Bacillus cereus
Bacillus cereus - это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки. Они вызывают у людей желудочные заболевания (диарею и др.), а также септицемию, эндокардит, поражения центральной нервной системы. Заболевание, как правило, непродолжительное и прекращается без какого-либо лечения, однако зарегистрированы также и единичные смертельные случаи. Отчетность о пищевых отравлениях Bacillus cereus не регистрируется, поскольку отмечено относительно низкое число случаев, вызванных ими заболеваний (до 1% от общего числа). Частота заболеваний географически варьирует. Так, в отдельных странах они составляют менее 1% всех пищевых отравлений, в то время как в других - более 30%. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения - это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. В дополнение к этим двум токсинам некоторые штаммы Bacillus сereus продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин (ЕТЕ). Предполагается, что вначале энтеротоксин ЕТЕ накапливается в пище, причем чаще в продуктах, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. По указанным причинам контроль названных продуктов на содержание энтеротоксинов с применением надежных ускоренных методов тестирования становится все более актуальным.

Патогенность, масштабы заболевания
Bacillus cereus является условно патогенным микроорганизмом, котрый вызывает у человека спорадические пищевые отравления. Bacillus cereus повсеместно распространен в природе. Этиологическая роль Bacillus cereus при пищевых отравлениях первоначально изучена и описана Наugе в 1950 г. Источником пищевых отравлений, обусловленных Bacillus cereus, сперва считали кулинарные изделия, содержащие картофельный крахмал. Затем были описаны вспышки аналогичных отравлений, обусловленные растительными, мясными, рыбными и другими пищевыми продуктами. Наиболее быстро Bacillus cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г, в консервах присутствие Bacillus cereus не допускается. В стерилизованных мясных консервах при соблюдении установленных технологических режимов, клетки этой бактерии отсутствуют. Когда в консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20 о С может отмечаться размножение возбудителя. На поверхности продукта при этом появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция.

Bacillus cereus способен вызывать диарейный синдром также у животных, птиц и насекомых по истечении 6-18 ч после поедания ими зараженного корма. Первично это обусловлено несколькими видами токсинов (NHE, НBL, bc-D-ENT), содержащимися в инфицированной пище, а впоследствии - размножением бактерии в кишечнике. Этот комплекс токсинов Bacillus cereus вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике. При постановке биопробы на мышах у животных в месте введения наблюдается некроз кожи, а в последующем гибель.

Морфология бактерий и колоний
Палочковидные (0,9-1,5 х 3-5 мкм), спорогенные хемоорганотрофные аэробные или факультативно-анаэробные бактерии из семейства Bacillaceae (под микроскопом клетки-палочки с обрубленными концами внешне напоминают восковые свечи). Эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки, жгутики - перетрихиально. Бактерии морфологически сходны с Bасillus anthracis, но обладает подвижностью. На селективном агаре образуют колонии диаметром 1,5-2 мм, окруженные зонами преципитата диаметром 4-5 мм. В первые часы роста колонии округлые, выпуклые, затем края колоний становятся изрезанными. Выросшие на агаре колонии имеют восковидный вид. На жидких средах Bacillus cereus образует хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона.

Физиолого-биохимические особенности
Bacillus сereus - аэроб, но может расти и при недостатке кислорода. На МПА образует крупные, распластанные, серовато-беловатые колонии с изрезанными краями, некоторые штаммы продуцируют розовато-коричневый пигмент, на кровяном агаре вырастают колонии с широкими, резко очерченными зонами гемолиза; на МПБ образует нежную пленку, пристеночное кольцо, равномерное помутнение и хлопьевидный осадок на дне пробирки. Все штаммы Bacillus cereus интенсивно растут при рН = 9-9,5, при рН 4,5-5 рост клеток прекращается. Оптимальная температура роста - 30-32 о С, максимальная - 37-48 о С, минимальная 10 о С. Бациллы чувствительны к действию гамма-фага, гемолизируют эритроциты барана, обладают высокой протеолитической активностью - 80% штаммов разжижают желатин в течение 1-4 суток. Расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инсулин, дульцит и декстрин. Бациллы продуцируют энтеротоксины только in vivo, патогенны для белых мышей и морских свинок.

Источники и факторы передачи инфекции
Основной средой обитания Bacillus cereus является почва с нейтральной или слабощелочной реакцией. Из почвы патоген попадает в воздух, воду, пищевые продукты, на одежду и руки людей, кожные покровы животных, на поверхность оборудования пищевых предприятий. Из кишечника здоровых людей и животных Bacillus cereus выявляется редко и в небольших количествах. Размножению Bacillus cereus препятствуют кислая среда и высокая концентрация сахара. При хранении зараженной пищи в холодильнике (при 0…+4°С) патоген не размножается.

Патогенез
Пищевые токсикоинфекции проявляются при употреблении в пищу продукта, содержащего большое количество живых клеток Bacillus cereus, продуцирующих энтеротоксины. Пищевые токсикоинфекции возникают в случаях, когда живые микроорганизмы вследствие различных санитарных и технологических нарушений при приготовлении, хранении и реализации пищевых продуктов, попав в них, начинают интенсивно размножаться и при приеме пищи попадают в организм человека в больших количествах. Инкубационный период у больного колеблется от 3-4 до 10-16 ч. Болезнь возникает внезапно, сопровождается рвотой и острой диареей. Летальность менее 1% и отмечается крайне редко: у лиц с ослабленным здоровьем, главным образом у стариков и детей. Попав в желудочно-кишечный тракт, микробы по лимфатическим путям проникают в кровь, вызывая бактериемию. При этом поступившие в кровь из первичного очага микробы в ней не размножаются, а лишь транспортируются в другие органы и ткани. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы бактерии размножаются. Продуцируемый бациллами эндотоксин поражает лимфатический аппарат кишечника, вызывая дистрофические изменения в стенках кишок. Общее недомогание обусловлено действием эндотоксина на центральную нервную систему. Последствием перенесения токсикоинфекции является бактерионосительство, причем в некоторых случаях довольно длительное. Для окружающих больные не опасны; контактное заражение отсутствует, поскольку возбудитель выделяется с рвотными массами и испражнениями непродолжительное время и обладает малой патогенностью. Клиническая картина выражается проявлениями гастроэнтерита (коликообразные боли в животе, тошнота, диарея). Энтеротоксины влияют на транспорт жидкости, электролитов и глюкозы клетками кишечника. Температура тела заболевшего человека обычно в пределах нормы, либо повышается незначительно. Более тяжелые формы заболевания сопровождаются резкой головной болью, рвотой, судорогами и даже потерей сознания. Продолжительность пищевой токсикоинфекции до 4-6 суток. На основании превалирующих симптомов пищевого отравления, вызванного Bacillus cereus, выделяют две формы заболеваний: диарейную и токсикозоподобную (рвотную). Диарейный тип пищевого отравления чаще возникает при употреблении некачественных мяса, рыбы, молока, овощей. При диарейной форме клиническая картина развивается через 24 ч после употребления инфицированного продукта. Температура, как правило, не повышается. Диарейная форма развивается при поступлении в организм больших количеств Bacillus cereus (свыше 10 6 микробных клеток), продуцирующих энтеротоксины диарейного типа. Токсикозоподобная (рвотная) форма пищевого отравления имеет чрезвычайно короткий инкубационный период 0,5-6 ч. Характеризуется тошнотой и рвотой, длящейся до 24 ч. В инфицированном продукте и рвотных массах регистрируется специфический термостабильный рвотный энтеротоксин. Возникновение конкретной формы пищевого отравления зависит от условий размножения Bacillus cereus. Рвотная форма заболевания связана, как правило, с контаминацией крупяных, картофельных и макаронных блюд, салатов, пудингов, соусов. Во всех случаях интенсивному накоплению бактерий и стимулированию токсинообразования способствует нарушение температурных условий и сроков хранения готовых к употреблению блюд и скоропортящихся продуктов. При этом интенсивное размножение Bacillus cereus в таких продуктах происходит при температуре выше 15°С.

Методы обнаружения

Классический метод
Метод основан на выделении Bacillus cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта или его разведения на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к Bacillus cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам [ГОСТ 10444.8-88].

Препарат Бактисубтил создан специально в рамках программы микробиологической безопасности французской фармацевтической компанией Patheon France. Пробиотик эффективен как в лечении желудочно-кишечных заболеваний, так и в профилактических целях. Способствует быстрому восстановлению нарушенной микрофлоры кишечника, нормализует обменные процессы в организме, повышает иммунитет.

Эффективность Бактисубтила доказана клиническими исследованиями. Препарат имеет мощное действие, полностью восстанавливающее структуру нарушенной микрофлоры ЖКТ, обладает широким спектром действия.

В состав препарата входят бактерии штамма Bacillus cereus IP 5832 в высушенном виде. Споры полезных бактерий устойчивы к воздействию желудочного сока, поэтому беспрепятственно попадают в тонкий и толстый кишечник в активном виде. Подавляют условно-патогенные и патогенные микроорганизмы.
Кроме этого, в состав средства входит кальция карбонат, каолин. Оболочка капсул изготовлена из титана диоксида и пищевого желатина.  Желатиновые капсулы имеют белый цвет.

Действие Бактисубтила

Эффективно и быстро восстанавливается нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта. Пробиотик имеет бактериальное противодиарейное, противомикробное действие.
Повышаются защитные силы организма. Предотвращаются заболевания кишечника, органов дыхания, поджелудочной железы, желудка.
Нормализуются нарушенные пищевые процессы.
Выводятся токсины, продукты распада.
Уменьшаются проявления язвенной болезни, панкреатита, гастрита, кишечного и вагинального дисбактериоза.
Препятствует нарушению синтеза.
Обладает детоксикационным действием.
Способствует образованию витаминов группы В
Снижается заболеваемость инфекционными, респираторными заболеваниями.
Средство показано в лечении и профилактике заболеваний детям с первых дней жизни.

Показания к применению

диарея, в том числе в лечении дисбактериоза;
нарушенный обмен веществ;
иммунодефицитное состояние;
бактериальные заболевания желудочно-кишечного тракта;
для устранения симптомов кишечного, влагалищного дисбаланса на любых стадиях;
гепатит, язвенная болезнь;
при синдроме избыточного бактериального роста;
стрессогенный кишечник;
энтерит, энтероколит;
повышенное газообразование;
аллергия на химические, бытовые, пищевые, растительные раздражители;
при избыточной массе тела;
хронические запоры;
при отравлениях, включительно с алкогольным;
при синдроме хронической усталости;
после лучевой терапии или курса лечения противомикробными препаратами, антибиотиками.

Курс лечения – от 1 до 4 недель, в зависимости от выраженных симптомов. При необходимости курс может быть увеличен по рекомендации лечащего врача.

При остром заболевании кишечника – по одной капсуле 4-6 раз в день, начиная с 12-ти летнего возраста. При остром течении болезни принимается до 10 капсул в сутки, но не более.

Детям с 3 до 12 лет – по 1 капсуле 3-4 раза в сутки.
Детям до трехлетнего возраста – по 1-2 капсулы в день.
При хронических заболеваниях или в профилактических целях – по 1 капсуле 2 раза в сутки.

Особенность: детям грудного возраста необходимо разбавить содержимое капсулы в небольшом количестве грудного молока, воды комнатной температуры, детской смеси или сока. Запрещается разводить в горячем напитке!

Побочные действия

Аллергия на любой из компонентов, входящих в состав пробиотика – высыпания, зуд, аллергический ринит, отек гортани, покраснение кожи.

Бактисубтил не вызывает побочных действий при рекомендуемых дозировках.

Противопоказания

1. Гиперчувствительность к активному веществу препарата.
2. СПИД.
3. При трансплантации.

Взаимодействие с лекарственными препаратами

Пробиотик разрешается одновременно принимать с сульфаниламидными препаратами или антибиотиками.
При взаимодействии с этанолом действие средства снижается, поэтому во время лечения Бактисубтилом не рекомендуется употреблять алкогольные напитки.

Применение средства при беременности и в лактационный период

Бактисубтил – одно из немногочисленных средств, которое не имеет противопоказаний в период беременности или кормления грудью. Объясняется это тем, что компоненты, входящие в его состав, не имеют свойств накапливаться в организме, поэтому исключена возможность их проникновения в грудное молоко или плаценту.

Аналоги

По структуре, приближенной максимально к Бактисубтилу, аналогов не имеется. Однако есть пробиотики, обладающие схожим фармакологическим действием и дающие не менее положительные лекарственные эффекты.

При выборе аналогов, следуют учитывать такие его характеристики:

при вирусной природе расстройства желудочно-кишечного тракта необходимо выбирать средства с высоким содержанием лактобактерий;
при подозрениях на бактериальную инфекцию подойдут комбинированные препараты синбиотики, содержащие одновременно бифидобактерии и лактобактерии;
при грибковом поражении органов желудочно-кишечного тракта назначаются средства, содержащие бифидобактерии.

Пробиотики отличаются по своему воздействию на организм, количественному и качественному составу полезных микроорганизмов и по стоимости.

Сравнительные характеристики некоторых аналогов Бактисубтила

Линекс . Как и Бактисубтил, способствует быстрому восстановлению нарушенной микрофлоры. Линекс имеет такие отличия: в его состав входит одновременно три компонента — бифидобактерии, лактобактерии, энтерококк. Поэтому он признан более действенным препаратом в лечении дисбактериоза.
Бифиформ . Содержит в составе бифидобактерии, энтерококки. Имеет аналогичный спектр действий. Противопоказание – гиперчувствительность к любому компоненту.
Энтерофурил . Относится к противомикробным препаратам, назначаемых в лечении инфекционных заболеваний кишечника. Более эффективен при диареи, но менее эффективен в лечении дисбактериоза.
Бактистатин . Комплексный пробиотик, изготовленный на основе лиофилизированных дрожжей. Быстро подавляет гнилостные процессы, ускоряет гибель вредных бактерий, грибов. Рекомендуется при диарее любого генеза. Малоэффективен при дисбактериозе.
Пробифор . Противомикробный препарат, обладающий широким спектром действия. Активен в отношении многих грамположительных энтеробактерий. Показан в лечении бактериальных инфекций, диареи.
Лактобактерин . Содержит высокое количество лактобактерий. Рекомендуется при соматических заболеваниях ЖКТ, осложненных дисбактериозом, при язвенных и хронических колитах, в предродовой подготовке для исключения риска развития септического осложнения.
Примадофилус . Биологически активная пищевая добавка, имеющая восстанавливающие свойства, синбиотик широкого спектра действия. Препарат препятствует развитию гнилостной и гноеродной флоры в кишечнике, усиливает перистальтику, стимулирует выработку витаминов. Рекомендуется при влагалишном и кишечном дисбактериозе, диареи, после длительного курса приема антибиотиков, ротавирусных инфекциях, пищевой аллергии, несбалансированном питании, любых формах диатеза у детей.

Также альтернативой Бактисубтилу являются следующие препараты:

Колибактерин;
Гастрофарм;
Ацилакт;
Флонивин БС;
Регулин;
Адвантан;
Диалин;
Альгилак;
Узара;
Симбиолакт;
Биоспорин;
Легколакс;
Энтерол;
Стоперан;
Поносол;
Аципол;
Карболонг;
Флорин Форте Сеньор;
Стопдиар;
Эубикор;
Орсоль.

В ходе клинических и микробиологических исследований Бактисубтила были сделаны выводы: средство быстро изменяет внутриполостную среду толстой кишки, способствует положительным изменениям микробиоценоза ЖКТ, эффективно в лечении и профилактике дисбиотических нарушений.

(лат. Bactisubtil ® ) — бактериальный противодирейный лекарственный препарат.

Действующее вещество бактисубтила — бациллы штамма IP 5832 (ATCC 14893) вида Bacillus cereus — микроорганизма, близкого сенной палочке .

Одна капсула бактисубтила содержит 35 мг (10 9 спор) высушенного порошка бактерий штамма Bacillus cereus IP 5832.

Механизм действия бактисубтила

Споры бацилл Bacillus cereus , будучи устойчивы к желудочному соку , проходят неповреждёнными в кишечник , где превращаются в активные формы, которые выделяют антибактериальные вещества широкого спектра действия, подавляющие развитие патогенных и условно патогенных бактерий, оказывающие противомикробное, противодиарейное действие, восстанавливает кишечную микрофлору.

Бактисубтил обладает антимикробной активностью и может использоваться при бактериальных инфекциях при невозможности приема антибиотиков или для селективной деконтаминации тонкой кишки при синдроме избыточного бактериального роста. Споры этих бактерий, превращаясь в толстой кишке в активные формы, вырабатывают в процессе жизнедеятельности кислые метаболиты — органические кислоты. При этом рН сдвигается в кислую сторону и подавляется рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (E.А. Белоусова, А.Р. Златкина).

Показания к применению бактисубтила

острая и хроническая диарея различной природы, в том числе инфекционная
дисбиоз кишечника, включая вызванный приёмом антибиотиков
энтерит и энтероколит
профилактика и лечение нарушений кишечника, вызванных химио- или радиотерапией.

Порядок приема бактисубтила и дозы

Бактисубтил принимают за час до еды. Запивать только холодной жидкостью. Прием бактисуптила нельзя совмещать с алкоголем. Длительность терапии бактисубтилом — 7-10 дней.

Взрослые и подростки принимают по 2 капсулы бактисубтила 2-4 раза в сутки.
Дети старше 7 лет принимают по 1-2 капсулы бактисубтила 2-3 раза в сутки.

При отсутствии улучшения от лечения бактисубтилом в течение трех дней дальнейший его прием нецелесообразен.

Общая информация

Бактисубтил — рецептурное лекарство. Лечение бактисубтилом допустимо только по назначению врача.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893). Осуществляют совместную инкубацию в физиологическом растворе выделенного штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре и выделенной чистой культуры условно-патогенного микроорганизма (УПМ) из фекалий пациента. Полученную смесь высевают по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества УПМ на среде с пенициллином по сравнению с количеством УПМ на среде без него определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма УПМ, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма УПМ, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение обеспечивает подавление штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) без ущерба для всхожести тест-культур УПМ. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с целью индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение может быть использовано также в гастроэнтерологии для индивидуального подбора эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), при лечении дисбактериоза кишечника.

Среди препаратов для коррекции измененного микробиоценоза кишечника важное место занимают эубиотики, предназначенные для подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus, которые не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, элиминируются вскоре после отмены и являются мощными антагонистами неродственных микроорганизмов за счет продукции лизоцима, протеолитических ферментов и бактериоцинов . Известно, что наиболее эффективно бациллы подавляют патогенные энтеробактерии и некоторые условно-патогенные микроорганизмы, колонизирующие кишечный биотоп: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и другие условно-патогенные энтеробактерии .

Одним из наиболее широко применяемых эубиотических препаратов во многих странах является препарат «Бактисубтил» (Франция), основным действующим началом которого является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) . Известен также эубиотик «Флонивин», основным действующим началом которого также является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), БС Производитель Galenika, A.D., Serbia.

Производственные штаммы рода Bacillus не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства к эпителиальным клеткам кишечника слабо выражены. Исходя из того, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой , то об эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при диагностике дисбактериоза кишечника, можно судить по наличию или отсутствию антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893).

Бактериоцины или бактериоциноподобные субстанции продуцируются бациллами преимущественно экстрацеллюлярно и способны накапливаться в питательной среде . Благодаря этому, теоретически антагонистическую активность бацилл можно выявить с использованием различных модификаций методов прямого или отсроченного антагонизма, традиционно используемых лишь для выявления антагонизма пробиотических лакто- и бифидобактерий: методом штрихов , методом отсроченного антагонизма по Фредерику с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом , методом двуслойного агара .

Для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) нами использовались вышеперечисленные методики.

Для оценки антагонистической активности бацилл методом прямого антагонизма по диаметру чашки Петри с питательным агаром штрихом засевали суспензию суточной культуры B.cereus в концентрации 1×10 9 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Перпендикулярно подсевали культуры условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. Инкубировали при 37°С 24 часа. Наличие антагонистической активности учитывали по наличию задержки роста тест-штаммов.

При оценке антагонистической активности бацилл методом отсроченного антагонизма тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов засевали через 24 и 48 ч после посева бацилл.

В рассмотренных вариантах оценки антагонизма штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по собственным данным, штамм не проявлял антагонистической активности в отношении тест-культур условно-патогенных микроорганизмов (80 штаммов). Некоторые активно подвижные штаммы условно-патогенных микроорганизмов (P. aeruginosa, E. coli) росли на поверхности бациллярных колоний.

Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры . Поэтому нами была также использована методика отсроченного антагонизма с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом . Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) засевали уколом в застывший 1,5% питательный агар, разлитый в чашки Петри, выращивали 48 часов при 37°С. После инкубации полученную культуру убивали парами хлороформа и наслаивали суспензию тест-культуры условно-патогенного микроорганизма. Для этого смешивали 0,1 мл культуры в конечной концентрации 10 8 клеток по оптическому стандарту мутности с 2,5-3 мл растопленного и остуженного до температуры 46-48°С 0,7% полужидкого агара. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предполагаемыми бактериоцинами.

Аналогичные данные нами были получены методом модифицированного двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является метод перевернутого агара, который описан для выявления антагонистической активности пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей . Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют количественно по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без пробиотических штаммов.

Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli. Но оценка антагонистического влияния на другие условно-патогенные микроорганизмы (не оппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Проверка данной методики с использованием эубиотического штамма-продуцента Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 80 тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, не позволила нам выявить ни одного случая антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).

Для оценки антагонистической активности лакто- и бифидосодержащих пробиотиков также описаны методики совместного культивирования в жидкой среде с различными косвенными способами оценки , не подразумевающими последующий высев на плотную питательную среду для определения количества подавляемых УПМ.

Таким образом, ни один из известных способов выявления антагонистической активности пробиотических лакто- и бифидобактерий, по данным авторов, не позволил выявить антагонистическую активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

В литературных источниках нами также не обнаружен способ индивидуальной оценки эффективности препарата «Бактисубтил» или других эубиотических препаратов, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Задачей изобретения является выявление антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Техническим результатом изобретения является подавление эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур.

Технический результат достигается тем, что выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Способ осуществляется следующим образом:

Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий пациента и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, являющийся основным действующим началом эубиотика. Нами выделялась чистая культура Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), из эубиотика «Бактисубтил». 1 мл суспензии тест-культуры условно-патогенного микроорганизма в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивают с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Смесь инкубируют 48 ч при 37°С. Затем осуществляют высев по Gold. Для этого проводят количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводят контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывают по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости. При выявлении более одного УПМ из фекалий больного описанную процедуру осуществляют с каждым из УПМ. При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с контрольным высевом определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Наличие или отсутствие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) является оценочным критерием для определения эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

Выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого;

Выделяют чистую культуру Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), являющуюся основным действующим началом эубиотика;

После чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе;

Последующий высев смеси на питательную среду по Gold;

Высев осуществляют на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него;

При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов;

При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

Индивидуальность выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, а в свою очередь, и индивидуальность оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, обеспечивается выделением условно-патогенных микроорганизмов в чистой культуре из фекалий обследуемого и выделением чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) с последующей совместной инкубацией в физиологическом растворе и высевом по Gold на питательную среду.

Высев по Gold на питательную среду необходим для определения количества подавляемых УПМ.

Питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без ущерба для всхожести тест-культур, что позволяет выявлять антагонистическую активность B. cereus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

В качестве тест-культур изучали штаммы условно-патогенных микроорганизмов, изолированные от пациентов с дисбактериозом кишечника - по 20 изолятов S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli с типичными свойствами, E. coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P. aeruginosa.

1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или условно-патогенных бактерий использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости 1 .

Для подавления роста бацилл на среде высева предварительно подобрали селективную добавку - антибиотик в концентрации подавляющей бациллы, но не угнетающей рост микроорганизмов, исходя из данных о распространенной среди тестируемых условно-патогенных бактерий (особенно энтеробактерий) устойчивости к пенициллину и стрептомицину . В растопленный и остуженный до 46-48°С питательный агар вносили разные концентрации антибиотиков. При тестировании сред со стрептомицином препарат вносили в концентрациях 1,0 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл, 0,25 ЕД/мл среды. Засевали 25 культур УПМ и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в концентрации 10 9 клеток/мл на среды с антибиотиками и без них. Однако рост бацилл подавлялся не полностью - с 10 9 до 10 4 клеток/мл при максимальной концентрации стрептомицина 1,0 ЕД/мл среды. В то же время выделенные при диагностике дисбактериоза культуры УПМ (Klebsiella spp., Enterobacter spp., атипичные E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) в разной степени подавлялись стрептомицином в 74 (96%) тестах (Таб.2 - Подбор антибиотика для подавления Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При тестировании сред с пенициллином добавляли препарат в концентрациях 0,001 ЕД/мл, 0,01 ЕД/ мл, 0,1 ЕД/мл, 1,0 ЕД/мл среды. Посев и учет результатов проводили аналогично. Условно-патогенные энтеробактерии не подавлялись даже максимальной концентрацией пенициллина 1,0 ЕД/мл среды. Отмечалось более интенсивное подавление S. aureus. Приемлемый уровень всхожести условно-патогенных бактерий, включая S. aureus, при одновременном полном подавлении штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) отмечался при концентрации пенициллина 0,01 ЕД/ мл питательной среды (Табл.2 - Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).

При наличии антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Оценочным критерием для индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, нами выбрана антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Это объясняется тем, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой.

Совокупность существенных отличительных признаков заявляемого способа является новой и позволяет подавлять эубиотический Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при исследовании на дисбактериоз кишечника от пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Примеры конкретного выполнения:

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 247) выявлен Citrobacter freundii в количестве 5×10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры Citrobacter freundii, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенной из эубиотика "Бактистатин", в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii (№ 247). Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 512) выявлен S aureus в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры S aureus, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток/мл по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация S aureus составила 5×10 6 КОЕ/г, в опытном варианте - 10 6 КОЕ/г. Антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма S aureus не выявлена (№ 512). Препарат «Бактисубтил» определяют как неэффективный в отношении штамма S aureus, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 429) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 4 КОЕ/г, Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г, Staphylococcus aureus в количестве 10 4 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных от пациента штаммов условно-патогенных микроорганизмов, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 4 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Staphylococcus aureus составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 10 6 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении данных штаммов, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 449) выявлены Enterobacter agglomerans в количестве 10 6 КОЕ/г, Klebsiella pneumoniae в количестве 5×10 4 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 3 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 6 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii, не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii и неэффективный в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№ 461) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 6 КОЕ/г и Citrobacter freundii в количестве 10 6 КОЕ/г.

1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 9 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 2 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста всех выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.

В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 7 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 5 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 8 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 7 КОЕ/г.

Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и неэффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.

С использованием разработанной среды с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл изучали антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) Да и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при исследовании на дисбактериоз кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E. coli (15), E. coli с атипичными свойствами (15). Антагонистическую активность эубиотика оценивали по числу подавляемых им штаммов тестируемых микроорганизмов (в %) (Табл. 3 - Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов).

Исследования показали, что изучаемый штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) подавляет 17,7% (17 изолятов) испытуемых штаммов УПМ.

Однако снижение количества условно-патогенных микроорганизмов было незначительным - на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0% (81 изолят) испытуемых штаммов.

Заявляемый способ позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного при диагностике дисбактериоза кишечника у пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Таблица 1
Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости
А	I	II	III	К-во в 1 мл
1-6	-	-		<1000
8-20	-	-	-	3000
20-30	-	-	-	5000
30-60	-	-	-	10000
70-80	-	-	-	50000
100-150	5-10	-	-	100000
не сосч.	20-30	-	-	500000
-"-	40-60	-	-	1 млн.
-"-	100-150	10-20	-	5 млн.
-"-	не сосч.	30-40	-	10 млн.
-"-	-"-	60-80	Единичные колонии	100 млн.

Таблица 2
Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов
Рост УПМ при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	Количество штаммов УПМ, выросших при данной концентрации антибиотика, абс (%)
Стрептомицин, ЕД/мл среды	Пенициллин, ЕД/мл среды
1,0	0,5	0,25	1,0	0,01	0,01	0,001
10 8 (идентично контролю)	1 (4)	8 (32)	10 (40)	16 (64)	19 (76)	22 (88)	23 (92)
10 6	4 (16)	2 (8)	0	4 (16)	3 (12)	3 (12)	2 (8)
10 5	15 (60)	12 (48)	15 (60)	5 (20)	3 (12)	0	0
10 4	3 (12)	3(12)	0	0	0	0	0
<10 4	2 (8)	0	0	0	0	0	0
Рост Bacillus cereus при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл	10 4	10 4	10 4	Отс.	Отс.	Отс.	10 4

Таблица 3
Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов
Тест-культуры УПМ	Кол-во штаммов	Чувствительные штаммы абс (%)	Устойчивые штаммы абс (%)*
Снижение на 1 lg	Снижение на 2 lg	Всего устойчивых штаммов	Из них способны к росту в присутствии эубиотика**
Klebsiella spp	17	1 (5,9)	0	16(94,1)	1 (6.25)
Enterobacter spp	15	4 (26,7)	1 (6,6)	10 (66,7)	1(10)
Citrobacter spp	16	5(31,3)	0	11 (68,7)	1 (9,1)
типичная E. coli	15	1 (6,7)	0	14 (93,3)	0
атипичная E. coli	15	2(13,3)	0	13 (86,7)	1 (7,7)
S. aureus	20	3 (15,0)	0	17 (85,0)	6 (35,3)
* - количество УПМ по сравнению с контролем не изменилось или изменилось не более, чем на 0,5 lg ** - количество УПМ по сравнению с контролем увеличилось

Источники информации

1. Осипова И.Г., Михайлова Р.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров А.А. Споровые пробиотики // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.113-119.

2. Блинкова Л.П., Семенова С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1994. - № 5. - С.71-75.

3. Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов. / Патент RU 2142287 , опубл. 10.12.99. - Бюл. N20.

4. Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности. / Патент RU N2182172, опубл. 10.05.02.

5. Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Э.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных мышей // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 2. - С.91-94.

6. Давыдов Д.С., Мефед К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Мировое применение споровых пробиотиков в практике здравоохранения // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А36.

7. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - № 2. - С.20-23.

8. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С.109-113.

9. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - № 2. С.64-69.

10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et etendue varibile de leur champ d"action. Ibid: 1031-1033.

11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.

12. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - № 5. - С.94-98.

13.Ушакова Н.А., Чернуха Б.А. Влияние температурного шока на биологическую эффективность пробиотика Bacillus subtilis 8130 // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А70.

14. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 5. С.53-54.

15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. / RU Патент № 2187801, опубл. 20.08.2002.

16. Зыкова Н.А., Молокеева Н.В. Новый пробиотический препарат «Трилакт» // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С.А42.

17. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР № 535. - 1986.

18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Twenty-ninth edition The Sanford Guid to antimicrobial therapy, 1999.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, заключающийся в том, что выделяют условно-патогенные микроорганизмы в чистой культуре из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus ШТАММ IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.

Bacillus cereus

Отличительные особенности бацилл: представлены крупными прямыми палочками, положительно окрашивающимися по Граму, способны образовывать споры в аэробных условиях, единственным патогенным для человека видом выступает Bacillus anthracis (палочка сибирской язвы), некоторые условно-патогенные виды также способны вызывать пищевые интоксикации и госпитальные инфекции. Бациллы выделяют из почвы, пресной и морской воды, а также с растений. Они могут расти в интервале температур от 5 до 75 °С, а их выживанию в экстремальных условиях способствует спорообразование. Госпитальные поражения (пневмонии, септицемии, эндокардиты, менингиты и др.) вызывают В. subtilis, В. cereus и В. megaterium (рис. 4, см. цветную вклейку), В. alvei, В. laterosporus, В. pumilus, В. thuringiensis и В. sphaericus. Поражения регистрируют сравнительно редко, а их развитию у человека способствуют широкая распространённость бактерий и высокая устойчивость их спор к различным воздействиям.

Bacillus cereus – это повсеместно встречающиеся грамположительные, спорообразующие, подвижные палочки.

Систематическое положение микроорганизма.

Семейство

Fungi impcrfecti

Eubacteriales

Bacillaceae

Bacillus

subtilis

Они вызывают у людей желудочные заболевания (диарею и др.), а также септицемию, эндокардит, поражения центральной нервной системы. Заболевание, как правило, непродолжительное и прекращается без какого-либо лечения, однако зарегистрированы также и единичные смертельные случаи. Отчетность о пищевых отравлениях Bacillus cereus не регистрируется, поскольку отмечено относительно низкое число случаев, вызванных ими заболеваний (до 1% от общего числа). Частота заболеваний географически варьирует. Так, в отдельных странах они составляют менее 1% всех пищевых отравлений, в то время как в других – более 30%. Bacillus сereus выделяется из продуктов сравнительно часто, что делает этот вид бактерий значимым индикаторным тест-организмом для пищевой промышленности. Пищевые продукты, подверженные наиболее частому риску заражения – это мясные и молочные продукты, овощи, супы, специи и, в особенности, продукты детского питания. Почти все штаммы Bacillus сereus продуцируют токсины. Цитотоксические энтеротоксины продуцируют почти 95% изолятов Bacillus сereus. Из них негемолитический энтеротоксин (NHE) продуцируют более чем 90% штаммов, а гемолизин BL (HBL) около 55% исследованных штаммов. Полагают, что HBL и NHE образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами Bacillus сereus. В дополнение к этим двум токсинам некоторые штаммы Bacillus сereus продуцируют термостабильный рвотный энтеротоксин (ЕТЕ). Предполагается, что вначале энтеротоксин ЕТЕ накапливается в пище, причем чаще в продуктах, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. По указанным причинам контроль названных продуктов на содержание энтеротоксинов с применением надежных ускоренных методов тестирования становится все более актуальным.

Патогенность, масштабы заболевания

Bacillus cereus - Dextrose casein-peptone agar

Bacillus cereus является условно патогенным микроорганизмом, котрый вызывает у человека спорадические пищевые отравления. Bacillus cereus повсеместно распространен в природеЭтиологическая роль Bacillus cereus при пищевых отравлениях первоначально изучена и описана Наugе в 1950 г. Источником пищевых отравлений, обусловленных Bacillus cereus, сперва считали кулинарные изделия, содержащие картофельный крахмал. Затем были описаны вспышки аналогичных отравлений, обусловленные растительными, мясными, рыбными и другими пищевыми продуктами. Наиболее быстро Bacillus cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г, в консервах присутствие Bacillus cereus не допускается. В стерилизованных мясных консервах при соблюдении установленных технологических режимов, клетки этой бактерии отсутствуют. Когда в консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20 о С может отмечаться размножение возбудителя. На поверхности продукта при этом появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция. Bacillus cereus способен вызывать диарейный синдром также у животных, птиц и насекомых по истечении 6-18 ч после поедания ими зараженного корма. Первично это обусловлено несколькими видами токсинов (NHE, НBL, bc-D-ENT), содержащимися в инфицированной пище, а впоследствии – размножением бактерии в кишечнике. Этот комплекс токсинов Bacillus cereus вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике. При постановке биопробы на мышах у животных в месте введения наблюдается некроз кожи, а в последующем гибель.