Лабораторные методы исследования вич инфекции. Способы диагностики вич-инфекции. Полимеразная реакция назначается пациенту с целью

В настоящее время новые диагностические технологии позволяют выявить этиологические и патогенетические причины многих заболеваний и коренным образом повлиять на результаты лечения. Пожалуй, наиболее впечатляющие результаты внедрения этих технологий в клиническую практику достигнуты в области иммунологии и диагностики инфекционных заболеваний.

Тест-системы на основе иммуноферментного и иммунохемилюминесцентного анализа позволяют выявить антитела различных классов, что значительно повышает информативность методов клинической, аналитической чувствительности и специфичности для диагностики инфекционных заболеваний. Следует отметить, что наиболее значительные успехи в диагностике инфекций связаны с внедрением в лабораторную практику метода полимеразной цепной реакции, который считается «золотым стандартом» в диагностике и оценке эффективности проведенного лечения ряда инфекционных заболеваний.

Для исследования может быть использован различный биологический материал: сыворотка, плазма крови, соскоб, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость (СМЖ). В первую очередь, методы лабораторной диагностики инфекций направлены на выявление таких заболеваний, как вирусный гепатит В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекции, передающиеся половым путем (гонорейная, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная), туберкулез, ВИЧ-инфекция и др.

ВИЧ-инфекция - заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующего в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.

Возбудители инфекции - вирусы иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) - относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы являются сферическими частицами диаметром 100-140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеиды (структурные белки) с определенной молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 - это gpl60, gpl20, gp41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой - р17, р24, р55 (ВИЧ-2 содержит gpl40, gpl05, gp36, р16, р25, р55).

В состав генома ВИЧ входит РНК и фермент обратная транскриптаза (ревертаза). Для того чтобы геном ретровируса соединился с геномом клетки хозяина, вначале с помощью ревертазы происходит синтез ДНК на матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значительно превышающей таковую у вируса гриппа.

В организме человека основной мишенью ВИЧ являются Т-лимфоциты, несущие на поверхности наибольшее количество СD4-рецепторов. После проникновения ВИЧ в клетку с помощью ревертазы по образцу своей РНК вирус синтезирует ДНК, которая встраивается в генетический аппарат клетки-хозяина (СD4-лимфоциты) и остается там пожизненно в состоянии провируса. Помимо Т-лимфоцитовхелперов поражаются макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии, слизистой оболочки кишечника и некоторые другие клетки. Причиной снижения количества Т-лимфоцитов (клетки CD4) является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и их слияние с неинфицированными клетками. Наряду с поражением Т-лимфоцитов у больных с ВИЧ-инфекцией отмечается поликлональная активация B-лимфоцитов с увеличением синтеза иммуноглобулинов всех классов, особенно IgG и IgA, и последующим истощением этого отдела иммунной системы. Нарушение регуляции иммунных процессов проявляется также повышением уровня α-интерферона, β2-микроглобулина, снижением уровня IL-2. В результате нарушения функции иммунной системы, особенно при снижении числа Т- лимфоцитов (CD4) до 400 клеток в 1 мкл крови и менее, возникают условия для неконтролируемой репликации ВИЧ со значительным увеличением количества вирионов в различных средах организма. В результате поражения многих звеньев иммунной системы человек, зараженный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций.

На фоне нарастающей иммунодепрессии развиваются тяжелые прогрессирующие заболевания, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Это заболевания, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила как СПИД-маркерные или СПИД-индикаторные заболевания.

СПИД-индикаторные заболевания

Первая группа - заболевания, присущие только тяжелому иммунодефициту (уровень СD4 <200). Клинический диагноз ставится при отсутствии анти-ВИЧ-антител или ВИЧ-антигенов.

Вторая группа - заболевания, которые могут развиваться как на фоне тяжелого иммунодефицита, так и в ряде случаев без него.

Поэтому в этих случаях необходимо лабораторное подтверждение диагноза.

Первая группа:

кандидоз пищевода, трахеи, бронхов;
внелегочный криптококкоз;
криптоспоридиоз с диареей более 1 месяца;
цитомегаловирусные поражения различных органов помимо печени, селезенки или лимфоузлов у больного в возрасте старше 1 месяца;
инфекция, обусловленная вирусом простого герпеса, проявляющаяся язвами на коже и слизистой оболочке, которые персистируют более 1 месяца, а также бронхитом, пневмонией или эзофагитом любой продолжительности, поражающим больного в возрасте старше 1 месяца;
генерализованная саркома Капоши у больных в возрасте до 60 лет;
лимфома головного мозга (первичная) у больных в возрасте до 60 лет;
лимфоцитарная интерстициальная пневмония и/или легочная лимфоидная дисплазия у детей в возрасте до 12 лет;
диссеминированная инфекция, вызванная атипичными микобактериями (микобактерии комплекса М. aviumintracellulare) со внелегочной локализацией или локализацией (дополнительно к легким) в коже, шейных лимфатических узлах, лимфатических узлах корней легких;
пневмоцистная пневмония;
прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия;
токсоплазмоз головного мозга у больных в возрасте старше 1 месяца.

Вторая группа:

бактериальные инфекции, сочетанные или рецидивирующие, у детей в возрасте до 13 лет (более двух случаев за 2 года наблюдения): сепсис, пневмония, менингит, поражение костей или суставов, абсцессы, обусловленные гемофильными палочками, стрептококками;
кокцидиоидомикоз диссеминированный (внелегочная локализация);
ВИЧ-энцефалопатия (ВИЧ-деменция, СПИД-деменция);
гистоплазмоз с диареей, персистирующей более 1 месяца;
изоспороз с диареей, персистирующей более 1 месяца;
саркома Капоши в любом возрасте;
лимфома головного мозга (первичная) у лиц любого возраста;
другие В-клеточные лимфомы (за исключением болезни Ходжкина) или лимфомы неизвестного иммунофенотипа: мелкоклеточные лимфомы (типа лимфомы Беркитта и др.); иммунобластные саркомы (лимфомы иммунобластные, крупноклеточные, диффузные гистиоцитарные, диффузные недифференцированные);
микобактериоз диссеминированный (не туберкулез) с поражением помимо легких кожи, шейных или прикорневых лимфоузлов;
туберкулез внелегочной (с поражением внутренних органов, помимо легких);
сальмонеллезная септицемия, рецидивирующая;
ВИЧ-дистрофия (истощение, резкое похудение).

В таблице 1 (см. ссылку на источник выше) приведены СПИД-индикаторные заболевания и их этиологические агенты.

Существует много классификаций СПИДа.

Согласно новой классификации, предложенной Центром по контролю за заболеваниями в США (табл. 2 - см. ссылку на источник выше), диагноз СПИДа устанавливается лицам, имеющим уровень CD4-лимфоцитов менее 200/мкл даже при отсутствии СПИД-индикаторных заболеваний.

Категория В включает различные синдромы, важнейшие из которых - бациллярный ангиоматоз, орофарингеальный кандидоз, рецидивирующий кандидозный вульвовагинит, трудно поддающийся терапии, цервикальная дисплазия, цервикальная карцинома, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, листериоз, периферическая нейропатия.

Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в крови

Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в сыворотке крови в норме отсутствуют.

Определение антител к ВИЧ является основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В основе метода лежит иммуноферментный анализ (ИФА) - чувствительность более 99,5%, специфичность - более 99,8%. Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 1 месяца после заражения, у 5-9% - через 6 месяцев, у 0,5-1% - в более поздние сроки. В стадии СПИДа число антител может снижаться вплоть до полного исчезновения.

Результат исследования выражается качественно: положительный или отрицательный.

Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в сыворотке крови. Отрицательный результат лаборатория выдает сразу по его готовности. При получении положительного результата - выявлении антител к ВИЧ - во избежание ложноположительных результатов в лаборатории анализ повторяют еще 2 раза.

Иммуноблоттинг на антитела к вирусным белкам ВИЧ в сыворотке крови

Антитела к вирусным белкам ВИЧ в сыворотке крови в норме отсутствуют.

Метод ИФА по определению антител к ВИЧ является скрининговым. При получении положительного результата для подтверждения его специфичности используется метод иммуноблоттинга - Western-blot - встречная преципитация в геле антител в сыворотке крови больного с различными вирусными белками, подвергнутыми разделению по молекулярной массе с помощью электрофореза и нанесенными на нитроцеллюлозу. Определяются антитела к вирусным белкам gp41, gpl20, gpl60, р24, pi8, р17 и др.

Согласно рекомендациям Российского центра по профилактике и борьбе со СПИДом обнаружение антител к одному из гликопротеидов gp41, gpl20, gpl60 - следует считать положительным результатом. В случае выявления антител к другим белкам вируса результат считается сомнительным, такого пациента следует обследовать дважды - через 3 и 6 месяцев.

Отсутствие антител к специфическим белкам ВИЧ означает, что иммуноферментный метод дал ложноположительный результат. Вместе с тем, в практической работе при оценке результатов метода иммуноблоттинга необходимо руководствоваться инструкцией, прилагаемой фирмой к используемому «Набору для иммуноблоттинга».

Метод иммуноблоттинга применяется для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

Антиген р24 в сыворотке крови

Антиген р24 в сыворотке крови в норме отсутствует.

Антиген р24 представляет собой белок стенки нуклеотида ВИЧ. Стадия первичных проявлений после инфицирования ВИЧ является следствием начала репликативного процесса. Антиген р24 появляется в крови спустя 2 недели после инфицирования и может быть выявлен методом ИФА в период от 2 до 8 недель. Через 2 месяца от момента инфицирования антиген р24 исчезает из крови. В дальнейшем в клиническом течении ВИЧ-инфекции отмечается второй подъем содержания в крови белка р24. Он приходится на период формирования СПИДа. Существующие тест-системы ИФА для детекции антигена р24 используются для раннего обнаружения ВИЧ у доноров крови и детей, определения прогноза течения СПИДа и контроля проводимой терапии у больных СПИДом. ИФА обладает высокой аналитической чувствительностью, что позволяет обнаруживать антиген р24 ВИЧ-1 в сыворотке крови в концентрации 5-10 пкг/мл и ВИЧ-2 - менее 0,5 нг/мл, и специфичностью. Однако следует отметить, что уровень антигена р24 в крови подвержен индивидуальным вариациям, а это значит, что только 20-30% пациентов могут быть выявлены с помощью данного исследования в ранний период после инфицирования (Rose N.R. et al., 1997).

Антитела к антигену р24 классов IgM и IgG в крови появляются со 2-й недели, достигают пика в течение 2-4 недель и удерживаются на таком уровне различное время: антитела класса IgM - в течение нескольких месяцев, исчезая в течение одного года после инфицирования, а антитела IgG могут сохраняться годами.

Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции зависит от фазы заболевания и характеризуется изменением динамики детекционных антител различных классов (рис. 1, 2 - см. ссылку на источник выше).

Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигена р24 в сыворотке крови.

Отрицательный результат лаборатория выдает сразу по его готовности. При получении положительного результата - выявлении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и/или антигена р24 - во избежание ложноположительных результатов в лаборатории анализ повторяют еще 2 раза.

Вне зависимости от полученных результатов исследования проба крови пациента и результаты 3 исследований направляются лабораторией в региональный центр СПИДа для подтверждения положительного результата или верификации неопределенного результата. В таких случаях окончательный ответ по данному исследованию выдает региональный центр СПИДа.

Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции (качественно)

Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции - ПЦР (качественно) проводится с целью:

разрешения сомнительных результатов иммуноблоттингового исследования;
для ранней диагностики инфицирования ВИЧ;
контроля эффективности противовирусного лечения;
определения стадии заболевания СПИДом (переход инфицированности в заболевание).

При первичном инфицировании ВИЧ метод ПЦР позволяет выявить РНК ВИЧ в крови уже спустя 10-14 суток после инфицирования.

Результат исследования выражается качественно: положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие РНК ВИЧ в крови.

Положительный результат - выявление РНК ВИЧ - свидетельствует об инфицировании пациента.

Обнаружение ВИЧ методом полимеразной цепной реакции (количественно)

ВИЧ в крови в норме отсутствует.

Прямое количественное определение РНК ВИЧ с помощью ПЦР позволяет более точно, чем определение содержания клеток CD4, предсказать скорость развития СПИДа у лиц, инфицированных ВИЧ, следовательно - более точно оценить их выживаемость. Высокое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с выраженным нарушением иммунного статуса и низким содержанием клеток CD4. Низкое содержание вирусных частиц обычно коррелирует с более благополучным иммунным статусом и более высоким содержанием клеток CD4. Содержание вирусной РНК в крови позволяет предсказать переход заболевания в клиническую стадию. При содержании РНК-1 ВИЧ >74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИДа (Senior D., Holden Е., 1996).

Вероятность развития СПИДа в 10,8 раз выше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови <10 000 копий/мл. При ВИЧ-инфекции прогноз непосредственно определяется уровнем виремии. Снижение уровня виремии при лечении улучшает прогноз заболевания.

Группой экспертов США разработаны показания для терапии пациентов с ВИЧ. Лечение показано пациентам с количеством клеток CD4 в крови <300/мкл или уровнем РНК ВИЧ в сыворотке >20 000 копий/мл (ПЦР). Оценка результатов антиретровирусной терапии у лиц, инфицированных ВИЧ, проводится по снижению уровня сывороточной РНК ВИЧ.

При эффективном лечении уровень виремии должен снижаться в 10 раз в течение первых 8 недель и быть ниже предела чувствительности метода (ПЦР) (<500 копий/мл) через 4-6 месяцев после начала терапии.

Таким образом, на сегодняшний день в клиническую практику для диагностики ВИЧ-инфекции внедрены и используются множество методов исследования, как и для всех других вирусных инфекций. Среди них ведущая роль отводится серологическим исследованиям. Основные методы диагностики ВИЧ-инфекций представлены в таблице 3 (см. ссылку на источник выше), где они разделены в зависимости от важности каждого метода для выявления вирусов на четыре уровня:

А - тест обычно используется для подтверждения диагноза;
В - тест полезен в определенных обстоятельствах для диагностики отдельных форм инфекции;
С - тест редко используется для целей диагностики, но имеет большое значение для эпидемиологических обследований;
D - тест обычно не используется лабораториями в диагностических целях.

Поскольку для диагностики вирусных инфекций помимо выбора оптимального метода анализа не менее важно правильное определение и взятие биоматериала для исследования, в таблице 4 (см. ссылку на источник выше) приведены рекомендации по выбору оптимального биоматериала для исследования ВИЧ-инфекции.

Для мониторинга ВИЧ-инфицированных следует использовать возможности комплексного исследования иммунного статуса - количественное и функциональное определение всех его звеньев: гуморального, клеточного иммунитета и неспецифической резистентности в целом.

В современных лабораторных условиях многоэтапный принцип оценки иммунологического статуса включает определение субпопуляции лимфоцитов, иммуноглобулинов крови. При оценке показателей следует учитывать, что для ВИЧ-инфекции характерно снижение соотношения CD4/CD8 Т-клеток меньше 1. Индекс CD4/CD8 1,5-2,5 -указывает на нормергическое состояние, более 2,5 - указывает на гиперактивность, менее 1,0 - свидетельствует об иммунодефиците. Также соотношение CD4/CD8 может быть меньше 1 при тяжелом течении воспалительного процесса.

Принципиальное значение это соотношение имеет при оценке иммунной системы у больных СПИДом, потому что ВИЧ избирательно поражает и разрушает СD4-лимфоциты, в результате чего соотношение CD4/CD8 понижается до значений, значительно меньше 1.

Оценка иммунологического статуса опирается также на выявление общих или «грубых» дефектов в системе клеточного и гуморального звена иммунитета: гипергаммаглобулинемия (повышение концентрации IgA, IgM, IgG) или гипогаммаглобулинемия в терминальной стадии; увеличение концентрации циркулирующих иммунных комплексов; снижение продукции цитокинов; ослабление ответа лимфоцитов на антигены и митогены.

Нарушение соотношения популяций в общем пуле В-лимфоцитов характерно для недостаточности гуморального иммунитета. Однако эти изменения неспецифичны для ВИЧ-инфекции и могут возникать и при других заболеваниях. В комплексной оценке ряда других лабораторных показателей следует учитывать, что для ВИЧ-инфекции характерны также: анемия, лимфо- и лейкопения, тромбоцитопения, повышение уровня β2-микроглобулина и С-реактивного протеина, повышение активности трансаминаз в сыворотке крови.

Профилактика ВИЧ-инфекции

Санитарно-эпидемиологические правила

СП 3.1.5. 2826-10

I.Область применения

1.1. Настоящие санитарно-эпидемиологические правила (далее санитарные правила) устанавливают основные требования к комплексу организационных, лечебно-профилактических, санитарно-противоэпидемических мероприятий, проведение которых обеспечивает предупреждение возникновения и распространения ВИЧ-инфекции.

1.2. Соблюдение санитарных правил является обязательным для граждан, индивидуальных предпринимателей и юридических лиц.

1.3. Контроль за выполнением настоящих санитарно-эпидемиологических правил проводят органы, осуществляющие государственный санитарно-эпидемиологический надзор.

II. Используемые сокращения

АРВ-препараты	антиретровирусные препараты
АРТ	антиретровирусная терапия
АГ	антигены
АТ	антитела
ВААРТ	высокоактивная антиретровирусная терапия
ВБИ	внутрибольничная инфекция
ВГ	вирусный гепатит
ВИЧ	вирус иммунодефицита человека
ВОЗ	Всемирная организация здравоохранения
ДИ	доверительный интервал
ИБ	иммунный блотинг
ИП	ингибиторы протеазы ВИЧ
ИППП	инфекции, передаваемые половым путем
ИФА	иммуноферментный анализ
КСР	коммерческие секс-работники
ЛИА	линейный блотинг
ЛПО	лечебно-профилактическая организация
МСМ	мужчины, вступающие в сексуальные отношения с мужчинами
НИОТ	нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ
ННИОТ	ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ
NAT	амплификация нуклеиновых кислот
ОИ	оппортунистические инфекции
ПЦР	полимеразная цепная реакция
ПИН	потребители инъекционных наркотиков
РНК	рибонуклеиновая кислота
СПИД	синдром приобретенного иммунодефицита
CD4	клетки, несущие на своей поверхности клеточный рецептор СД4

III. Общие положения

3.1. ВИЧ-инфекция – болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека – антропонозное инфекционное хроническое заболевание, характеризующееся специфическим поражением иммунной системы, приводящим к медленному ее разрушению до формирования синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), сопровождающегося развитием оппортунистических инфекций и вторичных злокачественных новообразований.

3.2. Диагноз ВИЧ-инфекции устанавливается на основании эпидемиологических, клинических и лабораторных данных.

3.3. СПИД – состояние, развивающееся на фоне ВИЧ-инфекции и характеризующееся появлением одного или нескольких заболеваний, отнесенных к СПИД-индикаторным. СПИД является эпидемиологическим понятием и используется в целях эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией.

3.4. Возбудитель ВИЧ-инфекции – вирус иммунодефицита человека – относится к подсемейству лентивирусов семейства ретровирусов. Существует два типа вируса: ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

3.5.Источником ВИЧ-инфекции являются люди, инфицированные ВИЧ на любой стадии заболевания, в том числе в инкубационном периоде.

3.6. Механизм и факторы передачи.

3.6.1. ВИЧ-инфекция может передаваться при реализации как естественного, так и искусственного механизма передачи.

3.6.2. К естественному механизму передачи ВИЧ относятся:

3.6.2.1. Контактный, который реализуется преимущественно при половых контактах (как при гомо-, так и гетеросексуальных) и при контакте слизистой или раневой поверхности с кровью.

3.6.2.2. Вертикальный (инфицирование ребенка от ВИЧ-инфицированной матери: во время беременности, в родах и при грудном вскармливании.)

3.7.3. К искусственному механизму передачи относятся:

3.7.3.1. Артифициальный при немедицинских инвазивных процедурах, в том числе внутривенном введении наркотиков (использование шприцев, игл, другого инъекционного оборудования и материалов), нанесение татуировок, при проведении косметических, маникюрных и педикюрных процедур нестерильным инструментарием.

3.7.3.2. Артифициальный при инвазивных вмешательствах в ЛПО. Инфицирование ВИЧ может осуществляться при переливании крови, ее компонентов, пересадке органов и тканей, использования донорской спермы, донорского грудного молока от ВИЧ-инфицированного донора, а также через медицинский инструментарий для парентеральных вмешательств, изделия медицинского назначения, контаминированные ВИЧ и не подвергшиеся обработке в соответствии с требованиями нормативных документов.

3.8. Основными факторами передачи возбудителя являются биологические жидкости человека (кровь, компоненты крови,сперма, вагинальное отделяемое, грудное молоко).

3.9. Основными уязвимыми ВИЧ-инфекцией группами населения являются: потребители инъекционных наркотиков (ПИН), коммерческие секс-работники (КСР), мужчины, имеющие секс с мужчинами (МСМ). Группу повышенного риска заражения ВИЧ представляют клиенты КСР, половые партнеры ПИН, заключенные, беспризорные дети, лица, имеющие большое число половых партнеров, мигрирующие слои населения, (водители-дальнобойщики, сезонные рабочие, в том числе иностранные граждане, работающие вахтовым методом и другие), люди злоупотребляющие алкоголем и не инъекционными наркотиками, поскольку под воздействием психоактивных веществ они чаще практикуют более опасное сексуальное поведение.

3.10. Клиническое течение ВИЧ-инфекции без применения антиретровирусной терапии.

3.10.1. Инкубационный период

Инкубационный период при ВИЧ-инфекции – это период от момента заражения до ответа организма на внедрение вируса (появление клинической симптоматики или выработки антител) составляет, как правило, 2–3 недели, но может затягиваться до 3–8 месяцев, иногда до 12 месяцев. В данном периоде у инфицированного антитела к ВИЧ не обнаруживаются в связи, с чем возрастает риск передачи от него инфекции во внутрибольничных очагах, в том числе при переливании крови и ее компонентов.

3.10.2. Острая ВИЧ-инфекция.

У 30–50% инфицированных появляются симптомы острой ВИЧ-инфекции, которая сопровождается различными проявлениями: лихорадка, лимфаденопатия, эритематозно-макулопапулезная сыпь на лице, туловище, иногда на конечностях, миалгии или артралгии, диарея, головная боль, тошнота и рвота, увеличение печени и селезенки, неврологические симптомы. Эти симптомы проявляются на фоне высокой вирусной нагрузки в разных сочетаниях и имеют разную степень выраженности. В редких случаях уже на этой стадии могут развиваться тяжелые вторичные заболевания, приводящие к гибели пациентов. В данном периоде возрастает частота обращаемости инфицированных в ЛПО; риск передачи инфекции – высокий, в связи с большим количеством вируса в крови.

3.10.3. Субклиническая стадия.

Продолжительность субклинической стадии в среднем составляет 5–7 лет (от 1 до 8 лет, иногда более), клинические проявления кроме лимфоаденопатии отсутствуют. В этой стадии в отсутствии проявлений инфицированный длительно является источником инфекции. Во время субклинического периода продолжается размножение ВИЧ и снижение количества CD4 лимфоцитов в крови.

3.10.4. Стадия вторичных заболеваний.

На фоне нарастающего иммунодефицита появляются вторичные заболевания (инфекционные и онкологические). Заболевания инфекциями вирусной, бактериальной, грибковой природы сначала протекают довольно благоприятно и купируются обычными терапевтическими средствами. Первоначально это преимущественно поражения кожи и слизистых, затем органные и генерализованные поражения, приводящие к смерти пациента.

3.11. Антиретровирусная терапия (АРТ) является этиотропной терапией ВИЧ-инфекции. На современном этапе АРТ не позволяет полностью элиминировать ВИЧ из организма больного, но останавливает размножение вируса, что приводит к восстановлению иммунитета, предотвращению развития или регрессу вторичных заболеваний, сохранению или восстановлению трудоспособности пациента и предотвращению его гибели. Эффективная противоретровирусная терапия одновременно является и профилактической мерой, снижающей опасность пациента как источника инфекции.

IV. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции

4.1. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции основана на выявлении антител к ВИЧ и вирусных антигенов, а также, в особых случаях, выявлении провирусной ДНК ВИЧ и вирусной РНК ВИЧ (у детей первого года жизни).

4.2. Лабораторные исследования по диагностике ВИЧ-инфекции осуществляются в учреждениях государственной, муниципальной или частной системы здравоохранения на основании санитарно-эпидемиологического заключения и лицензии, предоставляемой в порядке, установленном законодательством Российской Федерации.

4.3. Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции служит определение антител/антигенов к ВИЧ с помощью ИФА. Для подтверждения результатов в отношении ВИЧ применяются подтверждающие тесты (иммунный, линейный блот).

4.4. Диагностический алгоритм тестирования на наличие антител к ВИЧ:

4.4.1. На первом этапе (скрининговая лаборатория).

Если получен положительный результат в ИФА, анализ проводится последовательно еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-системе, вторая сыворотка запрашивается только в случае невозможности направления для дальнейшего исследования первой сыворотки). Если получены два положительных результата из трех постановок в ИФА сыворотка считается первично-положительной и направляется в референс-лабораторию (Лаборатория диагностики ВИЧ-инфекции центра по профилактике и борьбе со СПИД) для дальнейшего исследования.

4.4.2. На втором этапе (референс-лаборатория).

Первично положительная сыворотка повторно исследуется в ИФА во второй тест-системе другого производителя, отличающейся от первой по составу антигенов, антител или формату тестов, выбранной для подтверждения. При получении отрицательного результата сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе другого производителя, отличающейся от первой и второй по составу антигенов, антител или формату тестов. В случае получения отрицательного результата (во второй и третьей тест-системах) выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ. При получении положительного результата (во второй и/или третьей тест-системе) сыворотку необходимо исследовать в иммунном или линейном блоте. Результаты, полученные в подтверждающем тесте, интерпретируются как положительные, неопределенные и отрицательные.

4.4.2.1. В целях обеспечения контроля и учета исследований референс-диагностика должна осуществляться в том же субъекте Российской Федерации, где проводилось скрининговое обследование в лаборатории уполномоченной специализированной ЛПО, осуществляющей организационно-методическую работу по проведению диагностических, лечебных, профилактических и противоэпидемических мероприятий по ВИЧ-инфекции и сопутствующим заболеваниям.

Референс-диагностика может проводиться также во ФГУН, на базе которых функционируют федеральный и окружные центры по профилактике и борьбе со СПИД, и в ФГУ Республиканская клиническая инфекционная больница (г. Санкт-Петербург).

4.4.3. Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 из 3 гликопротеинов ВИЧ (env, gag, pol).

4.4.4. Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антитела ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или имеется слабое реагирование с белком р 18.

4.4.5. Неопределенными (сомнительными) считаются сыворотки, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ. При получении неопределенного результата с белковым профилем включающим, белки сердцевины (gag) р 25, проводится исследование для диагностики ВИЧ-2.

4.4.6. При получении отрицательного и сомнительного результата в иммунном или линейном блоте рекомендуется исследовать сыворотку в тест-системе для определения р24 антигена или ДНК/РНК ВИЧ. Если был выявлен антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ, повторное обследование в иммунном или линейном блоте проводится через 2, 4, 6 недель после получения первого неопределенного результата.

4.4.7. При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ иммунном или линейном блоте через 2 недели, 3 и 6 месяцев. Если получены отрицательные результаты в ИФА, то дальнейшее исследование не требуется. Если через 6 месяцев после первого обследования вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложноположительный. (При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования проводятся повторно по назначению лечащего врача или эпидемиолога).

4.5. Для диагностики ВИЧ-инфекции у детей в возрасте до 18 месяцев, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, в связи с наличием материнских антител применяются иные подходы.

4.5.1. Для диагностики ВИЧ-инфекции у детей в возрасте до 12 месяцев, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, используют методы, направленные на выявление генетического материала ВИЧ, (ДНК или РНК). Получение положительных результатов обследования на ДНК ВИЧ или РНК ВИЧ в двух отдельно взятых образцах крови у ребенка старше одного месяца является лабораторным подтверждением диагноза ВИЧ-инфекции. Получение двух отрицательных результатов обследования на ДНК ВИЧ или РНК ВИЧ в возрасте 1–2 месяцев и 4–6 месяцев (при отсутствии грудного вскармливания) свидетельствует против наличия у ребенка ВИЧ-инфекции, однако снятие ребенка с диспансерного учета по поводу интранатального и перинатального контакта по ВИЧ-инфекции может производится в возрасте старше 1 года.

4.5.2. Снятие с диспансерного учета по ВИЧ-инфекции в возрасте 18 месяцев проводится приодновременном наличии:

– два и более отрицательных результата исследования на антитела к ВИЧ методом ИФА;

– отсутствие выраженной гипогаммаглобулинемии на момент исследования крови на антитела к ВИЧ;

– отсутствие клинических проявлений ВИЧ-инфекции;

4.5.3. Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями и достигших возраста 18 месяцев,осуществляется так же, как у взрослых.

4.6. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции может осуществляться только при использовании сертифицированных стандартизованных диагностических тест-систем (наборов), разрешенных к использованию на территории Российской Федерации в установленном порядке.

В целях проведения входного контроля качества используемых тест-систем для выявления лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, применяются стандартные панели сывороток(отраслевые стандартные образцы) разрешенные к использованию в установленном порядке.

4.7. В документе, выдаваемом лабораторией по результатам исследования, указывается наименование тест-системы, ее срок годности, серия, результат ИФА (положительный, отрицательный), результат иммунного, линейного блота (перечень выявленных белков и заключение: положительный, отрицательный, неопределенный). При конфиденциальном исследовании документ должен содержать паспортные данные: полные Ф.И.О., полную дату рождения, адрес места жительства, код контингента. При анонимном обследовании документ маркируется специально установленным кодом.

4.7.1. При получении сомнительного результата в подтверждающем тесте (иммунный, линейный блот) выдается заключение о неопределенном результате исследования и рекомендуется повторить обследование пациента до определения статуса (через 3, 6, 12 месяцев).

4.8. Простые /быстрые тесты для определения специфических антител к ВИЧ – это тесты, которые можно выполнить без специального оборудования менее, чем за 60 минут. В качестве исследуемого материала может использоваться кровь, сыворотка, плазма крови и слюна (соскоб со слизистой десен).

4.8.1. Области применения простых/быстрых тестов:

транспслантология – перед забором донорского материала;
донорство – обследование крови, в случае экстренного переливания препаратов крови и отсутствия обследованной на антитела к ВИЧ донорской крови;
вертикальная профилактика – тестирование беременных женщин с неизвестным ВИЧ-статусом в предродовом периоде (для назначения медикаментозной профилактики ВИЧ-инфекции в родах);
постконтактная профилактика ВИЧ – тестирование на ВИЧ в случае аварийной ситуации;

4.8.2. Каждое исследование на ВИЧ с применением простых/быстрых тестов должно сопровождаться обязательным параллельным исследованием той же порции крови классическими методами ИФА, ИБ.

4.9. Выдача заключения о наличии или отсутствии ВИЧ-инфекции только по результатам простого/быстрого теста не допускается. Результаты простых/быстрых тестов используются только для своевременного принятия решений в экстренных ситуациях.

В высокоспециализироваиной лаборатории проводятся:

А) определение циркулирующих в крови антител, антигенов и иммунных комплексов; культивирование вируса, выявление его геномного материала и ферментов;

Б) оценка функций клеточного звена иммунной системы. Основная роль принадлежит методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма.

Тестирование на антитела к ВИЧ осуществляют с целью:

А) безопасности гемотрансфузий и трансплантаций;

Б) эпиднадзора, тестирование в целях мониторинга превалентности ВИЧ-инфекции и изучения динамики ее распространенности в определенной популяции;

В) диагностики ВИЧ-инфекции, т. е. добровольное тестирование сыворотки крови практически здоровых людей или больных с различными клиническими признаками и симптомами, сходными с ВИЧ-инфекцией или СПИДом.

Система проведения лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции построена по трехэтапному принципу. Первый этап - скрининговый, предназначен для выполнения первичных исследований крови на наличие антител к белкам ВИЧ. Второй этап референтный - позволяет с помощью специальных методических приемов уточнить (подтвердить) первичный положительный результат, полученный на скрининговом этапе. Третий этан - экспертный, предназначен для окончательной проверки наличия и специфичности маркеров ВИЧ-инфекции, выявленных на предыдущих этапах лабораторной диагностики. Необходимость нескольких этапов лабораторной диагностики обусловлена прежде всего экономическими соображениями.

В практике применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:

ИФА (ELISA)-тecт (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими;

Иммунный блот (Western-blot), весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ - 2;

Антигенемия р25-тест, эффективный в начальных стадиях заражения;

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В случаях массового скрининга образцов крови рекомендуется тестировать смеси сывороток от группы обследуемых, составленные с таким расчетом, чтобы конечное разведение каждого образца не превышало 1:100. Если смесь сывороток оказывается положительной, проводится исследование каждой сыворотки положительной смеси. Этот способ не ведет к потере чувствительности как в ИФА, так и в иммуноблоте, но снижает трудовые затраты и стоимость первичного обследования на 60-80%.

Иммунологические методы

1. количество Т хелперов,

2. соотношение Т4 иТ8,

3. состояние гиперчувствительности,

4. компенсаторная функция Т клеточной системы.

Проявляется гиперпродукцией иммуноглобулинов, они низко аффинны и материал организма расходуется еще больше.

Недостатки: проявляются поздно, некоторые иммунологические показатели могут быть при других инфекциях.

Клинические методы – м.б. сходны с другими заболеваниями, наиболее типичные проявления регистрируются на поздних стадиях, поэтому клиническая диагностика мало эффективна

Основной метод – серологический – реализуется в 2 этапа:

1 – скрининговое обследование – отбор проб к суммарным антителам ко всем белкам иммунного анализа. Этот этап дает 95% истинных результатов и 5% ложноположительных.

2 – подтверждающий метод – все пробы исследуют с помощью подтверждающего метода. Эта методика позволяет выявить антитела к вирусному белку. Положительный результат, когда обнаружены антитела не менее чем к 3 вирусным белкам, если к 1 или к 2 результат сомнительный и требует дополнительного обследования.

При первичной серодиагностике ВИЧ-инфекции проводится определение суммарных антител с помощью скрининговых отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложный тест - иммуноблот, позволяющий не только подтвердить или отклонить первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.

Интерпретация результатов анализа на антитела к ВИЧ

Достаточно большое количество различных факторов влияет на результат анализа на антитела к ВИЧ и среди них важное значение имеет время проведения анализа после возможного заражения.

В большинстве случаев антитела к ВИЧ можно обнаружить через 6–12 недель после заражения. Этот период от попадания вируса в организм до появления определяемого количества антител называется периодом положительной сероконверсии или периодом “окна”. Есть редкие случаи появления антител через 6 месяцев после заражения, а сообщения о выявлении антител только через 1 год не имеют доказательств. В настоящее время диагностическая служба использует новые генерации методов ИФА, которые позволяют выявить антитела к ВИЧ через 3–4 недели после заражения, а определенные комбинации этих методов, так называемые стратегии тестирования, сокращают период “окна” до 2–3 недель, т.е. дают возможность выявить антитела к ВИЧ как только они начинают вырабатываться в организме.

Отрицательный результат означает, что антитела к ВИЧ в крови обследуемого не обнаружены. Такое состояние называется серонегативностью и означает, как правило, что человек не заражен.

Отрицательный результат не дает никаких гарантий на будущее. Он констатирует только состояние в момент обследования. Существует незначительный шанс, что обследование проведено в период “окна”. Поэтому, если человек раньше рисковал заразиться ВИЧ и получил отрицательный результат тестирования, необходимо пройти повторное тестирование по крайней мере через 6 месяцев после рискованного события.

Положительный результат означает, что в крови обследуемого найдены антитела к ВИЧ. Такое состояние называется серопозитивностью – человек заражен ВИЧ. Важно понимать, что положительный результат свидетельствует только о ВИЧ-инфекции, а не о заболевании СПИДом. Тем не менее, крайне важно срезу по получению положительного результата обратиться ко врачу для получения консультаций и, если нужно, медицинской помощи, что позволит поддержать качество жизни на хорошем уровне длительное время.

Неопределенный результат. В редких случаях результат анализа на антитела к ВИЧ неясен. Лаборатория не может дать ответ серопозитивен человек или серонегативен. В таких обстоятельствах необходимо проконсультироваться с врачом, и еще раз пройти тестирование.

При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:

1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в материалах от больного или ВИЧ-инфицированного

2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.

3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.

4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).

1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональнъгх антител

В последние годы решающее значение для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР) - так называемая вирусная нагрузка. Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагрузка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.

2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.

Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить антитела к различным белкам ВИЧ. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования - выявление антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.

3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:

1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбошггопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;

6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;

7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.

… диагностика любого инфекционного заболевания основана на сопоставлении эпидемиологических, клинических и лабораторных данных, и преувеличение значения одной из групп этих данных может привести к диагностическим ошибкам.

Диагностика ВИЧ-инфекции включает в себя два этапа :
I этап - установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией ;
II этап - определение стадии заболевания .

УСТАНОВЛЕНИЕ ФАКТА ЗАРАЖЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Установление собственно факта зараженности ВИЧ-инфекцией (то есть выявление ВИЧ-инфицированных) в свою очередь также включает в себя два этапа :
I этап - иммуноферментный анализ (ИФА) : метод ИФА является скрининговым (отборочным) - отбор предположительно инфицированных лиц, то есть его целью является выявление подозрительных лиц и отсеивние здоровых лиц; антитела к ВИЧ выявляют с помощью других антител к искомым антителам (антитела против других антител). Эти «вспомогательные» антитела метят ферментом. Все скрининговые тесты обязаны быть высокочувствительными, чтобы не пропустить больного. Из-за этого их специфичность не очень высокая, то есть ИФА может дать положительный ответ («вероятно болен») у неинфицированных людей (например, у больных аутоиммунными заболеваниями: ревматизм, системная красная волчанка и др.). Частота ложноположительных результатов при использовании различных тест-систем колеблется от 0,02 до 0,5%. Если у человека ИФА дало положительный результат, то для подтверждения факта инфицирования ВИЧ необходимо обследоваться дальше. При проведении ИФА в 3 - 5% случаев возможны ложноотрицательные результаты - если инфицирование произошло относительно недавно и уровень антител еще очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса антителообразования. Поэтому при наличии данных, свидетельствующих о контакте с инфицированными ВИЧ обычно проводят повторные исследования через 2 - 3 месяца.
II этап - иммуноблоттинг (в модификации Western Blot, вестерн-блот) : является более сложным методом и служит для подтверждения факта инфицирования. Этот метод выявляет не комплексные антитела к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (p24, gp120, gp41 и др.). Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если выявляются антитела хотя бы к трем белкам, один из которых кодируется генами env , другой - генами gag , третий - генами pol . Если обнаруживаются антитела к одному или двум белкам, результат считается сомнительным и требует подтверждения. В большинстве лабораторий диагноз ВИЧ-инфекции ставится, если одновременно выявляются антитела к белкам р24 , р31 , gp4l и gpl20/gp160. Суть метода: вирус разрушают на компоненты (антигены), которые состоят из ионизированных аминокислотных остатков, а потому все компоненты имеют отличающийся друг от друга заря; затем с помощью электрофореза (электрического тока) антигены распределяются на поверхности полоски - если в исследуемой сыворотке есть антитела к ВИЧ, то они будут взаимодействовать со всеми группами антигенов, а это можно выявить.

Следует помнить , что антитела к ВИЧ появляются у 90-95% инфицированных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% инфицированных антитела к ВИЧ появляются через 6 месяцев и у 0,5-1 % инфицированных антитела к ВИЧ появляются в более поздние сроки. В стадии СПИДа количество антител может снижаться, вплоть до полного исчезновения.

В иммунологии существует такое понятие, как «серологическое окно» - период от инфицирования до появления такого количества антител, которое можно выявить. Для ВИЧ этот период обычно продолжается от 2 до 12 недель, в редких случаях дольше. В период «серологического окна» по анализам человек здоров, но на самом деле является зараженным ВИЧ. Установлено, что ДНК ВИЧ может находиться в геноме человека не менее трех лет без признаков активности и антитела к ВИЧ (маркеры ВИЧ-инфицирования) не появляются.

В данный период («серологическое окно») выявить ВИЧ-инфицированного и даже через 1-2 недели после заражения возможно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это чрезвычайно чувствительный метод - теоретически можно выявить 1 ДНК на 10 мл среды. Суть метода заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции получают много копий нуклеиновой кислоты (вирус является нуклеиновой кислотой -ДНК или РНК - в белковой оболочке), которые потом выявляют с помощью меченых ферментов или изотопов, а также по характерному строению. ПЦР является дорогостоящим методом диагностики, поэтому при скрининге и в плановом порядке не используется.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

В основе развития СПИДа лежит , в первую очередь, разрушение Т-лимфоцитов-хелперов, маркируемых моноклональными антителами - кластерами дифференцировки – как CD4. В связи с этим проведение диагностики и наблюдение за прогрессированием заболевания невозможно без контроля субпопуляции Т-хелперов, который наиболее удобно осуществлять с помощью лазерного клеточного сортировщика.

При слабо выраженной ВИЧ-инфекции количество Т-лимфоцитов - чрезвычайно вариабельный показатель. В целом, снижение числа клеток CD4 (абсолютное и относительное) обнаруживается у лиц, ВИЧ-инфицирование которых произошло не менее года назад. С другой стороны, на ранних стадиях инфекции нередко оказывается резко повышенным число Т-супрессоры (CD8) как в периферической крови, так и в увеличенных лимфоузлах.

При выраженном СПИДе абсолютное большинство больных имеет сниженное общее число Т-лимфоцитов (менее 1000 в 1 мкл крови, в том числе лимфоцитов CD4 - менее чем 22 в 1 мкл, тогда как абсолютное значение содержания CD8 остаётся в пределах нормы). Соответственно, резко снижается соотношение CD4/ CD8. Ответ Т-лимфоцитов in vitro на стандартные антигены и митогены снижается в строгом соответствии с относительно сниженным числом CD4.

Для поздних стадии СПИДа характерны общая лимфопения, нейтропения, тромбоцитопения (соответственно, снижение числа лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов), анемия. Эти изменения могут быть следствием центрального угнетения кроветворения за счёт поражения кроветворных органов вирусом, а также - аутоиммунного разрушения клеточных субпопуляции на периферии. Кроме того, для СПИДа характерно умеренное увеличение количества гамма-глобулинов с доминирующим увеличением содержания IgG. Больные с выраженными симптомами СПИДа нередко имеют повышенный уровень IgA. На некоторых стадиях заболевания существенно повышается уровень таких маркёров СПИДа, как 1-микроглобулин, кислотостабильный -интерферон, 1-тимозин. То же происходит с секрецией свободного неоптерина - метаболита макрофагов. Пока не представляется возможным оценить относительную значимость каждого из перечисленных тестов, число которых постоянно возрастает. Поэтому их следует рассматривать во взаимодействии с маркёрами ВИЧ-инфекции как иммуновирусологического, так и цитологического характера. Для клинического анализа крови характерны лейкопения, лимфопения (соответственно, снижение числа лейкоцитов и лимфоцитов).

1 стадия - «стадия инкубации » - антитела к ВИЧ еще не выявляются; диагноз ВИЧ-инфекции на данной стадии ставится на основании эпидемиологических данных и лабораторно должен подтверждаться обнаружением в сыворотке крови пациента вируса иммунодефицита человека, его антигенов, нуклеиновых кислот ВИЧ;
2 стадия - «стадия первичных проявлений » - в данном периоде уже имеется выработка антител:;
2А стадия - «бессимптомная » - ВИЧ-инфекция проявляется только выработкой антител;
2Б стадия - «острая ВИЧ-инфекция без вторичных заболеваний » - в крови больных могут обнаруживаться широкоплазменные лимфоциты - «мононуклеары» и часто отмечается транзиторное снижение уровня СD4-лимфоцитов (острая клиническая инфекция отмечается у 50-90% инфицированных лиц в первые 3 месяца после заражения; начало периода острой инфекции, как правило, опережает сероконверсию, т.е. появление антител к ВИЧ);
2В стадия - «острая ВИЧ-инфекция с вторичными заболеваниями » - на фоне снижения уровня СD4-лимфоцитов и развившегося вследствие этого иммунодефицита появляются вторичные заболевания различной этиологии (ангина, бактериальная и пневмоцистная пневмония, кандидозы, герпетическия инфекция и др.);
3 стадия - «латентная » - в ответ на прогрессирование иммунодефицита происходит модификация иммунного ответа в виде избыточного воспроизводства СD4-клеток с последующим постепенным снижением уровня СD4-лимфоцитов, в среднем со скоростью 0,05-0,07x109/л в год; в крови обнаруживаются антитела к ВИЧ;
4 стадия - «стадия вторичных заболеваний » - истощение лимфоцитов популяции CD4, концентрация антител к вирусу значительно снижается (в зависимости от тяжести вторичных заболеваний выделяют стадии 4А, 4Б, 4В);
5 стадия - «терминальная стадия » - типично снижение количества СD4-клеток ниже 0,05x109/л; концентрация антител к вирусу значительно снижается или антитела могут не определяться.