопоказаний для иммуноферментного исследования на сегодняшний день не выявлено.

При беременности, когда наблюдается постоянное изменение содержания в крови гормонов, необходимо неоднократное проведение данного анализа для подтверждения полученного результата. Новорожденные и дети грудного возраста могут также иметь некорректные данные анализа: во время внутриутробного развития определенные виды антител могут проникать в кровь плода через плаценту матери. Потому их наличие во взятом анализе не следует считать признаком имеющейся инфекции.

Безопасность анализов

Проведение процедуры взятия любого вида жидкости из организма человека не приносит никакого отрицательного воздействия на организм. Полная стерильность при совершении манипуляций позволяет избежать вероятность заражения любыми видами заболеваний.

Подготовка к проведению

Для получения максимально достоверных результатов исследования следует воздержаться от употребления алкогольных напитков и наркотических препаратов перед взятием крови (либо иной жидкости) на анализ.

Как проходит процедура, ощущения во время нее

Для проведения ИФА анализа кровь у пациента берется строго натощак: следует не принимать пищу в каком-либо виде не менее чем за часов до процедуры. Анализ берется из локтевой вены.

О наличии любых заболеваний и принимаемых лекарствах сообщается врачу заранее, наиболее часто препараты на момент сдачи крови будут отменены. Ощущения во время проведения процедуры сходны со взятием крови для проведения биохимического анализа.

Расшифровка результатов

ИФА-диагностика позволяет определить наличие инфекции в организме, активность патологического процесса и этиологию имеющейся инфекции. Быстрое получение результата проведенного анализа (в течение суток) — одно из преимуществ данного вида исследования.

Процесс расшифровки полученной информации осуществляет врач. При этом следует учитывать, что корректность полученных результатов по динамике любых процессов гарантируется при прохождении анализов в одной лаборатории.

Средняя стоимость процедуры

Средняя цена ИФА-исследования зависит от направленности анализа и определения конкретных величин. Так, определение серологических маркеров инфекционных заболеваний различных видов (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) будет стоить от 200 до 320 рублей и проводится в течение 2 рабочих дней. Показатель стоимости данной процедуры считается также его преимуществом: доступность цен на любые виды исследований позволяет проводить исследование при любом размере бюджета.

Стоимость ИФА-исследования зависит от политики медицинского учреждения, однако его следует считать общедоступной процедурой, позволяющей получить развернутую картину имеющегося заболевания и обеспечить максимально полное лечение.

Про нормы и особенности ИФА-исследования смотрите в видеоролике ниже:

Как проводится исследование методом ИФА

Механизм реакции

В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом,а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня.В упращенном виде механизм реакции можно представитьследующим образом:

	Первая реакция происходит между определяемым Ig (Ab) и очищенным антигеном возбудителя (Ag), фиксированным к поверхности лунок иммунологического планшета
	Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую иммунологичесую реакцию, в которой в качестве антигена выступает связавшийся специфический Ig, а в качестве антител к нему - коньюгат, представляющий собой Ig (Ab) к соответствующему Ig человека, меченный ферментом -пероксидазой (K)
	Далее происходит ферментативная реакция, катализируемая ферментной частью молекулы коньюгата.Субстратом данной реакции служит бесцветное вещество - хромоген, который в ходе реакции образует окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке определенным образом зависит от количества содержащихся в пробе иммуноглобулинов.

Подсчет результатов

Проведение иммуноферментного анализа

Для серодиагностике используются 96 луночные полистирольные планшеты, на стенках ячеек которых заранее адсорбируется антиген. Исследуемая сыворотка вносится в ячейку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к нему. Не прикрепившиеся антитела удаляются промыванием. Далее в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали определяемые антитела, то они на этом этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченные антитела. Добавление после промывки хромогенного вещества (красителя) позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в ячейках. Интенсивность окраски при этом пропорциональна количеству фермента, а следовательно количеству антител.При измерении оптическую плотности (ОП) жидкости в ячейке и сравнивании ее с контрольным образцом подсчитывается концентрация антител в единицах объема.Наиболее часто применяется подсчет результатов в единицах оптической плотности.Надо учитывать,что для каждой тест-системы есть свои показатели учета результатов и показатели нормы и патологии на которые надо ориентироваться при интерпретации результатов.

Какие инфекции можно выявить методом ИФА

В основном в современной венерологии применяется для диагностики сифилиса (в комплексе с другими реакциями),ВИЧ-инфекции ,вирусных гепатитов .Имеет ограниченное значение для диагностики хламидийной инфекции ,цитомегаловирусной инфекции и других герпетических инфекций .Метод ИФА используется также для определения антител при различных инфекционных заболеваниях,уровня гормонов,аутоантител и различных маркеров онкологических заболеваний.

Как интерпретировать результаты ИФА

Исследование наличия и уровня антител различных классов в некторых случаях помогает определить стадии инфекционного процесса

Стадия заболевания	IgM	IgA	IgG
Первичная фаза (2 недели от инфицирования)
Первичная фаза (2,5 - 3 недели от инфицирования)
Первичная фаза (3-4 недели от инфицирования)
Обострение хронической фазы (2 недели от начала обострения)
Хроническая фаза
Прошедшая (излеченная инфекция)
Выздоровление		снижение титра в 2-4 раза после успешного лечения	снижение титра в 4-8 раз через 1-1.5 мес после успешного лечения
Отрицательный результат

К сожалению,такое важное преимущество ИФА, как количественное определение антител не имеет большого значения в практической работе - т.е. не позволяет точно установить диагноз и не влияет на дозировку и сроки назначения лекарственных средств.

Какая роль метод ИФА в диагностике сифилиса

Метод ИФА в диагностике сифилиса был впервые применен в 1975 год.В настоящее время он широко применяется для серологической диагностики сифилиса в России и используется как потверждающий тест на сифилис.Обычно проводят исследование,выявляющее так называемые суммарные антитела к антигенам бледной трепонемы (IgM и IgG),хотя в отдельных случаях возможно и определение только "ранних" антител класса М.ИФА при сифилисе становится положительным после 3 недели с момента инфицирования и остается положительным довольно длительное время даже после лечения (иногда всю жизнь).Поэтому как тест,подтверждающий излечение сифилиса,ИФА не используется.В большинстве случаев проводится только качественное определение ИФА - т.е. только положительный или отрицательный результат,хотя возможно и количественное определение.

Самойликов Павел Владимирович интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики»

Российский государственный медицинский университет

Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.

Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.

В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

Рисунок 1. Основной принцып ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилизации, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы используются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предварительно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях, например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 - белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы:

– полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;

– отмывающий раствор;

– конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);

– смесь используемых субстратов;

– останавливающий раствор (Стоп-реагент – раствор для останавливания реакции);

– образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного контроля;

– стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);

– одно- и многоканальные пипетки;

– вошер (промыватель);

– оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);

– 5-100 мкл исследуемого биологическою материала.

Прямой ИФА

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к какому классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим исследуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибровочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для более точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации (рис. 2).

Рисунок 2. Прямой ИФА.

а) для выявления антигена; б) для выявления антител.

Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста.

Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:

1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3).

При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сыворотках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результатов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вариант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА (рис.4).

Рисунок 3. Непрямой ИФА для выявления антител.

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые моноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антигена. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.

Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропорционально ферментативной активности на твердой фазе.

В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена (рис.6).

1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.

Рисунок 4. «Сэндвич»- вариант ИФА.

2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшествующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного антигена и положительных контрольных проб.

3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.

4. Добавляют субстрат.

5. Проводят учет результатов.

Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.

ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.

В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины), in vitro. Метод получил название ELISPOT (метод иммуноферментных зон или пятен). Основной принцип метода:

1. На поверхности полистироловой лунки (используют 24-х луночные панели для культивирования клеток) сорбируют антигены или антитела, которые служат «ловушечными» реагентами.

2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют несколько часов при 37°С, давая им возможность занять определенное место и выполнить секреторную функцию. Антитела или антигены, секретируемые такими клетками, улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.

3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с детергентом, лизирующим клетки.

4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют, добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый реагент).

5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой фазы образуются коричневые или голубые пятна (в зависимости от используемых ферментов и субстратов), выявляя участки, где располагались клетки.

Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количество секретирующих клеток.

В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мембрана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной способности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, используемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходимость во включении агарозы в субстрат.

При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой.

Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, используется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а).

При использовании высокоаффинных антител чувствительность отдельных вариантов ИФА очень высока и теоретически позволяет выявить единичные молекулы антигена, но на практике чувствительность ограничивается рядом факторов: активностью фермента, интенсивностью сигнала и методами учета сигнала. Системы усиления сигнала дают возможность повышать чувствительность различных вариантов ИФА. Рассмотрим некоторые такие системы:

На основе взаимодействия авидин-биотин.

Молекулы кофермента биотина (м.м. 244 Да) конъюгируют с антителами при помощи биотинил-N-гидроксисукцимида. Небольших размеров молекулу биотина проще присоединить к иммуноглобулину или другому белку без нарушения его иммунных или ферментативных свойств. Фермент в этом случае связывают с гликопротеином яичного белка авидином. Аффинносгь связывания авидина с биотином очень высока (константа диссоциации комплекса – 10-15 моль), конъюгат авидин-фермент прочно фиксируется на комплексе антиген-антитело-биотин. После добавления соответствующего субстрата проводят определение продукта реакции спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции.

Одна молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, способна взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина, что позволяет использовать его как связующую молекулу между двумя биотинсодержащими соединениями. В этом случае фермент тоже биотинилируют, а авидин выполняет функцию мостика, соединяя две молекулы, содержащие остатки биотина. К образовавшемуся комплексу антиген-антитело-биотин добавляют свободный авидин, а затем биотинилированный фермент. Проводят учет реакции.

Белок авидин может неспецифически сорбироваться на других молекулах, поэтому все чаще используют другой биотинсвязывающий белок - стрептавидин, обнаруженный в бактериях Streptomyces avidinii. Стрептавидин также образует прочный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъединиц.

Применение авидин-биотинового комплекса позволяет значительно повысить чувствительность ИФА, так как при синтезе конъюгата с одной молекулой АТ можно связать десятки молекул биотина. Получение конъюгатов (антител и ферментов с биотином) осуществляется достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической и ферментативной активности. Конъюгаты ферментов с биотином могут быть использованы как универсальные реагенты.

Использование хемилюминесцентных реакций.

Хемилюминесцентные реакции можно использовать для получения сигнала в ИФА, при этом повышается чувствительность метода и сокращается время проведения анализа. В качестве метки в ИФА широко применяют пероксидазу хрена, для ее выявления можно использовать и различные хемилюминесцентные реакции. Хемилюминесцентные реакции основаны на способности люминола светиться при окислении перекисью водорода. В прямом анализе при ферментативной реакции образуется перекись водорода и окисляет люминол, катализатором этой реакции выступает пероксидаза хрена. Для усиления сигнала используются различные соединения, например, люциферин, фенолы, в этом случае интенсивность люминесценции усиливается в 10-100 раз, в отдельных вариантах в 500 раз (усиленный хемилюминесцентный анализ). Люминесцентный сигнал очень стабилен, его уровень достигает максимума за 30 с (для сравнения: цветная реакция с ОФД в качестве индикатора полностью развивается лишь за 30 мин).

При непрямом анализе люминолом или его производными метится антитело. Такая метка в свободном состоянии способна окисляться перекисью водорода с выделением света. Если она образовала комплекс, то теряет способность окисляться.

На основе каскадных систем.

Для повышения чувствительности ИФА можно использовать ферментные каскадные системы. В этом случае первый фермент, связанный с антителами, приводит к образованию восстанавливаемого субстрата для второй ферментной системы. Вторая ферментная система может быть субстрат-циклической или редоксициклической. Ферментными метками в этом случае могут служить фосфо-глюкоизомераза, альдолаза, щелочная фосфатаза. Конечный продукт реакции определяют визуально или спектрофотометрически.

Системы амплификации в ИФА позволяют добиться высокой чувствительности. Такие ИФА-системы используются для определения уровня гормонов (ти-реостимулирующего, прогестерона и др.).

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:

Массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

Выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

Определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

Выявления иммунных комплексов;

Выявления онкомаркеров;

Определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

Определения общего IgE и специфических IgE антител;

Скрининга моиоклональных антител;

Определения цитокинов в биологических жидкостях.

Чувствительность метода

ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов.

В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА – 10-9 – 10-12 моль.

Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета, 1998 г.

Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г.

Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия, 2004 г.

Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследования. Мир, 1988 г.

Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Мир, 2000 г.

Соколов Е.И. Клиническая иммунология. Медицина, 1998 г.

Фримель Г. Иммунологические методы. Медицина, 1987 г.

Хаитов Р. М. Иммунология. Медицина, 2000 г.

Шигина Ю.В. Иммунология: Учебное пособие. Издательство РИОР, 2007 г.

Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, 1999 г.